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Bioengineering

Calorespirometry: एक शक्तिशाली, आक्रामक दृष्टिकोण सेलुलर ऊर्जा चयापचय की जांच करने के लिए

Published: May 31, 2018 doi: 10.3791/57724
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, University of Louisville, 2Department of Chemistry, Ball State University

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन calorespirometry, दोनों गर्मी अपव्यय और श्वसन, जो ऊर्जा चयापचय का आकलन करने के लिए एक इनवेसिव दृष्टिकोण प्रदान करता है की प्रत्यक्ष और एक साथ माप । इस तकनीक का उपयोग कुल सेलुलर ऊर्जा प्रवाह की निगरानी के द्वारा ऊर्जा उपयोग के लिए एरोबिक और anaerobic दोनों मार्ग के योगदान का आकलन करने के लिए किया जाता है ।

Abstract

कई कोशिका लाइनों बुनियादी जैविक और जैव चिकित्सा अनुसंधान में इस्तेमाल किया एरोबिक और anaerobic श्वसन दोनों का एक संयोजन के माध्यम से ऊर्जा homeostasis बनाए रखने के । हालांकि, किस हद तक दोनों रास्ते सेलुलर ऊर्जा उत्पादन के परिदृश्य में योगदान लगातार अनदेखी की है । ग्लूकोज के स्तर संतृप्त करने में प्रसंस्कृत कोशिकाओं को बदल अक्सर एटीपी उत्पादन के लिए ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण पर एक कम निर्भरता दिखाने के लिए, जो सब्सट्रेट स्तर फास्फारिलीकरण में वृद्धि की भरपाई की है. चयापचय शिष्टता में यह बदलाव कोशिकाओं mitochondrial विषाक्त पदार्थों की उपस्थिति के बावजूद पैदा करना करने के लिए अनुमति देता है । बदल कोशिकाओं के बदल चयापचय शिष्टता की उपेक्षा में, एक दवा स्क्रीनिंग से परिणाम गलत व्याख्या की जा सकती है के बाद से संभावित mitotoxic प्रभाव मॉडल सेल का उपयोग कर पाया नहीं जा सकता है उच्च ग्लूकोज की उपस्थिति में कल्चरल लाइंस सांद्रता. इस प्रोटोकॉल का वर्णन दो शक्तिशाली तकनीक, respirometry और calorimetry, जो और सेलुलर एटीपी उत्पादन के लिए दोनों एरोबिक और anaerobic योगदान के मात्रात्मक और इनवेसिव मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है की बाँधना । एरोबिक और anaerobic श्वसन दोनों गर्मी है, जो calorimetry के माध्यम से निगरानी की जा सकती है उत्पंन करते हैं । इस बीच, ऑक्सीजन की खपत की दर को मापने एरोबिक श्वसन की हद का आकलन कर सकते हैं । जब दोनों गर्मी अपव्यय और ऑक्सीजन की खपत एक साथ मापा जाता है, calorespirometric अनुपात निर्धारित किया जा सकता है । प्रयोग से प्राप्त मूल्य तो सैद्धांतिक oxycaloric समकक्ष की तुलना में किया जा सकता है और anaerobic संवेदनाएं की हद तक ंयाय किया जा सकता है । इस प्रकार, calorespirometry दवा विकास, माइक्रोबियल विकास, और दोनों normoxic और hypoxic शर्तों के तहत मौलिक जैव ऊर्जा सहित जैविक प्रश्नों की एक विस्तृत श्रृंखला का विश्लेषण करने के लिए एक अनूठी विधि प्रदान करता है ।

Introduction

जैविक प्रणालियों में, गर्मी जारी या चयापचय के दौरान तापीय धारिता परिवर्तन आम तौर पर या तो सीधे निगरानी की जाती है (प्रत्यक्षcalorimetry के माध्यम से) या परोक्ष रूप से ओ 2 खपत और/या सह 2 उत्पादन (via respirometry) । दुर्भाग्य से, जब इन तकनीकों अलगाव में उपयोग किया जाता है, महत्वपूर्ण जानकारी ऐसे सेलुलर चयापचय के लिए anaerobic रास्ते के योगदान के रूप में खो दिया है । Calorespirometry एक शक्तिशाली तकनीक है कि दोनों गर्मी अपव्यय और श्वसन के समवर्ती माप पर निर्भर करता है । अग्रणी calorespirometric काम पूरी तरह से oxygenated स्तनधारी कोशिकाओं में anaerobic चयापचय की जांच की और दोनों एरोबिक और anaerobic रास्ते का एक साथ योगदान का प्रदर्शन ऊर्जा homeostasis में जा रहा है रूपांतरित कोशिकाओं के बावजूद एक पूर्णत: oxygenated वातावरण1. Calorespirometry के बाद से जैविक प्रश्नों की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू किया गया है । कुछ उदाहरण कम ऑक्सीजन के स्तर पर पशु ऊर्जावान के अध्ययन में शामिल हैं, दोनों herbicide और bivalves के गिल पर एस्ट्रोजन के प्रभाव, स्थलीय जीवों के चयापचय, और कार्बनिक मिट्टी बात की माइक्रोबियल अपघटन2, 3 , 4 , 5 , 6. इसके अलावा, calorespirometry ठंड से पहले कैसे चयापचय कंडीशनिंग से पता चला है स्तनधारी कोशिकाओं7के cryopreservation में सुधार । प्रत्येक दृष्टिकोण, दोनों calorimetry और respirometry, स्वतंत्र रूप से सेलुलर और जीव के हमारे ज्ञान में वृद्धि हुई है । हालांकि, मौलिक जैविक सवाल है कि calorespirometry के उपयोग के माध्यम से उत्तर दिया जा सकता है अपेक्षाकृत बेरोज़गार रहते हैं ।

