Summary
Este protocolo describe calorespirometry, la medición directa y simultánea de disipación de calor y la respiración, lo que proporciona un enfoque no invasivo para evaluar el metabolismo energético. Esta técnica se utiliza para evaluar la contribución de las vías aeróbicas y anaeróbicas para utilización de la energía mediante el control del flujo total de energía celular.
Abstract
Muchas líneas celulares utilizadas en la investigación biológica y biomédica básica mantienen la homeostasis de la energía a través de una combinación de respiración aerobia y anaerobia. Sin embargo, la medida en que ambas vías contribuyan al paisaje de la producción de energía celular es constantemente pasado por alto. Las células transformadas se cultivan en los niveles de glucosa se satura a menudo muestran una dependencia disminuida en la fosforilación oxidativa para la producción de ATP, que es compensada por un aumento en la fosforilación a nivel de sustrato. Este cambio en el equilibrio metabólico permite a las células de proliferar a pesar de la presencia de las toxinas mitocondriales. En descuidar el equilibrio metabólico alterado de las células transformadas, los resultados de una investigación farmacéutica puedan ser mal interpretados desde el potencialmente efectos mitotoxic no pueden ser detectadas utilizando modelo de líneas de celulares cultivado en presencia de glucosa alta concentraciones. Este protocolo describe el apareamiento de dos poderosas técnicas, respirometría y calorimetría, que permite la evaluación cuantitativa y no invasiva de contribuciones aeróbicas y anaeróbicas a la producción de ATP celular. Respiración aerobia y anaerobia genera calor, que puede ser monitoreados mediante calorimetría. Mientras tanto, medir la tasa de consumo de oxígeno puede evaluar el grado de respiración aeróbica. Disipación de calor y consumo de oxígeno se miden al mismo tiempo, se puede determinar la relación calorespirometric. Puede entonces compararse con el valor experimentalmente obtenido el oxycaloric teórico equivalente y la amplitud de la respiración anaerobia puede ser juzgada. Así, calorespirometry ofrece un método único para analizar una amplia gama de cuestiones biológicas, incluyendo el desarrollo de medicamentos, crecimiento microbiano y bioenergéticas fundamentales bajo condiciones hipóxicas y normoxic.
Introduction
En los sistemas biológicos, el cambio de la liberación de calor o entalpia durante el metabolismo suele ser supervisado ya sea directamente (vía directa calorimetría) o indirectamente por el consumo de O2 y CO2 producción (mediante respirometría). Desafortunadamente, cuando estas técnicas se utilizan en el aislamiento, información crítica se pierde, como la contribución de las vías anaerobias al metabolismo celular. Calorespirometry es una técnica poderosa que se basa en la medición simultánea de la disipación de calor y respiración. Calorespirometric labor pionera investigó el metabolismo anaerobio en células de mamífero totalmente oxigenadas y demostrado aportes simultáneos de las vías aeróbicas y anaeróbicas a la homeostasis de la energía a pesar de las células transformadas en un ambiente completamente oxigenada1. Calorespirometry desde entonces se ha aplicado a una amplia variedad de cuestiones biológicas. Algunos ejemplos incluyen el estudio de la energía animal en niveles bajos de oxígeno, los efectos del herbicida y estrógeno en las branquias de bivalvos, el metabolismo de organismos terrestres y la descomposición microbiana del suelo orgánico materia2, 3 , 4 , 5 , 6. Además, calorespirometry ha reveló cómo metabólica preacondicionamiento antes de congelación mejora la crioconservación de mamíferos las células7. Cada enfoque, calorimetría y respirometría, independientemente se ha incrementado nuestro conocimiento de la bioenergía celular y organismo. Sin embargo, cuestiones biológicas fundamentales que pueden ser contestadas mediante el uso de calorespirometry permanecen relativamente inexploradas.
Ley de Hess establece que el cambio total de entalpía de una reacción es independiente de la vía entre los Estados iniciales y finales. Por ejemplo, el cambio de entalpía total de un camino bioquímico es la suma del cambio en entalpías de todas las reacciones dentro de la vía. Calorimetría ofrece un enfoque en tiempo real para medir la producción de calor celular, que detecta indiscriminadamente las vías aeróbicas y anaeróbicas. Esto se basa en la Fundación que ninguna energía se intercambia en el sistema excepto a través de las paredes de la ampolla experimental8. Un cambio en la disipación de calor es igual al cambio en entalpía liberada de todas las reacciones metabólicas en la ampolla. Así, una entalpía negativa se corresponde con una pérdida de calor del sistema. Investigación exhaustiva sobre las últimas cuatro décadas ha caracterizado el paisaje termodinámico de catabolismo y anabolismo. Esto está representado por un aumento sostenido en los artículos de investigación en los términos de búsqueda "biológicos" y "calorimetría" como indexadas por los Estados Unidos Biblioteca Nacional de medicina (NLM) en los institutos nacionales de salud (PubMed). La búsqueda revela antes de 1970, un total de 27 publicaciones referencia calorimetría biológica; mientras tanto, en el 2016 solo, 546 publicaciones utilizan la técnica.
