Summary
ويصف هذا البروتوكول كالوريسبيروميتري، والقياس المباشر والمتزامن لتبديد الحرارة والتنفس، والتي تنص على اتباع نهج موسع لتقييم الطاقة الأيض. يتم استخدام هذا الأسلوب لتقييم مساهمة الممرات الهوائية واللاهوائية على حد سواء لاستخدام الطاقة عن طريق رصد تدفق إجمالي الطاقة الخلوية.
Abstract
العديد من خطوط الخلايا المستخدمة في الأبحاث البيولوجية والطبية الأساسية الحفاظ على التوازن الطاقة من خلال مزيج من التنفس الهوائي واللاهوائي على السواء. ومع ذلك، مدى إسهام كل المسارات في المناظر الطبيعية لإنتاج الطاقة الخلوية التغاضي عن استمرار. تحول الخلايا المستزرعة في تشبع مستويات الجلوكوز في كثير من الأحيان إظهار تبعية انخفاض في الفسفرة لإنتاج ATP، والتي عوضت زيادة في مستوى الركازة الفسفرة. ويسمح هذا التحول في الأيض اتزان الخلايا تنتشر على الرغم من وجود السموم المتقدرية. في إهمال اتزان الأيضية تغيير الخلايا المحولة، قد يساء تفسير نتائج فحص الأدوية منذ يحتمل أن تكون الآثار ميتوتوكسيك قد لا يمكن الكشف عنها باستخدام خطوط الخلايا نموذج مثقف حضور الجلوكوز عالية تركيزات. ويصف هذا البروتوكول الاقتران من اثنين من التقنيات القوية، ريسبيروميتري، والقياس، مما يسمح للتقييم الكمي وموسع للمساهمات سواء الهوائية أو اللاهوائية لإنتاج ATP الخلوي. ريسبيريشنز الهوائية واللاهوائية على حد سواء توليد الحرارة، التي يمكن رصدها عن طريق القياس. ومن ناحية أخرى، يمكن قياس معدل استهلاك الأوكسجين إلى تقييم مدى التنفس الهوائي. عندما يتم قياس الفقد الحراري واستهلاك الأكسجين في نفس الوقت، يمكن تحديد نسبة كالوريسبيروميتريك. يمكن بعد ذلك مقارنة القيمة التي تم الحصول عليها تجريبيا إلى أوكسيكالوريك نظرية تعادل ويمكن الحكم على مدى التنفس اللاهوائي. وهكذا، كالوريسبيروميتري يوفر طريقة فريدة لتحليل طائفة واسعة من المسائل البيولوجية، بما في ذلك تطوير العقاقير والنمو الميكروبي والاستقلاب الأساسية تحت نورموكسيك وظروف التاكسج.
Introduction
في الأنظمة البيولوجية، تغير الحرارة-الإصدار أو محتوى حراري أثناء التمثيل الغذائي عادة رصد أما مباشرة (عن طريق القياس المباشر) أو غير مباشر عن طريق استهلاك2 س و/أو إنتاج2 CO (عبر ريسبيروميتري). لسوء الحظ، عندما تستخدم هذه التقنيات بمعزل عن غيرها، المعلومات الهامة المفقودة، مثل مساهمة مسارات اللاهوائية الأيض الخلوية. كالوريسبيروميتري هي تقنية قوية تعتمد على قياس المتزامنة لتبديد الحرارة والتنفس. كالوريسبيروميتريك أعمال رائدة التحقيق الأيض اللاهوائي في خلايا الثدييات اﻷوكسيجين تماما وأظهرت المساهمات المتزامنة للممرات الهوائية واللاهوائية على حد سواء إلى التوازن الطاقة على الرغم من الخلايا المحولة يجري في 1من البيئة اﻷوكسيجين تماما. منذ ذلك الحين طبق كالوريسبيروميتري على طائفة واسعة من المسائل البيولوجية. وتشمل بعض الأمثلة على دراسة علم الطاقة الحيوانية في مستويات منخفضة الأكسجين، وآثار مبيدات الأعشاب والاستروجين في الخياشيم ذات الصدفتين والتمثيل الغذائي للكائنات الأرضية والتحلل الميكروبي للتربة العضوية هذه المسألة2، 3 , 4 , 5 , 6-وعلاوة على ذلك، قد كالوريسبيروميتري preconditioning الأيضية كيف كشفت قبل تجميد يحسن نعد الثدييات خلايا7. كل نهج، القياس وريسبيروميتري، وقد ازداد بشكل مستقل معرفتنا بالاستقلاب الخلوي والعضوي. ومع ذلك، تظل الأسئلة البيولوجية الأساسية التي يمكن الإجابة عن طريق استخدام كالوريسبيروميتري غير مستكشفة نسبيا.