हेस के कानून में कहा गया है कि एक प्रतिक्रिया के कुल तापीय धारिता परिवर्तन प्रारंभिक और अंतिम राज्यों के बीच मार्ग से स्वतंत्र है । उदाहरण के लिए, एक जैव रासायनिक मार्ग के लिए कुल तापीय धारिता परिवर्तन मार्ग के भीतर सभी प्रतिक्रियाओं के enthalpies में परिवर्तन का योग है । Calorimetry सेलुलर गर्मी उत्पादन को मापने के लिए एक वास्तविक समय दृष्टिकोण प्रदान करता है, जो अंधाधुंध दोनों एरोबिक और anaerobic रास्ते का पता लगाता है । यह बुनियाद पर आधारित है कि प्रायोगिक एंपुल8की दीवारों के माध्यम से छोड़कर सिस्टम में कोई ऊर्जा का आदान-प्रदान नहीं किया जाता है । गर्मी अपव्यय में परिवर्तन एंपुल में सभी चयापचय प्रतिक्रियाओं से जारी तापीय धारिता में परिवर्तन के बराबर है । इस प्रकार, एक नकारात्मक तापीय धारिता प्रणाली से गर्मी की हानि के लिए संबद्ध । पिछले चार दशकों में व्यापक अनुसंधान दोनों catabolism और उपचय के ऊष्मा परिदृश्य विशेषता है । यह शोध लेख में एक स्थिर वृद्धि के द्वारा प्रतिनिधित्व किया है खोज शब्द "जैविक" और "calorimetry" के रूप में संयुक्त राज्य चिकित्सा के राष्ट्रीय पुस्तकालय (एनएलएम) द्वारा अनुक्रमित के रूप में राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (PubMed) में । खोज से पता चलता है कि पहले १९७०, कुल 27 प्रकाशन संदर्भ जैविक calorimetry; इस बीच, २०१६ में अकेले, ५४६ प्रकाशन तकनीक का उपयोग किया ।

Calorimetric तरीकों को अच्छी तरह से गर्मी उत्पादन का निर्धारण स्थापित कर रहे हैं । हालांकि, और अधिक लचीलापन respirometric मान को हल करने के लिए दी गई है । respirometric माप ओ2, कं2, या दोनों हे2 और सह2से मिलकर कर सकते हैं । इसके अलावा, ओ2 या CO2 की माप विभिंन तकनीकों द्वारा पूरा किया जा सकता है, सहित optrodes, क्लार्क-प्रकार इलेक्ट्रोड, और स्वरित्र डायोड लेजर अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी7,9,10 ,11. जबकि सह2 उत्पादन कई respirometric अध्ययन में एक मूल्यवान मीट्रिक है, प्रसंस्कृत कोशिकाओं के लिए मध्यम अक्सर पीएच नियंत्रण12,13के लिए एक bicarbonic बफर प्रणाली का उपयोग करता है । बिकारबोनिट प्रणाली में सह2 माप की जटिलताओं से बचने के लिए, संस्कृति में कोशिकाओं के calorespirometry के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल एकमात्र respirometric पैरामीटर के रूप में2 ओ का उपयोग करता है ।

ऑक्सीजन प्रवाह को मापने के साथ समवर्ती, कुछ respirometers ( सामग्री की तालिकादेखें) mitochondrial समारोह के विस्तृत आकलन के लिए डिजाइन किए हैं । सब्सट्रेट-unयुग्मक-अवरोधक-titrations (सूट) प्रोटोकॉल अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं और झिल्ली की क्षमता या प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) गठन14को मापने के लिए डिज़ाइन किए गए प्रयोगों के साथ संगत कर रहे हैं । बरकरार कोशिकाओं के calorespirometry के लिए प्रस्तुत प्रोटोकॉल carbonyl साइनाइड-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) और f0f1-एटीपी सिंथेस अवरोधक oligomycin के रूप में रासायनिक युग्मकों की शुरूआत के साथ संगत है । FCCP के अलावा, ऑक्सीजन की खपत एटीपी उत्पादन है, जो mitochondrial peformance15पर संभावित चिकित्सीय उपचार के प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयोगी है से जोड़ा जा सकता है । इसके अलावा, oligomycin के अतिरिक्त लीक श्वसन की हद तक रोशन करती है । इस प्रकार, respirometric माप calorespirometry के दौरान प्रदर्शन व्यापक आगे स्पष्ट mitochondrial फिजियोलॉजी के लिए डिज़ाइन किया गया प्रोटोकॉल के साथ संगत कर रहे हैं ।

दोनों गर्मी अपव्यय और ऑक्सीजन फ्लक्स के एक साथ माप calorespirometric (सीआर) अनुपात की गणना के लिए अनुमति देता है । यह अनुपात तो है Thornton निरंतर या सैद्धांतिक oxycaloric समकक्ष, जो के बीच पर्वतमाला-४३० के लिए-४८० kJ मॉल-1 सेल लाइन या ब्याज की ऊतक और पूरक कार्बन सब्सट्रेट्स1पर निर्भर करता है की तुलना में, 16. इस प्रकार, एक और अधिक नकारात्मक सीआर अनुपात anaerobic रास्ते से समग्र चयापचय गतिविधि में वृद्धि हुई योगदान पता चलता है । उदाहरण के लिए, काम पर्वतमाला के सक्रिय प्रदर्शन के बिना नियमित मांसपेशी ऊतक श्वसन के लिए सीआर अनुपात-४४८ से-४६८ kJ मॉल-1 जो सैद्धांतिक oxycaloric समकक्ष की सीमा के भीतर है17,18. इस बीच, स्तनधारी कैंसर मध्यम है कि ग्लूकोज में उच्च है में प्रसंस्कृत कोशिकाओं प्रदर्शन बढ़ाया लैक्टिक एसिड किण्वन glycolysis और अपेक्षाकृत कम mitochondrial सगाई के बाद19। इस phenotype में सीआर अनुपात में परिणाम-४९० से-८०० kJ मॉल-1, सेलुलर चयापचय में anaerobic मार्ग के एक बढ़ भागीदारी का प्रदर्शन के रूप में और अधिक नकारात्मक सीआर अनुपात द्वारा संकेत दिया है1,7, 16,20.

