Summary
التفاعلات بين الميكروبات واستضافة القناة الهضمية قيمت استخدام نهجاً جديداً يجمع بين مجتمع شفوي اصطناعية و في المختبر الهضم المعدية المعوية، ونموذجا ظهارة الأمعاء. نحن نقدم طريقة التي يمكن تكييفها لتقييم غزو الخلية من مسببات الأمراض والأغشية الحيوية المتعددة الأنواع، أو حتى لاختبار قابلية بروبيوتيك الصيغ.
Abstract
وقد اعترف منذ زمن بعيد التفاعل بين المضيف والحجمية وعلى نطاق واسع ووصف. الفم مماثل إلى فروع أخرى من الجهاز الهضمي، كما يحدث الحجمية المقيمين ويمنع الاستعمار بالبكتيريا الخارجية. وفي الواقع، تم العثور على أكثر من 600 نوع من البكتيريا في تجويف الفم، وفرد واحد قد تحمل حوالي 100 مختلفة في أي وقت. بكتيريا الفم تمتلك القدرة على التمسك بالمنافذ المختلفة في النظام الإيكولوجي عن طريق الفم، وهكذا تصبح متكاملة داخل المجتمعات الميكروبية المقيمة، وتفضيل النمو والبقاء على قيد الحياة. ومع ذلك، اقترح تدفق البكتيريا إلى الأمعاء خلال البلع إلى الإخلال بتوازن الحجمية القناة الهضمية. في الواقع، تحولت الإدارة عن طريق الفم من جينجيفاليس P. تكوين البكتيرية في النبت لفائفي. أننا كمجتمع اصطناعية تمثيل مبسط للنظام الإيكولوجي الطبيعي عن طريق الفم، توضيح بالبقاء على قيد الحياة وبقاء البكتيريا عن طريق الفم يتعرضن لظروف محاكاة العبور الجهاز الهضمي. الأنواع الأربعة عشر المحددة، تعرض في المختبر اللعابية، والمعدة، وعمليات الهضم المعوية، وقدم إلى طراز مولتيكومبارتمينت خلية التي تحتوي على خلايا كربونات الكالسيوم-2 و HT29 MTX لمحاكاة ظهارة مخاطية الأمعاء. وعمل هذا النموذج لكشف تأثير البكتيريا ابتلع على الخلايا المعنية بتداول enterohepatic. يسمح استخدام المجتمعات الاصطناعية للتحكم وإمكانية تكرار نتائج. وهكذا، هذه المنهجية يمكن تكييفها لتقييم جدوى الممرض والتغيرات المرتبطة بالتهاب اللاحقة، قدرة الاستعمار من خلائط بروبيوتيك، وفي نهاية المطاف، البكتيرية المحتملة تؤثر على التداول بريسيستيميك.
Introduction
البشر التعايش مع البكتيريا، التي موجودة في نفس عدد الخلايا البشرية1. ومن ثم فمن المهم من أهمية حاسمة للحصول على فهم شامل ميكروبيومي البشرية. تجويف الفم بيئة فريدة من نوعها في ذلك ومقسمة إلى عدة الموائل أصغر، وبالتالي الذي يحتوي على مجموعة كبيرة ومتنوعة من البكتيريا والأغشية الحيوية في تلك المواقع المختلفة. ويجري فتح النظام إيكولوجي، قد تكون بعض الأنواع في الفم زائر عابر. ومع ذلك، بعض الكائنات المجهرية استعمار قريبا بعد الولادة وشكل تنظيم الأغشية الحيوية2. وتوجد هذه في سطح الأسنان أعلاه شق اللثة وشق سوبجينجيفال، واللسان، والأسطح المخاطية والأسنان الاصطناعية وحشوات3. يمكن أن تكون البكتيريا موجودة أيضا فلكس وخلايا العوالق في التجويف قناة الأسنان، أما ممزوج داخليا مع أنسجة اللب نخرية أو علقت في مرحلة السائل.
وهناك نشطة ومستمرة عبر الحديث بين الخلايا المضيفة و الحجمية المقيمين4. البكتيريا التواصل داخل وفيما بين الأنواع، وفقط نسبة صغيرة من المستعمرين الطبيعية يمكن أن تنضم إلى الأنسجة، بينما الأخرى البكتيريا إرفاق هذه المستعمرين الأولية. على سبيل المثال، خلية خلية الربط بين الكائنات الدقيقة هو المفتاح لدمج الثانوي المستعمرين في الأغشية الحيوية عن طريق الفم، وبناء شبكات معقدة من التفاعل الخلايا الجرثومية4. حوالي 70% مجاميع البكتيرية في عينة لعاب يتم تشكيلها من قبل بورفيروموناس sp. و العقدية sp.، بريفوتيلا sp.، فيلونيلا sp. ومجهولون باكتيرويديتيس. ف. نوكليتوم ، مستعمر وسيطة في بيوفيلم سوبجينجيفال والمجاميع مع المستعمرين أواخر P. جينجيفاليس، ت. دينتيكولا، و فورسيثيا تانيرلا، التي هي متورطة في التهاب اللثة5. وبالإضافة إلى ذلك، تحتل ميتس العقدية الموائل المخاطي والأسنان على حد سواء، بينما يفضل الدم س. وس. جوردو لاستعمار الأسنان3. وهكذا، والدم س. موجودة في أقل من القواطع والانياب، بينما تم العثور على نايسلوندي الحارش في أنتيريورس العلوي6.