القانون في هيس تنص على أن تغيير إجمالي محتوى حراري رد فعل مستقل عن المسار بين الدول الأولية والنهائية. على سبيل المثال، تغيير مجموع المحتوى الحراري لمسار الكيمياء الحيوية هو مجموع التغير في انثالبيس لجميع ردود الفعل داخل المسار. القياس يقدم نهجاً في الوقت الحقيقي لقياس إنتاج الحرارة الخلوية، مما يكشف الممرات الهوائية واللاهوائية على حد سواء دون تمييز. ويستند هذا على أساس أن يتم تبادل لا الطاقة في النظام إلا من خلال الجدران ampule التجريبية8. تغيير في تبديد الحرارة من مساوياً للتغيير في محتوى حراري صدر من جميع التفاعلات الأيضية في أمبولي. وهكذا، يرتبط محتوى حراري سلبي إلى فقدان الحرارة من النظام. أبحاث مستفيضة على مدى العقود الأربعة الماضية اتسم المشهد دينامي حراري الانتقاض وابتناء. ويمثل هذا ارتفاع مطرد في المقالات والبحوث الموجودة تحت مصطلحات البحث "البيولوجية" و "القياس" كما فهرستها بالولايات المتحدة الوطنية مكتبة للطب (NLM) في "المعاهد الوطنية للصحة" (PubMed). البحث يكشف عن أنه قبل عام 1970، ما مجموعة 27 المنشورات المرجعية القياس البيولوجي؛ وفي الوقت نفسه، استخدمت المنشورات 546 في عام 2016 وحدها، التقنية.
أساليب المسعريه راسخة لتحديد إنتاج الحرارة. ومع ذلك، يمنح قدرا أكبر من المرونة لحسم قيمة ريسبيروميتريك. يمكن أن تتكون بقياس ريسبيروميتريك من س2،2من أول أكسيد الكربون، أو كل من س2 و CO2. علاوة على ذلك، يمكن به قياس س2 أو CO2 تقنيات مختلفة، بما في ذلك أوبتروديس وكهربائي من نوع كلارك والانضباطي صمام ثنائي ليزر الامتصاص الطيفي7،9،10 ،11. المتوسطة للخلايا المستزرعة أثناء إنتاج2 CO مقياس قيمة في كثير من الدراسات ريسبيروميتريك، كثيرا ما يستخدم نظام المخزن مؤقت بيكاربونيك لدرجة الحموضة التحكم12،13. لتجنب المضاعفات الناجمة عن قياس2 CO في النظام بيكربونات، يستخدم البروتوكول التالي كالوريسبيروميتري الخلايا في ثقافة س2 كمعلمة ريسبيروميتريك الوحيد.
وبالتزامن مع قياس تدفق الأكسجين، ريسبيروميتيرس معينة (انظر الجدول للمواد) مصممة لتقييمات مفصلة للوظيفة المتقدرية. بروتوكولات (كوي) الركيزة-أونكوبلير-مثبط-معايرات هي راسخة ومتوافقة مع تجارب مصممة لقياس غشاء الأكسجين المحتملة أو رد الفعل الأنواع (روس) تشكيل14. البروتوكول المقدم من أجل كالوريسبيروميتري خلايا سليمة متوافق مع مقدمة أونكوبليرس الكيميائية مثل الكربونيل السيانيد-فتريفلوروميثوكسيفينيلهيدرازوني (فككب) وأوليجوميسين و0و1-ATP synthase المانع. عن طريق إضافة فككب، يمكن أن يكون استهلاك الأكسجين أونكوبليد من إنتاج ATP، ومفيدة تقييم أثر العلاجات المحتملة على أداء المتقدرية15. وعلاوة على ذلك، إضافة أوليجوميسين ينير مدى تسرب للتنفس. وهكذا، ريسبيروميتريك القياسات التي يتم إجراؤها أثناء كالوريسبيروميتري متوافقة مع البروتوكولات واسعة النطاق تهدف إلى توضيح فسيولوجيا المتقدرية.
يسمح قياس المتزامن لتبديد الحرارة وتدفق الأكسجين لحساب نسبة كالوريسبيروميتريك (الجمهورية التشيكية). ثم تتم مقارنة هذه النسبة ثورنتون الثابت أو أوكسيكالوريك نظرية تعادل، التي تتراوح بين-430 إلى-480 kJ mol-1 استناداً إلى خط الخلية أو النسيج لمصلحة و ركائز الكربون المكملة1، 16. وهكذا، يكشف نسبة CR أكثر سلبية زيادة المساهمات من مسارات اللاهوائية للنشاط الأيضي عموما. على سبيل المثال، تتراوح نسبة CR تنفس أنسجة العضلات الروتينية دون أداء العمل النشط-448-468 kJ mol-1 التي تدخل في نطاق ما يعادل17،أوكسيكالوريك النظري18. وفي الوقت نفسه، الخلايا السرطانية الثديية مثقف في المتوسط هو ارتفاع في مستوى السكر في عرض تخمير حمض الالكتيك المعزز عقب تحلل والمنخفضة نسبيا لمشاركة المتقدرية19. نتائج هذا النمط الظاهري في نسب CR في النطاق من-490 إلى-800 كيلو جول مول-1، مما يدل على تزايد مشاركة مسارات اللاهوائية في الأيض الخلوية كما أشار إلى ذلك أكثر سلبية CR نسب1،7، ،من 1620.
