Summary
Questo protocollo descrive calorespirometry, la misura diretta e simultanea di dissipazione di calore e di respirazione, che fornisce un approccio non invasivo per valutare il metabolismo energetico. Questa tecnica è utilizzata per valutare il contributo delle vie sia aerobiche e anaerobiche per l'utilizzazione di energia di monitoraggio del flusso totale di energia cellulare.
Abstract
Molte linee cellulari utilizzate nella ricerca biologica e biomedica di base mantengono l'omeostasi energetica attraverso una combinazione di respirazione sia aerobico che anaerobico. Tuttavia, nella misura in cui sia vie contribuiscono al paesaggio della produzione di energia cellulare è costantemente trascurata. Trasformato le cellule coltivate in saturando i livelli di glucosio spesso mostrano una dipendenza in diminuzione su fosforilazione ossidativa per la produzione di ATP, che viene compensata da un aumento nella fosforilazione del substrato-livello. Questo spostamento nell'equilibrio metabolico permette alle cellule di proliferare nonostante la presenza di tossine mitocondriali. Trascurando l'alterato equilibrio metabolico delle cellule trasformate, i risultati di uno screening farmaceutico potrebbero essere interpretata erroneamente dal potenzialmente effetti mitotoxic non possono essere rilevati utilizzando modello linee cellulari coltivate in presenza di elevati del glucosio concentrazioni. Questo protocollo descrive l'accoppiamento di due potenti tecniche, manometrica e Calorimetria, che consente la valutazione quantitativa e non invadente dei contributi sia aerobici ed anaerobici per la produzione di ATP cellulare. Respirazioni sia aerobici ed anaerobici generano calore, che può essere monitorato tramite calorimetria. Nel frattempo, la misurazione del tasso di consumo di ossigeno può valutare l'entità della respirazione aerobica. Quando sia la dissipazione di calore e consumo di ossigeno sono misurati simultaneamente, il rapporto di calorespirometric può essere determinato. Il valore ottenuto sperimentalmente può essere confrontato all'equivalente di oxycaloric teorico e nella misura della respirazione anaerobica può essere giudicata. Così, calorespirometry fornisce un metodo unico per analizzare una vasta gamma di domande biologiche, tra cui lo sviluppo di farmaci, la crescita microbica e bioenergetica fondamentale sia in normossia e in condizioni di ipossia.
Introduction
Nei sistemi biologici, il rilascio di calore o entalpia cambiamento durante il metabolismo è in genere monitorati sia direttamente (tramite diretta calorimetria) o indirettamente tramite il consumo di O2 e/o produzione di CO2 (via manometrica). Sfortunatamente, quando queste tecniche sono utilizzate in isolamento, informazioni critiche vengono perse, come il contributo delle vie anaerobiche al metabolismo cellulare. Calorespirometry è una potente tecnica che si basa sulla misurazione simultanea di dissipazione di calore e di respirazione. Calorespirometric lavoro pionieristico studiato il metabolismo anaerobico in cellule di mammiferi completamente ossigenate e dimostrato contributi simultanei dei percorsi sia aerobici che anaerobici di omeostasi energetica nonostante le cellule trasformate in un ambiente completamente ossigenato1. Calorespirometry da allora è stato applicato a una vasta gamma di domande biologiche. Alcuni esempi includono lo studio dell'animale energetica a bassi livelli di ossigeno, gli effetti di erbicidi e di estrogeno sulle lamelle di molluschi bivalvi, il metabolismo degli organismi terrestri e la decomposizione microbica di materia organica del suolo2, 3 , 4 , 5 , 6. Inoltre, calorespirometry ha rivelato come metabolica precondizionamento prima del congelamento migliora la crioconservazione di mammiferi celle7. Ogni approccio, sia calorimetria e manometrica, indipendentemente ha aumentato la nostra conoscenza della bioenergetica cellulare e organismica. Tuttavia, fondamentali domande biologiche che possono essere risolte attraverso l'uso di calorespirometry rimangono relativamente inesplorate.
Leggi di Hess afferma che la variazione di entalpia totale di una reazione è indipendente del pathway tra gli stati iniziali e finali. Ad esempio, la variazione di entalpia totale per una via biochimica è la somma della variazione di entalpie di tutte le reazioni all'interno della via. Calorimetria offre un approccio in tempo reale per misurare la produzione di calore cellulare, che rileva indiscriminatamente vie sia aerobiche che anaerobiche. Questo si basa sul fondamento che nessuna energia viene scambiata nel sistema tranne attraverso le pareti della fiala sperimentale8. Un cambiamento nella dissipazione del calore è uguale al cambiamento di entalpia rilasciato da tutte le reazioni metaboliche in fiala. Così, un negativo entalpia correla ad una perdita di calore dal sistema. Ricerche approfondite negli ultimi quattro decenni ha caratterizzato il paesaggio termodinamico di anabolismo e catabolismo. Questo è rappresentato da un aumento costante nella ricerca articoli trovati sotto i termini di ricerca "biologici" e "calorimetria" come indicizzato dallo Stati Uniti National Library di medicina (NLM) presso il National Institutes of Health (PubMed). La ricerca rivela che prima del 1970, un totale di 27 pubblicazioni riferimento biologico calorimetria; nel frattempo, nel 2016 da solo, 546 pubblicazioni utilizzato la tecnica.