وبالإضافة إلى ذلك، ميكروبيومي الأصلية يلعب دوراً في الحفاظ على صحة الإنسان2. وتشارك الحجمية المقيم في التعليم محصنة والحيلولة دون توسيع الممرض. مقاومة الاستعمار هذا يحدث بسبب البكتيريا الأصلية قد تكون أفضل تكييف في إرفاق للأسطح، وأكثر كفاءة في ميتابوليسينج المواد الغذائية المتاحة للنمو. لا وصف تماما على الرغم من أن سلالات الكائنات الحية المجهرية البقاء على قيد الحياة بمرور الجهاز الهضمي، ولا تزال نشطة، استمرار وجود البكتيريا أصلي ابتلع من موقع العلوي من الجهاز الهضمي. وهكذا، نتعرض جماعة اصطناعي، ممثل النظام الإيكولوجي عن طريق الفم، إلى ظروف محاكاة العبور الجهاز الهضمي. تم تقييم جدوى خلايا البكتيرية باستخدام نموذج مولتيكومبارتمينت تشبه ظهارة الأمعاء. الحالي القناة الهضمية المحاكاة توفر إمكانية تكرار نتائج مناسبة من حيث تحليل المجتمع الميكروبي لومينال7. ومع ذلك، التصاق البكتيريا والميكروبات والمضيف التفاعل كل على حدة تعالج، كالجمع بين خطوط الخلايا مع المجتمعات الميكروبية يتحدى8. وفي المقابل، نقدم إطارا يقدم شرحاً الميكانيكية المحتملة لإحداث الاستعمار الناجحة عن واجهة القناة الهضمية. في الواقع، استخدام هذا النموذج يمكن الاشتراك مع نموذج القناة الهضمية ثابتة لتقييم الأثر للمجتمعات الميكروبية على المضيف الإنذار سطحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-سلالات والثقافة الشروط
ملاحظة: كان يتألف المجتمع الشفوي الاصطناعية بسلالات موجودة عادة في الفم ميكروبيومي3.
- الحصول على سلالات التالية من جمع الثقافة نوع الأمريكية (ATCC): أكتينوميسيتيمكوميتانس أجريجاتيباكتير (ATCC 43718)، Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953)، (ATCC بورفيروموناس جينجيفاليس 33277)، الحارش نايسلوندي (ATCC 51655)، بكتيريا سوبرينوس (ATCC 33478)، ، بريفوتيلا انترميديا (ATCC 25611)، العقدية mutans (ATCC 25175) بكتيريا جوردو (ATCC 49818)، الحارش فيسكوسوس (ATCC 15987) و العقدية ميتس (ATCC 49456).
- الحصول على فيلونيلا بارفولا من لايبنتز المعهد الألماني دسمز مجموعة الكائنات الدقيقة والثقافات الخلية (DSM 2007)، بكتيريا الدم من "مجموعة البكتيريا" بككم/مجموعة المتشابهين في الآراء (مجموعة المتشابهين في الآراء 14657) واستخدام عقدية ساليفاريوس سلالة توف-ص9، و عقدية فموية10.
2-التنمية المنصبة المجتمع ممثل ميكروبيومي عن طريق الفم
ملاحظة: إنشاء مجتمع اصطناعية لمحاكاة قدرة التصاق المحتملة من البكتيريا عن طريق الفم ظهارة الأمعاء في المختبر . تنمو البكتيريا في لوحات أجار الدم وتستكمل مع 5 هيمن ميكروغرام/مل و 1 ميكروغرام/مل menadione الدم الحصان ديفيبريناتيد العقيمة 5%، كما هو موضح في هرنانديز-سانابريا et al. (2017) 11-باختصار:
- يذوب 100 مغ هيمن في 2 مل من هيدروكسيد الصوديوم م 1، وإضافة 100 مل ماء المقطر يعقم. تخزين في حاوية الظلام. تعقيم من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر قبل إضافة إلى متوسط.
- حل 100 مغ menadione في 20 مل إيثانول 96%. تعقيم من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر قبل إضافة إلى متوسط.
- تحضير 1 لتر متوسطة أجار الدم (انظر الجدول للمواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة والاوتوكلاف. السماح لتبرد قبل إضافة دم الحصان والملاحق. خلط وصب اللوحات.
- إعداد مرق ضخ القلب الدماغ المعدلة (بهي) كما ذكر سابقا12. إضافة 5 ميكروغرام/مل من هيمن و 1 ميكروغرام/مل من menadione بعد التعقيم.
- الاستغناء عن 9 مل المتوسط في أنابيب هونجاتي، وأغلق مع سداده مطاطية وغطاء ألومنيوم. تدفق الأنابيب مع/CO ن22 (10%/90%).
- استرجاع 1 مل من اللاهوائية المتوسطة مع المحاقن ووضعه في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. اختيار المستعمرات واحدة لكل نوع من الأنواع البكتيرية وريسوسبيند في الأجل المتوسط ونقل مرة أخرى إلى بهي معدلة اللاهوائية. احتضانها ل 48 ساعة عند 37 درجة مئوية، باستثناء س. ساليفاريوس، الذي يجب أن يكون المحتضنة ح 24.
-
إذا لزم الأمر، تؤكد نقاء الثقافات قبل تجميع المجتمع الاصطناعية. باختصار:
- استخراج الحمض النووي من ثقافات السائل كما هو الحال في هرنانديز-سانابريا et al. (2010) 13 وتضخيم الجين الرنا الريباسي 16S في كبسولة تفجير باستخدام 27 واو (أجاجتتجاتيمتجكتكاج) و 1492R (تاكجيتاككتجتاكجاكت)، والبرنامج التالي: 5 دقائق في 95 درجة مئوية، دورات 30 من 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 55 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقة 1.5، تليها خطوة تمديد نهائي لمدة 5 دقائق عند 72 درجة مئوية.
- تنقية المنتج بكر مع تجاري كيت (انظر الجدول للمواد)، اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- القيام برد فعل التسلسل من المنتجات النقية في حجم إجمالي 10 ميكروليتر المحتوية على 0.5 ميكروليتر من صبغ (انظر الجدول للمواد)، بمول 3.2 من التمهيدي M13f (كجككاججتتتكككاجتكاكجاك)، ميكروليتر 2.0 من 5 × التسلسل المخزن المؤقت، و 20 نانوغرام قالب، باستخدام نظام التسلسل التجاري مع مجموعة (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: كان لدينا هذا الإجراء إجراء تجارياً. - إجراء بحث انفجار في كل تسلسل (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) لتحديد الأصناف المعروفة الأقرب ومقارنة مع تسلسل سلالة الأصلي باستخدام أداة "المصنف برنامج التعمير والتنمية" على شبكة الإنترنت (http://rdp.cme.msu.edu/) وسينا خدمة المحاذاة (https://www.arb-silva.de/aligner/).
- قياس عدد الخلايا في نهاية الحضانة، باستخدام التدفق الخلوي ووصمة عار "سيبر يوديد" Propidium الأخضر/كما هو موضح في هرنانديز-سانابريا et al. (2017) 11-تمييع الثقافات إلى 10 مل الخلايا5 -1، واستخدام تعديل بهي.