الموزعين على حد سواء تجارية وغير هادفة للربح الخلايا والأنسجة حاليا خطوط الخلايا العرض من أكثر من 150 نوعا، مع ما يقرب من 4,000 من خطوط الخلايا المستمدة من البشر. خطوط خلية مخلدة هي أدوات ملائمة لتقييم سمية المداواة المحتملين، كثير منها قد مباشر أو غير مباشر تتداخل مع مهام المتقدرية بسرعة. باستخدام الخلايا المحولة خلال فحص المخدرات قد تكون محدودة القيمة التنبؤية جزئيا بسبب تأثير واربورغ، سمة مميزة لكثير من أنواع السرطان. في كثير من الأحيان، سرطانات توليد ATP من الركازة المستوى الفسفرة والحفاظ على توازن الأكسدة والاختزال من خلال إنتاج لاكتات دون الانخراط الكامل في ميتوكندريا تحت الظروف الهوائية19. تطوير المستحضرات الصيدلانية المعروف مكلفة وغير فعالة، مع ما يقرب من 8 من أصل 9 مركبات اختبارها في التجارب السريرية البشرية عاجزة عن تحقيق السوق الموافقة على21. بينما العلاجات المحتملة قد تمر الفحص الأولى بسبب انخفاض سيتوتوكسيسيتي في خطوط الخلايا، فمن الممكن أن بعض هذه المركبات ميتوتوكسيك. دون وسيلة مناسبة للكشف عن كيف يمكن أن يعوق هذه السموم ميزان الطاقة في الخلايا الأولية التي لا يتم عرض تأثير واربورغ، المعلومات الهامة غالباً ما بدأ الإفراط، bottlenecking التنمية العلاجية في المراحل المبكرة.
كالوريسبيروميتري نهج عملي موسع لتحليل النشاط الأيضي في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية، بما في ذلك الخلايا والأنسجة. جوهر البروتوكول عرض متوافق مع مجموعة من التطبيقات. ومع ذلك، حددت واحدة من المضاعفات،. وكثيراً ما تستزرع خلايا مخلدة في متوسط خالية من السكر وتستكمل مع اللبن لزيادة مساهمة الفسفرة (أوكسفوس) لإنتاج الطاقة، من أجل توعية الخلايا المحتملة ميتوتوكسينس22، 23. هذا إعادة برمجة الأيضية ويبدو أن يحجب التحليل عند وضع العينات في امبولات الفولاذ المقاوم للصدأ تستخدم قبل مسعر15. الخلايا المزروعة في متوسط جلوكوز مواصلة الانخراط في النشاط الأيضي عالية لعدة ساعات. وفي الوقت نفسه، الخلايا المستزرعة في المتوسط اللبن انخفاض إنتاج الحرارة داخل 30 دقيقة من وضعهم في أمبولي، مما يجعل قياسات تقتصر على النقاط الزمنية التجريبية المبكرة. ويعوق هذا السلوك، لسوء الحظ، الفرصة لتقييم انتشارها الخلوية. وعلى الرغم من هذا القيد محددة، معظم تطبيقات متوافقة مع التحليل كالوريسبيروميتريك ويمكن الحصول على معلومات مفصلة الأيضية عن طريق هذا النهج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-خلية ثقافة
- الحفاظ على البشرية سرطانه الخلية الكبدية (HepG2) الخلايا في المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو (دميم) التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS) وركائز إضافية (الجلوكوز 10 ملم والجلوتامين 2 مم وبيروفات 1 مم) عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثقافة خلية (5% CO2 ، 95% من الهواء، والرطوبة 100 ٪).
ملاحظة: استخدام صياغة دميم أعلاه عند الرجوع إلى دميم في خطوات لاحقة ريسبيروميتري والقياس. - لوحة الخلايا في 1 × 106 خلايا الواحدة 100 مم لوحة الثقافة وثقافة فرعية لها كل 7 أيام أو قبل أن تصل إلى 90% كونفلوينسي وتجديد في المتوسط كل 3-4 أيام.
- إجراء التجارب عندما تكون روافد 60-80% من الخلايا.
2-إعداد ريسبيروميتير ومسعر
- بيبيت مل 2.2 من دميم في قاعة ريسبيروميتير، إدراج السدادة كاملا، وضبطه باستخدام أداة مباعدة سداده للسماح بنشر الأوكسجين المثلى من الجو إلى متوسط.
- يقلب باستمرار في 37 درجة مئوية حتى تركيز الأكسجين (تتبع الأزرق) وتدفق الأوكسجين (تتبع الأحمر) مستقرة. ضمان البرامج ريسبيروميتير مبرمجة لحساب للذوبان الأوكسجين من الوسيلة المستخدمة في التجربة.
ملاحظة: وسائل الإعلام المختلفة لديها معاملات الذوبان الأوكسجين مختلفة (مثلاً، دميم = 0.92). - بعد استقرار تركيز الأكسجين في دميم مع فتح الدائرة، حدد جزء ثابت من تتبع تركيز الأكسجين ومعايرة تشبع الهواء 100%.
- معايرة للأكسجين 0% تحديد جزء ثابت من تتبع تركيز الأوكسجين عند لا الأكسجين موجود في الدائرة. القيام بهذه الخطوة بعد 20 ميليلتر المعايرة من 230 ملم ديثيونيتي الصوديوم أو بعد تستهلك الأوكسجين جميع العينات البيولوجية في نهاية التجربة.
- بعد إغلاق السدادة معايرة الهواء 100% من ريسبيروميتير، والتأكد من أن لا فقاعات موجودة في الدائرة.