Metodi calorimetrici sono ben stabiliti per determinare la produzione di calore. Tuttavia, una maggiore flessibilità è concesso per la risoluzione il valore respirometriche. La misurazione respirometriche può consistere di O2, CO2, o O2 e CO2. Ulteriormente, la misura di O2 o CO2 può essere compiuta mediante varie tecniche, tra cui optrodes, Clark-tipo di elettrodi e diodo tunable laser assorbimento spettroscopia7,9,10 ,11. Mentre la produzione di CO2 è una metrica preziosa in molti studi respirometriche, il supporto per le cellule coltivate spesso utilizza un sistema di buffer di bicarbonic per controllo pH12,13. Per evitare complicazioni di CO2 misura nel sistema di bicarbonato, il seguente protocollo per la calorespirometry delle cellule nella cultura utilizza O2 come unico parametro respirometriche.
In concomitanza con cambiamento continuo dell'ossigeno di misurazione, alcuni respirometers (Vedi Tabella materiali) sono progettati per valutazioni dettagliate della funzione mitocondriale. Substrato-disaccoppiatore-inibitore-titolazioni (SUIT) protocolli sono ben stabiliti e sono compatibili con gli esperimenti progettati per misurare la membrana potenziale o reattive dell'ossigeno (ROS) specie formazione14. Il protocollo presentato per calorespirometry di cellule intatte è compatibile con l'introduzione della chimica uncouplers come Carbonil cianuro-p-trifluorometossifenil idrazone (FCCP) e l'inibitore oligomycin di F0F1-ATP sintasi. Attraverso l'aggiunta di FCCP, consumo di ossigeno può essere disgiunto dalla produzione di ATP, che è utile per valutare l'impatto di potenziali terapie su mitocondriale peformance15. Inoltre, l'aggiunta di oligomycin si illumina nella misura della respirazione di perdita. Così, le misure respirometriche eseguite durante calorespirometry sono compatibili con protocolli vasti progettati più ulteriormente per delucidare fisiologia mitocondriale.
La misura simultanea di dissipazione di calore e di cambiamento continuo dell'ossigeno consente il calcolo del rapporto calorespirometric (CR). Questo rapporto viene quindi confrontato con costante di Thornton o il oxycaloric teorico equivalente, che spazia tra -430 a-480 kJ mol-1 a seconda della varietà di cellula o tessuto di interesse e il carbonio completati substrati1, 16. quindi, un rapporto più negativo di CR rivela maggiori contributi da vie anaerobiche per complessivo activity. Ad esempio, il rapporto di CR per la respirazione dei tessuti muscolo routine senza l'attiva delle prestazioni di lavoro varia da-448 a-468 kJ mol-1 che è all'interno della gamma del oxycaloric teorico equivalente17,18. Nel frattempo, le cellule tumorali dei mammiferi coltivate in medium che è ad alto contenuto di glucosio visualizzare fermentazione acido lattico avanzata seguendo la glicolisi e relativamente basso coinvolgimento mitocondriale19. Questo risultati di fenotipo in rapporti di CR nell'intervallo di-490 a-800 kJ mol-1, dimostrando una maggiore partecipazione delle vie anaerobiche nel metabolismo cellulare come indicato da più negativa CR rapporti1,7, 16,20.
Distributori di cellule e tessuti sia commerciali che senza scopo di lucro attualmente offerta linee cellulari provenienti da oltre 150 specie, con quasi 4.000 linee cellulari derivano da esseri umani. Linee cellulari immortalizzate sono strumenti utili per valutare rapidamente la tossicità delle terapie potenziali, molte delle quali possono interferire direttamente o indirettamente con funzioni mitocondriali. Utilizzando cellule trasformate durante lo screening di stupefacenti può essere di limitato valore predittivo in parte a causa dell'effetto di Warburg, un segno distintivo di molti cancri. Spesso, i cancri generano ATP da fosforilazione del substrato-livello e mantengono l'equilibrio redox attraverso la produzione di lattato senza impegnarsi pienamente il mitocondrio sotto condizioni aerobiche19. Sviluppo farmaceutico è notoriamente costoso ed inefficiente, con circa 8 su 9 composti provati nei test clinici umani non riuscendo a ottenere l'approvazione del mercato21. Mentre terapeutica potenziale può passare uno screening iniziale a causa della bassa citotossicità nelle linee cellulari, è possibile che alcuni di questi composti sono mitotoxic. Senza un metodo adatto per rilevare come queste tossine possono alterare l'equilibrio di energia nelle cellule primarie che non vengono visualizzati l'effetto Warburg, informazione critica è spesso sovra-sembrava, strozzature sviluppo terapeutico nelle fasi iniziali.
