Summary
창 자 미생물 호스트 상호 작용은 합성 구두 커뮤니티, 생체 외에서 위장 소화, 그리고 소장 상피의 모델을 결합 하 여 새로운 접근 방식을 사용 하 여 평가 됐다. 우리 세포 침입 병원 체와 다중 종 biofilms의 평가 또는 테스트 probiotic 정립 생존 적응 될 수 있는 방법 제시.
Abstract
호스트와 microbiota 사이 상호 작용은 오랫동안 인식 하 고 광범위 하 게 설명. 입 주민 microbiota 발생 하 고 외 인 박테리아에 의해 식민을 방지, 위장의 다른 섹션와 비슷합니다. 사실, 구강에서 발견 되는 박테리아의 600 이상 종 그리고 하나의 개별 약 100 다른 언제 든 지가지고 있습니다. 구강 박테리아 상주 미생물 지역 사회, 및 호의 보이는 성장 및 생존 통합 되 고 따라서 구강 생태계에서 다양 한 틈새에 고착 하는 기능을가지고 있습니다. 그러나, 삼 키는 동안 창 자에 박테리아의 흐름은 본질적인 microbiota의 균형을 방해 제시 되었다. 사실, P. gingivalis 의 구강 관리 ileal microflora에 세균성 구성 이동. 우리 사용 합성 커뮤니티 자연 구두 생태계의 단순화 표현으로 생존 및 시뮬레이션 된 위장 운송 조건을 복종 구강 박테리아의 생존 능력을 명료 하 게. 14 종 선택, 하 체 외에 타 액, 위, 장 소화 프로세스를 받게 되었고 Caco-2와 HT29 MTX 시뮬레이션 창 자 점 막 상피 세포를 포함 하는 multicompartment 세포 모델을 제시. 이 모델 장 순환에 관련 된 세포에 삼 킨된 박테리아의 영향을 해명 하기 제공. 가상 커뮤니티를 사용 하 여 제어 및 재현성에 대 한 수 있습니다. 따라서,이 방법론 병원 체 생존 능력 및 염증 관련 된 변경, probiotic 혼합물의 식민 용량 평가에 적용할 수 있습니다 그리고 궁극적으로, 잠재적인 박테리아 presystemic 순환에 영향을 미치는.
Introduction
인간은 인간 세포1와 동일한 수에 존재 하는 박테리아와 함께 동서. 따라서, 그것은 중요 한의 인간의 미생물에 대 한 포괄적인 이해를 얻기 위해 중요 한입니다. 그것은 나누어 여러 작은 서식 지, 따라서 박테리아와 그 다른 위치에 biofilms의 큰 다양성을 포함 하는 구강 독특한 환경입니다. 오픈 생태계를 되 고, 입에서 일부 수 종은 일시적인 방문자 수 있습니다. 그러나, 특정 미생물 식민지 탄생과 형태 구성 biofilms2후에 빨리. 이들은 gingival 틈새, subgingival 틈새, 혀, 점 막 표면 및 치과 보 철 및 충전 재3위에 치아 표면에서 발견 된다. 박테리아로 flocs 치아 운하의 루멘에 있는 planktonic 세포 괴 사 성 펄프 조직 개 및 액체 단계에서 중단에 있을 수 있습니다.
호스트 셀과 주민 microbiota4간의 활성화, 지속적인 간 이야기가 있다. 박테리아 통신 시간과 사이 종, 그리고 다른 박테리아 이러한 기본 colonizers에 연결 하는 동안 자연 식민지 개척자의 작은 비율만 조직에 고착 할 수 있다. 예를 들어, 미생물 간의-셀 바인딩 구두 biofilms에 보조 식민지 개척자를 통합 하 고 상호 작용 미생물 세포4의 복잡 한 네트워크 구축에 대 한 키입니다. 약 타 액 샘플에서 박테리아의 70%는 Porphyromonas sp., 연쇄 상 구 균 sp., Prevotella sp., Veillonella sp., 그리고 알 수 없는 Bacteroidetes에 의해 형성 된다. F. nucleatum subgingival biofilm에 늦은 colonizers P. gingivalis, T. denticola, 및 Tannerella 개나리, 염5연루와 집계는 중간 식민지 개척자입니다. 또한, 연쇄 상 구 균 mitis S. sanguinis 그리고 S. gordonii 치아3식민지 선호 점 막 및 치과 서식 지를 차지 합니다. 따라서, S. sanguinis 이다 더 낮은 앞 니와 송곳에 동안放 naeslundii 위 anteriors6에서 발견 되었습니다.