ملاحظة: زيادة طفيفة في تدفق الأكسجين سوف يتم الكشف عن في قاعة مغلقة كأجهزة الاستشعار الأوكسجين بولاروجرافيك (POS) يستهلك الأوكسجين من أجل قياس ضغط الأكسجين الجزئي. - بعد ~ 10 دقيقة من سداده إغلاق، تأكيد أن ريسبيروميتير جاهز للخلايا HepG2 بمراقبة تدفق الأوكسجين مستقرة.
ملاحظة: مسعر المستخدمة هنا يستخدم امبولات الفولاذ المقاوم للصدأ، ويتطلب ampule واحدة لاستخدامها كمرجع. - إضافة 2.5 مل ح2س (dH2س) [حجم متساوية العينات (الخطوة 4)] إلى أمبولي مرجع مسعر وتشديد عملية النداءات الموحدة، باستخدام كماشة إذا لزم الأمر. تنظيف ampule مختومة مع تدفق الهواء وانخفاض أمبولي لوضع 1 في قناة الإشارة مسعر ببطء. تبقى في الموضع 1 حتى يتم إعداد العينات البيولوجية.
3-إعداد الخلايا HepG2 ريسبيروميتري والقياس
- وتؤكد أن ريسبيروميتير ومسعر هي إعداد ومعايرة. حارة دميم والتربسين إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- إضافة دميم طازجة 100 ملم اللوحة والمكان في الحاضنة للسماح للموازنة المتوسط لكل من أول أكسيد الكربون2 ودرجة الحرارة.
ملاحظة: سيتم استخدام هذه الوسيلة للتجربة القياس، وبحجم مناسب يعتمد على عدد امبولات التي سيتم استخدامها. - تأكيد مع مجهر مقلوب خفيفة أن الخلايا في روافد 60-80%، ثم أغسل 2 x لوحة 100 ملم مع 10 مل من درجة حرارة الغرفة مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
- أضف 3 مل التربسين ج 37 ° لوحة 100 ملم من الخلايا واحتضانها لهم لمدة 7-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الخلية. تحييد التربسين مع 3 مل من 37 ° "ج دميم" وتعليق بلطف بيبيتينج من 20 مرات ~ مع بيبيت 5 مل.
- نقل مل 6 خلايا حراكه في دميم والتربسين في أنبوب مخروطي 15 مل عقيمة والطرد المركزي أنه لمدة 5 دقائق في 175 س زاي إزالة السائل دون إزعاج بيليه الخلية.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في ~ 5 مل من دميم وبيبيت من دقة للتأكد من الخلايا هي بما فيه الكفاية فصلها عن بعضها البعض.
- إزالة ~ 100 ميكروليتر من عينة مختلطة جيدا وأداء عدد خلايا شامل الاستفادة من جميع الميادين 8 في هيموسيتوميتير لتحديد العدد الإجمالي للخلايا. ثم حساب الحجم لاستثارة الخلايا من أجل توليد ~ 2 × 106 خلايا للواحد 50 ميليلتر.
ملاحظة: هذا يضمن أن تتم إضافة 2 × 106 خلايا لكل دائرة من ريسبيروميتير مع التشرد متوسط الحد الأدنى. - الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 175 س زاي ريسوسبيند بيليه في حجم دميم المحسوبة من الخطوة 3، 7.
- نفذ عدد خلايا لتحديد الحجم المطلوب لحقن الخلايا 2 × 106 كل دائرة في ريسبيروميتير (وينبغي أن يكون هذا ~ 50 ميليلتر). تخزين الخلايا لقياس ريسبيروميتريك على الجليد حتى جاهزة.
- بينما تكون العينة خلية تتركز على الجليد، تحديد التخفيف اللازم لإنتاج بتركيز 1 × 105 خلايا/مليلتر بالنسبة القياس.
- تخلط العينة جيدا وإعداد ~ 3 مل الخلايا في 1 × 105 خلايا/مل في دميم لكل أمبولي.
ملاحظة: يجب أن يكون دميم المستخدمة لتمييع عينة المتوسطة متوازن إعدادها في الخطوة 3، 3.
4-القياس
- ضمان أن مسعر متصل بالكمبيوتر وإشارة المسعريه في µW يمكن ملاحظتها ومستقرة.
- إضافة إلى كل ampule 2.5 مل الخلايا في 1 × 105 خلايا/مل (~2.5 x 105 خلايا)، ضمان الهواء كافية بين غطاء أمبولي والمتوسطة للسماح بنشر الغاز.
- فورا تشديد عملية النداءات الموحدة، باستخدام كماشة إذا لزم الأمر. تنظيف ampule مختومة، باستخدام تدفق الهواء لإزالة أي حطام الخارجية، وانخفاض أمبولي لوضع 1 مسعر ببطء. سجل الوقت خفضت أمبولي موقف 1.
- السماح أمبولي على الجلوس في الموضع 1 لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: الخلايا خلال هذه الفترة 15 دقيقة، أن حقن ريسبيروميتير (الخطوة 5). وهذا ما يضمن أن يتم استخدام نفس الفاصل الزمني لإنتاج الحرارة واستهلاك الأوكسجين عندما يتم تحديد نسبة CR. - وبعد 15 دقيقة في موقف 1، انخفاض ببطء امبولات كل مرجع وعينه لموقف 2. تسجيل الوقت خفضت امبولات والتدبير لمدة 30 دقيقة على الأقل.
5-ريسبيروميتري
- خلال الذي أمبولي في الموضع 1 في مسعر الفاصل الزمني 15 دقيقة، تبدأ الدراسات ريسبيروميتريك.