- أضف 1 مل من س. ميتس في 75 مل بهي اللاهوائية واحتضان حتى مرحلة ثابتة (ح 6). عقب، جمع 0.75 مل من كل سلالة المخفف والمزيج تحت الظروف اللاهوائية.
- متى كانت مختلطة جميع الثقافات، أخذ 1 مل من مصغر، وإضافة إلى 75 مل بهي. احتضان المجتمع الاصطناعية تحت 10% CO2، 10 ٪ ح2، 80% N2 ل 48 ساعة عند 37 درجة مئوية و 200 لفة في الدقيقة (انظر الجدول للمواد).
- قياس كثافة الخلية كما هو الحال في 2.8. قبل أن يعرض المجتمع إلى نموذج الخلية. ويمكن تقييم تركيبة المجتمع مع الكمي PCR الوقت الحقيقي، استخدام كبسولة تفجير والصلب في درجات الحرارة في الجدول 1 من سلومكا et al. (2017) 10-وبالإضافة إلى ذلك، استخدم 16S الرنا الريباسي amplicon التسلسل الجيني لتقديم معلومات عن أعضاء الأولية الحالية13،14. أما بروتوكول تأكيد الهوية، استخدم كدنا كقالب للإشارة إلى البكتيريا تدوين بنشاط البروتينات، واستخدام الحمض النووي كقالب لتكشف عن وجود/عدم وجود السلالات.
3-الممارسات العامة خلية ثقافة
ملاحظة: للجوانب العامة لثقافة الخلية، المؤلفين الرجوع إلى الأصول الرأسمالية وستايسي (2007)15. الحصول على خطوط الخلايا المستخدمة من "جمع من مصادقة خلية الثقافات الأوروبية" (كربونات الكالسيوم-2 اكاكك 86010202 و 12040401 اكاكك HT29-MTX-E12، إنكلترا الصحة العمومية، المملكة المتحدة). ويمكن شراء الكواشف لزراعة الخلايا (انظر الجدول للمواد)، ما لم يحدد خلاف ذلك.
-
الصيانة وباساجينج من خطوط الخلايا كربونات الكالسيوم-2 و HT29-MTX
ملاحظة: تزرع الخلايا كربونات الكالسيوم-2 و HT29 MTX بشكل روتيني في 25 سم2 زراعة الأنسجة قوارير تحتوي على تستكمل دميم المتوسطة (الجدول 1). يتم تريبسينيزيد الخلايا عندما يتم التوصل إلى التقاء 60 – 70%.- إزالة مستنبت الخلية من قوارير. تغسل مرتين مع 5 مل من برنامج تلفزيوني دون/Mg Ca++++.
- إضافة 2 مل محلول 0.5 ملغ/لتر من التربسين و 0.22 غرام/لتر الإثيلين diamine حمض tetraacetic (أدتا). توزيع الحل التربسين التي تتحرك بلطف قارورة. إزالة 1.5 مل الحل التربسين واحتضان قارورة في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- الاختيار تحت المجهر إذا يتم فصل الخلايا من سطح قارورة. احتضان لمدة 5 دقائق إضافية، إذا لزم الأمر.
- إضافة 5 مل وسائط الثقافة الخلية المكملة لقارورة لإلغاء تنشيط التربسين. بيبيت صعودا وهبوطاً للحصول على تعليق خلية واحدة متجانسة.
- فورا، تأخذ من 50 ميليلتر الكوة من تعليق خلية وخلط مع العقيمة الحل تريبان الأزرق 0.4 في المائة في نسبة 1:1 (v/v) للخلايا كربونات الكالسيوم-2 أو 1:5 v/v HT29-MTX. مزيج من بيبيتينج والتحميل إلى غرفة الفرز (انظر الجدول للمواد).
- عد الخلايا (خلايا بيضاء مشرقة) قابلة للبقاء تحت المجهر (راجع إرشادات الشركة المصنعة).
- البذور في قارورة جديدة في كثافة من 4 × 105 خلايا/سم2 و 1 × 104 خلايا/سم2، 2 كربونات الكالسيوم و HT29-MTX، على التوالي.
ملاحظة: (1) كربونات الكالسيوم-2 الخلايا تفرق وتشكل تقاطعات ضيق مرة التوصل إلى كونفلوينسي. من المهم جداً لتفادي كونفلوينسي أكثر من قبل تريبسينيزيشن. يمكن أن يسبب فرط نمو الخلايا في قارورة الفشل في الخلية المفرزة بعد كتل تريبسينيزيشن و/أو الخلية. (2) HT29-MTX الخلايا المنتجة للمخاط الخلايا ذات النشاط الأيضي عالية16. هذه الميزات قد يتسبب تحميض سريع وسائل الإعلام ثقافة الخلية، لا سيما إذا كانت الخلايا في كثافة عالية. يمكن إضافة حبيس المخزن المؤقت إلى مستنبت الخلية (الجدول 1) للحفاظ على درجة الحموضة بين 7 و 7.2. إذا كان الرقم الهيدروجيني قطرات، يمكن أن تكون وسيطة تبادل عند كونفلوينسي هو أقل من 50%. ومع ذلك، إذا كونفلوينسي > 50%، يجب تقسيم خلية ثقافة.
4-جمعية مولتيكومبارتمينت خلية نموذج محاكاة واجهة المضيف-ميكروب القناة الهضمية
ملاحظة: اكتمال ثقافة المشارك في الآبار غرفة مزدوجة (قطرها 24 ملم، المسامية حجم 0.4 ميكرومتر؛ انظر الجدول للمواد).
- إضافة 1.5 مل من خلية كاملة ثقافة وسائل الإعلام إلى حجرة قمي و 2 مل القاعدية. قبل احتضانها لمدة 20 – 30 دقيقة للحصول على توزيع متساو لتعليق خلية عند البذر.
- تريبسينيزي خلية ثقافة من كربونات الكالسيوم-2 و HT29 MTX كما هو موضح في القسم 3. يجب أن يتبع هذا الإجراء تريبسينيزيشن بدقة لتحقيق توزيع متجانس لكل خطوط الخلية، في تعليق خلية مفردة، دون كتل.