Calorespirometry è un approccio pratico, non invadente per analizzare l'attività metabolica in una varietà di campioni biologici, compreso le cellule e tessuti. Il nucleo del protocollo presentato è compatibile con una gamma di applicazioni. Una complicazione, tuttavia, è stata identificata. Cellule immortalizzate sono spesso coltivate in un medium privo di glucosio, completato con galattosio per aumentare il contributo della fosforilazione ossidativa (OXPHOS) per la produzione di energia, al fine di sensibilizzare le cellule a potenziali mitotoxins22, 23. Questa riprogrammazione metabolico sembra oscurare analisi quando i campioni vengono inseriti nelle fiale di acciaio inossidabile utilizzate dal calorimetro15. Le cellule coltivate in un medium del glucosio continuano ad impegnarsi in alta attività metabolica per diverse ore. Nel frattempo, le cellule coltivate in medium galattosio diminuiscono la produzione di calore entro 30 min della loro collocazione in fiala, effettuare misure limitate ai punti di tempo sperimentale in anticipo. Questo comportamento, purtroppo, ostacola la possibilità di valutare la loro proliferazione cellulare. Nonostante questa limitazione specifica, la maggior parte delle applicazioni sono compatibili con l'analisi calorespirometric e dettagliate informazioni metaboliche possono essere ottenute attraverso questo approccio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. coltura cellulare
- Mantenere cellule epatocellulari umane di carcinoma (HepG2) nel mezzo dell'Aquila per volta di Dulbecco (DMEM) contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e ulteriori substrati (10 millimetri di glucosio, glutammina 2 mM e 1 mM piruvato) a 37 ° C in un'incubatrice di coltura delle cellule (5% CO2 , aria di 95%, 100% di umidità).
Nota: Utilizzare la precedente formulazione di DMEM quando DMEM viene fatto riferimento nei passaggi successivi per manometrica e calorimetria. - Piastra le cellule a 1 x 106 cellule per piastra di coltura di 100 mm e sottocultura loro ogni 7 giorni o prima di raggiungere confluency di 90% e rinnovare il mezzo ogni 3-4 giorni.
- Eseguire gli esperimenti quando le cellule sono 60-80% confluenti.
2. preparazione del respirometro e calorimetro
- Dispensare 2,2 mL di DMEM nell'alloggiamento respirometro, mettere il tappo completamente e regolare con lo strumento di tappo distanziale per consentire per diffusione ottimale dell'ossigeno dall'aria al mezzo.
- Mescolate continuamente a 37 ° C fino a quando la concentrazione di ossigeno (traccia blu) e il flusso di ossigeno (traccia rossa) sono stabili. Garantire che software di respirometro è programmato per contabilizzare la solubilità dell'ossigeno del medium usato nell'esperimento.
Nota: Diversi media hanno coefficienti di solubilità di ossigeno differente (ad es., DMEM = 0,92). - Dopo la stabilizzazione della concentrazione di ossigeno in DMEM con la camera aperta, selezionare una parte stabile della traccia di concentrazione di ossigeno e calibrare per saturazione dell'aria di 100%.
- Calibrare per 0% ossigeno selezionando una parte stabile della traccia di concentrazione di ossigeno quando l'ossigeno non è presente in aula. Eseguire questo passaggio dopo titolazione di µ l 20 di 230 mM Ditionito di sodio o dopo tutto l'ossigeno viene consumato da campione biologico alla fine di un esperimento.
- Dopo la calibrazione con 100% aria del respirometro, chiudere il tappo e assicurarsi che non ci sono bolle siano presenti in aula.
Nota: un leggero aumento nel cambiamento continuo dell'ossigeno verrà rilevato in camera chiusa come il Sensore polarografico di ossigeno (POS) consuma ossigeno al fine di misurare la pressione parziale di ossigeno. - Dopo ~ 10 min del tappo chiuso, confermare che il respirometro è pronto per cellule HepG2 osservando un flusso di ossigeno stabile.