वाणिज्यिक और गैर लाभ सेल और ऊतक वितरकों दोनों वर्तमान में १५० से अधिक प्रजातियों से सेल लाइनों की पेशकश, लगभग ४,००० कोशिकाओं को मनुष्यों से व्युत्पंन लाइनों के साथ । अमर कोशिका लाइनों जल्दी से संभावित चिकित्सकीय की विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए सुविधाजनक उपकरण हैं, जिनमें से कई प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से mitochondrial कार्यों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । दवा स्क्रीनिंग के दौरान रूपांतरित कोशिकाओं का उपयोग करना Warburg प्रभाव, कई कैंसर की एक बानगी के भाग में सीमित भविष्यवाणी मूल्य का हो सकता है । अक्सर, कैंसर सब्सट्रेट स्तर फास्फारिलीकरण से एटीपी उत्पन्न और पूरी तरह से एरोबिक शर्तों के तहत mitochondrion को उलझाने के बिना स्तनपान के उत्पादन के माध्यम से redox संतुलन बनाए रखने19. दवा विकास बेहद महंगा है और अक्षम है, लगभग 9 से बाहर 8 मानव नैदानिक परीक्षण में परीक्षण के लिए बाजार की मंजूरी प्राप्त करने में विफल यौगिकों21। जबकि संभावित चिकित्सकीय सेल लाइनों में कम cytotoxicity के कारण प्रारंभिक स्क्रीनिंग पारित हो सकता है, यह संभव है कि इन यौगिकों के कुछ mitotoxic हैं । एक उपयुक्त विधि के बिना पता लगाने के लिए कैसे इन विषाक्त पदार्थों को प्राथमिक कोशिकाओं है कि Warburg प्रभाव प्रदर्शित नहीं करते में ऊर्जा संतुलन ख़राब कर सकते हैं, महत्वपूर्ण जानकारी अक्सर है पर देखा, प्रारंभिक अवस्था में चिकित्सीय विकास अड़चन ।

Calorespirometry कोशिकाओं और ऊतकों सहित जैविक नमूनों की एक किस्म में चयापचय गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए एक व्यावहारिक, इनवेसिव दृष्टिकोण है । प्रस्तुत प्रोटोकॉल के कोर आवेदनों की एक सीमा के साथ संगत है । एक जटिलता, तथापि, की पहचान की गई है । अमर कोशिकाओं को अक्सर एक ग्लूकोज मुक्त मध्यम ऊर्जा उत्पादन के लिए ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण (OXPHOS) के योगदान को बढ़ाने के लिए गैलेक्टोज के साथ पूरक में संस्कृति रहे हैं, क्रम में संभावित mitotoxins करने के लिए कोशिकाओं को संवेदनशील करने के लिए22, 23. इस चयापचय reprogramming जब नमूने स्टेनलेस स्टील कैलोरीमीटर द्वारा इस्तेमाल किया ampules में रखा जाता है अस्पष्ट विश्लेषण करने के लिए प्रकट होता है15। एक ग्लूकोज माध्यम में प्रसंस्कृत कोशिकाओं कई घंटे के लिए उच्च चयापचय गतिविधि में संलग्न करने के लिए जारी. इस बीच, गैलेक्टोज माध्यम में प्रसंस्कृत कोशिकाओं एंपुल में अपने स्थान के 30 मिनट के भीतर गर्मी उत्पादन में कमी, माप जल्दी प्रयोगात्मक समय अंक के लिए प्रतिबंधित कर रही है । यह व्यवहार दुर्भाग्यवश, उनके सेलुलर प्रसार का आकलन करने के अवसर में बाधा डालता है । इस विशिष्ट सीमा के बावजूद, सबसे अनुप्रयोगों calorespirometric विश्लेषण और विस्तृत चयापचय जानकारी के साथ संगत इस दृष्टिकोण के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है ।

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Protocol

1. सेल संस्कृति

  1. Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) में मानव hepatocellular कार्सिनोमा (HepG2) कोशिकाओं को बनाए रखने 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और अतिरिक्त सब्सट्रेट (10 मिमी ग्लूकोज, 2 मिमी glutamine, और 1 मिमी पाइरूवेट) में ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति मशीन (5% CO2 , ९५% हवा, १००% आर्द्रता) ।
    नोट: जब DMEM respirometry और calorimetry के लिए बाद के चरणों में संदर्भित है ऊपर DMEM निर्माण का उपयोग करें ।
  2. प्लेट 1 x 106 कोशिकाओं पर १०० mm संस्कृति प्लेट और उपसंस्कृति उंहें हर 7 दिन या ९०% तक पहुंचने से पहले प्रवाह और मध्यम हर 3-4 दिन नवीनीकृत ।
  3. जब कोशिकाओं ६०-८०% धाराप्रवाह है प्रयोगों को निष्पादित करें ।

2. आत्मशोधन और कैलोरीमीटर की तैयारी

  1. आत्मशोधन चैंबर में DMEM के २.२ मिलीलीटर प्लास्टिक, डाट पूरी तरह से डालें, और यह डाट स्पेसर उपकरण के साथ समायोजित करने के लिए हवा से मध्यम करने के लिए इष्टतम ऑक्सीजन प्रसार के लिए अनुमति देते हैं ।
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर लगातार हलचल जब तक ऑक्सीजन एकाग्रता (ब्लू ट्रेस) और ऑक्सीजन फ्लक्स (लाल ट्रेस) स्थिर हैं । सुनिश्चित करें कि आत्मशोधन के सॉफ्टवेयर को प्रयोग में प्रयुक्त माध्यम की ऑक्सीजन घुलनशीलता के लिए खाते में क्रमादेशित किया गया है ।
    नोट: अलग मीडिया अलग ऑक्सीजन घुलनशीलता गुणांक (उदा, DMEM = ०.९२) है ।
  3. चैंबर खुला के साथ DMEM में ऑक्सीजन एकाग्रता के स्थिरीकरण के बाद, ऑक्सीजन एकाग्रता का पता लगाने के एक स्थिर भाग का चयन करें और यह १००% हवा संतृप्ति के लिए जांचना ।
  4. 0% ऑक्सीजन के लिए जांचना ऑक्सीजन एकाग्रता का पता लगाने के एक स्थिर भाग का चयन जब कोई ऑक्सीजन चैंबर में मौजूद है । २३० mM सोडियम dithionite के 20 µ l अनुमापन के बाद या सभी ऑक्सीजन एक प्रयोग के अंत में जैविक नमूना द्वारा भस्म हो जाने के बाद यह कदम निष्पादित करें ।
  5. आत्मशोधन के १००% हवा अंशांकन के बाद, डाट बंद और सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले चैंबर में मौजूद हैं ।
    नोट: ऑक्सीजन प्रवाह में एक मामूली वृद्धि बंद चैंबर में पता लगाया जाएगा के रूप में polarographic ऑक्सीजन संवेदक (पीओएस) ऑक्सीजन का उपभोग करता है ताकि ऑक्सीजन आंशिक दबाव को मापने के लिए ।
  6. के बाद ~ डाट बंद किया जा रहा है की 10 मिनट, कि आत्मशोधन एक स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह देख द्वारा HepG2 कोशिकाओं के लिए तैयार है की पुष्टि करें ।
    नोट: कैलोरीमीटर यहां इस्तेमाल स्टेनलेस स्टील ampules उपयोग करता है और एक एंपुल एक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जा करने की आवश्यकता है ।
  7. २.५ एमएल के एच2ओ (डीएच2o) जोड़ें [नमूने के रूप में बराबर मात्रा (चरण 4)] कैलोरीमीटर के संदर्भ एंपुल करने के लिए और टोपी कस, चिमटा अगर आवश्यक का उपयोग कर. airflow के साथ सीलबंद एंपुल को साफ करें और एंपुल को कैलोरीमीटर के संदर्भ चैनल में 1 की स्थिति के लिए धीरे से कम करें । जैविक नमूना तैयार किया जाता है जब तक 1 स्थिति में रहते हैं ।