- عد الخلايا قابلة للحياة كما هو موضح في 3.1.8.
- ضبط كثافة الخلية إلى 6.5 × 104 خلايا/سم2 في نسبة 90/10 من كربونات الكالسيوم-2/HT29-MTX الخلايا.
- مجانسة تعليق خلية وإضافة حجم الخلايا كربونات الكالسيوم-2 و HT29 MTX المقابلة لحاوية معقمة معبأ مسبقاً مع الخلية تستكمل ثقافة وسائل الإعلام. إزالة الوسائط المحتضنة مسبقاً من جانب الدائرة قمي بتطلع.
- بلطف مزيج تعليق خلية من بيبيتينج، ونقل 1.5 مل إلى حجرة قمي من إدراج الدائرة. يتطلب الإجراء البذر تجانس مستمر من تعليق خلية، كما تميل الخلايا للرواسب. اعتماداً على خبرة المستخدم وسرعة العمل، يجب أن تكون مختلطة تعليق خلية بعد الاستغناء عن الآبار 1 – 3.
- نقل لوحات بلطف إلى الخلف وإلى الأمام واليمين ثم من اليسار إلى اليمين (5 – 10 مرات) للحصول على حتى انتشار الخلايا في البئر. نقل إلى حاضنة وكرر حركة الصفائح.
- الحفاظ على ثقافة المشارك من كربونات الكالسيوم-2/HT29-MTX الخلايا لمدة 15 يوما، تحديث مقصورات قمي والقاعدية كل يومين مع دميم المكملة. بعد هذا الوقت، يمكن تغيير وسائل الإعلام ثقافة الخلية إلى دميم المكملة دون حل المضادات الحيوية/فطري.
- الإبقاء على النظام حتى 20 – 21 يوما بعد البذر بتحديث المتوسط كل يومين.
-
قياس سلامة الحاجز الظهارية قبل البدء التحليل، باستخدام "نظام المقاومة الكهربائية" (انظر الجدول للمواد)، اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- التأكد من أن المعدات طير مشحونة بالكامل (> ح 24) قبل البدء في القياسات.
- قطع المعدات طير من إمدادات الطاقة وتغطية بكيس من بلاستيك اﻷوتوكﻻف. جعل ثقب في كيس لإدخال مسرى وقم بتوصيل منفذ الإدخال على العداد. رش مع 70% الإيثانول والمياه (v/v) قبل إدخال معدات طير في مجلس الوزراء التدفق.
- لتطهير مسرى، تزج نصائح القطب في الحل الإيثانول والمياه (v/v) 70% عن 15 دقيقة السماح للهواء الجاف شطف س. 15 مسرى في الخلية قبل حرارة الثقافة الإعلامية.
- تأخذ الخلايا خارج الحاضنة والسماح بالتوصل إلى درجة حرارة الغرفة داخل مجلس الوزراء التدفق الخلايا.
- تأكد من أن العداد مفصول من الشاحن. تعيين رمز التبديل وضع أوم وتشغيل تبديل الطاقة على.
- قياس مقاومة الخلية بغمر مسرى مع نصيحة أقصر في الإدراج وتلميح أطول من البئر. يبقى مسرى بزاوية 90 درجة لإدراج لوحة.
5-البكتيريا البقاء على قيد الحياة في المختبر العبور الجهاز الهضمي الشروط التالية
ملاحظة: تعد الهضم محاكاة السوائل بعد بروتوكول مينيكس et al. (2014) 17، مع إدخال التعديلات المبينة أدناه. إعداد جميع تخفيف الماء عالي النقاوة. فلتر تعقيم جميع الحلول من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر وتنفيذ الإجراء الهضم تحت ظروف معقمة.
-
الهضم عن طريق الفم:
- ضع 3 مل المجتمع البكتيري في أنبوب 50 مل عقيمة، وتخلط مع 3 مل من اللعاب محاكاة السوائل (صندوق الضمان الاجتماعي)، الذي يتضمن (في ملمول لتر-1): بوكل، 15.1؛ خ2ص4، 3، 7؛ ناكو3، 6.8؛ مجكل2(ح2س)6، 0.5، (NH4) CO3، 0.06؛ HCl، 1.1؛ كاكل2(ح2س)2، 0.75. إضافة 75 يو/مليلتر من α-الأميليز من اللعاب البشرية نوع أ التاسع والميوسين 2 غرام/لتر من نوع المعدة الخنزير الثاني إلى صندوق الضمان الاجتماعي.
- احتضان هذا الخليط لمدة 2 دقيقة، في 37 درجة مئوية، و 100 لفة في الدقيقة. جمع عينة 2 مل لاستخراج الحمض النووي والتدفق الخلوي الكمي (S1).
-
المعدة من الهضم:
- إضافة 4 مل سائل المعدة محاكاة (سجف)، الذي يتضمن (في ملمول لتر-1): بوكل، 6.9؛ خ2ص4، 0.9؛ ناكو3، 25؛ كلوريد الصوديوم، 47.2؛ مجكل2(ح2س)6, 0، 1، (NH4) CO3، 0.5؛ HCl، 15.6؛ كاكل2(ح2س)2، 0.075. وباﻹضافة إلى ذلك، الواردة سجف 2 غرام/لتر الميوسين من الخنزير المعدة من النوع الثاني.
- قياس درجة الحموضة وضبط على درجة الحموضة 3 مع 1 م HCl، إذا لزم الأمر. احتضان في 37 درجة مئوية و 100 لفة في الدقيقة. جمع عينة 2 مل (S2).
-
الهضم في الأمعاء الدقيقة:
- إضافة 4 مل من محاكاة السوائل المعوية (SIF) التي تحتوي على (في ملمول لتر-1): بوكل، 6.8؛ خ2ص4، 0.8؛ ناكو3، 85؛ كلوريد الصوديوم، 38.4؛ مجكل2(ح2س)6، 0.33؛ HCl، 8.4؛ كاكل2(ح2س)2، 0.3؛ إلى أنبوب الهضم.
- ضبط على درجة الحموضة 7 مع 1 م هيدروكسيد الصوديوم، إذا لزم الأمر. احتضان في 37 درجة مئوية و 100 لفة في الدقيقة. جمع عينة 2 مل (S3).