Nota: Il calorimetro usato qui utilizza Ampolle in acciaio inox e richiede una fiala da utilizzare come riferimento. - Aggiungere 2,5 mL di H2O (dH2O) [volume uguale come i campioni (passaggio 4)] per la fiala di riferimento del calorimetro e serrare il tappo, con una pinza, se necessario. Pulire la fiala sigillata con flusso d'aria e abbassare lentamente la fiala alla posizione 1 nel canale di riferimento del calorimetro. Rimangono nella posizione 1 fino a quando il campione biologico viene preparato.
3. preparazione delle cellule HepG2 Respirometry e Calorimetria
- Confermare che il respirometro e calorimetro sono preparati e calibrati. Caldo DMEM e tripsina a 37 ° C in un bagno d'acqua.
- Aggiungere DMEM a un fresco 100 mm di spessore e posto nell'incubatrice per consentire l'equilibrazione del mezzo per CO2 e la temperatura.
Nota: Questo mezzo verrà essere utilizzato per l'esperimento di calorimetria, così il volume appropriato dipende dal numero di fiale che verrà utilizzato. - Confermare con un microscopio ottico invertito che le cellule sono al 60-80% confluenti, poi lavare il 100 mm piastra 2 x 10 ml di soluzione tampone fosfato (PBS) e temperatura ambiente.
- Aggiungere 3 mL della tripsina di 37 ° C per la piastra di 100 mm delle cellule e loro Incubare per 7-10 min a 37 ° C nell'incubatore di cultura cellulare. Neutralizzare la tripsina con 3 mL di 37 ° C DMEM e sospendere pipettando delicatamente e ~ 20 volte con una pipetta da 5 mL.
- Trasferire i 6 mL di sedimento cellule in DMEM e tripsina in una provetta conica sterile di 15 mL e si centrifuga per 5 min a 175 x g. rimuovere il liquido senza disturbare il pellet cellulare.
- Risospendere il pellet cellulare in ~ 5 mL di DMEM e dispensare accuratamente per garantire le cellule sono sufficientemente dissociato da altra.
- Rimuovere ~ 100 µ l del campione omogeneizzato ed eseguire un conteggio accurato delle cellule utilizzando 8 tutti i campi su un emocitometro per determinare il numero totale delle cellule. Quindi calcolare il volume per la risospensione delle cellule al fine di generare ~ 2 x 106 cellule per 50 µ l.
Nota: Questo garantisce che 2 x 106 cellule vengono aggiunti a ciascuna camera del respirometro con minimo medio dislocamento. - Centrifugare le cellule per 5 min a 175 x g. Risospendere il pellet nel volume calcolato di DMEM dal punto 3.7.
- Eseguire un conteggio delle cellule per determinare il volume necessario per iniettare 2 x 106 cellule per camera nel respirometro (questo dovrebbe essere ~ 50 µ l). Conservare le cellule per la misurazione respirometriche su ghiaccio fino al momento.
- Mentre il campione concentrato cellulare è sul ghiaccio, determinare la diluizione necessaria per produrre una concentrazione di 1 x 105 cellule/mL per la calorimetria.
- Mescolare bene il campione e preparare ~ 3 mL delle cellule a 1 x 105 cellule/mL in DMEM per ogni fiala.
Nota: Il DMEM utilizzato per la diluizione del campione dovrebbe essere il mezzo equilibrato preparato al punto 3.3.
4. calorimetria
- Assicurarsi che il calorimetro è collegato al computer e il segnale calorimetrico in µW è osservabile e stabile.
- Aggiungere 2,5 mL delle cellule a 1 x 105 cellule/mL (~2.5 x 105 celle) per ogni fiala, garantire aria sufficiente è tra il coperchio della fiala ed il mezzo per consentire per la diffusione del gas.
- Immediatamente stringere il tappo, con una pinza, se necessario. Pulire la fiala sigillata, utilizzando il flusso d'aria per rimuovere eventuali detriti esterni e abbassare lentamente la fiala in posizione 1 del calorimetro. Registrare il tempo che la fiala è abbassata in posizione 1.
- Consentire la fiala per sedersi nella posizione 1 per 15 min.
Nota: Durante questo periodo di 15 minuti, le cellule sono deve essere iniettato in respirometro (passo 5). Questo assicura che lo stesso intervallo di tempo viene utilizzato per la produzione di calore e consumo di ossigeno quando il rapporto di CR è determinato. - Dopo 15 min in posizione 1, abbassare lentamente fiale del campione sia il riferimento alla posizione 2. Registrare il tempo che le fiale sono state abbassate e misura per almeno 30 min.
5. respirometry
- Durante l'intervallo di 15 minuti in cui la fiala è alla posizione 1 nel calorimetro, iniziano gli studi respirometrici.