Calorimétricas métodos están bien establecidos para determinar la producción de calor. Sin embargo, se otorga mayor flexibilidad para resolver el valor respirométricos. La medición respirométricos puede consistir en O2, CO2, o ambos O2 y CO2. Además, la medición de O2 o CO2 puede lograrse mediante varias técnicas, incluyendo optrodes, electrodos tipo Clark y absorción de láser de diodo sintonizable espectroscopia de9,de7,10 ,11. Mientras que la producción de CO2 es una medida valiosa en muchos estudios respirométricos, el medio para las células cultivadas a menudo utiliza un sistema bicarbonic para control de pH12,13. Para evitar las complicaciones de la medición de CO2 en el sistema del bicarbonato, el siguiente protocolo para la calorespirometry de las células en cultivo utiliza O2 como único parámetro respirométricos.
Concurrente con la medición de flujo de oxígeno, ciertos respirometers (véase Tabla de materiales) están diseñados para evaluaciones detalladas de la función mitocondrial. Protocolos (traje) de sustrato-uncoupler-inhibidor-titulaciones están bien establecidos y son compatibles con experimentos diseñados para medir la membrana potencial o reactivas de oxígeno (ROS) las especies formación14. El protocolo presentado para calorespirometry de las células intactas es compatible con la introducción de uncouplers químicos como cianuro de carbonilo-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) y el F0F1-ATP sintasa inhibidor oligomycin. Mediante la adición de FCCP, consumo de oxígeno puede ser desacoplado de la producción de ATP, que es útil para evaluar el impacto de la terapéutica potencial en el funcionamiento mitocondrial15. Además, la adición de oligomycin ilumina el grado de respiración de escape. Así, las mediciones respirométricos realizadas durante calorespirometry son compatibles con protocolos extenso diseñados para aclarar más lejos la fisiología mitocondrial.
La medida simultánea de la disipación de calor y flujo de oxígeno permite el cálculo de la relación calorespirometric (CR). Este cociente se compara constante de Thornton o la oxycaloric teórica equivalente, que oscila entre-430 a-480 kJ mol-1 dependiendo de la línea de células o tejidos de interés y el carbón suplido sustratos1, 16. por lo tanto, una relación más negativa de CR revela aumento de las contribuciones de vías anaeróbicas a la actividad metabólica general. Por ejemplo, la proporción de CR para la respiración de los tejidos musculares rutina sin el desempeño activo de trabajo oscila entre-448 y-468 kJ mol-1, que es dentro de la gama del oxycaloric teórico equivalente17,18. Mientras tanto, las células del cáncer mamíferos cultivadas en medio alto en glucosa Mostrar mayor ácido láctico fermentación después de glicolisis y relativamente baja participación mitocondrial19. Este resultados de fenotipo en las tasas de CR en la gama de-490 a-800 kJ mol-1, demostrando una mayor implicación de las vías anaerobias en el metabolismo celular como indica más negativas CR ratios1,7, 16,20.
Distribuidores de células y tejidos tanto comerciales como sin fines de lucro actualmente oferta de líneas de celulares de más de 150 especies, con casi 4.000 líneas celulares derivan de los seres humanos. Líneas celulares inmortalizadas son herramientas convenientes para la evaluación rápida de la toxicidad de la terapéutica potencial, muchos de los cuales pueden interferir directa o indirectamente con las funciones mitocondriales. Usando las células transformadas durante la detección de drogas puede ser un valor predictivo limitado en parte debido al efecto de Warburg, un rasgo distintivo de muchos cánceres. A menudo, los cánceres generan ATP fosforilación a nivel de sustrato y equilibrio redox a través de la producción de lactato sin comprometer completamente la mitocondria bajo condiciones aerobias19. Desarrollo farmacéutico es muy costoso e ineficiente, con 8 de los 9 compuestos probados en ensayos clínicos en humanos no lograr la aprobación de mercado21. Mientras que la terapéutica potencial puede pasar revisión inicial debido a la baja citotoxicidad en líneas celulares, es posible que algunos de estos compuestos son mitotoxic. Sin un método adecuado para detectar cómo estas toxinas pueden afectar el balance de energía en las células primarias que no muestran el efecto de Warburg, información crítica suele ser alto, cuellos de botella desarrollo terapéutico en fases tempranas.
