Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Evaluar la viabilidad de un consorcio bacteriano sintético en la interfaz de Host-microbio In Vitro Gut

Published: July 4, 2018 doi: 10.3791/57699
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Microbial Ecology and Technology (CMET), Ghent University

Summary

Interacciones de host-microbio intestinal fueron evaluadas usando un nuevo enfoque que combina una comunidad oral sintético, en vitro la digestión gastrointestinal y un modelo del epitelio del intestino delgado. Presentamos un método que puede ser adaptado para evaluar invasión celular de patógenos y biofilms multiespecies, o incluso para probar la supervivencia de las formulaciones probióticas.

Abstract

La interacción entre huésped y microbiota ha sido reconocida desde hace mucho y ampliamente descrito. La boca es similar a otras secciones del tracto gastrointestinal, como microbiota residente se produce y evita la colonización por bacterias exógenas. De hecho, más de 600 especies de bacterias se encuentran en la cavidad bucal, y una sola persona puede llevar alrededor de 100 diferentes en cualquier momento. Bacterias orales poseen la capacidad de adherirse a los diferentes nichos en el ecosistema oral, integrándose así dentro de las comunidades microbianas residente y que favorece crecimiento y supervivencia. Sin embargo, se ha propuesto el flujo de bacterias en el intestino durante la ingestión de perturbar el equilibrio de la microbiota intestinal. De hecho, la administración oral de p. gingivalis cambió de puesto la composición bacteriana en la microflora ileal. Utilizamos una comunidad sintético como una representación simplificada del ecosistema oral natural, a la supervivencia y viabilidad de bacterias orales sometidos a condiciones de tránsito gastrointestinal simulada. Catorce especies fueron seleccionadas sometidas a en vitro salival, gástrica y procesos de la digestión intestinal y presentó a un modelo de multicompartment de la célula que contiene las células Caco-2 y HT29-MTX para simular el epitelio de la mucosa intestinal. Este modelo sirve para desentrañar el impacto de bacterias ingeridas en células que participan en la circulación enterohepática. Utilizando las comunidades sintéticas permite la capacidad de control y reproducibilidad. Por lo tanto, esta metodología puede ser adaptada para evaluar viabilidad del patógeno y la subsecuentes inflamación asociados cambios, capacidad de colonización de las mezclas de probióticos, y en última instancia, bacteriana potencial impacto en la circulación presistémica.

Introduction

Los seres humanos conviven con las bacterias, que están presentes en el mismo número que las células humanas1. Por lo tanto, es de crucial importante obtener un conocimiento integral del microbioma humano. La cavidad bucal es un entorno único en que se divide en varios hábitats más pequeño, así que contiene una gran variedad de bacterias y biofilms en los diferentes lugares. Ser un ecosistema abierto, algunas especies en la boca pueden ser visitantes transitorios. Sin embargo, ciertos microorganismos colonicen pronto después de nacimiento y forma organizan de biofilms2. Estas se encuentran en la superficie de los dientes por encima de la grieta gingival, la grieta subgingival, lengüeta, superficies de la mucosa y prótesis dentales y rellenos3. Las bacterias también pueden estar presentes como flóculos y células planctónicas en el lumen del conducto del diente, entremezcladas con tejido pulpar necrótico o suspendidas en una fase fluida.

Existe una activo, continua interferencia entre las células del huésped y la microbiota residente4. Las bacterias se comunican dentro de y entre especies, y sólo una pequeña proporción de los colonizadores naturales puede adherirse a los tejidos, mientras que otras bacterias se conecte a estos colonizadores primarios. Por ejemplo, Unión célula-célula entre microorganismos es clave para la integración de colonizadores secundarios en biofilms orales y construcción de redes complejas de interacción de las células microbianas de4. Alrededor del 70% de agregados bacterianos en una muestra de saliva se forman por Porphyromonas SP., Streptococcus SP., Prevotella SP, Veillonella SP. y no identificado Bacteroidetes. F. nucleatum es un colonizador intermedio en la biopelícula subgingival y agregados con los colonizadores finales p. gingivalis, T. denticola y Tannerella forsythia, que están implicados en la periodontitis5. Además, Streptococcus mitis ocupa hábitats de mucosa y dentales, mientras que S. sanguinis y S. gordonii prefieren colonizar los dientes3. Así, S. sanguinis está presente en incisivos inferiores y caninos, mientras que el Actinomyces naeslundii se ha encontrado en dientes anteriores superiores6.

Además, lo indígenas microbioma juega un papel en el mantenimiento de la salud2. Microbiota residente participa en la educación inmune y en la prevención de la expansión de patógenos. Esta resistencia a la colonización se produce porque las bacterias nativas pueden ser mejor adaptado en la fijación a las superficies y más eficiente en metabolizar los nutrientes disponibles para el crecimiento. Aunque cepas probióticas sobreviven el paso gastrointestinal y permanecen activas, la persistencia de las bacterias autóctonas que se ingiere desde una ubicación superior del tracto gastrointestinal no se ha descrito completamente. Por lo tanto, sometimos a una comunidad artificial, representante del ecosistema oral, a las condiciones del tránsito gastrointestinal simulada. Viabilidad de las células bacterianas se evaluó mediante un modelo multicompartment que se asemeja al epitelio intestinal. Simuladores de tripa actual ofrecen reproducibilidad adecuada en términos de análisis de la comunidad microbiana luminal7. Sin embargo, adherencia bacteriana e interacción microbio host son por separado dirigidas, como la combinación de líneas celulares con comunidades microbianas es un reto8. Por el contrario, presentamos un marco que proporciona la explicación mecanicista potencial de colonización exitosa eventos registrados en la interfaz de la tripa. De hecho, este modelo puede conjuntamente utilizar con un modelo estático de la tripa para evaluar el impacto de las comunidades microbianas en señalización de superficie de host.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. las cepas y condiciones de la cultura

Nota: La comunidad oral sintético fue compuesta por cepas comúnmente presentes en el microbioma oral3.