3. Respirometry और Calorimetry के लिए HepG2 कोशिकाओं की तैयारी

  1. पुष्टि करें कि आत्मशोधन और कैलोरीमीटर तैयार और नपे हुए हैं । गर्म DMEM और trypsin करने के लिए ३७ ° c एक पानी में स्नान ।
  2. एक ताजा १०० मिमी प्लेट और जगह के लिए DMEM जोड़ें दोनों सह के लिए मध्यम के equilibration के लिए अनुमति देने के लिए2 और तापमान ।
    नोट: इस माध्यम का उपयोग calorimetry प्रयोग के लिए किया जाएगा, इसलिए उपयुक्त मात्रा ampules की संख्या पर निर्भर करती है जिसका उपयोग किया जाएगा ।
  3. एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ की पुष्टि करें कि कोशिकाओं पर कर रहे हैं ६०-८०% धाराप्रवाह, तो धो १००-mm प्लेट 2x के साथ 10 एमएल के कमरे के तापमान फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब).
  4. ३७-डिग्री सेल्सियस trypsin के १०० मिमी प्लेट के लिए 3 मिलीलीटर जोड़ें और सेल संस्कृति मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 7-10 मिनट के लिए उन्हें मशीन । ३७-° c DMEM के 3 मिलीलीटर के साथ trypsin बेअसर और धीरे से निलंबित यह एक 5 मिलीलीटर प्लास्टिक के साथ ~ 20 बार pipetting ।
  5. एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में DMEM और trypsin में reसस्पैंड कोशिकाओं के 6 मिलीलीटर स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए यह १७५ x g पर केंद्रापसारक सेल गोली परेशान बिना तरल हटा दें ।
  6. DMEM के ~ 5 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड और प्लास्टिक यह अच्छी तरह से सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से एक दूसरे से असंबद्ध हैं ।
  7. अच्छी तरह से मिश्रित नमूना के ~ १०० µ एल निकालें और कोशिकाओं की कुल संख्या का निर्धारण करने के लिए एक hemocytometer पर सभी 8 क्षेत्रों का उपयोग एक पूरी तरह से सेल गिनती प्रदर्शन करते हैं । फिर कोशिकाओं के resuspension के लिए मात्रा की गणना करने के लिए उत्पन्न करने के लिए ~ 2 x 106 कोशिकाओं प्रति ५० µ l
    नोट: यह सुनिश्चित करेंगे कि 2 x 106 कोशिकाओं को न्यूनतम मध्यम विस्थापन के साथ आत्मशोधन के प्रत्येक कक्ष में जोड़ रहे हैं ।
  8. १७५ एक्स जी में 5 मिनट के लिए कोशिकाओं के केंद्रापसारक चरण ३.७ से DMEM की गणना की मात्रा में गोली स्थगित ।
  9. आत्मशोधन (यह होना चाहिए ~ ५० µ l) में प्रति कक्ष 2 x 106 कक्षों को इंजेक्ट करने के लिए आवश्यक वॉल्यूम का निर्धारण करने के लिए एक कक्ष संख्या निष्पादित करें । तैयार होने तक बर्फ पर respirometric माप के लिए कोशिकाओं को स्टोर ।
  10. जबकि केंद्रित सेल नमूना बर्फ पर है, calorimetry के लिए 1 x 105 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता का उत्पादन करने के लिए आवश्यक कमजोर पड़ने का निर्धारण ।
  11. नमूना अच्छी तरह से मिश्रण है और प्रत्येक एंपुल के लिए DMEM में 1 एक्स 105 कोशिकाओं/एमएल में कोशिकाओं के ~ 3 मिलीलीटर तैयार करते हैं ।
    नोट: DMEM नमूना कमजोर पड़ने के लिए इस्तेमाल किया equilibrated चरण ३.३ में तैयार माध्यम होना चाहिए ।

4. Calorimetry

  1. सुनिश्चित करें कि कैलोरीमीटर कंप्यूटर से जुड़ा है और µW में calorimetric संकेत चौकस और स्थिर है ।
  2. 1 x 105 कोशिकाओं/एमएल (~ २.५ x 105 कोशिकाओं) प्रत्येक एंपुल करने के लिए, पर्याप्त हवा सुनिश्चित करने के ढक्कन के बीच है एंपुल और मध्यम गैस प्रसार के लिए अनुमति देने के लिए कोशिकाओं के २.५ मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. तुरंत टोपी कस, चिमटा अगर आवश्यक का उपयोग कर । सील एंपुल साफ, airflow का उपयोग कर किसी भी बाहरी मलबे को दूर करने के लिए, और धीरे एंपुल कम कैलोरीमीटर की स्थिति 1 करने के लिए । रिकॉर्ड समय एंपुल 1 स्थिति के लिए कम है ।
  4. एंपुल 15 मिनट के लिए स्थिति 1 पर बैठने के लिए अनुमति दें ।
    नोट: इस 15 मिनट की अवधि के दौरान, कोशिकाओं आत्मशोधन (चरण 5) में इंजेक्ट किया जा करने के लिए कर रहे हैं । यह सुनिश्चित करता है कि समय का एक ही अंतराल सीआर अनुपात निर्धारित किया जाता है जब दोनों गर्मी उत्पादन और ऑक्सीजन की खपत के लिए इस्तेमाल होता है ।
  5. 1 स्थिति में 15 मिनट के बाद, धीरे दोनों संदर्भ और नमूना ampules 2 स्थिति को कम । रिकॉर्ड समय ampules कम से कम 30 मिनट के लिए और मापने थे ।