6-قدرة الاستعمار البكتيرية في المختبر العبور الجهاز الهضمي الشروط التالية
- الطرد المركزي 2 مل هضم الأمعاء، لمدة 10 دقائق في س 2,650 ز.
- إزالة المادة طافية ومزيج بيليه البكتيرية مع 5 مل دميم المكملة دون المضادات الحيوية وفطري.
- وصمة عار وقياس سليمة أو تلف الخلايا باستخدام سيتوميتير تدفق (انظر الجدول للمواد)، كما وصفها هرنانديز-سانابريا et al. (2017) 11.
- ضبط كثافة الخلية إلى 105 صالحة خلايا/مل بتمييع في دميم المكملة دون المضادات الحيوية وفطري.
- إزالة المتوسطة قمي للنظام ترانسويل وإضافة 1.5 مل تعليق البكتيرية. شارك ثقافة نظام ح 2 تحت ظروف الثقافة العامة الخلية (37 درجة مئوية، ورطوبة 95%، 5% CO2).
ملاحظة: يمكن توسيع هذا الوقت تصل إلى 48 ساعة، اعتماداً على بروتوكول تجريبي المطلوب. يمكن الحفاظ على ثقافة المشارك في حاضنة مختلفة عن اللغة المستخدمة للصيانة الروتينية الخلية، لتجنب التلوث. - قياس القيم طير بعد الحضانة، لتقييم سلامة الحاجز الظهارية كما هو موضح في 4.11.
- فور الانتهاء من وقت الحضانة، قم بإزالة الوسائط قمي، وجمع 0.5 مل لمزيد من التحليلات (S4). عينة فرعية من وسائل الإعلام يمكن أن تستخدمها لتقييم سلامة خلية التحليل "نازعة لاكتات" (رابطة حقوق الإنسان) (انظر الجدول للمواد)، اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- إضافة 0.5 مل من 10 مم ن-أسيتيل في حبس (NAC-المخزن المؤقت) لجعل المخاط التي تنتجها HT29-MTX واستعادة البكتيريا التقيد بها. احتضان اللوحات في 37 درجة مئوية ح 1، تحت التحريض (135 لفة في الدقيقة، انظر الجدول للمواد).
- استرداد NAC-حبس في أنبوب ميكروسينتريفوجي (S5) وتغسل مرتين الخلايا مع 1 مل دببس.
- إضافة 0.5 مل من 0.5% X-100 تريتون (w/v) على رأس مونولاييرس، تعطيل الخلايا عن طريق بيبيتينج، واسترداد السائل ودوامه للحد الأدنى 1 السرعة أمر حاسم لتجنب إتلاف الخلايا البكتيرية مع مواد التنظيف.
- الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 2,650 س ز، وفصل المادة طافية (S6) وبيليه (S7).
7-عينة التحليل
ملاحظة: تحليل العينات التي تم جمعها (S1-S7) لتقييم جدوى البكتيرية والالتصاق المحتملة للخلايا المعوية، عقب محاكاة هضم المعدية معوية.
- بقاء البكتيرية: تمرير العينات S1-S5 مرتين عن طريق 0.45 ميكرومتر والتحديد الكمي للخلايا البكتيرية باستخدام خلية يعيش الميت تلطيخ والتدفق الخلوي، كما هو مبين في الخطوة 2.811.
-
التصاق المحتملة: إعداد تخفيف المسلسل (-1 إلى-8) ل S1-S6 ومتتالية 10 ميليلتر في أجار الدم وتعديل لوحات بهي. احتضان عند 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية ل h. 24 – 48 لوحة نفس الحجم من S7 غير مخفف.
- تحديد تصنيفية للبكتيريا التقيد بها:
- اختيار المستعمرات الفردية مع حلقة ثقافة وريسوسبيند كل منها على 10 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس. جمع 4 ميليلتر من هذا التعليق واستخدامه كقالب للتضخيم PCR الجينات الرنا الريباسي 16S باستخدام أجهزة الإشعال والشروط الموضحة في 2.7.1.
- إجراء تسلسل البروتوكول في 2.7.3 بعد، والتحقق من صحة تسلسل استخدام الإجراء المدرجة في 2.7.4.
- تحديد تصنيفية للبكتيريا التقيد بها:
- القيام بمزيد من التحليل المصب مثل مجموع استخراج الحمض النووي، قبكر القياس الكمي و/أو 16S الرنا الريباسي أمبليكون تسلسل واستخراج الحمض النووي الريبي وترانسكريبتوميك التنميط حسب الرغبة.
ملاحظة: أنجز التدفق الخلوي الكمي فورا بعد أخذ العينات. واستخدمت كعنصر تحكم لخلايا غشاء بيرميبيليزيد، عينة يتعرض إلى 70 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. تم تقييم الضوضاء الخلفية بقياس التدفق الخلوي مع سوائل الهضم أو العينات التي تم الحصول عليها من نموذج ثقافة الخلية دون البكتيريا. وتم قياس كل عينة في ثلاث نسخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذا البروتوكول يؤدي إلى توليد نموذج مناسب لتوضيح بالبقاء على قيد الحياة وبقاء البكتيريا عن طريق الفم يتعرضن لظروف محاكاة العبور الجهاز الهضمي. تهم خلايا سليمة من السلالات الفردية هو ما يقرب من 108 خلايا مل-1 قبل قيام المجتمع الاصطناعية، بينما مصغراً المنصبة الواردة أعلاه 90% خلايا قابلة للحياة أثناء إنشاء (المجتمع الشكل 1A و 1B). استناداً إلى التقدير الكمي لايف/الميت، يقلل بقاء البكتيرية بعد كل خطوة من خطوات عملية الهضم (الشكل 2). يمكن أن يكون هذا نتيجة للأس الهيدروجيني الحمضية أثناء مرور المعدة والأملاح الصفراوية الواردة في سوائل الهضم في الأمعاء، كالتي تحدث في ظل الظروف الفسيولوجية. البقاء أثناء عبورها على حد سواء في المختبر و في فيفو الهضم المعدية المعوية قد تعتمد على التغيرات في البيئة (مثل تغذية مقابل صام الشروط)، أو حتى على عمليات حماية البكتيريا (بوغ تشكيل أو طلاء المعوي).