  1. Obtener las siguientes cepas de la American Type Culture Collection (ATCC): adelante actinomycetemcomitans (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611) Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus sobrinus (ATCC 33478), Actinomyces naeslundii (ATCC 51655), Streptococcus gordonii (ATCC 49818), Actinomyces viscosus (ATCC 15987) y Streptococcus mitis (ATCC 49456).
  2. Veillonella parvula del Leibniz Institute alemán DSMZ colección de microorganismos y cultivos celulares (DSM 2007), Streptococcus sanguinis de la colección de bacterias LMG/BCCM (LMG 14657) de adquirir y utilizar Streptococcus salivarius cepa TOVE-R9y Streptococcus oralis10.

2. desarrollo de un representante de comunidad multiespecífico de microbioma Oral

Nota: Generar una comunidad sintética para simular la capacidad potencial de adherencia de las bacterias orales al epitelio de intestino en vitro . Crecer las bacterias en placas de agar sangre suplidas con hemina μg/mL, 1 menadiona μg/mL y desfibrinado estéril 5% sangre de caballo, 5 como se describe en Sanabria Hernández et al. (2017) 11. en Resumen:

  1. Disolver 100 mg de hemina en 2 mL de 1 M NaOH, añadir 100 mL de agua destilada esterilizada. Almacene en un recipiente oscuro. Esterilizar a través de un filtro de 0,22 μm antes de agregar al medio.
  2. Disolver 100 mg de menadiona en 20 mL de etanol al 96%. Esterilizar a través de un filtro de 0,22 μm antes de agregar al medio.
  3. Preparar 1 L de medio de agar sangre (véase Tabla de materiales) según las instrucciones del fabricante y autoclave. Deje que se enfríe hacia abajo antes de añadir la sangre de caballo y los suplementos. Mezclar y verter en las placas.
  4. Preparar modificado cerebro corazón infusión (BHI) caldo previamente divulgados12. Añadir 5 μg/mL de hemina y 1 μg/mL de menadiona después de autoclavar.
  5. Distribuir 9 mL del medio en tubos de Hungate y cerrar con un tapón de goma y una tapa de aluminio. Lavar los tubos con N2/CO2 (90% / 10%).
  6. Recuperar 1 mL de medio anaerobio con una jeringa y colóquela en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Seleccionar colonias individuales de cada especie bacteriana, resuspender en medio y transferir en la anaerobia BHI modificado. Incubar durante 48 h a 37 ° C, excepto S. salivarius, que deben incubarse por 24 h.
  7. Si es necesario, confirmar la pureza de las culturas antes de ensamblar la comunidad sintético. En breve:
    1. Extraer ADN de los cultivos líquidos como en Sanabria Hernández et al. (2010) 13 y amplificar el gene del rRNA 16S utilizando los iniciadores 27F (AGAGTTTGATYMTGGCTCAG) y 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACT) y el siguiente programa: 5 minutos a 95 ° C, 30 ciclos de 95 ° C por 1 min, 55 ° C por 1 min y 72 ° C durante 1,5 min, seguida por un paso de extensión final de 5 min a 72 ° C.
    2. Purificar el producto PCR con un comercial del kit (véase Tabla de materiales), siguiendo las instrucciones del fabricante.
    3. Realizar la reacción de secuenciación de los productos purificados en un volumen total de 10 μL, conteniendo 0,5 μL de colorante (véase Tabla de materiales), 3.2 pmol de primer M13f (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC), 2.0 μL de 5 x buffer de la secuencia y 20 ng de plantilla, utilizando una sistema de secuenciación comercial con kit (véase Tabla de materiales).
      Nota: Hemos tenido este procedimiento se realiza comercialmente.
    4. Realizar una búsqueda de explosión en todas las secuencias (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) determinar la taxonomía más conocida y comparar con la secuencia de la cepa original utilizando la herramienta online de clasificador de RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) y el SINA Servicio de alineación (https://www.arb-silva.de/aligner/).
  8. Medir el número de celular al final de la incubación, mediante citometría de flujo y SYBR Green/propidio mancha como se describe en Sanabria Hernández et al. (2017) 11. diluir las culturas a 105 células mL-1, usando modificado BHI.
  9. Añadir 1 mL de S. mitis en 75 mL de BHI anaeróbica e incubar hasta la fase estacionaria (6 h). Después, recoger 0,75 mL de cada cepa diluido y mezclar bajo condiciones anaeróbicas.
  10. Una vez que todas las culturas se han mezclado, tomar 1 mL del microcosmos y agregar los 75 ml de BHI. Incubar la comunidad sintético debajo del 10% de CO2, 10% H2, 80% N2 por 48 h a 37 ° C y 200 rpm (véase Tabla de materiales).
  11. Medir la densidad celular en 2.8. antes de presentar la comunidad al modelo de celular. Composición de la comunidad puede ser evaluado con PCR cuantitativa a tiempo real, usando los cebadores y recocido a temperaturas en la tabla 1 de Slomka et al. (2017) 10. Además, utilizar la secuenciación de amplicones de 16S rRNA gene para proporcionar información sobre los miembros iniciales presentes13,14. Cualquier protocolo de confirmación de identidad, utilice cDNA como una plantilla para indicar que las bacterias transcribiendo activamente proteínas y usar ADN como plantilla para revelar la presencia o ausencia de las cepas.