더하여, 토착 미생물2인간의 건강 유지 하는 역할을 재생 합니다. 주민 microbiota 참여 면역 교육에서 및 병원 체 확장을 방지 합니다. 이 식민 저항 표면에 부착에 적응 그리고 더 효율적으로 성장에 대 한 사용할 수 있는 영양분을 metabolising 네이티브 박테리아 더 있을 수 있습니다 때문에 발생 합니다. Probiotic 긴장 살아남을 위장 통과 하 고 활성 상태로 유지, 위장의 위 위치에서 삼 autochthonous 박테리아의 지 속성 없는 완전히 설명 하고있다. 따라서, 우리 시뮬레이션 된 위장 운송 조건 인공 커뮤니티, 대표 구두 생태계의 대상이. 세균성 세포의 생존 능력은 창 자 상피를 닮은 multicompartment 모델을 사용 하 여 평가 했다. 현재 창 시뮬레이터 luminal 미생물 커뮤니티7의 분석 측면에서 적합 한 재현성을 제공합니다. 그러나, 세균성 접착 및 호스트 미생물 상호 작용은 별도로 해결,8도전 미생물 지역 사회와 세포를 결합 하는으로. 반면, 우리는 성공적인 식민 이벤트 창 인터페이스에 보고의 잠재적인 기계 설명을 제공 하는 프레임 워크를 제시. 실제로,이 모델 사용할 수 있습니다 공동으로 정적 용기 모델 호스트 표면 신호에 미생물 커뮤니티의 영향을 평가 하기 위해.
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Protocol
1. 긴장 조건 문화
참고: 합성 구두 지역 사회는 일반적으로 구강 미생물3에 있는 긴장에 의해 구성 되었다.
- 미국 유형 문화 수집 (ATCC)에서 다음 종자를 얻기: Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611), 연쇄 상 구 균 mutans (ATCC 25175), 연쇄 상 구 균 sobrinus (ATCC 33478),放 naeslundii (ATCC 51655), 연쇄 상 구 균 gordonii (ATCC 49818),放 viscosus (ATCC 15987), 그리고 연쇄 상 구 균 mitis (ATCC 49456).
- 미생물의 라이프니츠 연구소 DSMZ-독일어 컬렉션 및 세포 배양 (DSM 2007), BCCM/LMG 박테리아 컬렉션 (LMG 14657)에서 구 sanguinis 에서 Veillonella parvula 취득 및 사용 연쇄 상 구 균 salivarius 변형 TOVE R9, 그리고 연쇄 상 구 균 oralis10.
2. 개발 구강 미생물의 Multispecies 커뮤니티 담당자의
참고: 생체 외에서 창 자 상피에 구강 박테리아의 잠재적인 접착 능력을 시뮬레이션 하기 위해 합성 커뮤니티를 생성 합니다. 혈액 한 천 배지 에르난데스 Sanabria 외 에 설명 된 대로 5 μ g/mL hemin와 1 μ g/mL menadione, 5% 살 균 defibrinated 말 혈액 보충에 박테리아를 성장 (2017) 11. 간단히:
- 100mg 2 ml의 1 M NaOH hemin의 분해, 압력가 증류수 100 mL를 추가 합니다. 어두운 컨테이너에 저장 합니다. 0.22 μ m 필터를 통해 매체를 추가 하기 전에 소독.
- 100mg menadione 96% 에탄올 20 mL에 용 해. 0.22 μ m 필터를 통해 매체를 추가 하기 전에 소독.
- 혈액 한 천 매체의 1 리터를 준비 ( 재료의 표참조) 제조 업체의 지침 및 오토 클레이 브. 말 피와 보충 추가 하기 전에 식힙니다. 혼합 하 고 접시를 붓는 다.
- 이전에 보고 된12수정된 두뇌 심 혼 주입 (BHI) 국물을 준비 합니다. 압력가 마로 소독 후 hemin의 5 μ g/mL와 menadione의 1 μ g/mL를 추가 합니다.
- Hungate 튜브에 매체의 9 mL를 분배 하 고 고무 마 개, 알루미늄 캡으로 닫습니다. N2/CO2 (90% / 10%)와 튜브를 플러시.
- 혐 기성 매체의 1 mL 주사기로 검색 하 고 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에. 각 세균성 종에의 한 식민지를 선택 하 고, 매체에서 resuspend 혐 기성 수정 된 BHI에 다시 전달. S. salivarius, 24 h에 대 한 인 큐베이 팅 해야 합니다을 제외 하 고 37 ° C에서 48 h에 품 어.
-
필요한 경우 가상 커뮤니티를 조립 하기 전에 문화의 순도 확인 합니다. 간단히:
- 에르난데스-Sanabria 외 에서 액체 문화에서 DNA를 추출 (2010 년) 13 16S rRNA 유전자는 뇌관을 사용 하 여 증폭 27F (AGAGTTTGATYMTGGCTCAG) 및 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACT), 및 다음 프로그램: 95 ° C에서 5 분, 1 분 동안 95 ° C의 30 주기 55 ° C 1 분 1.5 분 동안 72 ° C 다음 최종 확장 단계 72 ° c.에 5 분의
- 상업으로 PCR 제품을 정화 키트 ( 재료의 표참조), 제조업체의 지침에 따라.
- 10 μ 총 볼륨의 0.5 μ를 포함 된 정제 제품의 시퀀싱 반응 수행 ( 재료의 표참조), M13f 뇌관 (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC), 시퀀싱 버퍼, x 5와 20의 2.0 μ의 3.2 pmol 염색 ng 서식 파일의 사용 하는 상업적인 시퀀싱 시스템 키트 ( 재료의 표참조).