تدفق سيتوميتريك التهم يجب مقارنة مع ضوابط مناسبة، مثل البكتيريا قتلت الحرارة أو عينات الخلفية، لأداء الخلية قادرة على البقاء دقيقة التحديد الكمي18. يمكن التبديل الظروف القاسية لهضم المعدة والأمعاء البكتيريا لخلايا قابلة للحياة ولكن غير كولتورابل، وهي البكتيريا الحية التي لا تنمو أو تقسيم. ولهذا السبب، التهم لوحة تختلف عن عدد خلايا قابلة للحياة التي تم الحصول عليها مع التدفق الخلوي. على سبيل المثال، في الشكل 3، خلايا قابلة للحياة المستردة من واجهة المخاطية هي الملونة باللون الأزرق في مؤامرة التدفق الخلوي. ومع ذلك، لوحظ أي نمو عندما كانت هذه العينات مخاط مطلي (النتائج لا تظهر).
هو الكسر الذي تظهر البكتيريا معدلات البقاء أعلى الحطام الخلوية (S7)، كما كشفت عن طريق لوحة العد (الشكل 4). عدد المستعمرات قد يكون المتغير، ولكن تم العثور على وجود البكتيريا النشط أيضي في عينات المخفف أقل.
الشكل 1: خلية بقاء البكتيريا يؤلف المجتمع الميكروبي المنصبة في بداية الهضم الجهاز الهضمي في المختبر . (أ) عدد خلايا قابلة للتطبيق (سجل الوحدات) كمياً بالعيش الموت تلطيخ والتدفق الخلوي (المتوسط ± الانحراف المعياري، n = 3). (ب) ارسم الخلوي تدفق الممثل المجتمع الميكروبي المنصبة بعد 48 ساعة ثقافة المشتركة. ونقاط في تمثل خضراء وحمراء وسوداء قابلة للاستمرار، والتآلف والخلفية أو بكتيريا غير المصنفة، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: خلية بقاء البكتيريا بعد محاكاة الهضم المعوية. أشرطة تمثل عدد خلايا قابلة للحياة (سجل الوحدات) بعد الخطوات الصغيرة عن طريق الفم والمعدة من الهضم المعوية (المتوسط ± الانحراف المعياري، n = 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: ارسم الممثل للخلايا البكتيرية قابلة للتطبيق في الطور البيني المخاطية. النقاط الحمراء تمثل النقاط الخلفية والأزرق خلايا قابلة للحياة. تم إنشاء ظروف التدفق الخلوي استناداً إلى الدعائم et al. (2016) 19-عينات مخاطية المخفف 1: 100 (v/v) والملون مع "يوديد" Propidium الأخضر/سيبر لمدة 15 دقيقة، وتم قياس 100 ميكروليتر من عينة في FL1: 533/30 نانومتر، FL2: 585/40 نانومتر، FL3: > 670 نانومتر طويلة تمرير، و FL4: 675/25 شمال البحر الأبيض المتوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: مستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي) زاد من الحطام الخلوية في تعديل لوحات بهي. استخدمت ثلاثة replicates البيولوجية للمقايسة التصاق البكتيريا وأجريت ثلاثة replicates التقني للتحديد الكمي زيمبابوي. لوحات تكرار اثنين يتضمن-1 إلى-6 تخفيف الحطام خلية (S7) ترد في الشكل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| خلية ثقافة | ملتصقة/تعليق | استزراع المتوسطة | المكملات الغذائية العامة | ملاحق خاصة | مضاعفة الوقت | شروط الحضانة |
| كربونات الكالسيوم-2 (اكاكك 86010202) | ملتصقة | تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) مع الجلوكوز 4.5 غرام/لتر | إبطال المصل البقري الجنين (10% v/v) البنسلين (100 U/mL) * ستربتوميسين (0.1 مغ/مل) * الامفوتريسين (0.0025 ميلغرام/mL) * |
جلوتاماكس (4 ملم) الأحماض غير الأساسية (1% v/v) بيروفات (1 ملم) |
65 – 72 ح | 95% والرطوبة ونسبة 10% CO2 حاضنة2 CO (انظر الجدول للمواد) |
| HT29-MTX (اكاكك 12040401) | ملتصقة | حبيس (1 ملم) | ح 20 – 24 | |||
| * المضادات الحيوية والأنواع أزيلت من وسائط الثقافة الخلية 2 أيام قبل البدء فحوصات. | ||||||
الجدول 1: وصف لتكوين خلية خطوط ووسائل الإعلام لصون ثقافة الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ميكروبيومي عن طريق الفم عنصر أساسي في صحة الإنسان عنها مؤخرا في عدة المؤلفين20،21. تشير النتائج السابقة إلى أن ابتلاع اللعاب التي تحتوي على كميات كبيرة من البكتيريا يمكن أن تؤثر على النظام الإيكولوجي للميكروبات من الأمعاء الدقيقة، وواحد من المواقع الرئيسية فتيلة محصنة. تركيبة نموذج ثابت الهضم الجهاز الهضمي العلوي مع واجهة المضيف ممثلة بالخلايا الظهارية وإفراز مخاط الأمعاء، خدم لكشف تأثير العنصر الميكروبية على المضيف.
نماذج في المختبر هي الأدوات الأساسية للبحث، مما يسمح لإجراء الدراسات الميكانيكية وتحقيق المعرفة الخلفية التي ترمي إلى الحد من، وجعل الهدف أكثر كفاءة، وأفضل في فيفو الدراسات. ولهذا السبب، من المهم لضمان النقاء والبقاء والنمو الأمثل للثقافات أكسينيك قبل إنشاء الجماعة الميكروبية الاصطناعية. من المستحسن تقييم الجدوى وتكوين المجتمعات البكتيرية قبل التعرض للثقافات الخلية، تجنب التحيز في التحليل. قد تعوق الانضمام عدد كبير من البكتيريا التالفة وكذلك تؤثر على سلامة نموذج الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، سيتم تصغير استخدام مصدر trustable خطوط الخلية الخلية خط عدم التعرف، والتلوث، والشرح الفقراء، تعزيز إمكانية تكرار نتائج تجريبية22.