- دقة مزج العينة الخلية بيبيتينج لضمان حل متجانسة وحقن < 50 ميكروليتر من عينة خلية في كل دائرة من ريسبيروميتير لتركيز نهائي من ~ 2 × 106 خلايا/الدائرة. سجل الوقت يتم حقن الخلايا ريسبيروميتير.
- بعد الحقن، أثارت الخلايا HepG2 هي باستمرار عند 37 درجة مئوية. الانتظار على الأقل 20-30 دقيقة لكل استقرار تدفق الأوكسجين وانخفاض مطرد في تركيز الأكسجين.
- حدد علامة التبويب س2 التمويه الواحدة الخامس على يمين الشاشة وتسليط الضوء على جزء ثابت من تدفق الأوكسجين. حدد علامات، ثم من إحصاءات وبيانات السجل للتمويه2 س كل ت. سيتم استخدام هذا التسجيل في حساب نسبة CR.
ملاحظة: الخطوات 5.5 و 5.6 اختيارية. وسيتم الكشف عن تسرب في التنفس والتنفس أونكوبليد القصوى بالمعايرة أوليجوميسين وفككب. - حقن 1 ميليلتر من أوليجوميسين 4 مغ/مل في كل دائرة وتسمح ~ 10 دقيقة لاستقرار تدفق الأوكسجين. تسرب مستقرة سجل معدل التنفس باتباع الخطوات التي يؤديها في 5.4 تسليط الضوء على جزء ثابت من تتبع تدفق الأوكسجين بعد إضافة أوليجوميسين.
- تيتراتي حقن 2-ميليلتر من 0.2 مم فككب في كل دائرة، مما يسمح للأكسجين التمويه الاستقرار بعد كل حقن. مواصلة المعايرة حتى يتم التوصل إلى تدفق القصوى، كما هو مبين بانخفاض طفيف في المعايرة فككب اللاحقة. سجل معدل التنفس مستقرة خلال الجريان القصوى.
6-حساب النسبة كالوريسبيروميتريك
- إجراء عد نهائي خلية من العينات التي أعدت في ~ 1 × 105 خلايا/مل تستخدم جميع ميادين 8 هيموسيتوميتير لتحديد العدد الإجمالي للخلايا إضافة إلى أمبولي (2.5 مل).
- تحديد وقت لتسجيل القياسات من مسعر وريسبيروميتير فيه إشارات ثابتة موجودة في أوقات مماثلة. مرجع تسجيل الوقت عندما خفضت في أمبولي إلى موقف 2 والوقت من حقن الخلايا في ريسبيروميتير.
- سجل إنتاج الحرارة عن طريق وضع المؤشر فوق تتبع عرض الإخراج الحرارة ل ampule محترمة في الوقت الذي تحدد في الخطوة وصريح كخلايا µW/مليون. جمع بيانات استهلاك الأكسجين، وضمان أن يتم التعبير عنه ك pmol س2 x s-1 × ملايين الخلايا.
- لحساب نسبة CR، أولاً تحويل µW كيلوجول/s، ومن ثم تقسيم كيلوجول/s خلال mol/س2ق للحصول على نسبة CR معبراً كيلوجول/مول س2. ملاحظة: يتضمن نسبة CR كيلوجول/مول س2.
(انظر 1 ملف تكميلي)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إمكانية تكرار نتائج القياسات كالوريسبيروميتريك يعتمد على تحضير عينة سليمة ومتسقة. عينات أعد من خلية ثقافة ينبغي إلا إذا هي متضخمة اللوحات، كما يمكن أن يصبح عدد خلايا غير دقيقة بسبب التثاقل. كذلك، قد تحدث تدفقات الحرارة المخفضة بسبب نشر الركازة محدودة في الخلايا تحبب خفيف. لذلك، عند استخدام خلايا ملتصقة، من الأهمية بمكان لتحديد لوحة مع كونفلوينسي بين 60-80% وتغيير متوسطة 24 ساعة قبل التجربة.
معايرة الآلي السليم والصيانة أيضا حاسمة بالنسبة لقياسات كالوريسبيروميتريك الزاخر بالمعلومات واستنساخه. أنشأت الشركة المصنعة ببعد التنظيف البروتوكول ريسبيروميتير، وتنفذ يغسل واسعة النطاق مع الإيثانول ضمان أونكوبليرس مسعور المتبقية ومثبطات، تتم إزالة ولا تمس القياسات بشكل جزئي الميتوكوندريا المثبطة أو يفصل. عندما تعمل الدائرة ريسبيروميتير قبل قياس عينة، ينبغي أن يكون تركيز الأكسجين وآثار تدفق الأكسجين مستقر كما هو مبين في الشكل 1. إذا نقاط البيع في حاجة إلى خدمة أجهزة الاستشعار، عدم استقرار تدفق الأكسجين كما هو مبين في الشكل 2. لا يمكن إجراء القياسات عند نقاط البيع لا تقدم الخدمات بشكل صحيح. بالإضافة إلى ذلك، امبولات المستخدمة في مسعر ينبغي أن تكون تنظيف وتعقيم وتجفف قبل الاستخدام، كالتلوث البيولوجي يمكن أن تتداخل مع إنتاج الحرارة من العينة.