참고:이 절차를 상업적으로 실행 했습니다. - 모든 시퀀스 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 결정 하는 가장 가까운 알려진된 taxon 고 RDP 분류자 온라인 도구 (http://rdp.cme.msu.edu/)는 시 나를 사용 하 여 원래 긴장의 순서와 비교에서 폭발 검색을 수행 맞춤 서비스 (https://www.arb-silva.de/aligner/)입니다.
- 에르난데스 Sanabria 외 에 설명 된 대로 cytometry 및 SYBR 녹색/Propidium 요오드 화물 얼룩을 사용 하 여 외피의 끝에 휴대폰 번호를 측정 (2017) 11. 문화-1105 셀 mL를 희석, BHI 수정 사용 하 여.
- 혐 기성 BHI의 75 mL로 S. mitis 의 1 mL을 추가 하 고 고정 단계 (6 h)까지 품 어. 다음, 각 희석 긴장과 혐 기성 조건 하에서 혼합의 0.75 mL 수집 합니다.
- 일단 모든 문화, 혼합 소 우주의 1 mL를 걸릴 고 BHI의 75 mL를 추가 합니다. 합성 커뮤니티 10% 이내를 품 어 CO2, 10% H2, 80% N2 48 h 37 ° C와 200 rpm ( 재료의 표참조).
- 2.8에서 세포 밀도 측정 합니다. 전에 셀 모델을 커뮤니티 제시. 사회의 구성 양적 실시간 PCR, 뇌관을 사용 하 여 및 어 닐 링 온도 Slomka 외 의 표 1에서와 평가 될 수 있다 (2017) 10. 또한, 16S rRNA 유전자 amplicon 시퀀싱을 사용 하 여 초기 회원 현재13,14에 정보를 제공. 어느 정체성 확인 프로토콜에 대 한 템플릿으로 cDNA를 사용 하 여 적극적으로 속기 단백질, 박테리아를 나타냅니다 하 고 템플렛으로 DNA를 사용 하 여 긴장의 존재/부재를 공개.
3. 일반 세포 배양 방법
주: 세포 배양의 일반적인 측면에 대 한 저자를 참조 마스터와 스테이 시 (2007 년)15. 유럽 컬렉션의 인증 셀 문화 (Caco-2 ECACC 86010202와 HT29-MTX-E12 ECACC 12040401, 공중 보건 영국, 영국)에서 사용 하는 셀 라인을 얻을. 세포 배양에 대 한 시 약을 구입할 수 있습니다 ( 테이블의 자료를 참조), 달리 지정 하지 않는 한.
-
유지 보수 및 Caco-2와 HT29 MTX 셀 라인 뿌리고
참고: Caco-2와 HT29 MTX 셀 25 cm2 조직 배양 플라스 크 포함 하는 보충된 DMEM 매체 (표 1) 정기적으로 성장 된다. 60-70% 합류에 도달할 때 셀 trypsinized 있습니다.- 플라스 크에서 세포 배양 매체를 제거 합니다. /Mg Ca ++++없이 PBS의 5 mL로 두 번 세척.
- 트립 신, 0.22 g/L 에틸렌 diamine tetraacetic 산 성 (EDTA)의 0.5 mg/L 해결책의 2 개 mL를 추가 합니다. 부드럽게 플라스 크를 이동 하 여 트립 신 솔루션을 배포 합니다. 1.5 mL의 트립 신 솔루션을 제거 하 고 10 분 동안 37 ° C에 플라스 크를 품 어.
- 세포를 플라스 크 표면에서 분리는 현미경 아래에서 확인 하십시오. 필요한 경우 추가 5 분 동안 품 어.
- 비활성화 된 트립 신을 플라스 크에 보충된 세포 배양의 5 mL를 추가 합니다. 균질 단일 셀 서 스 펜 션 여기저기를 피펫으로.
- 즉시, 50 µ L 셀 서 스 펜 션의 aliquot 고 Caco-2 셀에 대 한 1:1 (v/v) 비율 또는 1:5 v/v HT29-MTX에 대 한 살 균 0.4 %Trypan 블루 솔루션 혼합. 세 실로 pipetting와 부하에 의해 혼합 ( 재료의 표참조).
- 현미경 (흰색 밝은 셀) 가능한 셀의 개수 (제조 업체의 지침을 참조 하십시오).
- 씨앗 1 x 104 셀/cm2, 4 × 105 셀/c m2 의 조밀도에 새로운 플라스 크에서 Caco-2, HT29-MTX, 각각.
참고: (1) Caco-2 셀 차별화 하 고 꽉 접합 한 번 도달 하는 confluency를 형성 한다. 오버-confluency trypsinization 전에 피하기 위해 매우 중요 하다. 자라 난 플라스 크에 세포의 trypsinization 또는 셀 덩어리 후 셀 분리 실패를 일으킬 수 있습니다. (2) HT29-MTX 세포는 점액을 생산 높은 신진 대사 활동16셀. 셀은 높은 밀도에서 하는 경우에 특히 이러한 기능 세포 배양의 빠른 산성화를 일으킬 수 있습니다. HEPES buffer (표 1) 7과 7.2 사이 pH를 유지 하기 위해 세포 배양에 추가할 수 있습니다. PH가 떨어지면, 매체 수 50% 미만 이다 교환 때 confluency. 그러나, 만약 confluency > 50%, 셀 문화 분할 해야 합니다.
