Summary
Burada bir otomatik optik kamera mikroskopla hücre göç vitro test etmek için bir yordam açıklanmaktadır. Kazı-kazan tahlil nerede çizik kapatılması için bir süre takip yaygın olarak kullanılmış. Optik mikroskop hücre göç güvenilir ve ucuz tespiti sağlar.
Abstract
Hücre göç sağlık, yara iyileşmesi ve kanser, gibi birçok yönünü etkileyen önemli bir süreçtir ve bu, bu nedenle, geçiş çalışma yöntemleri geliştirmek için çok önemlidir. Kazı-kazan tahlil uzun bileşikler ile anti ve pro migration özellikleri nedeniyle, düşük maliyetli ve basit yordamı sınamak için en yaygın vitro yöntemi olmuştur. Ancak, bir sık rapor tahlil hücreleri birikimi sıfırdan kenar boyunca bir sorundur. Ayrıca, tahlil verileri elde etmek için farklı pozlama görüntüleri bir süre içinde tam olarak aynı noktada göç hareketleri karşılaştırmak için alınması gerekir. Farklı analiz programları sıfırdan kapatılması tanımlamak için kullanılan, ancak emek yoğun, yanlış ve kuvvetleri döngüleri sıcaklık değişiklikleri. Bu çalışmada, geçiş etkisi, Örneğin doğal olarak meydana gelen proteinler insan ve sığır Laktoferrin ile ve epitel hücre satırındaki HaCaT onların N-terminal peptid Lactoferricin test etmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi göstermektedir. Çok önemli bir optimizasyon yıkayın ve söz konusu birikimi hücre kenarı boyunca ortadan kaldırır PBS sıfırdan etmektir. Bu özellikler, keratinosit hücre-hücre bağlantısı üzerinde etkisi olduğu gösterilmiştir kaldırma tarafından açıklanabilir. Geçiş doğru tespiti sağlamaktır, mitomycin C, DNA sentezi inhibitörü ile önceden tedavi protokolü için eklendi. Son olarak, aşırı sıcaklık döngüleri, ortadan kaldıran otomatik optik kamera, el emeği ile sıfırdan kapatma analizi, tekrarlanabilirlik üzerinde iyileştirilmesi ve zamanla çizik aynı bölümden analiz sağlanması sırasında göstermek.
Introduction
Geçiş birçok fizyolojik açıdan etkileyen önemli bir süreçtir. Yara iyileşmesinde, geçiş cildin yeniden epithelization kolaylaştırır. Kronik yaralar gibi Sigara şifa yaralar fırsatçı bakteriler yara enfeksiyonu neden ve açık yaralar bakteri büyüme ve biyofilm1,2oluşumu için idealdir. Biyofilm dirençli bakterilerin gelişimi nedenleri biri bizim modern toplumun3için en büyük tehdit olan biridir. Yara iyileşmesinde, bağışıklık hücreleri biyofilm aşamıyor. Kanser, kanser hücrelerinin geçiş metastaz, çok önemli bir adım olan ölüm solid tümör4,5olan hastalar için birincil nedeni olmasıdır. Bu nedenle, geçiş çalışma çok önemlidir.
Kazı-kazan tahlil kez çünkü ucuz ve kolay, fibroblast, endotel ve epitel hücre hatları6,7gibi yapışık hücre satırları üzerinde gerçekleştirmek için hücre göç sınamak için kullanılır. Bugün, çizikler8gerçekleştirmek için birkaç yöntem var ve farklı malzemeler kullanılmak üzere, kürdan9, hücre Kazıma aletleri10, lazerler11ve elektrik akımları12de dahil olmak üzere bildirilmiştir. Tüm yöntemleri farklı artıları ve eksileri var ve yöntem üzerine hücre türü, bütçe ve analiz aracına göre karar vermesi gerektiğini. Örnek olarak, kullanılan hücre tipi, el ile basınç kaldırma, kaplama gerektiriyorsa, Örneğin bir kürdan veya pipet ucu ile geçiş alanı içinde etkisi, farklı bir yöntem kullanılmalıdır. Bu çalışmada, el ile kazıma üzerinde durulacak.
