Summary
膝关节骨关节炎在骨科经常出现。我们详细介绍了全膝关节骨关节炎治疗过程中富含血小板的血浆注射, 包括制备, 程序, 和评价。
Abstract
膝关节骨关节炎 (koa) 是骨科最常见的疾病之一。现有的非手术治疗对软骨的修复和骨再生的影响有限。富含血小板的血浆 (prp) 是一种自体生物活性物质, 能有效修复软骨损伤, 促进骨再生。然而, 临床研究中对 prp 制备方案的报告非常不一致, 大多数研究提供的信息不足, 无法复制该方案。我们描述了一种可重复的方法, 准备 prp 视觉, 使用 prp 关节内注射治疗 koa, 以及评估结果的方法。采用人工双离心法制备了 prp。从外周血中提取 prp 层, 用于膝关节腔注射。评估包括对血小板浓度和临床结果的评估。人工离心制备 prp 所需的设备较少, 而且比使用设备的等离子过滤或离心成本更低。我们的双离心方法的离心时间分别为6分钟和 5分钟, 分别为800和 1400 x g 的离心, 以便一致地制备标准化的 prp。但是, 手动方法容易受到操作人员错误的影响, 并且不提供 prp 批处理准备。关节内注射 prp 是治疗膝关节骨关节炎的有效方法。整个治疗过程不到 30分钟, 可规范 prp 的血小板浓度, 经随访评估证明治疗有效。
Introduction
膝关节骨关节炎 (koa) 是骨科最常见的疾病之一;30%-50% 的65岁以上的人经历过这种疾病1。目前, koa 的保守治疗主要包括口服非甾体抗炎药和软骨营养药物、关节内注射透明质酸钠和物理治疗。然而, 这些方法不能阻止膝关节退化2的过程。关节软骨缺损可导致关节表面磨损、关节不稳定和代谢变化, 这些都是 koa 3 发病机制的一部分.然而, 由于关节软骨中缺乏血管、神经和淋巴组织, 损伤后恢复困难。一种有效的软骨修复方法对 koa 的治疗尤为重要。破骨细胞的治疗也是 koa 治疗的重点。
富含血小板的血浆 (prp) 是一种自体生物活性物质, prp 在骨和关节中的应用问题也越来越多。prp 临床应用的生物学原理包括其对生长因子局部传递和炎症反应改变的影响及其对细胞增殖和分化的积极影响4。关节内注射后激活后, prp 通过去颗粒释放α颗粒, 并分泌各种生长因子, 包括血小板衍生生长因子、转化生长因子β、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子。这些促进成骨细胞和软骨细胞增殖, 抑制软骨变性, 增强软骨和软骨下骨的稳定性, 调节金属蛋白酶的基因表达组织抑制剂, 并保持合成的平衡和蛋白多糖降解5,6。因此, prp 可以修复软骨损伤, 促进骨再生。
prp 注射的结果受各种因素的影响, 包括取样点7、离心机制备方法8、抗凝剂9和激活剂10的使用.制备 prp 的离心方法大约有3种。虽然是最常用的人工离心、设备离心或等离子过滤技术, 但也有手工和设备过滤技术。手动方法要求最少的设备, 方便, 成本低, 操作简单 (图 1)。prp 是通过人工离心两次制备的。将混合外周血和抗凝剂离心, 将血细胞从血浆和血小板中分离出来。丢弃底层红血球后, 将上清液离心再分离, 分为上清液血小板差血浆、中 prp 和亚钠残留红细胞。中间层用于膝关节腔注射 (如果数量不足, 可以提取部分上清液)。该方法的评价包括对血小板浓度和临床结果的评估。
临床研究中对 prp 制备方案的报告非常不一致, 大多数研究没有提供足够的信息, 使协议无法复制 11.在这里, 我们描述了一种可重复的方法, 准备 prp 和治疗 koa 与 prp 关节内注射, 并对结果进行评价。纳入标准是膝关节骨关节炎患者谁有不良的疼痛缓解简单的镇痛药物 (如对乙酰氨基酚) 和保守治疗。排除标准包括静脉回流或淋巴引流障碍患者;膝关节感染患者;注射区发生皮肤病或感染的病人;发热患者;凝血功能异常患者;严重心血管疾病的患者。整个治疗过程不到 30分钟, prp 的血小板浓度被证明达到了标准化的测量。它的有效性通过在密切随访期间评估结果来证明。
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Protocol
上述方法得到了广东总医院伦理委员会的批准。
1. 通过手动离心获得 prp
- 在室温和湿度舒适的无菌层流手术室中, 让患者处于仰面位置, 室温为 22°c, 室温为60%。
- 使用1毫升注射器绘制 0.2 ml 的肝素钠 (2 毫升 = 12, 500 u), 然后弄湿一个50毫升的注射器。
注: 3 毫升柠檬酸钠也是典型的, 在这一步, 以取代肝素钠。 - 组织止血带, 对肘部进行2-3 次消毒, 然后使用潮湿的50毫升注射器从肘部静脉提取30毫升外周血。
- 执行第一次离心。
- 将外周血平均分为两个50毫升无菌离心管。
- 在无菌条件下, 将两个管放入水平转子中, 然后放入离心机中。
- 在 800 x 克离心6分钟。
- 取出卧式转子, 戴上无菌手套, 并将离心机管取出。
- 观察分层, 以确保外周血分为两层。
- 使用干净的10毫升注射器将这两个离心管中的上清液液体收集到干净的离心管中。
- 执行第二次离心。
- 使用干净的10-ml 注射器, 在另一个干净的离心管中加入等量的无菌水或正常盐水进行平衡。把管子放在水平转子里。用粘合剂石膏标记上清液层液体。
- 在 1400 x g 处离心5分钟。
- 取水平转子, 并通过观察分层检查标记管的液体分为三层。
- 使用10-ml 注射器从中颗粒细胞层 (富含白细胞的 prp 层) 和上清液的底层提取4毫升的液体。如果中间层量足够, 只需从中提取4毫升。
- 将0.4 毫升的液体放入无菌抗凝管中 (k2edta, 3.6 mg) 进行评估, 将3.6 毫升的液体留在注射器中。
注: 协议可以在此处暂停。
2. prp 的关节内管理
- 让病人仰卧在手术台上, 将膝盖弯曲到90度。
- 位于膝盖骨的下缘和离外侧的锁骨韧带1厘米处的穿刺部位。使用标记笔标记网站。
- 在穿刺部位进行三次皮肤消毒, 戴无菌手套, 并用无菌孔巾覆盖。
- 将注射器平行放置在胫骨平台上, 然后以45度的角度进行穿刺。将针头完全插入皮肤。
- 将注射器中3.6 毫升的 prp 注入膝关节腔。
- 用无菌纱布覆盖穿刺位置, 并用粘合剂石膏固定。
- 对伤口施加压力10分钟。观察任何严重的不良反应30分钟。
- 每月每隔三次进行一次注射。
注: 协议可以在此处暂停。
3. prp 注射液的术后评价
- 评估 prp 中血小板的浓度。
- 使用从抗凝管 (k2edta, 3.6 毫克) 的 prp 0.4 毫升。
- 使用自动血细胞分析仪分析 prp 的血小板浓度。
- 评估 prp 注射液术后的疗效。
- 每次治疗前1天进行会诊, 每次治疗后1天进行进一步的患者随访, 每次治疗后 3天, 每次治疗后 1周, 第三次治疗后 1周, 第三次治疗后 1个月, 疗程后 3个月, 6个月在第三次治疗之后
- 使用视觉模拟量表 (vas)、西安大略大学和麦克马斯特大学骨关节炎指数 (womac)、膝关节社会评分 (kss) 和 lysholm 膝关节功能量表来评估术后效果。
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Representative Results
因此, prp 的血小板计数达到了 1121 x 103 l 的标准浓度水平。我们对一名55岁的男性患者进行了协议中描述的15项随访调查。可见, 早期临床结果是满意的关节内给药后的 prp (图 2)。然而, 中期疗效略差。观察到明显的镇痛效果 (图 2a)。kss 膝关节得分高于 kss 功能评分 (图 2c,图 2d), 这意味着 prp 对主观症状的影响优于对客观症状的影响。lysholm 膝关节功能量表评分表明, 我们的方法对改善软骨损伤和软组织损伤症状有明显的效果 (图 2e)。总体而言, 我们的 prp 方案的治疗效果是显著的。
图 1: 协议设计流程图.请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 评价 prp 注射液术后疗效.vas (a)、womac (b)、kss (c、 d) 和 lysholm 膝关节功能量表 (e) 的临床疗效评价。kss 提供膝盖得分 (疼痛、活动和稳定性, c) 和功能得分 (行走能力和楼梯活动, d)。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
正常血液中的血小板浓度在 150, 000μμl 和 350000/ll 之间, 人们普遍认为 prp 的血小板浓度应达到 1000000/μl, 是正常浓度9的3至5倍。根据 paw 层次体系, 认为当血小板浓度低于正常浓度的三倍时, prp 没有明显的效果, 而当血小板浓度大于6时, prp 有抑制作用乘以正常浓度的 12。因此, 该方案的最低要求是, prp 的血小板浓度介于这些水平之间。
手动 prp 准备可以通过一次离心或两轮离心来实现。由于离心机参数的不同, 获得的 prp 质量在两种技术之间是不同的。单离心获得的血小板浓度较低, 但 prp 不同时含有白血和红细胞。双离心获得的血小板浓度较高, prp 通常含有少量的白细胞, 甚至红血球 13.prp 中白细胞的存在是否有利于结果是有争议的。一些研究表明, 富含白细胞的 prp 具有较强的抗菌活性, 促进功能恢复, 且对刺激物的作用较小, 减少了对镇痛药的需求。然而, 细胞因子、金属蛋白酶、白细胞间质和白细胞释放的氧自由基会加重急性期的损伤, 阻碍组织自我修复, 延缓愈合过程15。为了获得浓度较高的血小板, 我们采用了双离心法。
血小板的收集率也与离心力和时间有关。人们普遍认为, 血小板浓度随着离心力的增加而增加。然而, 过度的离心力会损害血小板, 降低恢复率。血小板浓度也随着离心时间的延长而增加。离心时间小于5分钟时, 血小板较低, 无明显效果;离心 10至20分钟, 血小板浓度逐渐稳定增加;超过20分钟后, 血小板浓度不再明显改变 16.长时间的离心可能会导致过度的血小板沉积, 降低生物活性, 因此最佳离心时间为5至10分钟。我们建立了第一和第二离心机在800和 1400 x g 的力下进行6分钟和5分钟的双离心的最佳离心时间, 以制备 prp。
一些 prp 被收获并直接注射到损伤区域, 但其他配方添加血小板活化剂, 如凝血酶或 ccl2。一般情况下, 用于缓解慢性炎症或 oa 等 "磨损" 损伤的 prp 通常是在没有活化剂17的情况下注射的。
为了评估治疗结果, 我们使用了一些尺度。vas 提供了详细的疼痛测量。我们使用 womac 根据相关症状和体征评估淋角炎的严重程度和治疗效果。kss 为疼痛、移动性和稳定性提供了膝盖得分, 并为行走能力和楼梯活动提供了功能得分。牙线膝关节功能量表评价韧带和软骨损伤。
我们的方法有几个局限性。首先, 人工制备容易受到操作人员误差的影响, 主要是在第二次离心后, 中间缓冲层和部分上清液的绘图中的主观性。然而, 经过与不同操作人员的反复实验, 我们最终找到了有效的血小板浓度。其次, 使用此方法不提供 prp 批处理准备。只有在每次注射前抽血才能制备 prp。由于样品的储存是困难的, 每次重新准备 prp 都必须是可以接受的。
总之, 关节内注射 prp 是一种有效的治疗膝关节骨关节炎。本研究报告详细介绍了整个治疗过程, 包括编制质量可靠的 prp、引入标准注射程序以及科学实用的评价方案。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究得到了国家自然科学基金 (81371991) 和广东省科技重点项目 (2015 b020225007) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Centrifuge tube | CORNING | 430828 | |
| Horizontal rotor | Eppendorf | LL080 | |
| Anerdian III | Shanghai Likang Disinfectant HiTech Co., LTD | 310173 | Disinfect the skin |
| 1ml Syringe | KDL Medical Equipment Co., LTD | 0.4*13 RWLB | |
| 10ml Syringe | KDL Medical Equipment Co., LTD | 1.2*38 TWSB | |
| 50ml Syringe | KDL Medical Equipment Co., LTD | 0.7*32 TWLB | |
| Medical Tourniquet | Changzhou Jinli Latex Products Co., LTD | 0087-2011 | |
| Single-use sterile rubber surgical gloves | Shanghai jinxiang Latex Products Co., LTD | 17060 | |
| Disposable Draw Blood Needle | KDL Medical Equipment Co., LTD | 0.55*20 L(II) RWLB | |
| Heparin Sodium Injection | SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD | 1706101 | 2ml:12500U |
| Jifro Hand Antiseptic Rinse Free Gel | Shanghai Likang Disinfectant HiTech Co., LTD | 311793 | |
| Medical Cotton Swab | Foshan Kangzheng Medical Supplies Co., LTD | KZ3-12 | Disinfect the skin |
| 10ml Normal Saline | Jiangxi Shuangshi Pharmecutical Co., LTD | 140211458 | |
| Automatic Blood Cell Analyzer | Beckman Coulter | LH-750 | |
| Hole-towe | Sterile | ||
| Anticoagulation Tube(Blood Collection Tubes, K2E 3.6mg) | Becton, Dickinson and Company | CNL17-COO56 | Store in a cool dry place within 4 to 25 degrees Celcius |
| Tweezers | RWD LIFE SCIENCE | F12006-10 | |
| Sterile Gauze | Guangdong Ze Chang Trade Co., LTD | 170915 | |
| Adhesive Plaster | 3M Transpore | 1527C-0 | |
| Skin Marker Pen | Guangzhou Mingjia Medical Device Manufacturing Co., LTD | 10110 |
References
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