4. 창 자 미생물 호스트 인터페이스 시뮬레이션 Multicompartment 셀 모델의 조립
참고: 완료 스 더블 챔버 (직경 24mm, 기 공 크기 0.4 μ m; 참조 테이블의 재료) 공동 문화.
- 꼭대기 구획 및 2 mL에는 기저를 완전 한 세포 배양의 1.5 mL를 추가 합니다. 사전 시드 때 세포 현 탁 액의 분배를 20-30 분 동안 품 어.
- 섹션 3에에서 설명 된 대로 Caco-2와 HT29 MTX의 세포 배양을 trypsinize. Trypsinization 절차 덩어리 없이 단일 셀 정지에서 두 셀 라인의 균일 분배를 달성 하기 위해 정확 하 게 따라야 합니다.
- 3.1.8에 설명 된 대로 실행 가능한 세포를 계산.
- Caco-2/HT29-MTX 셀 90/10 비율에 104 셀/cm2 x 6.5에 셀 밀도 조정 합니다.
- 셀 정지 균질 하 고 보충된 셀 문화 미디어와 함께 미리 채워진 살 균 컨테이너 Caco-2와 HT29 MTX 셀의 해당 볼륨을 추가 합니다. 포부에 의해 챔버의 꼭대기 쪽에서 미리 incubated 미디어를 제거 합니다.
- 부드럽게 pipetting, 세포 현 탁 액을 혼합 하 고 챔버 삽입의 꼭대기 구획을 1.5 mL를 전송. 시드 절차 세포 현 탁 액의 일정 한 균질 세포 침전 하는 경향이 필요 합니다. 작업 속도 사용자의 경험에 따라 1-3 웰 스 분배 후 세포 현 탁 액을 혼합 해야 합니다.
- 접시 부드럽게 뒤로 및 앞으로 이동 하 고 다음 오른쪽 왼쪽 오른쪽 (5-10 배)를 더 우물에서 세포의 확산. 인큐베이터에 전송 및 플레이트의 움직임을 반복.
- Caco-2/HT29-MTX 셀의 공동 문화를 유지 15 일 동안 상쾌한 꼭대기와 기저 구획 보충된 DMEM와 매 2 일. 이 시간 후, 세포 배양은 항생제/antimycotic 솔루션 없이 보충된 DMEM을 변경할 수 있습니다.
- 20-21 일 후 매 2 일 매체를 새로 고쳐 시드까지 시스템을 유지 합니다.
-
분석 결과, 전기 저항 시스템을 사용 하 여 시작 하기 전에 상피 방 벽 완전성을 측정 (재료의 표 참조), 제조업체 지침에 따라.
- TEER 장비 완전히 충전 확인 (> 24 h) 측정을 시작 하기 전에.
- 전원 공급 장치 및 플라스틱 압력솥 가방 커버에서 TEER 장비를 분리 합니다. 전극을 소개 하 고 미터에 입력된 포트에 연결 하기 위해 가방에 구멍을 확인 합니다. 70% 에탄올/물 (v/v) 흐름 캐비닛으로 TEER 장비를 도입 하기 전에 살포.
- 전극 소독, 15 미 린스 미리 데워 진된 세포 배양에서 전극에 대 일 분 건조 공기를 허용에 대 한 70% 에탄올/물 (v/v) 솔루션에 전극 팁을 담가.
- 인큐베이터에서 세포 고 흐름 캐비닛 내부 실내 온도에 서 세포 허용.
- 미터는 충전기에서 분리 되 다는 것을 확인 하십시오. 옴을 차례 전원 스위치에 모드 스위치를 설정 합니다.
- 전극 삽입에 짧은 팁 및 우물에서 더 이상 팁을 immersing 하 여 셀 저항을 측정 합니다. 플레이트 삽입을 90 ° 각도로 전극 유지.
5. 세균 생존 체 외에서 위장 운송 조건에 따라
참고: 시뮬레이션된 소화 준비 Minekus 외 의 프로토콜에 따라 체액 (2014) 17, 아래 설명 된 수정. 초순 수와 모든 희석을 준비 합니다. 0.22 μ m 필터를 통해 모든 솔루션 필터 소독 하 고 메 마른 조건 하에서 소화 절차를 수행 합니다.
-
구두 소화:
- 세균성 지역 사회의 3 mL 50 mL 무 균 튜브에 배치, 모의 타 액 유체 (SSF), (m m o l L-1)에 포함 된 3 mL와 혼합: KCl, 15.1; KH2포4, 3.7; NaHCO3, 6.8; MgCl2(H2O)6, 0.5, (NH4) 공동3, 0.06; HCl, 1.1; CaCl2(H2O)2, 0.75. 인간 침 유형 IX A를 SSF 돼지 위 유형 II에서에서 2 g/L mucin의 α-아 밀라 제 75 U/mL를 추가 합니다.