El ile kazıma için bir zararı olmaz bu çizikler şekilleri ve çizik kenarlarında hücre birikimi, boyutu varyasyonu. Birçok protokoller bulunmaktadır ve hızlı artış ve/veya13çizilmemesi sonra ayrıntılı çamaşır yüksek atıf kağıt tavsiye eder. Buna ek olarak, hücrelerin çoğalması göç--dan ayırt edici olamaz ve bu nedenle yanlış pozitif sonuçlar göç verebilir beri yayılması, en aza indirmek için birkaç yöntem kullanılmıştır. Bazı yöntemler sıfırdan14 önceki ve serum15miktarı azalan serum açlık bildirilir. Ancak, bu yöntemlerin ikisi de hiçbir nükleer silahların yayılmasına karşı olduğundan emin olabilirsiniz. Bu nedenle, biz ön arıtma göç doğru sonuçlar sağlamak için mitomycin C içeren hücrelerin raporu. Mitomycin C DNA16ayıran engeller DNA ile kovalent bağ oluşturarak DNA sentezini engeller bir antibiyotiktir. Mitomycin C ile önceden tedavi ve çizilmemesi önce PBS ile yıkama, Gap algılanan kapatılması (Şekil 1) hücrelerinin doğru geçiş gösteriyor.
Tüm yöntemleri geçiş17süreci analiz etmek bir sistemi için ihtiyaç özelliğidir. Ortak bir ilerleme çözümlemek için ucuz bir yöntem ise bir görüntü yazılımı18,19boşluğu kapatılması bir analizini ve ardından önceden belirlenmiş zaman noktalarda çizik görüntülerini çekmek için ışık alan mikroskop kullanmak için. Bu yöntem zaman alan, aynı yerde ve odak fotoğraf çekmek açısından güvenilmez ve resimlerin çekildiği ise sıcaklık değişiklikleri döngüleri kuluçka hareketinden kamera için zorlar. Diğer yöntemler mevcut akışını ölçerek geçiş algılamak için geliştirilmiştir. Geçerli değişiklikleri hücreler olarak empedans20artış olarak okumak plaka üzerinde daha fazla yer kapsamaktadır. Empedans ölçüm, çevrenin hücrelerin etkilenmez ve yöntemi bu nedenle non-invaziv olarak kabul edilir. Bu yöntem pahalı, altın elektrotlar ile özel plakaları kullanır ama onlar hücresel bağlılık, nükleer silahların yayılmasına karşı geçiş ve hücre ölümü gibi birçok işlemlerin algılanmasını sağlar. Sıcaklık gibi faktörler empedansı üzerinde büyük bir etkiye sahip olarak empedans ölçüm doğrudan geçiş, göstermez bu yöntemin bir engel olduğunu. Empedans değişimler veri analizi daha zor hale yazılım tarafından incelenir değil çeşitli faktörler neden olabilir. Bu nedenle, görselleştirme eksikliği geçiş doğrulamak için geleneksel bir ışık mikroskobu gerektirir.
Birçok kullanılabilir teknikleri downsides üstesinden gelmek için gerçek zamanlı otomatik optik kamera kullanın. Optik kamera küçük bir platformda bir lens, aydınlatma ünitesi ve bir dijital fotoğraf makinesi ile yüksek-den geçerek mikroskop ile algılama sistemidir. Göç ve diğer şeyler arasında nükleer silahların yayılmasına karşı test edebilirsiniz bir yerleşik yazılım vardır. Geçiş algılamak için iki algoritmaları büyüme ve hücrelerin çoğalması ve analizi, sırasıyla şifa yara adı verilen geçiş kinetik çözümlemek için kullanılır. Doku analizi (sarı renkle gösterilmiştir) cep kaplı alanlar arasındaki farkı bulmak için geçerlidir bir iki aşamalı görüntü segmentasyonu algoritma dayalı ve boş yayılması analizi arka plan alanları göre gelişmiş çubuk grafik analiz. Analiz şifa yara hücre monolayer algılar, yara boşluk bulur ve boşluk genişliğini belirler bir üç adım algoritmasına dayanan. Aşağıdaki adımları Kullanıcı tarafından belirlenen saat-noktalarda yapıldığı ve verileri kapalı alan, boşluk genişliği ve gap alanı sunulur. Bu makine büyük avantajlarından biri21kamera açısı yüzünden sıvı ile yapışık hücreleri görüntüleme sağlar olduğunu. Resimleri odak noktası (Şekil 2) olduğundan emin olmak için bir z-yığını için tek bir z uçağı öngörülen kamera hareket ettirildiğinde lenstakes görüntüler oluşturmak. z-yığınlar yara kenarına ve tüm yara arasında dikey çekilen fotoğraflar (Örneğin 40) dizi birleştirme tarafından oluşturulur. Z-yığınlar hücre katmanı hem de bir odakta uçak derinliği yara yakalama sağlar. Ayrıca, resimleri dizi görüntüleri, video koleksiyonuna bir düğmeyi tıklamak ile birlikte konabilir.