5. Respirometry

  1. 15-ंयूनतम अंतराल में एंपुल कैलोरीमीटर में स्थिति 1 पर है, के दौरान respirometric अध्ययन शुरू करते हैं ।
  2. अच्छी तरह से एक समरूप समाधान सुनिश्चित करने के लिए pipetting द्वारा सेल नमूना मिश्रण और आत्मशोधन के प्रत्येक कक्ष में सेल नमूना के < 50 µ एल सुई के एक अंतिम एकाग्रता के लिए ~ 2 x 106 कक्ष/ समय कोशिकाओं आत्मशोधन में इंजेक्ट कर रहे है रिकॉर्ड ।
  3. इंजेक्शन के बाद, HepG2 कोशिकाओं को लगातार ३७ डिग्री सेल्सियस पर उभारा जाता है । ऑक्सीजन प्रवाह का स्थिरीकरण और ऑक्सीजन एकाग्रता में एक स्थिर कमी दोनों के लिए कम से 20-30 मिनट रुको ।
  4. का चयन करें O2 प्रवाह प्रति V टैब स्क्रीन के दाईं ओर और ऑक्सीजन प्रवाह के एक स्थिर भाग पर प्रकाश डाला. मार्क का चयन करें, तो सांख्यिकी और V प्रति ओ2 प्रवाह के लिए रिकॉर्ड डेटा । इस रिकॉर्डिंग का उपयोग सीआर अनुपात की गणना में किया जाएगा ।
    नोट: चरण ५.५ और ५.६ वैकल्पिक हैं । रिसाव श्वसन और अधिक से अधिक जोड़ा श्वसन oligomycin और FCCP के titrations से पता चल जाएगा ।
  5. प्रत्येक कक्ष में 4mg/एमएल oligomycin के 1 µ एल इंजेक्षन और ऑक्सीजन फ्लक्स स्थिरीकरण के लिए ~ 10 मिनट की अनुमति दें । oligomycin अतिरिक्त के बाद ऑक्सीजन फ्लक्स ट्रेस के एक स्थिर हिस्से पर प्रकाश डाला द्वारा ५.४ में प्रदर्शन निम्नलिखित चरणों द्वारा स्थिर रिसाव श्वसन दर रिकॉर्ड करें ।
  6. प्रत्येक कक्ष में ०.२ mM FCCP के अनुमापन 2-µ एल इंजेक्शन, प्रत्येक इंजेक्शन के बाद ऑक्सीजन फ्लक्स स्थिरीकरण के लिए अनुमति देता है । titrations जारी जब तक अधिक से अधिक प्रवाह तक पहुंच गया है, के रूप में बाद में FCCP अनुमापन में एक मामूली गिरावट से संकेत दिया । अधिक से अधिक प्रवाह के दौरान स्थिर श्वसन दर रिकॉर्ड ।

6. Calorespirometric अनुपात की गणना

  1. एंपुल (२.५ मिलीलीटर) में जोड़े गए कक्षों की कुल संख्या का निर्धारण करने के लिए एक hemocytometer के सभी 8 फ़ील्ड्स का उपयोग कर ~ 1 x 105 कक्षों/mL पर तैयार नमूनों की अंतिम सेल गणना निष्पादित करें ।
  2. कैलोरीमीटर और आत्मशोधन दोनों से माप रिकॉर्ड करने के लिए एक समय निर्धारित करें जिस पर स्थिर संकेतों समान समय पर मौजूद हैं । संदर्भ समय जब एंपुल 2 स्थिति और आत्मशोधन में कोशिकाओं के इंजेक्शन के समय को कम किया गया था ।
  3. चरण में निर्धारित समय पर सम्मान एंपुल के लिए गर्मी उत्पादन प्रदर्शित करने के लिए ट्रेस पर कर्सर रखकर गर्मी उत्पादन रिकॉर्ड और µW/लाख कोशिकाओं के रूप में व्यक्त करते हैं । ऑक्सीजन खपत डेटा ले लीजिए और यह सुनिश्चित करें कि यह pmol ओ2 एक्स एस-1 एक्स लाख कोशिकाओं के रूप में व्यक्त किया है ।
  4. cr अनुपात की गणना करने के लिए, पहले µW को kJ/s में कनवर्ट करें, और फिर kJ/s के मॉल पर विभाजित करें ओ2/सीआर अनुपात kJ/ नोट: CR अनुपात kJ/मॉल O2में प्रस्तुत किया गया है ।
    ( अनुपूरक फाइल 1देखें)

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Representative Results

calorespirometric मापन का reproducibility एक उचित और सुसंगत नमूना तैयारी पर निर्भर करता है । कोशिका संस्कृति से तैयार किए गए नमूनों का उपयोग यदि प्लेटों को ऊंचा करने के लिए नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि कोशिका गिनती के झुरमुट के कारण गलत हो सकता है । इसके अलावा, कम गर्मी के झुरमुट में सीमित सब्सट्रेट प्रसार के कारण बहती कोशिकाओं हो सकता है । इसलिए, अनुयाई कोशिकाओं का उपयोग करते समय, यह ६०-८०% के बीच प्रवाह के साथ एक थाली का चयन करने के लिए और प्रयोग करने से पहले मध्यम 24 एच बदलने के लिए महत्वपूर्ण है ।

उचित वाद्य अंशांकन और रखरखाव भी जानकारीपूर्ण और reproducible calorespirometric माप के लिए महत्वपूर्ण हैं । आत्मशोधन के लिए निर्माता की स्थापना की सफाई प्रोटोकॉल का पालन करके, इथेनॉल के साथ व्यापक बहाकर यह सुनिश्चित करने के लिए लागू किया जाता है कि अवशिष्ट hydrophobic unयुग्मकों और अवरोधकों को हटा दिया जाता है और आंशिक रूप से माप से समझौता नहीं करते हैं बाधा या unयुग्मन mitochondria । जब आत्मशोधन चैंबर नमूना माप करने से पहले काम कर रहा है, दोनों ऑक्सीजन एकाग्रता और ऑक्सीजन फ्लक्स निशान स्थिर होना चाहिए के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया है । यदि POS सेंसर सेवा की जरूरत है, ऑक्सीजन फ्लक्स स्थिर नहीं होगा के रूप में चित्रा 2में देखा । माप नहीं किया जाना चाहिए जब पॉस ठीक से सेवा नहीं है । इसके अतिरिक्त, कैलोरीमीटर में उपयोग ampules साफ किया जाना चाहिए, निष्फल, और पहले सूखे का उपयोग करने के लिए, के रूप में जैविक संदूषण नमूना की गर्मी उत्पादन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं ।