- Mescolare bene il campione di cellule pipettando per garantire una soluzione omogenea e iniettare < 50 µ l di campione cellulare in ogni camera del respirometro per una concentrazione finale di ~ 2 x 106 cellule/camera. Registrare il tempo, che le cellule vengono iniettate il respirometro.
- Dopo l'iniezione, le cellule HepG2 sono continuamente agitate a 37 ° C. Attendere almeno 20-30 min per entrambi una stabilizzazione del flusso ossigeno ed una costante diminuzione della concentrazione di ossigeno.
- Selezionare la scheda flusso di2 O a V sulla destra dello schermo ed evidenziare una parte stabile del flusso di ossigeno. Selezionare indicatori, quindi le statistiche e dati del record per flusso2 O a V. Questa registrazione verrà utilizzata nel calcolo del rapporto CR.
Nota: Passaggi 5.5 e 5.6 sono facoltativi. Perdita di respirazione e la respirazione disgiunto massima sarà rivelati di titolazioni di oligomycin e FCCP. - Iniettare 1 µ l di oligomycin 4mg/mL in ogni camera e consentire ~ 10 min per la stabilizzazione del flusso di ossigeno. Tasso di respirazione di perdita stabile record eseguendo i passaggi eseguiti in 5.4 mettendo in evidenza una parte stabile della traccia del flusso di ossigeno dopo l'aggiunta di oligomycin.
- Titolare le iniezioni di 2-µ l di 0,2 mM FCCP in ogni camera, consentendo per la stabilizzazione di flusso di ossigeno dopo ogni iniezione. Continuano le titolazioni fino a quando il flusso massimo è raggiunto, come indicato da un lieve calo la successiva titolazione FCCP. Registrare il tasso di respirazione stabile durante il flusso massimo.
6. calcolo del rapporto di Calorespirometric
- Eseguire un conteggio finale delle cellule dei campioni preparati a ~ 1 x 105 cellule/mL utilizzando 8 tutti i campi di un emocitometro per determinare il numero totale di celle aggiunte alla fiala (2,5 mL).
- Determinare un tempo per i valori di misurazione dal calorimetro e respirometro in cui sono presenti a volte identici segnale stabile. Riferimento che il tempo registrato quando la fiala è stata abbassata a posizione 2 e il tempo di iniezione delle cellule nel respirometro.
- Registrare la produzione di calore posizionando il cursore sopra la traccia visualizzare l'output di calore per la fiala rispettata al momento determinato nel passaggio ed espressa come µW/milioni di cellule. Raccogliere dati sul consumo di ossigeno e garantire che si esprime come pmol O2 x s-1 1x milioni di cellule.
- Per calcolare il rapporto di CR, prima convertire µW in kJ/s e quindi dividere kJ/s per mol di O2/s per ottenere il rapporto CR espresso in kJ/mol O2. Nota: Il rapporto di CR è presentato in kJ/mol O2.
(Vedi 1 FIle supplementari)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La riproducibilità delle misurazioni calorespirometric dipende da una preparazione del campione corretto e coerente. Campioni preparati da coltura cellulare non devono essere utilizzati se le piastre sono invasi, come i conteggi delle cellule possono diventare imprecisi a causa di agglutinamento. Inoltre, flussi di calore ridotta a causa della diffusione di substrato limitato nelle cellule ragruppate possono verificarsi. Pertanto, quando si utilizza cellule aderenti, è fondamentale per selezionare un piatto con la confluenza tra 60-80% e di cambiare il mezzo 24 h prima dell'esperimento.
Manutenzione e calibrazione strumentale corretta sono anche critici per le misure calorespirometric informativo e riproducibile. Seguendo il fabbricante stabilito protocollo di pulizia per il respirometro, vasti lavaggi con etanolo sono attuate per garantire che inibitori e uncouplers idrofobo residui vengono rimossi e non compromettano le misure di parzialmente mitocondri inibendo o disgiungere. Quando la camera di respirometro sta funzionando prima la misura campione, sia la concentrazione di ossigeno e le tracce di flusso di ossigeno dovrebbero essere stabile, come mostrato nella Figura 1. Se il POS ha bisogno di servizio di sensore, il flusso di ossigeno non si stabilizzerà come si vede nella Figura 2. Misure non dovrebbero essere effettuate quando il POS non viene gestito correttamente. Inoltre, le fiale utilizzate nel calorimetro dovrebbero essere pulite, sterilizzate e asciugate prima dell'uso, come contaminazione biologica può interferire con la produzione di calore del campione.