Biz algılanması HaCaT keratinosit hücre doğrultusunda geçiş için en iyi duruma getirilmiş bir protokol göstermek. Laktoferrin ve onun N-terminal peptid, Lactoferricin, insanlar ve inekler, bu moleküller çok sayıda uygulama antimikrobiyal ve bağışıklık molekülleri22 oransal için gösterildiği şekilde geçiş üzerindeki etkileri analiz etmek için test , 23. dört bileşikler tedavi edilmezse HaCaT hücrelere karşılaştırıldı ve epidermal büyüme faktörü (EGF) olumlu bir denetim olarak kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneysel Kur etik ve yasal sınırlama yoktur vardır ve Roskilde Üniversitesi ile anlaşma yapılmıştır. Deneysel set-up bir bakış resim 1 ve Şekil 2optik kamera mekanizmaları görülebilir.
1. hazırlık
- Tüm adımları bir steril laminar akış-tezgah tezgah ve tüm ekipmanları ile % 70 etanol başından önce deneme temizleyerek gerçekleştirin.
- Hücreler için en uygun koşulları sağlamak için % 5 CO2 37 ° C'de geleneksel bir kuluçka optik kamera yerleştirin.
- %10 FBS ve 1 x antibiyotik (penisilin ve streptomisin) bir T75 şişesi ile DMEM medyada HaCaT hücrelerin büyümesine.
- 1 mL 1 x tripsin hücreleri bağlantısını kesin ve onları her 3-4 gün yetiştirmek hücresel katmanı üzerinden Dispergatör tarafından alt için kullanın. Oda sıcaklığına kullanmadan önce ön ısı.
2. HaCaT Monolayer üreten hücreleri bir 48-kuyu Microtiter plaka
- Orta T75 şişeye Pasteur pipet ile kaldırın.
- Şişeye yapışık hücreleri T75 şişesi 5 mL 1 x steril PBS ekleyerek yıkayın.
Not: PBS kalsiyum ve magnezyum serbest olduğundan emin olun. - PBS geçirilip yorumlanması için dolaştırmak ve Pasteur pipet ile çıkarın.
- 2.2 2.3 arasındaki adımları yineleyin.
- Şişesi için 1 mL 1 x tripsin ekleyin ve hücre katmanı dağıttı.
- Hücreleri müstakil kadar geleneksel bir kuluçka 37 ° C'de şişeye kuluçkaya (5-8 dk çoğu hücre hatlarında yeterli).
- Hücreleri müstakil ise mikroskop altında görüntüleyin. Hücreleri müstakil kez 9 mL % 10 ile düzenli kültür ortamının eklemek FBS 1 x tripsin devre dışı bırakabilirsiniz.
- Her iki hemasitometre, hücresiyle saymak coulter-sayaç veya benzer bir.
Not: Trypan mavi ölü hücreleri görüntülemek için kullanılabilir. Ancak, 1 x tripsin HaCaT hücreleri vardır mükemmel yuvarlak zaman canlı. - 7.5 x 104 hücreleri/iyi 250 µL % 10 FBS medya 48-iyi doku kültürü yuvarlak popolu plaka (Standart plaka) aktarın.
Not: tahlil de ayarlanabilir 6-, 12-, 24-veya hangi optik mikroskop altında denetlesinler 96-şey plakaları. - Yavaşça plaka yan tarafında hücreleri aynı derecede içinde wells yayılır emin olmak için hareket veya hücreleri kuyuları Merkezi'nde bir araya gelecek. Hücre medyada eşit yayılmış emin olmak için hafif bir mikroskop altında incelemek
- Gecede veya hücreleri kuyu dibine yapıştırılır kadar geleneksel bir CO2 kuluçka 37 ° C'de plaka koymak.