3. prácticas de cultivo celular de general

Nota: Para aspectos generales del cultivo celular, los autores refieren a maestro y Stacey (2007)15. Obtener líneas celulares de la colección de autentica celular culturas europeas (86010202 de ECACC Caco-2 y HT29-MTX-E12 ECACC 12040401, salud pública de Inglaterra, Reino Unido). Reactivos para cultivo celular pueden ser comprados (véase Tabla de materiales), a menos que se especifique lo contrario.

  1. Mantenimiento y pases de líneas celulares de Caco-2 y HT29-MTX
    Nota: Las células Caco-2 y HT29-MTX habitualmente se cultivan en frascos de cultivo de tejidos2 25 cm que contiene medio DMEM suplementado (tabla 1). Las células se tripsinizaron alcanzado 60 – 70% de confluencia.
    1. Retire el medio de cultivo celular de los frascos. Lavar dos veces con 5 mL de PBS sin /Mg de Ca++++.
    2. Añadir 2 mL de una solución de 0,5 mg/L de tripsina y 0,22 g/L ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Distribuir la solución de tripsina moviendo suavemente el frasco. Quitar 1,5 mL de solución de tripsina e Incube el frasco a 37 ° C durante 10 minutos.
    3. Comprobar al microscopio si las células son separadas de la superficie del frasco. Incubar durante 5 minutos adicionales, si es necesario.
    4. Añadir 5 mL de medio de cultivo celular suplementado al matraz para inactivar la tripsina. Pipeta hacia arriba y hacia abajo para obtener una suspensión homogénea única.
    5. De inmediato, tomar 50 μl alícuota de la suspensión de células y mezclar con solución de azul de tripano 0.4% estéril en una proporción de 1:1 (v/v) para las células Caco-2 o 1:5 v/v de HT29-MTX. Mezclar por pipeteo y carga en una cámara de conteo (véase Tabla de materiales).
    6. Contar las células viables (células brillantes blanco) bajo el microscopio (ver instrucciones del fabricante).
    7. De la semilla en un frasco nuevo con una densidad de 4 x 105 células/cm2 y 1 x 104 células/cm2, Caco-2 y HT29-MTX, respectivamente.
      Nota: (1) Caco-2 células distinguir y forman a ensambladuras apretadas una vez llegando a la confluencia. Es muy importante evitar sobre-confluencia antes de tripsinización. Crecimiento excesivo de células en el matraz puede causar fallas en desprendimiento celular después de la tripsinización o celulares macizos. (2) HT29-MTX células son productoras de moco células con alta actividad metabólica16. Estas características pueden provocar una acidificación rápida de los medios de cultivo celular, especialmente si las células están en alta densidad. Buffer HEPES se puede Agregar al medio de cultivo celular (tabla 1) para mantener el pH entre 7 y 7.2. Si el pH cae, puede ser medio intercambiado cuando confluency es menos del 50%. Sin embargo, si confluency > 50%, el cultivo celular debe dividirse.

4. montaje de un modelo de celular Multicompartment que simula la interfaz de Host-microbio intestinal

Nota: Completar el co-cultivo en pozos de doble cámara (diámetro 24 mm, poro tamaño 0.4 μm; véase Tabla de materiales).