- 37 ° C, 및 100 rpm에서 2 분 동안 혼합물을 품 어. DNA 추출 및 흐름 cytometry 정량화 (S1) 2 mL 샘플을 수집 합니다.
-
위 소화:
- (M m o l L-1)에 포함 된 시뮬레이션된 위 액체 (SGF)의 4 개 mL를 추가: KCl, 6.9; KH2포4, 0.9; NaHCO3, 25; NaCl, 47.2; MgCl2(H2O)6, 0.1, (NH4) 공동3, 0.5; HCl, 15.6; CaCl2(H2O)2, 0.075. 또한,는 SGF 돼지 위 유형 II에서에서 mucin의 2 g/L를 포함 했다.
- PH를 측정 하 고 필요한 경우 3 1 M HCl로 pH를 조정 합니다. 37 ° C와 100 rpm에서 품 어. 2 mL 샘플 (S2)를 수집 합니다.
-
소장 소화:
- 시뮬레이션 된 장 (SIF) 포함 하는 액체 (mmol L-1)에서 4 개 mL를 추가: KCl, 6.8; KH2포4, 0.8; NaHCO3, 85; NaCl, 38.4; MgCl2(H2O)6, 0.33; HCl, 8.4; CaCl2(H2O)2, 0.3; 소화 관.
- 필요한 경우에 1 M NaOH로 pH 7 조정 합니다. 37 ° C와 100 rpm에서 품 어. 2 mL 샘플 (S3)를 수집 합니다.
6. 세균성 식민지 능력 생체 외에서 위장 운송 조건에 따라
- 2 mL의 소장 소화 2650 x g에서 10 분 원심
- 상쾌한을 제거 하 고 항생제와 antimycotic 없이 보충된 DMEM의 5 mL 세균 펠 릿 혼합.
- 얼룩 및 교류 cytometer를 사용 하 여 그대로/손상 된 세포를 계량 (참조 테이블의 자료), 헤 르 난 데스-Sanabria 외 에 설명 된 대로 (2017) 11.
- 항생제와 antimycotic 없이 보충된 DMEM에 희석 하 여 105 가능한 셀/mL로 세포 밀도 조정 합니다.
- Transwell 시스템의 꼭대기 매체를 제거 하 고 세균 현 탁 액의 1.5 mL를 추가 합니다. 공동 문화 일반 셀 문화 조건 (37 ° C, 습도 95%, 5% CO2)에서 2 시간에 대 한 시스템.
참고:이 시간까지 48 h, 필요한 실험 프로토콜에 따라 확장할 수 있습니다. 일상적인 셀 유지 관리를 위해 오염 방지 하는 데 사용 보다 다른 인큐베이터에서 공동 문화를 유지할 수 있습니다. - 4.11에 설명 된 대로 상피 방 벽의 무결성을 평가 하 부 화 후 TEER 값을 측정 합니다.
- 보육 시간, 완료 되 면 꼭대기 미디어를 제거 하 고 추가 분석 (S4) 0.5 mL를 수집 합니다. 미디어의 subsample 젖 산 효소 (LDH) 분석 결과 의해 세포 생존 능력의 평가에 사용할 수 있습니다 ( 테이블의 자료를 참조), 제조업체 지침에 따라.
- HBSS (NAC-버퍼) HT29-MTX를 제작한 점액을 solubilize 및 준수 박테리아 복구 하에서 10 mM N acetylcysteine의 0.5 mL를 추가 합니다. 동요에서 1 h 동안 37 ° C에서 번호판을 품 어 (135 rpm 재료의 표참조).
- Microcentrifuge 튜브 (S5)에서 NAC HBSS 복구 하 고 1 mL DPBS 셀 두 번 씻어.
- 0.5%의 0.5 mL을 추가 Triton X-100 (w/v) monolayers, 위에 pipetting으로 세포를 방해, 1 분 속도 세제와 세균성 세포의 손상을 방지 하려면 중요 한 액체와 소용돌이 복구.
- 2650 x g, 5 분에 대 한 셀을 원심 하 고 상쾌한 (S6)와 펠 릿 (S7).
7. 샘플 분석
참고: 분석 수집된 샘플 (S1-S7) 세균 생존 능력을 평가 하 고 잠재적인 시뮬레이션된 위장 소화 다음 창 자 세포에 접착.
- 세균성 생존: 0.45 μ m 통해 두 번 샘플 S1-s 5를 통과 하 고 계량 라이브/죽은 세포 얼룩을 사용 하 여 세균성 세포 단계 2.811에 표시 된 대로 cytometry, 흐름.
-
잠재적인 접착: 직렬 희석 (-1-8) S1-S6 준비 및 혈액 한 천에서 10 µ L 행진 및 BHI 접시를 수정. 24-48 h. 플레이트 undiluted S7의 같은 볼륨에 대 한 혐 기성 조건 하에서 37 ° C에서 품 어.
- 준수 박테리아의 분류학 식별:
- 문화 루프와 개별 식민지를 선택 하 고 각 nuclease 무료 물 10 µ L에 resuspend. 이 서 스 펜이 션의 4 µ L를 수집 하 고 뇌관 및 2.7.1에 설명 된 조건을 사용 하 여 16S rRNA 유전자의 PCR 증폭에 대 한 템플릿으로 사용.