Campioni di cellule sono preparati dopo la calibrazione corretta e la preparazione di entrambi il respirometro e il calorimetro. In primo luogo, il tappo del respirometro è chiuso e la camera è ispezionata per assicurare che bolle d'aria non sono presenti. Quindi, cellule HepG2 sono concentrate a ~ 2 x 10650 µ l per manometrica e immediatamente posti su ghiaccio. Per calorimetria, cellule HepG2 dal campione concentrato sono diluite in DMEM equilibrato a ~ 1 x 105 cellule/mL. Dopo che le cellule siano ben amalgamate di pipettaggio, 2,5 mL di sospensione viene aggiunto a una fiala sterile. La fiala è ermeticamente sigillata, ed eventuali detriti esterno viene rimosso soffiando la fiala con un flusso di aria da una pompa ad aria. La fiala si abbassa lentamente alla posizione 1, dove rimane per 15 min. Dopo 15 min è passato, l'esempio e riferimento fiale poi sono lentamente abbassati in posizione 2 e misure possono cominciare a essere registrate una volta che la potenza calorifica è stabile (Figura 3).
Un conteggio finale delle cellule viene eseguito dopo che le cellule vengono aggiunti al calorimetro sia il respirometro per determinare il numero preciso di cellule introdotto nel calorimetro. La produzione di calore è poi espresso per milioni di cellule. Se le cellule HepG2 sono coltivate in assenza di glucosio e galattosio è completata per aumentare il coinvolgimento mitocondriale, le cellule non proliferano all'interno del calorimetro, ma invece diminuiscono la loro attività metabolica dopo circa 30 min in fiala. Questo limita il calcolo CR fino al punto di tempo più in anticipo in cui è stata misurata la dissipazione di calore (Figura 4).
È fondamentale per registrare il tempo, che le cellule vengono aggiunti per la fiala affinché le misure del consumo di ossigeno e la produzione di calore sono raccolti a intervalli di tempo identici. Se questa precauzione non è stata presa, importanti errori sperimentali possono essere introdotto nella determinazione del rapporto CR. Durante il periodo di 15 minuti, mentre la fiala è alla posizione 1 nel calorimetro, le cellule sono sufficientemente mescolate pipettando li, e 2 x 106 cellule vengono iniettate nel respirometro tramite una siringa Hamilton. Cambiamento continuo dell'ossigeno si stabilizza dopo circa 15 min e ossigeno la concentrazione diminuisce costantemente (Figura 5). Ancora una volta, è fondamentale che il tempo di iniezione del campione viene registrato per l'analisi dei dati. Il flusso di ossigeno stabilizzato delle cellule serve come surrogato per il consumo di ossigeno quando si calcola il rapporto di CR. Altre titolazioni vengono eseguite per valutare la respirazione di perdita (1 µ l oligomycin) indicata da una goccia a un flusso di ossigeno inferiore e la massima respirazione disgiunta (3-5 titolazioni di 2 µ l FCCP) indicata dall'errore per aumentare la respirazione dopo successivi Titolazioni FCCP. Disgiungere incompleto o un'inibizione della respirazione potrebbe non essere osservate se lo stock FCCP è scaduto (Figura 6).
Taratura aria Figura 1:100 % del respirometro e lo stato del Sensore polarografico di ossigeno (POS). I segnali per la concentrazione di ossigeno (linea blu) e il flusso di ossigeno (linea rossa) entrambi stabilizzare prima della taratura aria al 100%. Le linee stabili indicano che il respirometro è pronto per la calibrazione. La calibrazione deve essere effettuata in DMEM e non in H2O. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: POS necessitante servizio. Dopo la stabilizzazione della concentrazione di ossigeno (traccia blu), il flusso di ossigeno (traccia rossa) non riesce a stabilizzare. Il POS non deve essere utilizzato per la sperimentazione e il servizio deve essere applicato come descritto dal produttore. Un'instabilità aumentata del flusso ossigeno correla con un aumento della domanda per il servizio POS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Circa 2,5 x 105 HepG2 cellule coltivate in medium del glucosio mostrano segni di proliferazione nel calorimetro. ~2.5 x 105 HepG2 cellule coltivate in presenza di glucosio ogni fiala di caricamento genera una produzione di calore costante di -20 a-28 µW utilizzando l'impostazione di 30-µW sullo strumento e una produzione di calore aumentato nel tempo correla con proliferazione cellulare all'interno della fiala. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Circa 2,5 x 105 HepG2 cellule coltivate in medium galattosio non proliferano e diminuisce nel corso del tempo la produzione di calore. Caricamento ~2.5 x 105 HepG2 cellule coltivate in galattosio a risultati fiala in una produzione di calore immediato di ~-20 µW. Tuttavia, la produzione di calore diminuisce nel tempo e limita le misure di rapporto CR per i punti di tempo in anticipo dell'esperimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Routine, disgiunto e una perdita di respirazione delle cellule HepG2. Una volta che le cellule sono state iniettate nel respirometro, concentrazione di ossigeno è diminuito costantemente (traccia blu). Dopo la stabilizzazione del flusso di ossigeno (traccia rossa) durante la respirazione ordinaria di cellule intatte, oligomycin è stato aggiunto per inibire F0F1- trifosfato di adenosina synthase. Questo è indicato dalla stabilizzazione del flusso di ossigeno dopo l'aggiunta di oligomycin, che rivela la perdita di respirazione. Circa 3-5 titolazioni di FCCP devono essere eseguite a disgiungere la respirazione dalla sintesi di ATP e di rivelare la capacità di trasporto dell'elettrone del sistema (ETS). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: disgiungere infruttuoso di respirazione delle cellule HepG2. Dopo l'aggiunta di cellule, di ossigeno flusso stabilizzato (traccia rossa) durante la routine respirazione concentrazione e di ossigeno è diminuita costantemente (linea blu). Titolazione di FCCP è provocato da un'incompleta disgiungere ed eventuale inibizione, impedendo la massima capacità ETS di essere raggiunto. FCCP era probabilmente contaminati o degradati da immagazzinaggio a lungo termine. Se osservate, uno stock FCCP fresco deve essere preparato. Inoltre, di confermare che tale oligomycin non inibisce la capacità ETS durante disgiungere. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'obiettivo di calorespirometry è quello di valutare quantitativamente i contributi dei percorsi aerobici ed anaerobici di attività metabolica e ottenere una vista composta di flusso di energia cellulare. Ciò avviene mediante una misura simultanea di dissipazione del calore e flusso di ossigeno seguita da un confronto tra il rapporto CR calcolato con il teorico oxycaloric equivalente. Diversi passaggi critici devono essere considerate per dati riproducibili e affidabili. Il mantenimento di una cultura sterile cellula sana è fondamentale. Contaminazione da batteri o funghi può provocare calore altrimenti sottratti consumo di produzione o ossigeno, rendendo il rapporto CR senza senso. I conteggi delle cellule maggiori, inadeguata, povero esempio miscelazione, o cellule ragruppate possono anche tradursi in un rapporto di CR impreciso. Un passo fondamentale per quanto riguarda il respirometro è preparazione adeguata del campione in modo che l'iniezione è inferiore a 50 µ l di volume. Questo volume garantisce una quantità minima di mezzo è spostata dalla camera e il consumo di ossigeno è correttamente attribuito a 2 x 106 cellule. Una volta che la respirazione ordinaria è osservato, il protocollo proposto è compatibile con due titolazioni aggiuntive (oligomycin e FCCP), che illuminano la perdita respirazione e capacità ETS dei mitocondri. Per questa applicazione, aggiunta eccessiva di FCCP può inibire la respirazione e prevenire massimo flusso; di conseguenza, titolazioni di almeno 3-5 devono essere eseguite prima di raggiungere la massima respirazione disgiunta.
Manutenzione e calibrazione corretta del respirometro e del calorimetro è critica per calorespirometry. Il protocollo di titolazione per consumo di ossigeno di sfondo è altamente consigliato e viene eseguito con titolazioni graduale di Ditionito di raggiungere livelli di diminuzione di ossigeno all'interno della camera. Si tratta di una misura essenziale per confermare chambers, sigillate ermeticamente e correggere per diffusione posteriore dell'ossigeno negli alloggiamenti, soprattutto se misurazioni vengono eseguite a una tensione di ossigeno basso. Inoltre, l'esecuzione di un test di agitatore prima dell'aggiunta delle cellule può fornire informazioni circa la capacità di risposta del POS. Se la risposta è scarsa o il flusso di ossigeno non è stabile (Figura 2), servizio al POS è richiesto. Pulizia impropria delle sezioni respirometro può lasciare alle spalle le quantità residue di inibitori o uncouplers, che possono riguardare esperimenti successivi. Bolle d'aria nella camera stagna sono anche in grado di interferire con le misure e possono essere introdotte durante la chiusura della camera o durante l'iniezione del campione, se sono bolle d'aria presenti all'interno della siringa. Protocollo di calorimetro è più diretto, ma è anche suscettibile di errori sperimentali. Ad esempio, la tenuta impropria della fiala permetterà di evaporazione si verifichi che cambia in maniera massiccia il flusso di calore.