  1. Añadir 1,5 mL de medio de cultivo de célula completa en el compartimiento apical y 2 mL a la basal. Pre-incubar durante 20-30 min obtener una distribución uniforme de la suspensión de células cuando se siembra.
  2. Trypsinize la cultura de célula de Caco-2 y HT29-MTX como se describe en la sección 3. El procedimiento de la tripsinización debe seguirse con precisión para lograr una distribución homogénea de ambas líneas celulares, una suspensión unicelular, sin grumos.
  3. Contar las células viables como se indica en 3.1.8.
  4. Ajustar la densidad celular a 6.5 x 104 células/cm2 en una proporción de 90/10 de células Caco-2/HT29-MTX.
  5. Homogeneizar las suspensiones de células y añadir el correspondiente volumen de células Caco-2 y HT29-MTX a un recipiente estéril precargado con medios de cultivo celular suplementado. Retire los medios previamente incubados desde el lado apical de la cámara de aspiración.
  6. Suavemente mezcle la suspensión de células mediante pipeteo y transferir 1,5 mL en el compartimento apical de los partes movibles de compartimiento. El procedimiento de siembra requiere un constante homogenización de la suspensión de células, las células tienden a sedimento. Dependiendo de la experiencia del usuario y la velocidad de trabajo, suspensión de células se debe mezclar después de dispensar 1-3 pozos.
  7. Mover las placas suavemente hacia atrás y hacia adelante y luego a la derecha a izquierda a derecha (5-10 veces) para obtener una incluso diseminación de las células en el pozo. Traslado a la incubadora y repita el movimiento de las placas.
  8. Mantener el co-cultivo de células Caco-2/HT29-MTX de 15 días, refrescante compartimientos apicales y basals cada 2 días con DMEM suplementado. Después de este tiempo, los medios de cultivo celular puede cambiarse por DMEM suplementado sin solución antibiótico/antimicótico.
  9. Mantener el sistema de hasta 20 a 21 días post siembra actualizando el medio cada 2 días.
  10. Medir la integridad de la barrera epitelial antes de comenzar el ensayo, utilizando un sistema eléctrico de la resistencia (véase tabla de materiales), siguiendo las instrucciones del fabricante.
    1. Asegúrese de que equipo de TEER está cargada (> 24 h) antes de iniciar las mediciones.
    2. Desconecte el equipo de TEER la fuente de alimentación y cubierta con una bolsa de plástico de la autoclave. Hacer un agujero en la bolsa para introducir el electrodo y enchufe en el puerto de entrada del medidor. Rocíe con 70% etanol/agua (v/v) antes de introducir el equipo de TEER en el gabinete de flujo.
    3. Para desinfectar el electrodo, sumergir las puntas de los electrodos en solución de etanol/agua (v/v) de 70% durante 15 minutos deje que seque al aire durante 15 s. Enjuague el electrodo en medios de cultivo celular precalentado.
    4. Tomar las células fuera de la incubadora y permitir que llegue a temperatura ambiente dentro del gabinete del flujo de las células.
    5. Asegúrese de que el medidor es desconectado del cargador. Coloque el interruptor de modo en ohmios y gire el interruptor.
    6. Medir la resistencia de la célula sumergiendo el electrodo con la punta más corta en el inserto y la punta más larga fuera del pozo. Mantener el electrodo en un ángulo de 90° a la inserción de la placa.

5. bacteriana supervivencia tras In Vitro las condiciones de tránsito Gastrointestinal

Nota: Preparar la digestión simulada líquidos siguiendo el protocolo de Minekus et al. (2014) 17, con las modificaciones que se describen a continuación. Preparar todas las diluciones con agua ultrapura. Todas las soluciones de filtro esterilizar mediante filtro 0,22 μm y realice el procedimiento de digestión en condiciones estériles.

  1. Digestión bucal:
    1. Colocar 3 mL de la comunidad bacteriana en un tubo estéril de 50 mL, mezclar con 3 mL de líquido de saliva simulada (SSF), que contiene (en mmol L-1): KCl, 15.1; KH2PO4, 3.7; NaHCO3, 6.8; MgCl2(H2O)6, 0.5, (NH4) CO3, 0.06; Ácido clorhídrico, 1.1; CaCl2(H2O)20.75. Agregar 75 U/mL de α-amilasa de la saliva humana tipo IX-A y mucina 2 g/L de tipo II de estómago porcino a la SSF.
    2. Incubar la mezcla por 2 min, a 37 ° C y 100 rpm. Recoge una muestra de 2 mL para la extracción de ADN y la cuantificación de la citometría de flujo (S1).
  2. Digestión gástrica:
    1. Añadir 4 mL de fluido gástrico simulado (SGF), que contiene (en mmol L-1): KCl, 6.9; KH2PO4, 0.9; NaHCO3, 25; NaCl, 47.2; MgCl2(H2O)6, 0.1, (NH4) CO3, 0,5; Ácido clorhídrico, 15,6; CaCl2(H2O)2, 0.075. Además, el SGF había contenido 2 g/L de la mucina de tipo de estómago porcino II.
    2. Medir el pH y ajustar a pH 3 con 1 M de HCl, si es necesario. Incubar a 37 ° C y 100 rpm. Recoge una muestra de 2 mL (S2).
  3. Digestión del intestino delgado:
    1. Añadir 4 mL de fluido intestinal simulado (SIF) que contiene (en mmol L-1): KCl, 6.8; KH2PO4, 0.8; NaHCO3, 85; NaCl, 38.4; MgCl2(H2O)6, 0,33; Ácido clorhídrico, 8.4; CaCl2(H2O)2, 0,3; al tubo de digestión.
    2. Ajustar a pH 7 con 1 NaOH de M, si es necesario. Incubar a 37 ° C y 100 rpm. Recoge una muestra de 2 mL (S3).

6. capacidad de colonización bacteriana tras In Vitro las condiciones de tránsito Gastrointestinal