3. geçiş efektleri için bir çekim gücü eklenmesi
- Kuyuları % 90-95 birleşmesi hafif bir mikroskop altında olup olmadığını kontrol edin.
- 10 µg/mL mitomycin C orta uygun bir miktarda hazırlamak.
Not: Bu çalışmada, Mitomycin C 1 mg/mL, hisse senedi bir çözümde 4 ° C'de tutulur. 2-8 ° C'de karanlıkta bir hafta için Mitomycin C çözüm içinde depolanması - Pasteur pipet ile harcanan medya her kuyudan çıkarın.
- 5 µg/mL mitomycin C de 250 µL her şey için ekleyin.
- 2 h 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.
- Peptidler uyaranlara onları Orta uygun bir miktarda sulandrarak hazırlayın.
Not: Bu çalışmada, insan ve sığır laktoferrin hem Lactoferricin 25 µg/mL 250 µL hacmine, test edildi - Mitomycin C ile Pasteur pipet ile orta kaldırın.
- 1 x 1 x PBS (Oda sıcaklığında) ve Kaldır yıkama bir Pasteur ile 250 µL ile pipet wells yıkayın.
- 1 x PBS 250 µL ekleme ve el ile wells 200 µL pipet ucu ile dikey çizik. Yeni bir pipet ucu her şey için kullanın.
- PBS kaldırın ve 250 µL peptid uyaranlara ekleyin.
- Plaka plaka her iki tarafındaki vidaları ayarlayarak optik kamera sistemi monte. Kapak microtiter plaka üzerinde bırakın.
Not: Kameranın açık gerekirse kapak ile çalışabilir.
4. Program bilgisayarın optik kamera için ayarlama
- Al soldaki görev çubuğundaki düğmesini tıklatın.
- Görev çubuğundaki soldaki iyileşmesi işlevi seçin.
- Plaka tipi plaka illüstrasyonaşağı tıklatarak seçin.
- Wells, kullanılmadığı, onları işaretleyerek seçimini kaldırın ve ekranın üst sol tarafında, Etkinleştir ' i tıklatın.
Not: Bütün wells varsayılan olarak seçilir. - Hücrelerin konumunu bir kuyu üzerinde sağ tıklatarak sığdırmak için kuyu objektif odak noktası ayarlayın.
Not: Otofokus da plaka illüstrasyon sağında çubuğunu taşıyarak el ile ayarlanabilir. - Zaman dönemi Resim aralığı altında görüntü için ayarla (Örneğin (00: 30:00)).
- Tekrarı istenen dönem (Örneğin 97 tekrarlar) sığacak şekilde ayarlayın.
- Run Başlat düğmesini sağ alt köşesine tıklatarak başlatın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HaCaT keratinosit hücre, deride en bol bulunan hücre türlerinden biri olan bir. Bir yara ortaya çıktığında, cilt hücrelerini çoğalırlar ve üzerinde yara (Şekil 3) kapatmak için yara yatağına geçirmek başlatın. Her iki süreç vardır, bu nedenle, uygun şifa için son derece önemlidir.
Optik kamera her iki süreç gerçek zamanlı olarak takip edebilirsiniz. Geçiş için sistemi üç veri kümeleri verir: hücre kapalı alan, boşluk genişliği ve gap alanı. Çizikler izleme Lactoferrin, Lactoferricin veya EGF ile tedavi ederken, optik mikroskop zamanla bu üç parametreleri izlemek için bize izin verir. 48 h kuluçka sonra biz EGF tedavi edilmezse denetimi (Şekil 3A) % 38 kapatmaya göre yara, % 95 kapatılması sonuçlandı görmekteyiz. Laktoferrin ve Lactoferricin farklı sürümleri ile üst proteinler daha güçlü olmak peptidler % 33 ve % 62 yara kapatma arasında yerleştirilir. Yara kapatma, boşluk genişliği ilk sıfırdan değişikliklerden belirlenen yüzdesi de olabilir (Şekil 3B) çizilen.
HaCaT hücrelerin güçlü hücre-hücre etkileşim ve hücreleri'e geçiş yaparken, gerekli24dizi adımı vardır. Kısa bir süre, önde gelen hücrelerin yapıştırılması sitelerinde bozacak, çıkıntı ve25taşımak için sitoiskeleti sözleşme. Önde gelen hücrelerin çıkıntı optik kamera (Şekil 4) ile kolayca görülebilir.