Una delle limitazioni di questo metodo è che non tutte le cellule possono essere coltivate in sospensione e molte linee cellulari sono aderenti alla piastra di coltura delle cellule o substrato. Per eseguire esperimenti, cellule allegate devono essere sloggiato enzimaticamente dalla piastra mediante l'utilizzo di agenti di dissociazione come tripsina. Cellule in questo stato non possono essere in fase di crescita logaritmica e loro fisiologia può essere alterato. Così, l'analisi successiva tramite che il calorimetro e respirometro delle cellule recentemente tripsinizzate può valutare interrotta attività cellulari. Ulteriormente, una limitazione del protocollo calorimetrico presentato è la sedimentazione delle cellule nelle fiale chiuse, che possono causare ipossia locale intorno alle cellule a causa della diffusione dell'ossigeno lento in soluzioni acquose. Abbiamo determinato che ~ 3 x 105 celle è il limite superiore compatibile con le fiale utilizzate in questo protocollo. Aumento del numero delle cellule può generare un ambiente ipossico dalla sedimentazione delle cellule, compromettere i risultati. Così, ottimizzazione è fondamentale se è studiata una linea di cellule diverse e approcci alternativi dovrebbero essere considerati come l'aumento della densità media per ridurre la sedimentazione delle cellule24. Ampolle sono disponibili che permettono mescolando; Tuttavia, è fondamentale per garantire che un minimo rapporto segnale-rumore è presente durante l'agitazione. Inoltre, calorimetri oltre a quella impiegata in questo protocollo sono compatibili con calorespirometry e le loro capacità possono essere di là di quello che abbiamo presentato. Un'altra limitazione di calorespirometric analisi tramite un respirometro bicamerale è l'impossibilità per un'analisi di alto-rendimento, che sarebbe più rilevante per lo sviluppo farmaceutico. Questa limitazione, tuttavia, è compensata dalla capacità per una caratterizzazione ad alta risoluzione di influenza del complesso della catena respiratoria e fisiologia mitocondriale.
La capacità di misurazione sia ad alta risoluzione e simultanea del flusso di ossigeno e di uscita di calore dallo stesso campione è un significativo punto di forza di questo metodo. Un potenziale gold standard quando si utilizza cellule aderenti sarebbe per entrambi cultura e analizzare le cellule coltivate su microcarrier perline in sospensione. Questo metodo sarebbe evitare l'impatto negativo della dissociazione dalla superficie di coltura delle cellule e consentono l'analisi delle funzioni cellulari in diverse fasi della curva di crescita (fase logaritmica vs contatto-inibito fase7). Purtroppo, usando le perle di microcarrier può essere problematico a causa della elevata velocità dell'agitatore richiesta il respirometro e il potenziale per la rettifica delle sfere insieme con le cellule sotto l'ancoretta. Nonostante queste limitazioni, una vasta gamma di applicazioni rimane compatibile con calorespirometry. In particolare, questo metodo è pronta per meglio facilitare sviluppo farmaceutico di identificare rapidamente i composti di mitotoxic in cellule coltivate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato in parte dalla sovvenzione della National Science Foundation-160944 Mary E. Konkle e Michael A. Menze.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HepG2 Cells | American Type Culture Collection | HB-8065 | Cells used for calorespirometry |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | Respirometer |
| LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) | Thermometric AB | Thermometric was purchased by TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | 100x solution added to DMEM medium |
| Fetal Bovine Serum - Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | Added to 10% in DMEM medium |
| Trypsn-EDTA (0.25%) | Thermofisher Scientific | 25200072 | Cell dissociation reagent |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Sigma Aldrich | O4876 | Mitochondrial Inhibitor |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | Mitochondrial Uncoupler |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning Corporation | 430167 | Tissue culture dish |
| Glucose, powder | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose for DMEM medium |
| Galactose, powder | Fischer Scientific | BP656500 | Galactose for DMEM medium |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher Scientific | 25030081 | Glutamine for DMEM medium |
| DMEM, no glucose | Thermofisher Scientific | 11966025 | Cell culture medium |
References
- Gnaiger, E., Kemp, R. B. Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux. Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).
- Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications. Chemistry & Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).
- Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).
- Wadso, L., Hansen, L. D. Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems. Methods. 76, 11-19 (2015).
- Gnaiger, E. Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry. Strategies for Gas Exchange and Metabolism. Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. , Cambridge University Press. London. 149-171 (1991).
- Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism. Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).
- Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation. Cryobiology. 61, 79-88 (2010).
- Webb, P. Human Calorimetry. , ABC-CLIO, LCC. Santa Barbara, CA. In Volume 7 of Endocrinology and Metabolism Series (1985).
- Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism. Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).
- Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis. Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).
- Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry. Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).
- Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry. Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).
- Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues. Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone. Cell and Tissue Research. , (2017).
- Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells. Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).
- Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat. The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).
- Paul, R. J. Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C. Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Kemp, R. B. Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells. Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).
- Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death. Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).
- Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64, 985-993 (2004).
- Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures. Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).