  1. Centrifugar 2 mL de la digestión del intestino delgado, por 10 min a 2.650 x g.
  2. Quite el sobrenadante y el pellet bacteriano se mezclan con 5 mL de DMEM suplementado sin antibiótico y antimicótico.
  3. Mancha y cuantificar las células intacta o dañada usando un citómetro de flujo (véase Tabla de materiales), según lo descrito por Hernández Sanabria et al. (2017) 11.
  4. Ajustar la densidad celular a 105 células/mL viable diluyendo en DMEM suplementado sin antibiótico y antimicótico.
  5. Retire el medio apical del sistema transwell y añadir 1,5 mL de la suspensión bacteriana. Co de la cultura el sistema de 2 h bajo condiciones de cultivo celular general (37 ° C, 95% de humedad, 5% CO2).
    Nota: Este tiempo puede prolongarse hasta 48 h, dependiendo del protocolo experimental requerido. La cultura Co puede ser mantenida en una incubadora diferente que el utilizado para el mantenimiento de rutina de la célula, para evitar contaminaciones.
  6. Medir los valores TEER después de la incubación, para evaluar la integridad de la barrera epitelial como se describe en 4.11.
  7. Al terminar el tiempo de incubación, sacar media apical y recoger 0,5 mL para mayores análisis (S4). Una submuestra de los medios de comunicación puede utilizarse para la evaluación de la viabilidad celular por análisis de lactato deshidrogenasa (LDH) (véase Tabla de materiales), siguiendo las instrucciones del fabricante.
  8. Agregar 0,5 mL de 10 mM N-acetilcisteína en HBSS (NAC-buffer) para solubilizar el moco producido por el HT29-MTX y para recuperar las bacterias adheridas. Incubar las placas a 37 ° C por 1 h, en agitación (rpm 135, véase Tabla de materiales).
  9. Recuperar la HBSS NAC en un tubo de microcentrífuga (S5) y lavar dos veces las células con 1 mL DPBS.
  10. Añadir 0,5 mL de 0,5% Tritón X-100 (w/v) en la parte superior las monocapas, romper las células mediante pipeteo, recupera el líquido y vortex por 1 min velocidad es crucial para evitar daños a las células bacterianas con el detergente.
  11. Centrifugar las células durante 5 min a 2.650 x gy separar el sobrenadante (S6) y el pellet (S7).

7. Análisis de la muestra

Nota: Analizar muestras colectadas (S1-S7) para evaluar viabilidad bacteriana y la adherencia potencial a las células intestinales, después de una digestión gastrointestinal simulada.

  1. Viabilidad bacteriana: Pase muestras S1-S5 dos veces a través de un 0.45 μm y cuantificar las células bacterianas mediante tinción celular vivo o muertos y citometría de flujo como se indica en el paso 2.811.
  2. Potencial de adherencia: preparar diluciones seriadas (-1 a -8) para S1-S6 y 10 μL en agar sangre de la raya y modificado las placas de BHI. Incubar a 37 ° C en condiciones anaerobias por 24 – 48 h. placa el mismo volumen de S7 sin diluir.
    1. Identificación taxonómica de bacterias adheridas:
      1. Seleccionar colonias individuales con un bucle de cultura y resuspender cada uno en 10 μl de agua libre de nucleasa. Recoger 4 μL de esta suspensión y utilizarlo como plantilla para la amplificación por PCR del gene del rRNA 16S utilizando los cebadores y condiciones descritas en 2.7.1.
      2. Realizar la secuenciación siguiendo el protocolo en 2.7.3 y validación de la secuencia usando el procedimiento incluido en 2.7.4.
  3. Hacer más análisis aguas abajo como la total extracción de ADN, secuenciación de amplicones de qPCR cuantificación o 16S rRNA, extracción de RNA y transcriptómicos de perfiles como desee.
    Nota: Cuantificación de citometría de flujo se realizó inmediatamente después del muestreo. Como control de células de membrana-permeabilized, se utilizó una muestra expuesta a 70 ° C por 3 minutos. Ruido de fondo se evaluó mediante la medición con citometría de flujo de los líquidos de digestión o muestras obtenidas desde el modelo de cultivo celular sin bacterias. Cada muestra se midió por triplicado.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Este protocolo conduce a la generación de un modelo adecuado para elucidar la supervivencia y viabilidad de bacterias orales sometidos a condiciones de tránsito gastrointestinal simulada. Las cuentas de las células intactas de cepas individuales es de aproximadamente 108 células antes de mL-1 la creación de la comunidad sintético, mientras que el multiespecífico microcosmos contenido sobre el 90% de células viables durante el establecimiento de la comunidad ( Figura 1A y 1B). Basado en la cuantificación de vivos o muertos, viabilidad bacteriana disminuye después de cada paso de la digestión (figura 2). Esto puede ser el resultado de pH ácido durante el paso gástrico y las sales biliares contenidas en los líquidos de digestión del intestino delgado, como que ocurre bajo condiciones fisiológicas. Viabilidad durante el tránsito por digestión gastrointestinal in vitro e in vivo puede depender de variaciones en el ambiente (alimentadospor ejemplo, frente a condiciones de ayuno), o incluso en procesos de protección de las bacterias (esporas formación o recubrimientos entéricos).

Cuentas de citometría de flujo deben ser comparadas con controles adecuados, como las bacterias muertas por calor o muestras de fondo, para realizar la cuantificación de células viables exacta18. Las duras condiciones de la digestión del estómago y el intestino pueden cambiar las bacterias a las células viables pero no cultivables, que son bacterias vivas que no crecen o se dividen. Por esta razón, placa cuentas diferencian de recuento de células viables obtenido con citometría de flujo. Por ejemplo, en la figura 3, células viables recuperadas de la interfaz de mucosa son de color azul en la trama de la citometría de flujo. Sin embargo, no hay crecimiento observó cuando estas muestras de moco plateados (resultados no mostrados).

La fracción en la que las bacterias muestran mayores tasas de viabilidad es la ruina celular (S7), según lo revelado por la placa de recuento (figura 4). El número de colonias puede ser variable, pero la presencia de bacterias metabólicamente activas se encuentra en las muestras menos diluidas.