सेल नमूने उचित अंशांकन और आत्मशोधन और कैलोरीमीटर दोनों की तैयारी के बाद तैयार कर रहे हैं । सबसे पहले, आत्मशोधन में डाट बंद है और कोई हवा में बुलबुले मौजूद है सुनिश्चित करने के लिए चैंबर का निरीक्षण किया है । फिर, HepG2 कोशिकाओं को ध्यान केंद्रित कर रहे है ~ 2 x 106/५० µ एल के लिए respirometry और तुरंत बर्फ पर रखा । calorimetry के लिए, केंद्रित नमूना से HepG2 कोशिकाओं पर equilibrated DMEM में पतला कर रहे हैं ~ 1 x 105 कोशिकाओं/एमएल । कोशिकाओं को अच्छी तरह से pipetting द्वारा मिश्रित कर रहे हैं के बाद, निलंबन की २.५ मिलीलीटर एक बाँझ एंपुल करने के लिए जोड़ा जाता है । एंपुल कसकर सील है, और किसी भी बाहरी मलबे हवा पंप से एक हवा की एक धारा के साथ एंपुल उड़ाने से हटा दिया है । एंपुल तो धीरे से 1 स्थिति है, जहां यह 15 मिनट के लिए रहता है कम है । 15 मिनट के बाद पारित कर दिया है, दोनों संदर्भ और नमूना ampules फिर धीरे 2 स्थिति को कम कर रहे हैं, और माप एक बार गर्मी उत्पादन स्थिर है (चित्रा 3) दर्ज होना शुरू कर सकते हैं.

कक्ष कैलोरीमीटर और आत्मशोधन कैलोरीमीटर में समाविष्ट कक्षों की सटीक संख्या निर्धारित करने के लिए दोनों करने के लिए जोड़े जाते हैं के बाद एक अंतिम कक्ष गणना की जाती है । गर्मी उत्पादन तो प्रति मिलियन कोशिकाओं व्यक्त की है । यदि HepG2 कोशिकाओं ग्लूकोज और गैलेक्टोज के अभाव में mitochondrial भागीदारी बढ़ाने के लिए पूरक है, कोशिकाओं कैलोरीमीटर अंदर पैदा करना नहीं है, लेकिन इसके बजाय एंपुल में लगभग 30 मिनट के बाद उनके चयापचय गतिविधि में कमी । यह सीआर परिकलन करने के लिए जो गर्मी अपव्यय मापा गया था जल्द से जल्दी समय बिंदु (आरेख 4) सीमित करता है ।

यह समय कोशिकाओं एंपुल करने के लिए जोड़ रहे हैं रिकॉर्ड करने के लिए महत्वपूर्ण है ताकि गर्मी उत्पादन और ऑक्सीजन की खपत की माप समान समय बिंदुओं पर एकत्र कर रहे हैं. यदि यह एहतियात नहीं लिया जाता है, महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक त्रुटियों सीआर अनुपात के निर्धारण में शुरू किया जा सकता है । 15 मिनट की अवधि के दौरान, जबकि एंपुल कैलोरीमीटर में स्थिति 1 पर है, कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से उन्हें pipetting द्वारा मिश्रित कर रहे हैं, और 2 x 106 कोशिकाओं एक हैमिल्टन सिरिंज के माध्यम से आत्मशोधन में इंजेक्ट कर रहे हैं. ऑक्सीजन प्रवाह लगभग 15 मिनट और ऑक्सीजन एकाग्रता तेजी से गिरावट आती है (चित्रा 5) के बाद स्थिर । फिर, यह महत्वपूर्ण है कि नमूना इंजेक्शन के समय डेटा विश्लेषण के लिए दर्ज की गई है । कोशिकाओं के स्थिर ऑक्सीजन प्रवाह सीआर अनुपात की गणना करते समय ऑक्सीजन की खपत के लिए किराए के रूप में कार्य करता है । अतिरिक्त titrations रिसाव श्वसन का आकलन करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं (1 µ l oligomycin) एक कम ऑक्सीजन प्रवाह के लिए एक बूंद से संकेत मिलता है और अधिक से अधिक कुछ श्वसन (2 µ l FCCP के 3-5 titrations) असफलता के बाद श्वसन बढ़ाने के लिए द्वारा संकेत दिया उत्तराधिकारी FCCP titrations. यदि FCCP स्टॉक की समय सीमा समाप्त हो गई हो (चित्र 6) तो एक अपूर्ण युग्मन या श्वसन का निषेध नहीं देखा जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1:100% हवा आत्मशोधन और polarographic ऑक्सीजन संवेदक (POS) की स्थिति का अंशांकन । ऑक्सीजन एकाग्रता (नीली रेखा) और ऑक्सीजन फ्लक्स (लाल रेखा) दोनों १००% हवा अंशांकन से पहले स्थिर के लिए संकेत । स्थिर पंक्तियां संकेत करती है कि आत्मशोधन अंशांकन के लिए तैयार है । अंशांकन DMEM में किया जाना चाहिए, और नहीं में एच2O. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: पॉस सेवा की आवश्यकता है । ऑक्सीजन एकाग्रता (ब्लू ट्रेस) के स्थिरीकरण के बाद, ऑक्सीजन फ्लक्स (लाल ट्रेस) को स्थिर करने में विफल रहता है । पॉस प्रयोग के लिए उपयोग नहीं किया जाना चाहिए और सेवा निर्माता द्वारा वर्णित के रूप में लागू किया जाना चाहिए । ऑक्सीजन प्रवाह की एक वृद्धि की अस्थिरता पॉस सेवा के लिए एक वृद्धि की मांग के साथ संबद्ध है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: लगभग २.५ x 105 HepG2 कोशिकाओं ग्लूकोज मध्यम में प्रसंस्कृत कैलोरीमीटर में प्रसार के लक्षण दिखाते हैं । लोड हो रहा है ~ २.५ x 105 HepG2 प्रति ग्लूकोज की उपस्थिति में प्रसंस्कृत कोशिकाओं एंपुल के एक निरंतर गर्मी उत्पादन उत्पंन करता है-20 से-28 µW उपकरण पर 30 µW सेटिंग का उपयोग कर और समय के साथ एक वृद्धि की गर्मी उत्पादन पर सेलुलर प्रसार के साथ संबद्ध अंदर एंपुल । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: लगभग २.५ x 105 HepG2 गैलेक्टोज मध्यम में प्रसंस्कृत कोशिकाओं पैदा करना नहीं है और समय के साथ गर्मी उत्पादन घट जाती है । लोड हो रहा है ~ २.५ x 105 HepG2 कोशिकाओं एंपुल परिणाम में गैलेक्टोज प्रति एक तत्काल गर्मी उत्पादन में संस्कृति ~-20 µW । हालांकि, समय के साथ गर्मी उत्पादन कम हो जाती है और प्रयोग के प्रारंभिक समय बिंदुओं को सीआर-अनुपात माप प्रतिबंधित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: नित्य, युगल, और HepG2 कोशिकाओं के रिसाव श्वसन । एक बार कोशिकाओं आत्मशोधन में इंजेक्शन थे, ऑक्सीजन एकाग्रता लगातार कम (ब्लू ट्रेस) । बरकरार कोशिकाओं की दिनचर्या श्वसन के दौरान ऑक्सीजन फ्लक्स (रेड ट्रेस) के स्थिरीकरण के बाद, oligomycin एफ0एफ1-एटीपी सिंथेस को बाधित करने के लिए जोड़ा गया था । यह ऑक्सीजन फ्लक्स के स्थिरीकरण के बाद oligomycin अलावा, जो रिसाव श्वसन पता चलता है द्वारा संकेत दिया है । FCCP के लगभग 3-5 titrations एटीपी संश्लेषण से कुछ न कुछ करने के लिए और इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली (ETS) क्षमता प्रकट करने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: HepG2 सेल श्वसन के असफल युग्मन. कोशिकाओं के अलावा, ऑक्सीजन प्रवाह स्थिर (लाल ट्रेस) दिनचर्या श्वसन और ऑक्सीजन एकाग्रता के दौरान लगातार कम (नीली रेखा) । FCCP के अनुमापन एक अपूर्ण unयुग्मन और अंततः निषेध में हुई, से अधिक से अधिक ETS क्षमता को रोकने के लिए पहुंच जा रहा है । FCCP की संभावना दूषित या दीर्घकालिक भंडारण से नीचा था । अगर मनाया, एक ताजा FCCP स्टॉक तैयार किया जाना चाहिए । इसके अलावा, पुष्टि करें कि oligomycin ETS क्षमता unयुग्मन के दौरान बाधित नहीं करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

calorespirometry के उद्देश्य के लिए मात्रात्मक को चयापचय गतिविधि के लिए एरोबिक और anaerobic रास्ते के योगदान का मूल्यांकन और सेलुलर ऊर्जा प्रवाह का एक समग्र दृष्टिकोण प्राप्त है । यह गर्मी अपव्यय और ऑक्सीजन प्रवाह सैद्धांतिक oxycaloric समकक्ष के साथ परिकलित सीआर अनुपात की तुलना के बाद की एक एक साथ माप द्वारा पूरा किया है । कई महत्वपूर्ण कदम reproducible और विश्वसनीय डेटा के लिए विचार किया जाना चाहिए । एक बाँझ, स्वस्थ कोशिका संस्कृति के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है । बैक्टीरिया या कवक द्वारा संक्रमण अनुचित गर्मी उत्पादन या ऑक्सीजन की खपत में परिणाम हो सकता है, सीआर अनुपात अर्थहीन प्रतिपादन । इसके अलावा, अनुचित कोशिका गिनती, गरीब नमूना मिश्रण, या झुरमुट कोशिकाओं भी एक गलत सीआर अनुपात में परिणाम कर सकते हैं । आत्मशोधन के संबंध में एक महत्वपूर्ण कदम उचित नमूना तैयारी है ताकि इंजेक्शन ५० µ एल मात्रा में नीचे है । यह मात्रा मध्यम की एक न्यूनतम राशि चैंबर से विस्थापित है और ऑक्सीजन की खपत सही ढंग से 2 x 106 कोशिकाओं के लिए जिंमेदार ठहराया है सुनिश्चित करता है । एक बार नियमित श्वसन मनाया जाता है, प्रस्तावित प्रोटोकॉल दो अतिरिक्त titrations (oligomycin और FCCP) है, जो रिसाव श्वसन और mitochondria की ETS क्षमता रोशन के साथ संगत है । इस आवेदन के लिए, FCCP के अत्यधिक इसके अलावा श्वसन को बाधित और अधिक से अधिक प्रवाह को रोकने कर सकते हैं; इसलिए, अधिकतम 3-5 titrations से पहले अधिक से अधिक युगल श्वसन तक पहुंचने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।

आत्मशोधन और कैलोरीमीटर दोनों का रखरखाव और उचित अंशांकन calorespirometry के लिए महत्वपूर्ण है । पृष्ठभूमि ऑक्सीजन की खपत के लिए अनुमापन प्रोटोकॉल अत्यधिक की सिफारिश की है और dithionite के चरण वार titrations के साथ प्रदर्शन किया है चैंबर के भीतर कम ऑक्सीजन के स्तर तक पहुंचने के लिए । यह एक आवश्यक उपाय करने के लिए कसकर सील कक्षों की पुष्टि और ऑक्सीजन के लिए सही कक्षों में वापस प्रसार, खासकर अगर माप एक कम ऑक्सीजन तनाव में प्रदर्शन कर रहे हैं । इसके अलावा, कोशिकाओं के अतिरिक्त पहले एक सरगर्मी परीक्षण प्रदर्शन पॉस की जवाबदेही के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं । यदि जवाबदेही गरीब है या ऑक्सीजन फ्लक्स स्थिर नहीं है (चित्र 2), पॉस के लिए सेवा की आवश्यकता है । आत्मशोधन कक्षों की अनुचित सफाई अवरोधकों या युग्मकों, जो बाद में प्रयोगों को प्रभावित कर सकते है की अवशिष्ट मात्रा के पीछे छोड़ सकते हैं । सील कक्ष में हवा के बुलबुले भी माप के साथ हस्तक्षेप करने में सक्षम हैं और कक्ष के समापन के दौरान या नमूना इंजेक्शन के दौरान पेश किया जा सकता है अगर हवा के बुलबुले सिरिंज के भीतर मौजूद हैं । कैलोरीमीटर के प्रोटोकॉल अधिक प्रत्यक्ष है, लेकिन यह भी प्रयोगात्मक त्रुटियों के लिए अतिसंवेदनशील है । उदाहरण के लिए, एंपुल की गलत सीलिंग वाष्पीकरण के लिए जो बड़े पैमाने पर गर्मी के प्रवाह में परिवर्तन होने की अनुमति देगा ।