وتعد عينات الخلايا بعد معايرة السليم وإعداد ريسبيروميتير ومسعر. أولاً، مغلق السدادة في ريسبيروميتير ويتم تفتيش الدائرة لضمان لا فقاعات هواء موجودة. ثم، تتركز على ~ 2 × 10650 ميليلتر ريسبيروميتري HepG2 الخلايا وتوضع فورا على الجليد. للقياس، هي تضعف الخلايا HepG2 من العينة تتركز في دميم متوازن في ~ 1 × 105 خلايا/مل. بعد الخلايا يتم خلطها بشكل تام قبل بيبيتينج، تتم إضافة 2.5 مل التعليق إلى ampule عقيمة. محكم مختومة أمبولي، ويتم إزالة أي حطام الخارجية التي تهب ampule مع تيار الهواء من مضخة هواء. أمبولي ثم يخفض ببطء موقف 1، حيث يظل لمدة 15 دقيقة. بعد مرت 15 دقيقة، ثم تخفض امبولات كل مرجع وعينه ببطء إلى موقف 2، وقياسات يمكن البدء بتسجيلها بمجرد إخراج الحرارة هو مستقر (الشكل 3).
يتم تنفيذ عدد خلايا نهائية بعد إضافة الخلايا مسعر وريسبيروميتير لتحديد العدد الدقيق للخلايا التي أدخلت مسعر. ثم أعرب عن إنتاج الحرارة الواحدة ملايين الخلايا. إذا الخلايا HepG2 تستزرع في غياب الجلوكوز واللبن هو تكملة لزيادة مشاركة المتقدرية، الخلايا لا تتكاثر داخل مسعر، ولكن بدلاً من تقليل نشاطها الأيضي بعد حوالي 30 دقيقة في أمبولي. وهذا يقيد الحساب CR إلى أقرب نقطة في الوقت الذي تم قياسه بتبديد الحرارة (الشكل 4).
من المهم لتسجيل الوقت الخلايا تتم إضافة إلى أمبولي حيث أنه يتم جمع قياسات استهلاك الأوكسجين وإنتاج الحرارة في نقاط زمنية متطابقة. إذا لم تتخذ هذه الاحتياطات، يمكن إدخال أخطاء تجريبية هامة في تحديد نسبة CR. خلال فترة 15 دقيقة، في حين أمبولي في الموضع 1 في مسعر، تختلط الخلايا بما فيه الكفاية من بيبيتينج لهم، ويتم حقن 2 × 106 خلايا في ريسبيروميتير عن طريق حقنه هاملتون. استقرار تدفق الأوكسجين بعد حوالي 15 دقيقة والأكسجين تركيز انخفاضات مطردة (الشكل 5). ومرة أخرى، من الأهمية بمكان أن يتم تسجيل وقت حقن عينة لتحليل البيانات. تدفق الأوكسجين استقرت الخلايا يخدم كبديل لاستهلاك الأوكسجين عند حساب نسبة CR. تتم المعايرة إضافية لتقييم التنفس تسرب (1 ميليلتر أوليجوميسين) يتبين من انخفاض إلى انخفاض تدفق أكسجين والتنفس أونكوبليد القصوى (3-5 المعايرة من 2 ميليلتر فككب) أشارت إلى عدم زيادة التنفس بعد المتعاقبة فككب المعايرة. قد لا تكون فصل غير مكتملة أو تثبيط التنفس ولاحظ إذا كان المخزون فككب انتهت (الشكل 6).
معايرة الهواء الرقم 1:100 % ريسبيروميتير ومركز للاستشعار الأكسجين بولاروجرافيك (POS). الإشارات لتركيز الأكسجين (الخط الأزرق) وتدفق الأوكسجين (الخط الأحمر) على حد سواء استقرار قبل معايرة الهواء 100%. خطوط مستقرة تشير إلى أن ريسبيروميتير استعداد للمعايرة. ينبغي إجراء المعايرة في دميم، وليس في ح2O. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: نقاط البيع التي تحتاج إلى الخدمة- بعد استقرار تركيز الأكسجين (تتبع الأزرق)، يفشل تدفق الأوكسجين (تتبع الأحمر) لتحقيق الاستقرار. لا ينبغي أن تستخدم في نقاط البيع للتجريب وينبغي تطبيق الخدمة كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. يرتبط زيادة عدم استقرار تدفق الأوكسجين مع زيادة طلب على خدمة نقاط البيع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: حوالي 2.5 × 105 HepG2 الخلايا المستزرعة في المتوسط الجلوكوز تظهر علامات على الانتشار في مسعر. تحميل خلايا5 HepG2 ~2.5 x 10 مثقف حضور الجلوكوز كل ampule يولد إنتاج حرارة ثابتة من-20 إلى µW-28 باستخدام الإعداد 30-µW على الصك ويرتبط إنتاج حرارة زيادة على مر الزمن مع انتشار الهاتف الخلوي داخل أمبولي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تتكاثر حوالي 2.5 × 105 HepG2 الخلايا المستزرعة في المتوسط اللبن والحرارة انخفاض الإنتاج على مر الزمن لا. تحميل ~2.5 x 105 HepG2 الخلايا المستزرعة في اللبن كل النتائج أمبولي في