Resim 1 : Geçiş bir optik kamera test etmek için sıfırdan testin şematik akış çizelgesi. HaCaT hücreleri 48-şey plaka üzerinde kaplama ve 24 saat bağlı kalmak için izin verdi. Hücreleri mitomycin C için nükleer silahların yayılmasına karşı etkisizleştirmek 2 h ile önceden kabul edilir ve sıfırdan yapılır ve buna ek olarak peptid uyaranlara tarafından takip. Plaka optik kamera birimi eklenir ve geçiş için 48 saat gelir.
Resim 2 : Optik kamera tarama teknolojisi. Otomatik optik kamera optik lens birimi yatay düzlemde bakteriyel ve hücresel çözümleri gibi çeşitli çözümler yoluyla taranmasını sağlamak için 6.25 ° açılı. Görüntü yığınları bütün odaklanır, odak ve odaktaki, hücreleri odaktaki görüntülerle sağlamak için alınan dizi resmi içerir. 26değiştiren.
Şekil 3 : Geçiş 48 saat önceden tedavi mitomycin C HaCaT hücrenin. (A) geçiş 48 saat için her yarım saatte otomatik optik kamera tespit edildi. Hücreleri ile mitomycin C-nükleer silahların yayılmasına karşı etkisizleştirmek için önceden kabul edilir. Hücreleri 25 µg/mL ile insana ilişkin - veya sığır-Lactoferrin (H-Eğer veya B-Eğer) veya - Lactoferricin (H-LFcin, B-LFcin) kabul edilir. Epitelyal büyüme faktörü (EGF) 500 ng/mL, pozitif kontrol olarak kullanılır. Tedavi edilmemiş HaCaT hücreler bir denetim olarak kullanılır. (B) geçiş tedavi grafik resmini. Üç bağımsız çalışan temsilcileri sonuçlarıdır ve sonuçları ilk sıfırdan yüzde kapatma olarak verilen * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
Şekil 4 : Lamellipodia, çıkıntılı HaCaT hücreleri tedavi. Lamellipodia HaCaT hücre siyah oklarla işaretlenmiş. Onlar göç ve zaman içinde kolayca görülebilir HaCaT güçlü hücre-hücre etkileşiminin hücrelerin dinamik hareket sonuçlanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Geliştirme, yara iyileşmesi, immünoloji ve kanser araştırmaları göç önemi için birkaç farklı yöntem geçiş çalışma yol açmıştır. Geçiş ya da bir ifade genişleme veya boşluk hücreleri tarafından kapatılması olabilir. Bir monolayer hücreleri büyümek ve daha belirli form8hücrelerde büyüyen bir çizik bile yapmak daha kolay olduğu gibi en sık kapatılması çizik, mercek altına alındı. Tekniği Master kolay ve düşük maliyetli olduğu gibi bizim çalışma manuel tırmalamak için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemini gösterir. Biz DNA sentezi inhibitörü mitomycin C, yayımlanmış yöntemleri18ve yüksek üretilen iş çalışmaları sağlayan bir optik kamera kullanımı ile karşılaştırıldığında çizik optimize etmek için ilave bir yıkama tanıttı.
Vitro sıfırdan tahlil düzgün kuyuları köküne bağlar bir yapisan hücre kültürünü gerektirir ve geçiş üzerinde bir çizik bile algılamak için nükleer silahların yayılmasına karşı inhibe olabilir gerekiyor. Bu iki özellik tahlil için gereklidir. Gerçek geçiş algılamak için birkaç yaklaşım14, DMSO veya çeşitli inhibitörleri 13,27tırmalamak önce hücre açlıktan serum konsantrasyonu düşürücü tarif edilmistir. Genel olarak, serum-ücretsiz medya-ebilmek var olmak kullanılmış, ancak, bazı birincil hücre hatları, taşıma ve genel sağkalım ihtiyaç serum gibi satırları hücre. Bu nedenle, hücre kültürünü göre seçim yapılmalıdır. Manuel çizikler kaplama rahatsız etmeyecek gibi kaplama gerektiren hücre hatları bu tahlil, sorunlu olabilir de.