इस विधि की सीमाओं में से एक यह है कि सभी कोशिकाओं को निलंबन में नहीं किया जा सकता है और कई सेल लाइनों सेल संस्कृति प्लेट या सब्सट्रेट करने के लिए अनुयाई हैं । प्रयोग करने के लिए, संलग्न कोशिकाओं को पृथक्करण एजेंटों जैसे trypsin के उपयोग के माध्यम से थाली से उखाड़ enzymatically जाना होगा । इस स्थिति में कक्ष लघुगणकीय विकास चरण में नहीं हो सकते और उनके फिजियोलॉजी को बदला जा सकता है । इस प्रकार, कैलोरीमीटर और हाल ही में trypsinized कोशिकाओं के आत्मशोधन के माध्यम से बाद विश्लेषण बाधित सेलुलर गतिविधियों का आकलन कर सकते हैं. इसके अलावा, प्रस्तुत calorimetric प्रोटोकॉल में एक सीमा संलग्न ampules में कोशिकाओं के अवसादन है, जो जलीय समाधान में धीमी गति से ऑक्सीजन प्रसार के कारण कोशिकाओं के आसपास स्थानीय हाइपोक्सिया के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । हम निर्धारित किया है कि ~ 3 x 105 कोशिकाओं को ऊपरी सीमा इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया ampules के साथ संगत है । कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि कोशिकाओं के अवसादन से एक hypoxic वातावरण उत्पन्न कर सकते हैं, परिणामों से समझौता. इस प्रकार, अनुकूलन महत्वपूर्ण है अगर एक अलग सेल लाइन की जांच की है और वैकल्पिक दृष्टिकोण ऐसे मध्यम घनत्व को बढ़ाने के लिए कोशिकाओं को24के अवसादन को कम करने के रूप में विचार किया जाना चाहिए । Ampules उपलब्ध है कि परमिट सरगर्मी; हालांकि, यह एक ंयूनतम संकेत करने के लिए शोर अनुपात सरगर्मी के दौरान मौजूद है सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल में कार्यरत एक के अलावा calorimeters calorespirometry के साथ संगत कर रहे है और उनकी क्षमताओं हम क्या प्रस्तुत किया है परे हो सकता है । एक दो चैंबर आत्मशोधन के माध्यम से calorespirometric विश्लेषण की एक और सीमा एक उच्च प्रवाह विश्लेषण है, जो दवा के विकास के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक होगा के लिए अक्षमता है । इस सीमा, तथापि, श्वसन श्रृंखला और mitochondrial फिजियोलॉजी पर यौगिक के प्रभाव के एक उच्च संकल्प लक्षण वर्णन के लिए क्षमता द्वारा ऑफसेट है ।

एक ही नमूना से गर्मी उत्पादन और ऑक्सीजन फ्लक्स के दोनों उच्च संकल्प और एक साथ माप के लिए क्षमता इस विधि की एक महत्वपूर्ण ताकत है । एक संभावित सोने के मानक जब अनुयाई कोशिकाओं का उपयोग दोनों संस्कृति के लिए होगा और निलंबन में microcarrier मोतियों पर हो कोशिकाओं का विश्लेषण । इस विधि सेल संस्कृति सतह से पृथक्करण के नकारात्मक प्रभाव से बचना होगा और विकास वक्र के विभिंन चरणों में सेलुलर कार्यों के विश्लेषण के लिए अनुमति (लघुगणक चरण बनाम संपर्क-बाधित चरण7) । दुर्भाग्य से, microcarrier मोतियों का प्रयोग उच्च सरगर्मी आत्मशोधन में आवश्यक गति और हलचल पट्टी के नीचे कोशिकाओं के साथ साथ मोतियों की पीसने के लिए क्षमता के कारण समस्याग्रस्त किया जा सकता है । इन सीमाओं के बावजूद, आवेदनों की एक व्यापक रेंज calorespirometry के साथ संगत रहता है । विशेष रूप से, इस विधि को बेहतर जल्दी से संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं में mitotoxic यौगिकों की पहचान करके दवा के विकास की ओर अग्रसर है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के हिस्से में राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रांट चे-१६०९४४ मरियम ई. Konkle और माइकल ए Menze के द्वारा वित्त पोषित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HepG2 Cells American Type Culture Collection HB-8065 Cells used for calorespirometry
O2k-Respirometer Oroboros Instruments 10022-02 Respirometer
LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) Thermometric AB Thermometric was purchased by TA Instruments
Sodium Pyruvate (100 mM) Thermofisher Scientific 11360070 100x solution added to DMEM medium
Fetal Bovine Serum - Premiuim Select Atlanta Biologicals S11550 Added to 10% in DMEM medium
Trypsn-EDTA (0.25%) Thermofisher Scientific 25200072 Cell dissociation reagent
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes Sigma Aldrich  O4876 Mitochondrial Inhibitor
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma Aldrich C2920 Mitochondrial Uncoupler
Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish Corning Corporation 430167 Tissue culture dish
Glucose, powder Thermofisher Scientific 15023021 Glucose for DMEM medium
Galactose, powder Fischer Scientific BP656500 Galactose for DMEM medium
L-Glutamine (200 mM) Thermofisher Scientific 25030081 Glutamine for DMEM medium
DMEM, no glucose Thermofisher Scientific 11966025 Cell culture medium

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References

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अभियांत्रिकी अंक १३५ Respirometry calorimetry एरोबिक चयापचय anaerobic HepG2
Calorespirometry: एक शक्तिशाली, आक्रामक दृष्टिकोण सेलुलर ऊर्जा चयापचय की जांच करने के लिए
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Skolik, R. A., Konkle, M. E., Menze, M. A. Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism. J. Vis. Exp. (135), e57724, doi:10.3791/57724 (2018).

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