إنتاج حرارة مباشرة ~ µW-20. بيد أن إنتاج الحرارة تتناقص بمرور الوقت ويحد من قياسات CR-نسبة إلى نقاط الوقت المبكر من التجربة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: روتينية، فصل، وتسرب تنفس الخلايا HepG2- بمجرد تم حقن الخلايا ريسبيروميتير، انخفض تركيز الأكسجين اطراد (تتبع الأزرق). بعد استقرار تدفق الأوكسجين (تتبع أحمر) أثناء التنفس الروتينية لخلايا سليمة، تمت إضافة أوليجوميسين إلى تمنع و0و1-ATP synthase. يدل على ذلك استقرار تدفق الأوكسجين بعد إضافة أوليجوميسين، الذي يكشف عن تسرب للتنفس. ينبغي القيام بحوالي 3-5 في المعايرة من فككب فصل التنفس من التوليف ATP وتكشف عن قدرة نظام (ETS) نقل الإلكترون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: الهدف غير ناجحة تنفس الخلية HepG2- بعد إضافة الخلايا، تدفق الأوكسجين استقرت (تتبع الأحمر) خلال الروتينية التنفس والأكسجين تركيز تناقص مطرد (الخط الأزرق). معايرة فككب أسفرت فصل غير مكتملة وتثبيط في نهاية المطاف، يحول دون التوصل إلى قدرة ETS القصوى. فككب المحتمل الملوثة أو المتدهورة من التخزين على المدى الطويل. إذا لاحظت، يجب أن يكون مستعدا بمخزون فككب طازجة. أيضا، تأكد من أن أوليجوميسين لا يعوق قدرة ETS خلال فصل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كالوريسبيروميتري يهدف إلى تقييم كمي مساهمات الممرات الهوائية واللاهوائية للنشاط الأيضي والحصول على صورة مركبة لتدفق الطاقة الخلوية. يتم ذلك عن طريق قياس متزامن لتبديد الحرارة وتدفق الأوكسجين تليها مقارنة مع أوكسيكالوريك نظرية تعادل نسبة CR المحسوبة. يجب النظر في عدة خطوات حاسمة لبيانات موثوق بها واستنساخه. المحافظة على ثقافة الخلية معقمة وصحية أمر بالغ الأهمية. قد يؤدي التلوث بالبكتريا أو الفطريات في استهلاك الحرارة المختلسة الإنتاج أو الأكسجين، مما يجعل نسبة CR لا معنى لها. خلية غير لائق، وكذلك التهم، عينة الفقراء الاختلاط، أو خلايا تحبب خفيف يمكن أن يؤدي أيضا إلى نسبة CR غير دقيقة. خطوة بالغة الأهمية فيما يتعلق ريسبيروميتير إعداد نموذج مناسب حيث يكون الحقن أدناه 50 ميليلتر في وحدة التخزين. ويضمن هذا الحجم مقداراً قليلاً من المتوسط مشردون من الدائرة واستهلاك الأكسجين ويعزى بشكل صحيح إلى 2 × 106 خلايا. حالما يتم ملاحظة التنفس الروتينية، البروتوكول المقترح متوافق مع المعايرة إضافية اثنين (أوليجوميسين وفككب)، التي تضيء تسرب التنفس وقدرة ETS الميتوكوندريا. لهذا التطبيق، يمكن أن تعوق التنفس المفرط إضافة فككب ومنع تدفق القصوى؛ ولذلك، ينبغي إجراء المعايرة على الأقل 3-5 قبل الوصول إلى التنفس أونكوبليد القصوى.
صيانة ومعايرة السليم لكل من ريسبيروميتير ومسعر حاسم بالنسبة كالوريسبيروميتري. يوصي بشدة ببروتوكول المعايرة لاستهلاك الأوكسجين الخلفية ويتم تنفيذها مع المعايرة تدريجي من ديثيونيتي للوصول إلى مستويات انخفاض الأكسجين داخل الدائرة. وهذا تدبير ضروري لتأكيد الدوائر محكم مختومة وتصحيح للأكسجين نشرها مرة أخرى في الدوائر، وخاصة إذا كان يتم إجراء قياسات في توتر أكسجين منخفض. أيضا، إجراء اختبار محرض قبل إضافة الخلايا يمكن أن توفر معلومات عن مدى استجابة نقاط البيع. إذا كانت الاستجابة الفقيرة أو تدفق الأوكسجين ليست مستقرة (الشكل 2)، خدمة لنقاط البيع مطلوب. تنظيف غير لائق للدوائر ريسبيروميتير، يمكن أن تترك وراءها المبالغ المتبقية من مثبطات أو أونكوبليرس، مما قد يؤثر على التجارب اللاحقة. فقاعات الهواء في دائرة مغلقة هي أيضا قادرة على التدخل مع القياسات ويمكن إدخال أثناء إغلاق الدائرة أو حقن عينة إذا فقاعات الهواء موجودة ضمن المحاقن. البروتوكول مسعر أكثر مباشرة، ولكن كما أنها عرضه للأخطاء التجريبية. على سبيل المثال، سيتيح الختم غير لائق ampule التبخر تحدث على نطاق واسع الذي يتغير تدفق الحرارة.