- 2.7.3, 2.7.4에 포함 된 절차를 사용 하 여 시퀀스의 유효성 검사에서 프로토콜에 따라 시퀀싱을 수행 합니다.
- 준수 박테리아의 분류학 식별:
- 할 등 총 DNA 추출, 정량 정량화 그리고/또한 16S rRNA amplicon 시퀀싱, RNA 추출, 원하는 대로 프로 파일링 transcriptomic 다운스트림 분석 추가.
참고: 흐름 cytometry 정량화 샘플링 후 즉시 수행 되었다. 멤브레인 permeabilized 세포에 대 한 컨트롤, 3 분 동안 70 ° C에 노출 샘플 사용 되었다. 배경 잡음 소화 액체 또는 세균 없이 셀 문화 모델에서 얻은 샘플 cytometry로 측정 하 여 평가 되었다. 모든 샘플 3 중에서 측정 했다.
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Representative Results
이 프로토콜 elucidating 생존 및 시뮬레이션 된 위장 운송 조건을 복종 구강 박테리아의 생존에 적합 한 모델의 생성에 지도 한다. 개별 긴장에서 그대로 셀의 개수는 약 108 세포 mL-1 사전 커뮤니티 (의 설립 동안 실행 가능한 세포의 90% 이상 포함 된 multispecies 소 하면서 합성 공동체의 창조 그림 1A 및 1B). 라이브/죽은 부 량을 바탕으로, 세균 생존 능력 (그림 2) 각 소화 단계 후 감소 합니다. 이것의 위 통과 하는 동안 산 성 pH와 생리 적인 조건 하에서 발생으로 소장 소화 유체에 포함 된 담 즙 염의 결과 수 있습니다. 체 외에서 그리고 vivo에서 모두 위장 소화를 통해 운송 중 생존 환경 변화에 따라 달라질 수 있습니다 (예: 대 먹이 조건 금식), 또는 심지어 박테리아 보호 프로세스 (포자 형성 또는 장 용 코팅)입니다.
흐름 cytometric 조사 열 살해 박테리아 등 배경 샘플, 정확한 가능한 셀 부 량18을 수행 하기 위해 적합 한 컨트롤과 비교 해야 합니다. 위장과 소장 소화의 가혹한 조건 라이브 박테리아가 할 하지 성장 또는 분할 가능한 하지만 비 culturable 세포에 박테리아를 전환할 수 있습니다. 이러한 이유로, 접시 수 cytometry 취득 가능한 셀 계산에서 다. 예를 들어, 그림 3, 점 막 인터페이스에서 복구 가능한 셀 흐름 cytometry 플롯에 파란색에서 색깔은. 그러나, 성장이 이러한 점액 샘플 도금된 (결과 표시 되지 않음)를 했다 하는 때 관찰 되었다.
분수는 박테리아 더 높은 생존 율을 보여 세포질 파편 (S7), (그림 4)를 계산 하는 격판덮개에 의해 밝혀입니다. 식민지의 수 변수를 있을 수 있습니다 하지만 metabolically 활성 박테리아의 존재는 덜 희석된 샘플에서 발견 된다.
그림 1: 체 외에서 위장 소화의 시작 부분에 multispecies 미생물 커뮤니티를 구성 하는 박테리아의 세포. (A) 가능한 셀 수 (로그 단위) 라이브/죽음 얼룩이 지 고 교류 cytometry에 의해 계량 (평균 ± 표준 편차, n = 3). (B) 의 공동 문화 48 h 후 multispecies 미생물 커뮤니티의 대표적인 흐름 cytometry 줄거리. 녹색, 빨강, 그리고 검정 대표 가능한, 손상 및 배경 또는 박테리아 분류에서 각각 점. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 시뮬레이션된 위장 소화 후 박테리아의 생존 능력을 셀. 구강, 위, 작은 창 자의 소화 단계 후 가능한 셀 (로그 단위) 수를 나타내는 막대 (평균 ± 표준 편차, n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 가능한 세균 세포 막 interphase의 대표 작. 빨간 점을 배경 및 파란색 점을 가능한 셀을 나타냅니다. 교류 cytometry 상태 소품 외 에 따라 설립 되었다 (2016) 19. 점 막 샘플 희석된 1: 100 (v/v) 15 분, Sybr 녹색/Propidium 요오드 화물으로 얼룩진 고 FL1에서 샘플의 100 µ L를 측정 했다: 533/30 nm, FL2: 585/40 nm, FL3: > 670 nm 긴 패스, 그리고 FL4: 675/25 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 콜로 니 형성 단위 (CFU)에서 세포질 파편에서 성장 BHI 판 수정. 3 생물 복제 세균성 접착 시험을 위해 사용 되었다 고 CFU 정량화에 대 한 3 개의 기술 복제 수행 했다. 두 복제 접시-1-6 셀 파편 (S7)의 희석을 포함 하는 그림에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 세포 배양 | 부착 / 서 스 펜 션 | 매체를 경작 | 일반 보충제 | 특정 보충 교재 | 시간을 두 배로 | 부 화 조건 |
| Caco-2 (ECACC 86010202) | 점착 | Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 4.5 g/L 포도 당으로 | 소 태아 혈 청 (10 %v / v)를 비활성화 페니실린 (100 U/mL) * 스 (0.1 mg/mL) * 암포 (0.0025 mg/mL) * |
Glutamax (4 mM) 비 필수 aminoacids (1 %v / v) Pyruvate (1 mM) |
65-72 h | 95% 습도 10% CO2 CO2 배양 기 ( 재료의 표참조) |
| HT29-MTX (ECACC 12040401) | 점착 | HEPES (1 mM) | 20-24 h | |||
| * 항생제와 antifungals는 분석 실험을 시작 하기 전에 2 일 세포 배양에서 제거 되었습니다. | ||||||
표 1: 셀 문화 유지 보수에 대 한 셀 라인 및 미디어 구성의 설명입니다.