Figure 1
Figura 1: Viabilidad de las bacterias que componen la comunidad microbiana especies al comienzo de la digestión gastrointestinal en vitro de la célula. (A) Viable un recuento (unidades logarítmicas) cuantificado por vivir, muerte coloración y flujo cytometry (promedio ± desviación estándar, n = 3). (B) parcela de citometría flujo representativo de la comunidad microbiana multiespecífica después de 48 h de co-cultivo. Puntos en verde, rojo y negro representan viable, dañado y fondo o las bacterias no clasificado, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: viabilidad de las bacterias de la célula después de la digestión gastrointestinal simulada. Barras representan el número de células viables (unidades de registro) tras los pasos de digestión intestinal oral, gástrica y pequeñas (media ± desviación estándar, n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: parcela representativa de células bacterianas viables en la interfase mucosa. Puntos rojos representan los puntos de fondo y azul las células viables. Condiciones de citometría de flujo se establecieron con base en apoyos et al. (2016) 19. mucosa muestras fueron diluidas 1: 100 (v/v) y teñidos con Sybr Green/propidio durante 15 min, y 100 μl de la muestra se midió a FL1: 533/30 nm, FL2: 585/40 nm, FL3: > 670 nm paso largo y FL4: 675/25 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: modificación de colonias formando unidades (UFC) de la ruina celular en placas BHI. Tres réplicas biológicas fueron utilizados para el ensayo de adherencia bacteriana y se realizaron tres repeticiones técnicas para la cuantificación de UFC. En la figura se muestran dos placas replicadas, con -1 a-6 diluciones de los desechos de la célula (S7). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Cultivo de células Adherente / suspensión Medio de cultivo Suplementos generales Suplementos específicos Tiempo de duplicación Condiciones de incubación
Caco-2 (ECACC 86010202) Adherente Modificado Eagle Medium (DMEM de Dulbecco) con glucosa de 4.5 g/L Suero bovino fetal inactivado (10% v/v)
Penicilina (100 U/mL) *
Estreptomicina (0.1 mg/mL) *
Anfotericina (0,0025 mg/mL) *		 Glutamax (4 mM)
Aminoácidos no esenciales (1% v/v)
Piruvato (1 mM)		 65 – 72 h 95% humedad y 10% CO2
Incubadora de CO2 (véase Tabla de materiales)
HT29-MTX (ECACC 12040401) Adherente HEPES (1 mM) 20 – 24 h
* Antibióticos y antifúngicos fueron retirados de los medios de cultivo celular 2 días antes de comenzar los ensayos.

Tabla 1: Descripción de la composición de líneas y medios de comunicación de células para el mantenimiento de la cultura de célula.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El microbioma oral es un elemento clave en la salud humana reportada recientemente por varios autores20,21. Los resultados anteriores sugieren que la ingestión de saliva, que contiene grandes cargas de bacterias puede influir en el ecosistema microbiano del intestino, que es uno de los sitios principales para oscurecimiento inmunológico. La combinación de un modelo de digestión gastrointestinal superior estático con la interfaz de anfitrión, representado por las células epiteliales y secreción de moco intestinales, sirve para desentrañar el impacto del componente microbiano en el host.

In vitro los modelos son herramientas básicas para la investigación, lo que permite realizar estudios mecanísticos y alcanzar conocimiento de fondo destinada a reducir, hace más eficiente y mejor destino en vivo estudios. Por esta razón, es fundamental para asegurar la pureza, viabilidad y crecimiento óptimo de cultivos axénicos antes de establecer la comunidad microbiana sintético. Se recomienda evaluar la viabilidad y la composición de comunidades bacterianas antes de la exposición a los cultivos celulares, para evitar un sesgo en el análisis. Gran número de bacterias dañadas puede dificultar la adherencia y afectar aún más la integridad del modelo de celular. Además, el uso de una fuente confiable de líneas celulares minimizará identificación errónea de línea celular, contaminación y mala anotación, mejorando la reproducibilidad experimental22.

Incluyendo células productoras de moco permite parecido al intestino, como el moco y mucinas proporcionan la primera línea de defensa del tracto gastrointestinal23. Además, la capa mucosa es conveniente para la colonización bacteriana, permitiendo transporte bilateral caracterización de metabolitos bacterianos. Por otra parte, condiciones gastrointestinales simuladas aumentan la capacidad de adherencia de las cepas de Lactobacillus paracasei Caco-2 y mucina24, apoyando la importancia de la incorporación de procesos digestivos en nuestro modelo.

Pueden introducirse otras mejoras en el modelo para incorporar el componente de host inmune, como previamente ha25. Sin embargo, los sistemas actuales de cocultivo de células epiteliales e inmunes no han sido utilizados para aplicaciones de interacción microbio de host (por ejemplo, evaluación de compuestos bioactivos de alimentos o probióticos), que podrían indicar que estos sistemas pueden carecer reproducibilidad de25.