Farklı hücre türleri farklı konfluent monolayer bağlı olarak onların boyutu ve büyüme oranı oluşturmak için hücre sayısı gerektirir. HaCaT hücreleri yaklaşık 4-6 h sonra uygun ama gece dengeli monolayer yapmak için yerleşmek için yaptı. Kazı-kazan tahlil önemli dezavantajları biridir düzensiz çizikler8. Bu çalışmada, PBS ile ön yıkama ve çizik içinde yeni PBS yapma birikimleri çizik kenarları boyunca yaralı ve hasarlı hücrelerinin azaltmak göster. Bu tanıdıklarını cilt hücrelerinde bağlanma desmosomes kavşağı tarafından açıklanabilir. Kavşak Ca2 +vardır-bağımlı24 ve PBS, kullanarak hangi güçlü hücre-hücre adezyon zayıflatabilir özellikler kaldırılır. Böylece, PBS kullanımı hücrelerin daha iyi temizleme tek tek hücreler yara kenarı boyunca daha az birikimi önde gelen izin verebilir. Ayrıca, optik kamera Wells, her plaka geniş bir kısım önlemler ve bents, üç adım algoritma üzerinden çizik içinde uyum sağlar. Böylece, ön yıkama PBS ile ve optik kamera kullanarak, el ile çizikler dezavantajları ortadan kalkar. Z-görüntülerin istifleme, daha doğrusu, hücreleri üzerinde odaklama yapar ama büyümeye bağlı olarak ne kadar farklı hücre tipleri, odağı bir sorun olabilir. Hücreleri çok fazla genişlerse, fotoğraf makinesinin odak odak out gelen odak kayacak. Böylece, Mitomycin C kullanılırsa, deneysel kurulumunuzu daha 24 h çalıştırırsanız biraz daha yüksek odak ayarlamak için yararlı olabilir. Optik kamera microtiter tabak tabak üzerinden 6 - 96-iyi ölçebilirsiniz sezgisel bir yazılım ile standart bir bilgisayar aracılığıyla işletilen kolay bir kurulumu vardır ve bu nedenle çeşitli test set-up sağlar. Alınması gereken görüntü sayısını seçerken, bazı sınırlamalar vardır. 96-şey plaka kullandıysanız, bir elde edebilirsiniz resimler sadece sınırlı veri kümeleri gibi bilgisayarında yer büyük hale gelebilir ve fotoğraf makinesinin hızı tarafından sayıdır. Hızlı bir şekilde çok sayıda resim gerekirse, her inceden inceye gözden geçirmek için zaman ihtiyacı olduğu kamera hareketi kısıtlayıcı bir faktör olabilir de.
Optik sistem basit ama güçlü izleme sağlar. Çizik resimleri boşluğu kapatma işlemi açısından incelenir ama hücreleri morfolojik karakterizasyonu için de kullanılabilir. Yazılımı hücreleri sarı işaretler ve arka plan rengi gri ham görüntüleri belli ki bu Örneğin yayınlar için gerekli mevcuttur rağmen yara kenarına daha iyi görmek için standart bir özellik olarak değiştirmez. HaCaT hücreleri içinde dinamik sayfa28ortaya geçiş yapan güçlü hücre-hücre etkileşime sahip olabilirsiniz. Bu özellik, lamellipodia geçirme hücre zaman (Şekil 4) görmek kolaylaştırır.
Bu çalışmada laktoferrin proteinlerin etkisi ve Lactoferricin ve EGF pozitif kontrol olarak türetilmiş N-terminal peptidler gösterir, ancak farklı ilaçlar, peptidler/proteinler ve kombinasyonları, inhibitörleri veya uyarıcılar olarak test etmek için değiştirilmiş olabilir yara iyileşmesi. Kazı-kazan tahlil değişmiş ve çeşitli hücre hatları ve geçiş etkileyebilir bileşikler uyacak şekilde en iyi duruma getirilmiş. Birlikte, düşük maliyetli ve kolay yönetilebilirlik ile bu tahlil çoğu laboratuarlar için çok uygundur. Optik kamera farklı ilaçlar, inhibitörleri veya uyarıcılar geçiş, aynı zamanda nükleer silahların yayılmasına karşı test etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bağımsız araştırma, teknoloji ve üretim, Danimarkalı kurulu #4005-00029 vermek
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| oCelloScope | BioSense Solution ApS | Optical camera | |
| UniExplorer software | BioSense Solution ApS | (8.0.0.7144 (RL3)) | |
| HaCaT cell | Donated from Bispebjerg Hospital | ||
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | Medium for HaCaT |
| FBS | Gibco | 10270 | Fetal bovine serum |
| PBS | Gibco | D837 | Without Mg+ and Ca2+ |
| Pencillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | Antibiotics |
| Trypsin (10x) | Sigma | T3924 | |
| Mitomycin C | Tocris | 3258 | Inhibits proliferation |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 677 180 | |
| Incubator | Panasonic | 37°C, 5% CO2 | |
| Hemocytometer | Assistent | Türk (0.1 mm) | |
| Pipet boy | Accu-Jet pro |
References
- Frykberg, R. G., Banks, J. Challenges in the Treatment of Chronic Wounds. Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).