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Discussion
구강 미생물은 최근에 여러 작가20,21에서 보고 하는 인간의 건강에는 핵심 요소입니다. 이전 결과 큰 중 박테리아를 포함 하는 타 액의 섭취는 작은 창 자, 면역 못쓰게에 대 한 주요 사이트 중 하나입니다의 미생물 생태계 영향을 미칠 수 좋습니다. 호스트 인터페이스는 미생물에 구성 요소는 호스트의 영향을 해명 하기 봉사 장 상피 및 점액 분 비 세포에 의해 표현 정적 위 위장 소화 모델의 조합.
생체 외에서 모델 연구, 기계 론 적인 연구를 실시 하 고 배경 지식을 줄이기 위해, 의도 달성에 대 한 허용 더 효율적이 고 더 나은 대상 vivo에서 연구 위한 기본적인 도구입니다. 이러한 이유로, 그것은 순도, 생존 능력, 그리고 합성 미생물 지역 사회를 설치 하기 전에 axenic 문화의 최적의 성장을 위해 중요 한. 생존 능력 및 분석에 편견을 피하기 위해 셀 문화에 노출 하기 전에 세균 커뮤니티의 구성 하는 것이 좋습니다. 손상 된 박테리아의 높은 수 접착을 방해 하 고 더 셀 모델의 무결성에 영향을 줄 수 있습니다. 또한, 셀 라인의 trustable 소스를 사용 하 여 셀 라인 오인, 오염, 그리고 가난한 주석, 실험의 재현성22강화를 최소화 합니다.
점액과 mucins 제공 위장23의 첫 번째 방어 라인 점액 생성 세포를 포함 하 여 작은 창 자에 닮 았을 수 있습니다. 또한, 점 막 레이어 세균성 식민, 세균성 대사 산물의 특성화 양자 전송 허용 위해 적당 하다. 또한, 시뮬레이션된 위장 조건 Caco-2, mucin24, 우리의 모델에서 소화 프로세스 통합의 관련성을 지 원하는 유산 균 paracasei 긴장의 접착 능력을 증가.
모델에서 더 개선 이전 검토25면역 호스트 구성 요소를 통합 하 소개 될 수 있습니다. 그러나, 상피와 면역 세포의 현재 공동 문화 시스템 사용 되지 않은 호스트-미생물 상호 작용 있는 응용 프로그램 (예: 식품 생리 활성 화합물 또는 probiotics의 평가), 그 시스템 부족 수 있습니다. 나타낼 수 있습니다. 재현성25.
Caco-2, HT29-MTX 또는 공동 문화 이전 연구 평가 probiotic 또는 포유류 세포26,27병원 성 긴장의 접착. 얼룩을 사용 하 여 단일 또는 몇 가지 미생물의 수 있습니다 제공 제한 개요 호스트 미생물에 상호 작용 하 고 그것은 인간의 위장의 복잡성의 대표. 자연 미생물 커뮤니티의 사용 될 수 있지만 vivo에서 시나리오의 대표, 그들은 characterise 공부 하기가 어렵습니다. 반면, 우리의 방법론은 복잡 하 고 대표 축소판을 사용 하 여 여러 호스트-미생물 상호작용 평가의 기회를 제공 합니다. 정의 된 합성 미생물 커뮤니티의 사용은 감소 된 복잡성28으로 시스템의 세대에 대 한 수 있습니다. 지역 사회에 있는 변화는 개별 실험의 맥락에서 microenvironmental 조건의 결과 수 있습니다. 따라서,이 모델의 미생물 구성 요소 확장할 수 있습니다 쉽게 위 또는 아래로 deconstructing 선택적인 힘으로 환경에 미치는 영향에 대 한. 마지막으로, 샘플링 접근성 보장 추가 인간의 세포와 관련 된 미생물 지역 사회 둘 다의 기능 활동의 특성.