La investigación anterior con Caco-2 y HT29-MTX co-cultivos evaluaron la adherencia de los probióticos o cepas patógenas a células de mamífero26,27. Usando solo las manchas o asociaciones de algunos microorganismos pueden proporcionar una visión limitada en el host-microbio las interacciones, y no es representativa de la complejidad del tracto gastrointestinal humano. Aunque el uso de las comunidades microbianas naturales puede ser más representativo de la situación en vivo , son difíciles de caracterizar y estudiar. Por el contrario, nuestra metodología ofrece la oportunidad de valorar múltiples interacciones host-microbio, utilizando un microcosmos complejo y representativo. El uso de una comunidad microbiana sintético definido permite la generación de un sistema con menor complejidad28. Cambios en la comunidad pueden ser el resultado de las condiciones microambiental en el contexto de experimentos individuales. Así, el componente microbiano de este modelo puede fácilmente escalar hacia arriba o hacia abajo para deconstruir el impacto del medio ambiente como una fuerza selectiva. Finalmente, accesibilidad de muestreo garantiza más la caracterización de las actividades funcionales de las células humanas y de la comunidad microbiana asociada.

En los últimos años, se han desarrollado nuevos en vitro modelos basados en tecnología de organoide. Organoides son cultivos celulares 3D que incorporan algunas de las características claves del tejido primario mentionada aquí arriba. Aunque organitas intestinales son un sistema de cerca-fisiológicas para el estudio de las células madre adultas y los tejidos, este modelo también tiene algunas limitaciones. Organoides intestinales han limitado uso en que se asemejan a las respuestas inflamatorias a la infección o medicamentos, ya que carecen de células inmunes. Además, organitas son heterogéneos en cuanto a viabilidad, tamaño y forma, impedir la proyección de fenotipo y representación compleja estandarización. A pesar de la limitación de líneas celulares inmortalizadas en vitro modelado de tejidos sanos, el uso de líneas celulares bien caracterizadas y estable también ofrece ventajas como la repetibilidad, reproducibilidad y bajo costo. Estos beneficios permiten para la detección simultánea de varias condiciones, pero el uso traslacional de los datos es controvertido. Células primarias puede ser más representativo de la fisiología en vivo ; sin embargo, tiene gran variabilidad interindividual, no están completamente caracterizadas, son heterogéneos y tienen un limitado intervalo de tiempo. Estos factores son un inconveniente para incluir varias condiciones o replica en un ensayo.

Como la combinación de líneas de células con complejas comunidades microbianas puede representar un reto, nos enfocamos en el desarrollo de un modelo reproducible y repetible con alta flexibilidad y aplicabilidad en laboratorios con equipamiento básico de la célula, hasta el más representativo modelos se convirtieron disponible y bien caracterizados. Hemos evaluado la funcionalidad de diversas comunidades bacterianas con estos modelos de multicompartment, por ejemplo, para evaluar el comportamiento de probióticos en el tracto gastrointestinal superior y caracterización impacto de xenobiótico sobre la interfaz de tripa. Por lo tanto, proponemos este modelo como base para otros ensayos con una amplia variedad de probióticos, drogas o compuestos de alimentos, dentro de un ecosistema relevante y definida en vitro .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar

Acknowledgments

Los autores reconocen con gratitud el apoyo financiero de la Fundación de investigación de Flandes a Marta Calatayud Arroyo (FWO postdoctoral fellowship-12N2815N). Emma Hernandez-Sanabria es una beca posdoctoral apoyada por Flandes innovación y emprendimiento (Agentschap voor innovadores puerta Wetenschap en Technologie, IWT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
STRAINS
Aggregatibacter actinomycetemcomitans American Type Culture Collection ATCC 43718
Fusobacterium nucleatum American Type Culture Collection ATCC 10953
Porphyromonas gingivalis American Type Culture Collection ATCC 33277
Prevotella intermedia American Type Culture Collection ATCC 25611
Streptococcus mutans American Type Culture Collection ATCC 25175
Streptococcus sobrinus American Type Culture Collection ATCC 33478
Actinomyces viscosus American Type Culture Collection ATCC 15987
Streptococcus salivarius  TOVE-R
Streptococcus mitis American Type Culture Collection ATCC 49456
Streptococcus sanguinis BCCM/LMG Bacteria Collection LMG 14657
Veillonella parvula Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSM 2007
Streptococcus gordonii American Type Culture Collection ATCC 49818
CELL LINES
Caco-2 cells European Collection of Authenticated Cell Cultures 86010202
HT29-MTX cells European Collection of Authenticated Cell Cultures 12040401
REAGENTS AND CONSUMABLES
Brain Heart Infusion (BHI) broth Oxoid CM1135
Blood Agar 2 Oxoid CM0055 Blood Agar medium
Menadione Sigma M9429
Hemin Sigma H9039
5% sterile defibrinated horse blood E&O Laboratories Ltd, P030
InnuPREP PCRpure Kit Analytik Jena 845-KS-5010250 PCR purification kit
Big Dye Applied Biosystems 4337454 Dye for sequencing
ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit Applied Biosystems 4337456
SYBR Green I Invitrogen S7585
Propidium Iodide Invitrogen P1304MP
T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile VWR 734-2311
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T3924-100ML
Trypan Blue solution
0.4%, liquid, sterile-filtered		 Sigma-Aldrich T8154 
PBS Gibco 14190250
DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate Life technologies 31966-047
Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts Sigma-Aldrich CLS3450-24EA
Mucin from porcine stomach Type II   Sigma-Aldrich M2378
Inactivated fetal bovine serum Greiner Bio One 758093
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco 15240062
Triton X 100 for molecular biology Sigma-Aldrich T8787 
DPBS without calcium, magnesium Gibco 14190-250
Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit Thermo Fisher Scientific 88953
Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm Corning Costar Corp 3450
Nuclease-free water Serva Electrophoresis 28539010
EQUIPMENT
Neubauer counting chamber improved Carl Roth T729.1
BD Accuri C6 Flow cytometer BD Biosciences 653118
PowerLyzer 24 Homogenizer MoBio 13155
T100 Thermal Cycler BioRad 186-1096
Flush system Custom made -
InnOva 4080 Incubator Shaker New Brunswick Scientific 8261-30-1007 Shaker for 2.10
Memmert CO2 incubator Memmert GmbH & Co. ICO150med
Millicell ERS (Electrical Resistance System) EMD Millipore, Merck KGaA MERS00002
Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system Millipore, Merck KGaA -
Shaker (ROCKER 3D basic) IKA 4000000 Shaker for 6.10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biology. 14, e1002533 (2016).
  2. Kelly, D., King, T., Aminov, R. Importance of microbial colonization of the gut in early life to the development of immunity. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. , 58-69 (2007).
  3. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5721-5732 (2005).
  4. Marsh, P. D., Head, D. A., Devine, D. A. Dental plaque as a biofilm and a microbial community-Implications for treatment. Journal of Oral Biosciences. 57, 185-191 (2015).
  5. Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Cugini, M. A., Smith, C., Kent, R. L. Microbial complexes in subgingival plaque. Journal of Clinical Periodontology. 25, 134-144 (1998).
  6. Haffajee, A. D., et al. Subgingival microbiota in healthy, well-maintained elder and periodontitis subjects. Journal of Clinical Periodontology. 25, 346-353 (1998).
  7. Venema, K. Microbial metabolites produced by the colonic microbiota as drivers for immunomodulation in the host. The FASEB Journal. 27, (2013).
  8. Marzorati, M., et al. The HMI (TM) module: A new tool to study the Host-Microbiota Interaction in the human gastrointestinal tract in vitro. BMC Microbiology. 14, 133 (2014).
  9. Tanzer, J. M., Kurasz, A. B., Clive, J. Competitive displacement of mutans streptococci and inhibition of tooth-decay by Streptococcus-Salivarius Tove-R. Infection and Immunity. 48, 44-50 (1985).
  10. Slomka, V., et al. Nutritional stimulation of commensal oral bacteria suppresses pathogens: the prebiotic concept. Journal of Clinical Periodontology. 44, 344-352 (2017).
  11. Hernandez-Sanabria, E., et al. In vitro increased respiratory activity of selected oral bacteria may explain competitive and collaborative interactions in the oral microbiome. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 235 (2017).
  12. Alvarez, G., Gonzalez, M., Isabal, S., Blanc, V., Leon, R. Method to quantify live and dead cells in multi-species oral biofilm by real-time PCR with propidium monoazide. AMB Express. 3, (2013).
  13. Ehsani, E., et al. Initial evenness determines diversity and cell density dynamics in synthetic microbial ecosystems. Scientific Reports. 8, 340 (2018).
  14. Hernandez-Sanabria, E., et al. Correlation of particular bacterial PCR-denaturing gradient gel electrophoresis patterns with bovine ruminal fermentation parameters and feed efficiency traits. Applied and Environmental Microbiology. 76, 6338-6350 (2010).
  15. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2, 2276-2284 (2007).
  16. Calatayud, M., Velez, D., Devesa, V. Metabolism of inorganic arsenic in intestinal epithelial cell lines. Chemical Research in Toxicology. 25, 2402-2411 (2012).
  17. Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food - an international consensus. Food & Function. 5, 1113-1124 (2014).
  18. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73, 3283-3290 (2007).
  19. Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7, 1376-1385 (2016).
  20. Yamashita, Y., Takeshita, T. The oral microbiome and human health. Journal of Oral Science. 59, 201-206 (2017).
  21. Wade, W. G. The oral microbiome in health and disease. Pharmacological Research. 69, 137-143 (2013).
  22. Yu, M., et al. A resource for cell line authentication, annotation and quality control. Nature. 520, 307 (2015).
  23. Pelaseyed, T., et al. The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system. Immunological Reviews. 260, 8-20 (2014).
  24. Bengoa, A. A., et al. Simulated gastrointestinal conditions increase adhesion ability of Lactobacillus paracasei strains isolated from kefir to Caco-2 cells and mucin. Food Research International. 103, 462-467 (2018).
  25. Kleiveland, C. R., et al. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. Verhoeckx, K., et al. , Springer International Publishing. 197-205 (2015).
  26. Laparra, J. M., Sanz, Y. Comparison of in vitro models to study bacterial adhesion to the intestinal epithelium. Letters in Applied Microbiology. 49, 695-701 (2009).
  27. Gagnon, M., Berner, A. Z., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. Journal of Microbiological Methods. 94, 274-279 (2013).
  28. Großkopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Current Opinion in Microbiology. 18, 72-77 (2014).

Tags

Bioquímica número 137 microbioma Oral comunidad microbiana sintético modelos in vitro pasaje gastrointestinal bacterias salud bacterias comensales interacción host microbe epitelio intestinal viabilidad bacteriana bacteriana adherencia citometría de flujo
Evaluar la viabilidad de un consorcio bacteriano sintético en la interfaz de Host-microbio <em>In Vitro</em> Gut
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Calatayud Arroyo, M., Van de Wiele,… More

Calatayud Arroyo, M., Van de Wiele, T., Hernandez-Sanabria, E. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (137), e57699, doi:10.3791/57699 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter