Summary
このプロトコルでは、calorespirometry、放熱の呼吸、エネルギー代謝を評価するために非侵襲的アプローチを提供する直接・同時測定をについて説明します。この手法は、総細胞エネルギーの流れを監視することによって好気性と嫌気性経路エネルギー利用への貢献を評価するために使用されます。
Abstract
基本的な生物学的および生物医学研究で使用される多くの細胞は、好気性と嫌気性の呼吸の組み合わせによりエネルギー恒常性を維持します。ただし、両方の経路が細胞のエネルギー生産の景観に貢献する範囲は一貫して見落とさ。変換で培養された細胞のブドウ糖のレベルをしばしば飽和は、酸化的リン酸化基質レベルのリン酸化の増加によって償われる ATP の生産のために減少の依存関係を表示します。代謝の身のこなし、このシフトでは、細胞はミトコンドリア毒素の存在にもかかわらず増殖することができます。以来トランス ホーム細胞の変えられた代謝身のこなしを無視して、医薬品のスクリーニングの結果が誤って、潜在的 mitotoxic の効果が検出されないモデル高グルコースの存在下で培養のセルラインを使用して濃度。このプロトコルでは、呼吸と熱量測定、細胞 ATP を生産する好気性と嫌気性の貢献の量的で、非侵襲的評価を可能にする 2 つの強力な手法の組み合わせについて説明します。好気性と嫌気性の呼吸熱監視を介して熱量測定をすることができますを生成します。一方、酸素消費率を測定は、好気呼吸の程度を評価できます。放熱と酸素消費量の両方を同時に測定、calorespirometric 比が決定できます。理論 oxycaloric 相当に得られた実測値を比較し、ことができ、嫌気性の呼吸の程度を判断できます。したがって、calorespirometry は、医薬品開発、微生物の増殖、平地と低酸素の条件の下で基本的な生体エネルギーなど生物の質問の広い範囲を分析するユニークな方法を提供します。
Introduction
生物学的システム、代謝時に熱リリースまたはエンタルピーの変更は通常直接どちらかを監視 (を介して直接熱量測定) または間接的 O2消費量や CO2の生産 (呼吸) を経由。残念ながら、単独でこれらのテクニックを使用すると、重要な情報が失われます、嫌気性細胞の代謝経路の貢献など。Calorespirometry は、放熱と呼吸の両方の同時測定に依存する強力な手法です。完全に酸素の哺乳類細胞の嫌気性代謝を検討した calorespirometric 仕事を開拓し、にもかかわらず中トランス ホーム細胞のエネルギー恒常性する好気性と嫌気性経路の同時の貢献を実証します。完全に酸素環境1。Calorespirometry は、さまざまな生物学的質問にから適用されています。いくつかの例は、低酸素レベルで動物のエネルギー論の研究、二枚貝、地上の生物の代謝と有機質土壌物質2,の微生物分解のえらに及ぼす除草剤とエストロゲンの両方3,4,5,6。 さらに、calorespirometry は7細胞の哺乳類の凍結凍結する前に明らかにしたどのように代謝前処理向上。それぞれのアプローチは、熱量測定および呼吸、細胞と個体の生体エネルギーの私達の知識は個別に増加しました。ただし、calorespirometry を使用して答えることができる基本的な生物学的質問比較的未踏のままです。
ヘスの法則の反作用の合計エンタルピー変化は初期と最終状態の間の経路に依存しません。たとえば、生化学的経路の合計エンタルピー変更は、経路内のすべての反作用のエンタルピーの変更の合計です。熱量測定は、無差別に好気性と嫌気性の両方の経路を検出する細胞熱生産を測定するためのリアルタイムのアプローチを提供しています。これは実験アンプル8の壁を通ってを除く、システムでエネルギーは交換されません基盤に基づいています。放熱の変更は、アンプルのすべての代謝反応からリリース エンタルピーの変更と同じです。したがって、負のエンタルピーは、システムからの熱の損失に関連します。過去 4 年間の徹底的な研究は、異化と同化の熱力学的景観を特徴としています。これは、検索用語「生物」と「熱量」インデックスによってアメリカ合衆国国立図書館の医学 (NLM) 健康の国民の協会 (PubMed) で研究の記事の安定した上昇によって表されます。検索は合計 27 の文書参照の生物学的熱量測定; 1970 年前にことを明らかに一方、単独で 2016 年 546 出版物利用技術です。
熱量測定法は、熱生産を決定する確立されています。ただし、進入します。 値を解決するためより多くの柔軟性が与えられます。進入します。 測定は、O2CO2、または O2と CO2の両方で構成できます。さらに、O2 ・ CO2測定は optrodes、クラーク型電極、波長可変半導体レーザー吸収分光法7,9,10 など、様々 な手法で行うことができます。、11。CO2の生産は多くの進入します研究に貴重な指標が、培養細胞用培地はしばしば pH コントロール12,13炭酸水バッファー システムを利用しています。重炭酸塩システムの CO2測定の合併症を避けるためには、培養細胞の calorespirometry の次のプロトコルは、唯一の進入しますパラメーターとして O2を利用しています。
酸素のフラックスの測定と並行して、特定の respirometers (材料の表を参照してください) は、ミトコンドリア機能の詳細な評価のため設計されています。基板-ランプ-阻害剤-滴定 (スーツ) プロトコルは、よく確立されるおよび膜の潜在的な反応酸素種 (ROS) の形成14を測定するために設計された実験と互換性が。そのままなセルの calorespirometry の提案するプロトコルは、化学的脱共役カルボニル シアン化物-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) と F0F1-ATP 合成酵素阻害剤オリゴマイシンなどの導入と互換性が。FCCP 添加して酸素消費量が、ミトコンドリアの性能15の潜在的な治療の影響を評価するために有用である ATP を生産から結合することができます。さらに、オリゴマイシン添加漏れ呼吸の程度が点灯します。したがって、calorespirometry の中に実行される進入します。 測定がさらにミトコンドリアの生理機能を解明するために広範なプロトコルと互換性があります。
放熱の酸素流量同時測定 calorespirometric (CR) 比の計算が可能です。この比率は、ソーントンの定数または細胞または興味の組織によって-480 kJ mol-1 -430 と補われた炭素基板1,間の範囲と同等理論 oxycaloric と比較して16. したがってより否定的な CR の比率は、全体的な代謝活動に嫌気代謝経路から増加した貢献を明らかにします。たとえば、仕事の積極的なパフォーマンスなしルーチン筋肉組織呼吸の CR 率は-448 から-468 の理論 oxycaloric 等価17,18の範囲内にある kJ mol-1 範囲します。一方、哺乳類の癌細胞は高いブドウ糖の培地で培養した解糖系に続く強化の乳酸発酵を表示、ミトコンドリア婚約19が比較的低い。-800 kJ mol-1、嫌気性より否定的な CR 比1,7、によって示されると細胞の代謝経路の高まりの関与を示す-490 の CR 率の範囲内でこの表現型の結果 16,20。
両方の商業および非営利の細胞・組織の代理店現在ほぼ 4,000 細胞 150 種以上提供細胞は、人間から派生しました。不死化細胞株は、すぐに多くの直接または間接的を妨げるミトコンドリア機能の潜在的な治療の毒性を評価するための便利なツールです。薬剤のスクリーニング中に変換されたセルを使用して可能性があります限られた予測値の一部に Warburg 効果、多くの癌の特徴のため。多くの場合、癌は基質レベルのリン酸化から ATP を生成し、完全好気性条件19の下でミトコンドリアを雇わないで乳酸の産生を介して酸化還元バランスを維持します。医薬品開発は、悪名高い高価、非能率的で 9 化合物市場承認21を達成するために失敗した人間の臨床試験で検証中約 8 です。潜在的な治療は、細胞株の低毒性のための最初のスクリーニングを渡すことも、これらの化合物のいくつかが mitotoxic であることは可能です。これらの毒素が Warburg 効果を表示しない一次電池のエネルギー ・ バランスを損なうことができる方法を検出するための適切なメソッドがない重要な情報は過剰に見て、初期の段階で治療開発のボトルネックします。
Calorespirometry は、さまざまな細胞や組織を含む生体試料などの代謝活動を分析する実用的な非侵襲的アプローチです。提案するプロトコルのコアは、アプリケーションの範囲との互換性です。ただし、1 つの合併症が確認されています。不死化細胞は、潜在的な mitotoxins22、細胞を感作するために酸化的リン酸化 (OXPHOS) エネルギー生産のための貢献度を高めてガラクトースと補われるブドウ糖自由の培地中で培養頻繁 23。この代謝リプログラミングが熱量計15で使用されるステンレス製アンプルに配置するサンプル分析を不明瞭に表示されます。グルコース培地で培養された細胞は、いくつかの時間の高い代謝活性に従事し続けてください。一方、ガラクトース培地で培養された細胞は、測定実験早くポイントに制限を行う、アンプル内の配置の 30 分以内熱生産を減少させます。この現象は、残念ながら、彼らの細胞増殖を評価する機会を妨げています。この特定の制限にもかかわらず calorespirometric 解析と互換性のあるほとんどのアプリケーション、これにより代謝の詳細情報を取得できます。
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Protocol
1. 細胞培養
- ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 細胞文化のインキュベーターで 37 ° C で 10% 牛胎児血清 (FBS)、追加基板 (10 mM グルコース、グルタミン、2 mM と 1 mM ピルビン酸) を含む人間の肝細胞癌 (hepg2 細胞) 細胞を維持 (5 %co2、95% の空気、湿度 100%)。
注: は、DMEM が呼吸と熱量測定の後の手順で参照される上記 DMEM の定式化を使用します。 - 1 x 106細胞をプレートあたりセル 100 mm の板を文化とサブカルチャーそれらすべて 7 日または 90% の confluency に達する前に、媒体ごとに 3-4 日を更新します。
- セルが 60-80% 合流実験を実行します。
2. 呼吸度計、熱量計の準備
- 呼吸室に DMEM の 2.2 mL ピペットで移しなさい完全にストッパーを挿入、中に空気から最適な酸素の拡散を実現するストッパー スペーサー ツールで調整。
- (ブルー トレース) の酸素濃度、酸素流量 (赤のトレース) が安定するまで、37 ° C で継続的にかき混ぜます。実験で使用中の酸素溶解度を考慮して呼吸のソフトウェアをプログラムを確認します。
注: 別のメディアがある別の酸素溶解度係数 (例えば、DMEM 0.92 を =)。 - 商工会議所を開き DMEM で酸素濃度の安定化は後、酸素濃度トレースの安定した部分を選択し、100% の空気飽和のためにそれを校正します。
- 0% 酸素室で酸素がないとき酸素濃度トレースの安定した部分を選択するために校正します。20 μ L の滴定実験の終わりに生物学的サンプルですべての酸素が消費された後の 230 mM 亜ジチオン酸ナトリウムの後、この手順を実行します。
- 100% の空気の呼吸度計のキャリブレーション後ストッパーを閉じ泡が商工会議所に存在しないことを確認します。
注: 酸素流量のわずかな増加として検出される密閉チャンバーのポーラロ グラフ法による酸素センサー (POS) の酸素分圧を測定するために酸素を消費します。 - 閉じられているストッパーの ~ 10 分後安定した酸素流量を観察することによって呼吸度計を HepG2 細胞の準備ができているを確認します。
注: ここで使用される熱量計ステンレス アンプルを利用し、1 アンプルの参照として使用することが必要です。 - カロリメータの参照アンプルに 2.5 mL H2O (dH2O) の [サンプル (ステップ 4) と等しいボリューム] を追加し、必要に応じて、ペンチを使用してキャップを締めます。気流のある密封されたアンプルをきれいにし、熱量計の参照チャネルの 1 の位置にアンプルをゆっくりと下ろします。位置 1 まで生物的サンプルを用意しています。
3. HepG2 細胞の呼吸と熱量測定のための準備
- 計、熱量計の準備し、校正を確認します。暖かい DMEM そして 37 の ° C の水浴中にトリプシン。
- 新鮮な 100 mm プレートと CO2と温度の両方のための媒体の平衡を許可するインキュベーターで場所に DMEM を追加します。
注: 適切なボリュームに使用するアンプル数によって異なりますので、この媒体は熱量測定実験のため使用されます。 - セルは、60-80% 合流、その後洗って 100 mm プレート室温リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 mL を 2 倍を倒立顕微鏡で確認します。
- 細胞の 100 mm プレートを 37 ° C トリプシンの 3 mL を加えるし、細胞文化のインキュベーターで 37 ° C で 7-10 分間インキュベートします。37 ° C DMEM の 3 mL のトリプシンを中和し、5 mL のピペットを使い、優しく 〜 20 回ピペッティング システムそれによって中断します。
- 滅菌 15 mL の円錐管に DMEM およびトリプシンの再懸濁細胞の 6 mL を転送し、175 x g に 5 分は細胞ペレットを乱すことがなく液体を削除、それを遠心分離します。
- 〜 5 mL DMEM とセルを万全にそれが十分に互いから分離したピペットで細胞ペレットを再懸濁します。
- 十分に混合されたサンプルの ~ 100 μ L を削除し、セルの合計数を決定するための診断のすべての 8 のフィールドを利用した徹底的な細胞数を実行します。〜 50 μ L あたり 10 の6セル × 2 を生成するために、細胞の再懸濁のボリュームを計算します。
注: これは 2 × 106セルが最小限の中変位計の各商工会議所に追加されている保証されます。 - 細胞を再懸濁します 175 x g. で 5 分間遠心分離機の DMEM ステップ 3.7 から計算される量のペレット。
- (これは 〜 50 μ L をする必要があります) 呼吸の商工会議所あたり 2 × 106細胞を注入するために必要なボリュームを決定するセル数を実行します。氷の準備ができるまで進入します。 測定用セルを格納します。
- 濃縮細胞サンプルは、氷の上は、熱量測定の 1 x 10 の5セル/mL の濃度を生成するために必要な希釈を決定します。
- サンプルをよく混ぜ、それぞれアンプルの DMEM で 1 x 10 の5セル/mL で細胞の 〜 3 mL を準備します。
注: サンプル希釈用 DMEM は 3.3 の手順で調製した平衡の培地をする必要があります。
4. 熱量測定
- 熱量計は、コンピューターに接続されている μ で熱量の信号が観察可能な安定したことを確認します。
- 各アンプルに 1 x 105セル/ml (~2.5 x 105細胞) 細胞の 2.5 mL を追加、アンプルの蓋とガスの拡散を許可する媒体の間は十分な空気を確保します。
- すぐに必要に応じて、ペンチを使用して、キャップを締めます。密封されたアンプルは、空気の流れを使用して任意の外部の破片を削除するをきれいにし、熱量計の 1 の位置にアンプルをゆっくりと下ろします。アンプルは 1 の位置に下がる時間を記録します。
- 15 分の 1 の位置に座っているアンプルを許可します。
注: この 15 分間は、細胞呼吸 (手順 5) に注入されるべきです。これにより、CR の比率が決定するときに、熱発生量と酸素消費量の時間の同じ間隔を使用します。 - 位置 1 で 15 分後のリファレンスとサンプルの両方のアンプル 2 の位置までゆっくりと下ろします。時間、アンプルが引き下げられると、少なくとも 30 分のための測定を記録します。
5. 呼吸
- アンプルがカロリメータの位置 1 は 15 分間隔、中に進入します研究を開始します。
- 同種のソリューションを確認し注入ピペッティングにより細胞サンプルを徹底的にミックス < ~ 106セル/室 × 2 の最終濃度計の各チャンバーに細胞サンプルを 50 μ l 添加します。呼吸度計に細胞を注入時間を記録します。
- HepG2 細胞を継続的に 37 ° C で攪拌注入後酸素流量と酸素濃度の安定した減少の両方安定化のため、少なくとも 20 〜 30 分を待ちます。
- 画面の右上あたり V O2フラックスタブを選択し、酸素流量の安定した部分を強調表示。マーク、統計、および V 当たり O2フラックスのレコード データを選択します。この記録は、CR 率の計算に使用されます。
注: 5.5、5.6 の手順はオプションです。漏れの呼吸と最大の共役呼吸オリゴマイシンおよび FCCP の滴定によって明らかにされます。 - 各チャンバーに 4 mg/mL オリゴマイシンの 1 μ L を注入でき 〜 酸素のフラックスの安定化のため 10 分。以下の手順でレコードの安定したリーク呼吸オリゴマイシン添加後酸素フラックス トレースの安定した部分を強調することによって 5.4 で実行されます。
- 0.2 mM の FCCP 各商工会議所に各投与後酸素フラックス安定化を可能にする 2 μ L 注入を滴定しなさい。最大磁束に到達するまで、後続 FCCP 滴定のわずかな低下によって示されるように、滴定を続けます。最大磁束中安定した呼吸を記録します。
6. Calorespirometric 比の計算
- 作製したサンプルの最後のセルの数を数えるため 〜 1 x 10 の5セル/mL アンプル (2.5 mL) に追加されるセルの合計数を決定するための診断のすべての 8 のフィールドを活用しました。
- 熱量計法と安定した信号が同じ時間に存在する計から測定を記録する時間を決定します。アンプルは位置 2 と呼吸度計にセルの注入の時間に低下したときに記録された時間を参照します。
- ステップと μ/100万セルとして急行を決められた時点で尊敬のアンプルの熱出力を表示するトレースの上にカーソルを置くと、熱生産を記録します。酸素消費量データを収集し、pmol O2倍の 100万個 x s-1として表現されることを確認します。
- CR の比率を計算するために μ を kJ/秒に変換し、kJ/mol O2として表される CR 比を取得する O2/s の mol 以上 kJ/s を分割します。注: CR 率は kJ/mol O2で提示されます。
(補足のファイル 1を参照してください)
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Representative Results
Calorespirometric 測定値の再現性は、適切かつ一貫性のある試料に依存します。培養細胞から調製したサンプル使用しないでくださいプレートが大きくなり過ぎた場合細胞数は凝集のため不正確になることができます。さらに、限られた基板周辺固定支持の細胞の拡散による熱フローが発生する可能性があります。したがって、付着性のセルを使用する場合は、60-80% の confluency にプレートを選択して媒体の実験の前に 24 時間を変更する重要です。
適切な機器の校正とメンテナンスは、有益であり、再現性のある calorespirometric の測定のために重大。に従って、製造元の確立工場の洗浄のプロトコル、エタノールと広範な洗浄残留疎水性脱共役剤と阻害剤が削除され。、測定値を部分的に妥協しないように実装されます。抑制または連結を解くミトコンドリア。計室が試料測定前に動作しているとき酸素濃度と酸素フラックス トレースは図 1に示すように、安定したする必要があります。POS は、センサーの修理が必要な場合、図 2に見られるように酸素流量は安定しません。POS は、適切に処理しない場合、測定を実行できませんする必要があります。また、アンプル カロリメータで利用する必要があります洗浄、殺菌、乾燥し、使用前に生物学的汚染がサンプルの熱生産を妨げることができます。
適切な校正と工場のカロリメータ準備後セルのサンプルが用意されています。まず、工場でストッパーが閉じられ、商工会議所は空気泡が存在しないことを確認する検査します。HepG2 細胞が 〜 呼吸の 10650 μ × 2 に集中し、すぐに氷の上に配置します。熱量測定法の集中のサンプルから HepG2 細胞は釣合い DMEM で 〜 105セル/mL × 1 で希釈しました。セルが徹底的にピペッティングして混合、懸濁液 2.5 mL 滅菌アンプルに追加されます。アンプルは密閉し、任意の外部の残骸が空気ポンプからの空気の流れとアンプルを吹くことによって取除かれます。アンプル、ゆっくりと 15 分間残ります、1 の位置に下げます。15 分経過後、リファレンスとサンプルの両方のアンプルは、2 の位置までゆっくりと下げ、熱出力は安定しています (図 3) 一度記録する測定を開始できます。
最後のセル数は、カロリメータと呼吸度計、熱量計に導入された細胞の正確な数を決定するためにセルを追加した後に実行されます。熱産生は、100万個につき、表されます。HepG2 細胞のブドウ糖の不在で培養しているし、ガラクトースはミトコンドリアの関与を高めるため補われる、セル、カロリメータ内部増殖を行うが代わりにアンプルの約 30 分後、代謝活性の低下します。これは熱放散を測定した最も早い時点に CR 計算を制限されます (図 4)。
セルはアンプルに追加されるので、熱生産と酸素消費量の測定は、同一時点で収集された時間を記録するが重要です。この予防措置が取られなかった場合、CR 率の決定に重要な実験誤差を導入できます。15 分の期間中に、アンプルは、カロリメータの位置 1、セルは十分それらをピペッティングにより混合、2 x 10 の6セルを介して呼吸にハミルトン シリンジを注入します。酸素流量が安定後、約 15 分と酸素濃度安定的に減少 (図 5)。また、データ分析のためのサンプル注入時間が記録されているが重要です。CR 比を計算するとき、セルの安定化酸素流量は酸素消費量のサロゲートとして機能します。後呼吸を増加する失敗によって示される低酸素流量と最大の共役呼吸 (2 μ L FCCP の 3-5 滴定) にドロップによって示されるリーク呼吸 (1 μ L オリゴマイシン) を評価するために実行される追加の滴定連続FCCP 滴定。不完全な連結を解く、または呼吸の阻止はできません FCCP 株式が (図 6) を期限が切れているかどうかは観察されました。
呼吸のポーラロ グラフ法による酸素センサー (POS) の状態図 1: 100% 空気校正します。(青線) の酸素濃度、酸素流量 (赤い線) の信号の両方に 100% の空気校正前に安定します。安定したラインを示す呼吸度計校正のため準備ができています。H2O をしないと、DMEM でキャリブレーションを実行必要がありますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: POS サービスを必要としています。酸素濃度 (ブルー トレース) の安定化後、酸素流量 (赤いトレース) は安定させるために失敗します。実験のため、POS を使用しないでくださいし、メーカーの使用説明とサービスを適用する必要があります。酸素流量の増加不安定 POS サービス需要の増加と相関します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 約 2.5 x 10 の5 HepG2 細胞がグルコース培地で培養、カロリメータの増殖の兆しを見せています。アンプルあたりグルコースの存在下で培養した ~2.5 x 105 HepG2 細胞を読み込み-20-28 μ 計測器の 30 μ の設定を使用してから一定熱生産を生成し、時間の経過と共に増加熱生産が細胞の増殖と相関アンプルの中。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 約 2.5 倍の 105 HepG2 細胞ガラクトース培地中で培養増殖していない時間をかけて生産が減少を熱します。ガラクトースの即時熱生産にアンプルあたりで ~2.5 x 105 HepG2 細胞を読み込み ~-20 μ。ただし、熱生産は時間の経過とともに減少、CR 比測定実験の早い時期のポイントを制限します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: ルーチンされておよび HepG2 細胞の呼吸をリークします。細胞呼吸度計が注入され、一度酸素濃度は (青いトレース) を着実に減少しました。そのままなセルの日常呼吸時に酸素流量 (赤のトレース) の安定化後、オリゴマイシンは F0F1-ATP 合成酵素を阻害するのに追加されました。これは明らかにリーク呼吸オリゴマイシン添加後酸素流量の安定化によって示されます。ATP 合成から呼吸を切り離すと、電子輸送システム (ETS) の容量を明らかにするため、FCCP の約 3-5 滴定を行わなければなりません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: HepG2 細胞の呼吸の失敗した脱共役します。セルを追加後、酸素ルーチン呼吸と酸素濃度が着実に減少 (青線) の中に安定化 (赤のトレース) のフラックスします。FCCP の滴定結果不完全な連結を解くことと最終的な抑制、到達することから最大の ETS 量を防止します。FCCP は、可能性が高い汚染された長期保管から低下しました。観察、新鮮な FCCP 在庫が準備されなければなりません。また、そのオリゴマイシン連結を解くことの間に ETS 能力を阻害しないを確認します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
Calorespirometry の目的は、好気性と嫌気性代謝経路の貢献を定量的に評価し、細胞のエネルギー流束の複合ビューを取得することです。これは、熱放散と同等理論 oxycaloric の計算の CR 率の比較に続いて酸素流量の同時測定で。いくつかの重要なステップは、再現性のある信頼性の高いデータの考慮されなければなりません。滅菌、健康な細胞培養のメンテナンスが重要です。細菌や真菌による汚染流用熱生産や酸素消費量、CR 率の無意味なレンダリング可能性があります。さらに、不適切なセルをカウント、ミキシング、貧しい人々 のサンプルまたは周辺固定支持細胞は、不正確な CR 率にも 。呼吸度計に関しての重要なステップは適切な試料注入はボリュームに 50 μ L 以下です。このボリュームは、商工会議所から中の最小限の量を転置し、酸素消費量が 2 x 10 の6セルに正しく帰属を保証します。日常の呼吸を観察すると、一度提案プロトコルは 2 つ追加滴定 (オリゴマイシンおよび FCCP) リーク呼吸とミトコンドリアの ETS 容量を照らすと互換性が。このアプリケーションは、FCCP の過剰な添加を呼吸を阻害し、最大磁束; を防ぐためしたがって、最大の共役呼吸を到達する前に、少なくとも 3-5 滴定を行わなければなりません。
メンテナンスと計熱量計の適切な校正 calorespirometry のため重要です。背景酸素消費量の滴定プロトコルは、強くお勧め、チャンバー内の酸素濃度の低下のレベルに達するにハイドロサルファイトの段階滴定で実行されます。低酸素分圧の測定が実行される場合は特に、これは堅く密封された部屋を確認し、酸素室に逆拡散の修正に必要な措置です。また、細胞添加前に攪拌テストを実行すると、POS の応答性に関する情報を提供できます。場合の応答性が悪い、または酸素流量ではない安定した (図 2)、POS へのサービスが必要です。阻害剤や脱共役剤は、その後の実験に影響を与える可能性がありますの残留量を残すことが呼吸室の不適切なクリーニングします。密閉室で空気泡の測定と干渉することが可能ですまた、導入できますサンプル注入時に商工会議所の終了時に注射器内の空気の泡がある場合。熱量計のプロトコルより直接的も実験的エラーを起こしやすい。たとえば、アンプルの不適切なシーリングには、蒸発が発生し大規模な熱の流れを変更するができます。
このメソッドの制限の 1 つは、いないすべてのセルは懸濁液で培養することができ、多くの細胞は、細胞培養プレートや基質に付着。実験を実行するために接続されたセルはトリプシンなど解離エージェントを使用してプレートから外れする酵素によってする必要があります。この状態で細胞が対数増殖期にないかもしれないし、自分の生理機能を変更可能性があります。したがって、その後の分析を介して熱量計法と最近トリプシンの細胞の呼吸を評価する可能性があります携帯電話の活動を中断しました。さらに、提案する熱量プロトコルの制限は同封のアンプルでは、水溶液中の低酸素の拡散によるセルの周囲のローカル低酸素症につながる可能性がありますセルの堆積です。〜 105セル × 3 が上限このプロトコルで使用するアンプルと互換性があることを定めています。細胞の数を増やす結果を損なうこと、細胞の沈降から低酸素環境を生成できます。したがって、最適化は、別のセルの行を行い細胞24の沈降を抑えるに中程度の密度の増加などの代替アプローチを見なす場合重要です。アンプルがあります許可を攪拌。ただし、最小限の信号対雑音比が攪拌中に存在するために重要です。さらに、このプロトコルで採用されているもの以外にも熱量は calorespirometry と互換性があるとその能力、我々 が提示している以外。Calorespirometric 解析を介して別の制限 2 室計は高スループット分析、医薬品開発に最も関連するとなることができません。ただし、この制限は、呼吸鎖とミトコンドリアの生理に影響を及ぼす化合物の高分解能解析のための容量によって相殺されます。
同じサンプルからの熱出力と酸素流の高解像度で同時測定のための能力は、このメソッドの重要な強さです。両方の文化に付着性のセルを使用する場合の潜在的なゴールド スタンダードとマイクロ ・ キャリア ビーズ懸濁液の上に成長した細胞を分析します。このメソッドは、細胞培養面から解離の負の影響を避けるためし、成長曲線 (対数段階対接触抑制相7) のさまざまな段階の細胞機能の解析を可能にします。残念ながら、マイクロ ・ キャリア ビーズを使用して呼吸度計と攪拌棒の下にセルとともにビーズの研削加工の可能性に必要な高い攪拌速度のため問題となります。これらの制限にもかかわらずアプリケーションの広い範囲のまま calorespirometry と互換性があります。特に、このメソッドはより迅速に培養細胞における mitotoxic の化合物を識別することによって医薬品開発を容易にする態勢を整えています。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この仕事の一部メアリー é. Konkle とマイケル ・ a. Menze に国立科学財団助成金チェ 160944 によって資金を供給されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HepG2 Cells | American Type Culture Collection | HB-8065 | Cells used for calorespirometry |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | Respirometer |
| LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) | Thermometric AB | Thermometric was purchased by TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | 100x solution added to DMEM medium |
| Fetal Bovine Serum - Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | Added to 10% in DMEM medium |
| Trypsn-EDTA (0.25%) | Thermofisher Scientific | 25200072 | Cell dissociation reagent |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Sigma Aldrich | O4876 | Mitochondrial Inhibitor |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | Mitochondrial Uncoupler |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning Corporation | 430167 | Tissue culture dish |
| Glucose, powder | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose for DMEM medium |
| Galactose, powder | Fischer Scientific | BP656500 | Galactose for DMEM medium |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher Scientific | 25030081 | Glutamine for DMEM medium |
| DMEM, no glucose | Thermofisher Scientific | 11966025 | Cell culture medium |
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