- da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing. Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).
- Vyas, K. S., Wong, L. K. Detection of Biofilm in Wounds as an Early Indicator for Risk for Tissue Infection and Wound Chronicity. Annals of Plastic Surgery. 76 (1), 127-131 (2016).
- Paul, C. D., Mistriotis, P., Konstantopoulos, K. Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces. Nature Reviews Cancer. 17 (2), 131-140 (2016).
- Folkman, J. Angiogenesis. Annual review of medicine. 57, 1-18 (2006).
- Monsuur, H. N., et al. Methods to study differences in cell mobility during skin wound healing in vitro. Journal of Biomechanics. 49 (8), 1381-1387 (2016).
- Tang, L., et al. Human lactoferrin stimulates skin keratinocyte function and wound re-epithelialization. The British journal of dermatology. 163 (1), 38-47 (2010).
- Ashby, W. J., Zijlstra, A. Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration. Integrative Biology. 4 (11), 1338-1350 (2012).
- Klettner, A., Tahmaz, N., Dithmer, M., Richert, E., Roider, J. Effects of aflibercept on primary RPE cells: toxicity, wound healing, uptake and phagocytosis. British Journal of Ophthalmology. 98 (10), 1448-1452 (2014).
- Doyle, W., Shide, E., Thapa, S., Chandrasekaran, V. The effects of energy beverages on cultured cells. Food and Chemical Toxicology. 50 (10), 3759-3768 (2012).
- Zordan, M. D., Mill, C. P., Riese, D. J., Leary, J. F. A high throughput, interactive imaging, bright-field wound healing assay. Cytometry Part A. 79 (3), 227-232 (2011).
- Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (6), 1554-1559 (2004).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Räsänen, K., Vaheri, A. TGF-beta1 causes epithelial-mesenchymal transition in HaCaT derivatives, but induces expression of COX-2 and migration only in benign, not in malignant keratinocytes. Journal of Dermatological Science. 58 (2), 97-104 (2010).
- Tochio, T., Tanaka, H., Nakata, S., Hosoya, H. Fructose-1,6-bisphosphate aldolase A is involved in HaCaT cell migration by inducing lamellipodia formation. Journal of Dermatological Science. 58 (2), 123-129 (2010).
- Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chemistry and Biology. 2 (9), 575-579 (1995).
- Stamm, A., Reimers, K., Strauß, S., Vogt, P., Scheper, T., Pepelanova, I. In vitro wound healing assays - state of the art. BioNanoMaterials. 17 (1-2), 79-87 (2016).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).
- Jonkman, J. E. N., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 440-451 (2016).
- Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. S., Kim, S. Electrical cell-substrate impedance sensing as a non-invasive tool for cancer cell study. The Analyst. 136 (2), 237-245 (2011).
- Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
- Jenssen, H. Anti herpes simplex virus activity of lactoferrin/lactoferricin - An example of antiviral activity of antimicrobial protein/peptide. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3002-3013 (2005).
- Jenssen, H., Hancock, R. E. W. Antimicrobial properties of lactoferrin. Biochimie. 91 (1), 19-29 (2009).
- Delva, E., Tucker, D. K., Kowalczyk, A. P. The desmosome. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 1 (2), 1-17 (2009).
- Ponti, A. Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells. Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).
- Canali, C., Spillum, E., Valvik, M., Agersnap, N., Olesen, T. Whitepaper a Digital Time-Lapse Bright Field Technology To Drive Faster, Higher Throughput Bioanalysis. , (2016).
- Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration. Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).
- Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).