بما في ذلك الخلايا المنتجة للمخاط يمكن تشابه إلى الأمعاء الدقيقة، المخاط وموكنيس توفر خط الدفاع الأول ل الجهاز الهضمي23. وباﻹضافة إلى ذلك، الطبقة المخاطية مناسبة للاستعمار الجرثومي، مما يسمح للنقل الثنائية المتميزة من نواتج الأيض البكتيرية. وعلاوة على ذلك، محاكاة ظروف الجهاز الهضمي زيادة قدرة التصاق سلالات باراكاسي اكتوباكيللوس لكربونات الكالسيوم-2 والميوسين24، دعم أهمية إدماج عمليات الجهاز الهضمي في نموذجنا.
ويمكن إدخال المزيد من التحسينات في النموذج لإدماج عنصر المضيف المناعية، كما استعرضت سابقا25. ومع ذلك، لم تستخدم نظم الثقافة المشتركة الحالية للخلايا الظهارية ومحصنة للميكروبات والمضيف التفاعل التطبيقات (مثل، التقييم من المركبات الغذائية النشطة بيولوجيا أو البروبيوتيك)، مما قد يدل على أن تلك الأنظمة قد تفتقر إلى إمكانية تكرار نتائج25.
تقييم البحوث السابقة مع كربونات الكالسيوم-2، HT29-MTX أو الثقافات المشارك الالتصاق للكائنات الحية المجهرية أو السلالات المسببة للأمراض لخلايا الثدييات26،27. باستخدام واحدة من البقع أو الجمعيات الكائنات الدقيقة القليلة قد توفر نظرة محدودة على المضيف-الميكروب التفاعلات، وأنها ليست ممثلة للطابع المعقد للجهاز الهضمي البشري. على الرغم من أن استخدام المجتمعات الميكروبية الطبيعية يمكن أن يكون أكثر تمثيلاً للسيناريو في فيفو ، أنها صعبة لتميز ودراسة. وفي المقابل، يقدم منهجيتنا الفرصة لتقييم التفاعلات بين الميكروبات والمضيف متعددة، باستخدام نموذج مصغر المعقدة والممثل. يسمح استخدام مجتمع الميكروبية الاصطناعية المعرفة لتوليد نظام مع تقليل التعقيد28. التغيرات في المجتمع يمكن أن يكون نتيجة لظروف ميكرونفيرونمينتال في السياق التجارب الفردية. وهكذا، العنصر الميكروبية لهذا النموذج يمكن بسهولة توسيع نطاق أعلى أو لأسفل لتفكيك أثر البيئة كقوة انتقائية. وأخيراً، إمكانية أخذ العينات يضمن كذلك توصيف الأنشطة الوظيفية للخلايا البشرية والمجتمع الميكروبي المرتبطة بها.
في السنوات الماضية، وضعت في المختبر نماذج جديدة تستند إلى التكنولوجيا أورجانويد. أورجانويدس هي الثقافات الخلية ثلاثية الأبعاد التي تتضمن بعض الملامح الرئيسية للنسيج الأساسي ممثلة. وعلى الرغم من أورجانويدس المعوية نظام قرب فسيولوجية لدراسة الخلايا الجذعية البالغة والأنسجة، مثل هذا النموذج أيضا على بعض القيود. أورجانويدس المعوية محدودة الاستخدام في تشبه ردود تحريضية للإصابة أو المخدرات، كما أنها تفتقر إلى الخلايا المناعية. بالإضافة إلى ذلك، أورجانويدس غير متجانسة بشأن جدوى والحجم والشكل، وإعاقة فحص النمط الظاهري والتقديم توحيد المعقدة. الحد خطوط الخلايا مخلدة في المختبر وضع نماذج من الأنسجة السليمة، وعلى الرغم من مزايا استخدام خطوط الخلية تتسم جيدة ومستقرة أيضا كالتكرار، وإمكانية تكرار نتائج، والتكلفة المنخفضة. تسمح هذه المزايا للفحص المتزامن لعدة شروط، ولكن استخدام متعدية الجنسيات من البيانات المثيرة للجدل. الخلايا الأولية قد تكون أكثر تمثيلاً في فيفو علم وظائف الأعضاء؛ بيد أنهم قد تقلب بين فردية عالية ولا تتسم تماما وهي غير متجانسة ويكون محدود الفترة الزمنية. هذه العوامل هي عيب بما في ذلك شروط متعددة أو يتطابق في فحص واحد.
كما تجمع بين خطوط الخلايا مع المجتمعات الميكروبية المعقدة قد تمثل تحديا، وركزنا على تطوير نموذج قابل للتكرار واستنساخه بالمرونة العالية وإمكانية تطبيقها في المختبرات بالمعدات الأساسية من الخلية، وحتى أكثر تمثيلاً وأصبحت النماذج المتاحة وكذلك تتميز. ونحن قد تقييم الأداء الوظيفي لمختلف الطوائف البكتيرية باستخدام هذه النماذج مولتيكومبارتمينت، على سبيل المثال، لتقييم سلوك الكائنات الحية المجهرية في الجهاز الهضمي العلوي وأثر إكسينوبيوتيك المتميزة على واجهة القناة الهضمية. وبالتالي، نقترح هذا النموذج كقاعدة لفحوصات إضافية مع مجموعة متنوعة واسعة من البروبيوتيك، والمخدرات، أو مركبات الغذاء، داخل النظم الإيكولوجية ذات الصلة والمحددة في المختبر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن
Acknowledgments
الكتاب الاعتراف بامتنان الدعم المالي من "مؤسسة البحوث فلاندرز" إلى مارتا كاﻻتايود أرويو (فو بعد الدكتوراه زمالة-12N2815N). وأيما هرنانديز-سانابريا زميل ما بعد الدكتوراه تدعمها فلاندرز الابتكار وروح المبادرة (أجينتشاب voor إينوفاتي الباب ويتينشاب en تكنولوجي، IWT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| STRAINS | |||
| Aggregatibacter actinomycetemcomitans | American Type Culture Collection | ATCC 43718 | |
| Fusobacterium nucleatum | American Type Culture Collection | ATCC 10953 | |
| Porphyromonas gingivalis | American Type Culture Collection | ATCC 33277 | |
| Prevotella intermedia | American Type Culture Collection | ATCC 25611 | |
| Streptococcus mutans | American Type Culture Collection | ATCC 25175 | |
| Streptococcus sobrinus | American Type Culture Collection | ATCC 33478 | |
| Actinomyces viscosus | American Type Culture Collection | ATCC 15987 | |
| Streptococcus salivarius TOVE-R | |||
| Streptococcus mitis | American Type Culture Collection | ATCC 49456 | |
| Streptococcus sanguinis | BCCM/LMG Bacteria Collection | LMG 14657 | |
| Veillonella parvula | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures | DSM 2007 | |
| Streptococcus gordonii | American Type Culture Collection | ATCC 49818 | |
| CELL LINES | |||
| Caco-2 cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 86010202 | |
| HT29-MTX cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 12040401 | |
| REAGENTS AND CONSUMABLES | |||
| Brain Heart Infusion (BHI) broth | Oxoid | CM1135 | |
| Blood Agar 2 | Oxoid | CM0055 | Blood Agar medium |
| Menadione | Sigma | M9429 | |
| Hemin | Sigma | H9039 | |
| 5% sterile defibrinated horse blood | E&O Laboratories Ltd, | P030 | |
| InnuPREP PCRpure Kit | Analytik Jena | 845-KS-5010250 | PCR purification kit |
| Big Dye | Applied Biosystems | 4337454 | Dye for sequencing |
| ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337456 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile | VWR | 734-2311 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Trypan Blue solution 0.4%, liquid, sterile-filtered |
Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate | Life technologies | 31966-047 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3450-24EA | |
| Mucin from porcine stomach Type II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| Inactivated fetal bovine serum | Greiner Bio One | 758093 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Triton X 100 for molecular biology | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DPBS without calcium, magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm | Corning Costar Corp | 3450 | |
| Nuclease-free water | Serva Electrophoresis | 28539010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Neubauer counting chamber improved | Carl Roth | T729.1 | |
| BD Accuri C6 Flow cytometer | BD Biosciences | 653118 | |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | MoBio | 13155 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 186-1096 | |
| Flush system | Custom made | - | |
| InnOva 4080 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | 8261-30-1007 | Shaker for 2.10 |
| Memmert CO2 incubator | Memmert GmbH & Co. | ICO150med | |
| Millicell ERS (Electrical Resistance System) | EMD Millipore, Merck KGaA | MERS00002 | |
| Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system | Millipore, Merck KGaA | - | |
| Shaker (ROCKER 3D basic) | IKA | 4000000 | Shaker for 6.10 |
References
- Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biology. 14, e1002533 (2016).
- Kelly, D., King, T., Aminov, R. Importance of microbial colonization of the gut in early life to the development of immunity. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. , 58-69 (2007).
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5721-5732 (2005).
- Marsh, P. D., Head, D. A., Devine, D. A. Dental plaque as a biofilm and a microbial community-Implications for treatment. Journal of Oral Biosciences. 57, 185-191 (2015).
- Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Cugini, M. A., Smith, C., Kent, R. L. Microbial complexes in subgingival plaque. Journal of Clinical Periodontology. 25, 134-144 (1998).
- Haffajee, A. D., et al. Subgingival microbiota in healthy, well-maintained elder and periodontitis subjects. Journal of Clinical Periodontology. 25, 346-353 (1998).
- Venema, K. Microbial metabolites produced by the colonic microbiota as drivers for immunomodulation in the host. The FASEB Journal. 27, (2013).
- Marzorati, M., et al. The HMI (TM) module: A new tool to study the Host-Microbiota Interaction in the human gastrointestinal tract in vitro. BMC Microbiology. 14, 133 (2014).
- Tanzer, J. M., Kurasz, A. B., Clive, J. Competitive displacement of mutans streptococci and inhibition of tooth-decay by Streptococcus-Salivarius Tove-R. Infection and Immunity. 48, 44-50 (1985).
- Slomka, V., et al. Nutritional stimulation of commensal oral bacteria suppresses pathogens: the prebiotic concept. Journal of Clinical Periodontology. 44, 344-352 (2017).
- Hernandez-Sanabria, E., et al. In vitro increased respiratory activity of selected oral bacteria may explain competitive and collaborative interactions in the oral microbiome. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 235 (2017).
- Alvarez, G., Gonzalez, M., Isabal, S., Blanc, V., Leon, R. Method to quantify live and dead cells in multi-species oral biofilm by real-time PCR with propidium monoazide. AMB Express. 3, (2013).
- Ehsani, E., et al. Initial evenness determines diversity and cell density dynamics in synthetic microbial ecosystems. Scientific Reports. 8, 340 (2018).
- Hernandez-Sanabria, E., et al. Correlation of particular bacterial PCR-denaturing gradient gel electrophoresis patterns with bovine ruminal fermentation parameters and feed efficiency traits. Applied and Environmental Microbiology. 76, 6338-6350 (2010).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2, 2276-2284 (2007).
- Calatayud, M., Velez, D., Devesa, V. Metabolism of inorganic arsenic in intestinal epithelial cell lines. Chemical Research in Toxicology. 25, 2402-2411 (2012).
- Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food - an international consensus. Food & Function. 5, 1113-1124 (2014).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73, 3283-3290 (2007).
- Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7, 1376-1385 (2016).
- Yamashita, Y., Takeshita, T. The oral microbiome and human health. Journal of Oral Science. 59, 201-206 (2017).
- Wade, W. G. The oral microbiome in health and disease. Pharmacological Research. 69, 137-143 (2013).
- Yu, M., et al. A resource for cell line authentication, annotation and quality control. Nature. 520, 307 (2015).
- Pelaseyed, T., et al. The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system. Immunological Reviews. 260, 8-20 (2014).
- Bengoa, A. A., et al. Simulated gastrointestinal conditions increase adhesion ability of Lactobacillus paracasei strains isolated from kefir to Caco-2 cells and mucin. Food Research International. 103, 462-467 (2018).
- Kleiveland, C. R., et al. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. Verhoeckx, K., et al. , Springer International Publishing. 197-205 (2015).
- Laparra, J. M., Sanz, Y. Comparison of in vitro models to study bacterial adhesion to the intestinal epithelium. Letters in Applied Microbiology. 49, 695-701 (2009).
- Gagnon, M., Berner, A. Z., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. Journal of Microbiological Methods. 94, 274-279 (2013).
- Großkopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Current Opinion in Microbiology. 18, 72-77 (2014).