지난 몇 년 동안, organoid 기술 기반 새로운 시험관에 모델 개발 되었습니다. Organoids는 대표 주 조직의 주요 기능 중 일부를 통합 하는 3 차원 세포 배양. 장 organoids는 공부 하는 성인 줄기 세포와 조직에 대 한 근처 생리 적 시스템, 비록 같은 모델은 또한 몇 가지 제한 사항이 있다. 장 organoids 사용 제한에 그들은 면역 세포 부족으로 감염이 나 약물, 선 동적인 응답을 닮은. 또한, organoids는 생존 능력, 크기, 모양, 표현 형 검사 및 표준화 복잡 한 렌더링을 방해한에 관한 이종. 생체 외에서 건강 한 조직이의 모델링에 대 한 불멸 하 게 셀 라인의 제한에도 불구 하 고 잘 특징이 고 안정적인 셀 라인의 사용 또한 장점이 반복성, 재현성, 및 낮은 비용으로 있습니다. 이러한 혜택의 여러 조건, 동시 상영에 대 한 허용 하지만 데이터의 변환 사용 논란. 1 차 셀 vivo에서 생리학;의 대표 될 수 있습니다. 그러나, 그들은 높은 간 개별 가변성, 완전히 특징 되지 않습니다, 이기종는 있고 제한 된 시간 범위. 이러한 요소는 여러 조건을 포함 한 단점이 또는 한 분석 결과에서 복제.
복잡 한 미생물 지역 사회와 세포를 결합 하는 것은 도전 대표 수 있습니다, 우리 대표까지 높은 유연성과 적응성 기본 셀 장비, 실험실에서 재현 하 고 반복 가능한 모델을 개발에 초점 모델 사용 가능 하 고 잘 특징 되었다. 우리는 상부 위 장관에 probiotic 행동 평가 및 특성화 xenobiotic 영향 용기 인터페이스에 대 한 예를 들어, multicompartment이 모델을 사용 하 여 다양 한 세균성 지역 사회 기능을 평가 했습니다. 따라서, 우리 probiotics, 마약, 또는 관련 및 정의 된 생체 외에서 생태계 내에서 식품 화합물의 광범위 한 추가 분석에 대 한 기반으로이 모델을 제안합니다.
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Disclosures
저자 공개할 게 없다
Acknowledgments
저자는 기꺼이 마르타 Calatayud 아로요 (FWO 박사 친목-12N2815N) 플랑드르 연구 재단 으로부터 재정 지원을 인정 한다. 엠마 헤 르 난 데스-Sanabria 플랑드르 혁신 및 기업가 정신 (Agentschap voor Innovatie 문 Wetenschap en Technologie, IWT)에서 지 원하는 박사 후 연구원 이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| STRAINS | |||
| Aggregatibacter actinomycetemcomitans | American Type Culture Collection | ATCC 43718 | |
| Fusobacterium nucleatum | American Type Culture Collection | ATCC 10953 | |
| Porphyromonas gingivalis | American Type Culture Collection | ATCC 33277 | |
| Prevotella intermedia | American Type Culture Collection | ATCC 25611 | |
| Streptococcus mutans | American Type Culture Collection | ATCC 25175 | |
| Streptococcus sobrinus | American Type Culture Collection | ATCC 33478 | |
| Actinomyces viscosus | American Type Culture Collection | ATCC 15987 | |
| Streptococcus salivarius TOVE-R | |||
| Streptococcus mitis | American Type Culture Collection | ATCC 49456 | |
| Streptococcus sanguinis | BCCM/LMG Bacteria Collection | LMG 14657 | |
| Veillonella parvula | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures | DSM 2007 | |
| Streptococcus gordonii | American Type Culture Collection | ATCC 49818 | |
| CELL LINES | |||
| Caco-2 cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 86010202 | |
| HT29-MTX cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 12040401 | |
| REAGENTS AND CONSUMABLES | |||
| Brain Heart Infusion (BHI) broth | Oxoid | CM1135 | |
| Blood Agar 2 | Oxoid | CM0055 | Blood Agar medium |
| Menadione | Sigma | M9429 | |
| Hemin | Sigma | H9039 | |
| 5% sterile defibrinated horse blood | E&O Laboratories Ltd, | P030 | |
| InnuPREP PCRpure Kit | Analytik Jena | 845-KS-5010250 | PCR purification kit |
| Big Dye | Applied Biosystems | 4337454 | Dye for sequencing |
| ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337456 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile | VWR | 734-2311 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Trypan Blue solution 0.4%, liquid, sterile-filtered |
Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate | Life technologies | 31966-047 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3450-24EA | |
| Mucin from porcine stomach Type II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| Inactivated fetal bovine serum | Greiner Bio One | 758093 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Triton X 100 for molecular biology | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DPBS without calcium, magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm | Corning Costar Corp | 3450 | |
| Nuclease-free water | Serva Electrophoresis | 28539010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Neubauer counting chamber improved | Carl Roth | T729.1 | |
| BD Accuri C6 Flow cytometer | BD Biosciences | 653118 | |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | MoBio | 13155 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 186-1096 | |
| Flush system | Custom made | - | |
| InnOva 4080 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | 8261-30-1007 | Shaker for 2.10 |
| Memmert CO2 incubator | Memmert GmbH & Co. | ICO150med | |
| Millicell ERS (Electrical Resistance System) | EMD Millipore, Merck KGaA | MERS00002 | |
| Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system | Millipore, Merck KGaA | - | |
| Shaker (ROCKER 3D basic) | IKA | 4000000 | Shaker for 6.10 |
References
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