أحد أوجه القصور في هذا الأسلوب هو أنه ليست كافة الخلايا يمكن أن يكون مثقف في تعليق والعديد من خطوط الخلايا ملتصقة بلوحة الثقافة الخلية أو الركيزة. للقيام بتجارب، بالخلايا المرفقة يمكن فكها انزيماتيكالي من لوحة عن طريق استخدام عوامل التفكك مثل التربسين. الخلايا في هذه الحالة قد لا يكون في مرحلة النمو لوغاريتمي، وقد يكون تغيير علم وظائف الأعضاء. وهكذا، التحليل اللاحق عن طريق مسعر وريسبيروميتير من الخلايا تريبسينيزيد مؤخرا قد تقييم تعطلت الأنشطة الخلوية. علاوة على ذلك، هو قيد في البروتوكول المسعريه قدم ترسب الخلايا في امبولات المغلقة، مما قد يؤدي إلى نقص المحلية حول الخلايا بسبب انتشار الأكسجين بطيئا في المحاليل. لقد حددنا أن ~ 3 × 105 الخلايا هو الحد الأعلى متوافقة مع امبولات المستخدمة في هذا البروتوكول. زيادة عدد الخلايا يمكن أن تولد بيئة التاكسج من ترسب الخلايا، والمساس بالنتائج. وهكذا، الأمثل أمر بالغ الأهمية إذا كان خط خلية مختلفة يتم التحقيق فيها، وينبغي النظر في النهج البديلة مثل زيادة كثافة متوسطة لتقليل ترسيب الخلايا24. تتوفر امبولات هذا التصريح إثارة؛ ومع ذلك، أنها حاسمة لضمان نسبة الإشارة إلى الضوضاء الحد أدنى حاضرا التحريك. بالإضافة إلى ذلك، لقياسات المسعريه إلى جانب واحد يعمل بهذا البروتوكول متوافقة مع كالوريسبيروميتري وقد تكون قدراتها تتجاوز ما قدمنا. قيد آخر من كالوريسبيروميتريك التحليل عن طريق ريسبيروميتير مجلسين هو عدم القدرة لتحليل الإنتاجية العالية، التي ستكون الأكثر ملاءمة لتطوير المستحضرات الصيدلانية. غير أن هذا القيد، تقابله القدرة على توصيف الاستبانة من تأثير المجمع في سلسلة التنفس وفسيولوجيا المتقدرية.
القدرة على قياس الحرارة دفق الإخراج والأكسجين من نفس العينة ذات الدقة العالية والمتزامنة على حد سواء قوة كبيرة من هذا الأسلوب. معيار الذهب محتملة عند استخدام خلايا ملتصقة بكل ثقافة وتحليل الخلايا المزروعة في الخرز ميكروكارير في تعليق. هذا الأسلوب أن تجنب الآثار السلبية للانفصال من على سطح الثقافة الخلية والسماح لتحليل الوظائف الخلوية في مراحل مختلفة من منحنى النمو (مرحلة لوغاريتمي مقابل مرحلة تحول دون الاتصال7). لسوء الحظ، يمكن استخدام الخرز ميكروكارير إشكالية بسبب إثارة عالية السرعة المطلوبة في ريسبيروميتير وإمكانات لطحن حبات جنبا إلى جنب مع الخلايا أسفل شريط إثارة. على الرغم من هذه القيود، ما زالت طائفة واسعة من التطبيقات المتوافقة مع كالوريسبيروميتري. على وجه الخصوص، هذا الأسلوب تستعد لزيادة تسهيل التنمية الصيدلانية بتحديد سرعة المركبات ميتوتوكسيك في الخلايا المستزرعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل جزئيا بمنحه "مؤسسة العلوم الوطنية" تشي-160944 كونكلي هاء ماري ومايكل ألف منز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HepG2 Cells | American Type Culture Collection | HB-8065 | Cells used for calorespirometry |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | Respirometer |
| LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) | Thermometric AB | Thermometric was purchased by TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | 100x solution added to DMEM medium |
| Fetal Bovine Serum - Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | Added to 10% in DMEM medium |
| Trypsn-EDTA (0.25%) | Thermofisher Scientific | 25200072 | Cell dissociation reagent |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Sigma Aldrich | O4876 | Mitochondrial Inhibitor |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | Mitochondrial Uncoupler |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning Corporation | 430167 | Tissue culture dish |
| Glucose, powder | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose for DMEM medium |
| Galactose, powder | Fischer Scientific | BP656500 | Galactose for DMEM medium |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher Scientific | 25030081 | Glutamine for DMEM medium |
| DMEM, no glucose | Thermofisher Scientific | 11966025 | Cell culture medium |
References
- Gnaiger, E., Kemp, R. B. Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux. Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).
- Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications. Chemistry & Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).
- Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).
- Wadso, L., Hansen, L. D. Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems. Methods. 76, 11-19 (2015).
- Gnaiger, E. Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry. Strategies for Gas Exchange and Metabolism. Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. , Cambridge University Press. London. 149-171 (1991).
- Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism. Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).
- Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation. Cryobiology. 61, 79-88 (2010).
- Webb, P. Human Calorimetry. , ABC-CLIO, LCC. Santa Barbara, CA. In Volume 7 of Endocrinology and Metabolism Series (1985).
- Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism. Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).
- Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis. Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).
- Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry. Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).
- Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry. Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).
- Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues. Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone. Cell and Tissue Research. , (2017).
- Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells. Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).
- Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat. The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).
- Paul, R. J. Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C. Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Kemp, R. B. Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells. Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).
- Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death. Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).
- Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64, 985-993 (2004).
- Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures. Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).