Calorespirometry es un enfoque práctico, no invasivo para analizar la actividad metabólica en una variedad de muestras biológicas, incluidas las células y los tejidos. El núcleo del protocolo presentado es compatible con una gama de aplicaciones. Una complicación, sin embargo, ha sido identificada. Las células inmortalizadas a menudo se cultivan en un medio libre de glucosa con la galactosa para aumentar la contribución de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) para la producción de energía, con el fin de sensibilizar las células a potenciales mitotoxins22, 23. Esta reprogramación metabólica parece oscurecer el análisis cuando las muestras se colocan en las ampollas de acero inoxidable utilizados por el calorímetro15. Las células cultivadas en un medio de glucosa seguirán en alta actividad metabólica durante varias horas. Mientras tanto, las células cultivadas en medio de galactosa disminuyen la producción de calor dentro de 30 minutos de su colocación en la ampolla, de realizar medidas de restringido a puntos del tiempo experimental temprana. Este comportamiento, desafortunadamente, impide la oportunidad de evaluar su proliferación celular. A pesar de esta limitación específica, mayoría de las aplicaciones es compatible con el análisis de calorespirometric y toda la información metabólica puede obtenerse a través de este enfoque.
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Protocol
1. cultivo celular
- Mantener las células del carcinoma (HepG2) hepatocelular humano en medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) y sustratos adicionales (10 mM de glucosa, glutamina 2 mM y 1 mM piruvato) a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular (5% CO2 , 95% aire, 100% de humedad).
Nota: Utilice la anterior formulación de DMEM al DMEM se hace referencia en pasos posteriores para la respirometría y calorimetría. - La placa de las celdas de 1 x 106 células por placa de 100 mm cultura y subcultura cada 7 días o antes de llegar a 90% de confluencia y renovar el medio cada 3-4 días.
- Realizar los experimentos cuando las células son confluentes de 60-80%.
2. preparación del respirómetro y calorímetro
- Pipeta, 2,2 mL de DMEM en la cámara del respirómetro, inserte el tapón y ajustar con la herramienta de espaciador tapón para permitir la difusión óptima del oxígeno del aire al medio.
- Revolver continuamente a 37 ° C hasta que la concentración de oxígeno (trazo azul) y el flujo de oxígeno (trazo rojo) son estables. Asegúrese de que software del respirómetro está programado para tener en cuenta la solubilidad de oxígeno de los medios utilizados en el experimento.
Nota: Los diferentes medios de comunicación tienen coeficientes de solubilidad de oxígeno diferentes (por ejemplo, DMEM = 0,92). - Después de la estabilización de la concentración de oxígeno en DMEM con la cámara abierta, seleccionar una parte estable de la traza de la concentración de oxígeno y calibre para la saturación del aire del 100%.
- Calibrar el 0% de oxígeno seleccionando una porción estable de la traza de la concentración de oxígeno cuando no hay oxígeno presente en la cámara. Realizar este paso después de 20 valoración de μl de Ditionito de sodio 230 mM o después de que todo el oxígeno es consumido por la muestra biológica al final de un experimento.
- Después de la calibración de aire del 100% del respirómetro, cerrar el tapón y asegúrese de que no hay burbujas están presentes en la cámara.
Nota: un ligero aumento en el flujo de oxígeno será detectado en la cámara cerrada como el sensor de oxígeno polarográfico (POS) consume oxígeno para medir la presión parcial de oxígeno. - Después de ~ 10 minutos del obturador se cierra, confirman que el respirómetro está listo para las células HepG2 mediante la observación de un flujo de oxígeno estable.
Nota: El calorímetro utilizado aquí utiliza ampollas de acero inoxidable y requiere una ampolla que se utilizará como referencia. - Añadir 2,5 mL de H2O (dH2O) [volumen igual que las muestras (paso 4)] a la ampolla de la referencia del calorímetro y apriete la tapa, usando alicates de ser necesario. Limpiar la ampolla sellada con flujo de aire y baje lentamente la ampolla hasta la posición 1 en el canal de referencia del calorímetro. Permanecen en la posición 1 hasta que se prepara la muestra biológica.
3. preparación de células HepG2 de respirometría y calorimetría
- Confirmar que el respirómetro calorímetro preparado y calibrado. DMEM y tripsina a 37 ° C en un baño de agua.
- Agregar DMEM fresca placa de 100 mm y de lugar en la incubadora para permitir el equilibrio del medio de CO2 y temperatura.
Nota: Este medio se usará para el experimento de calorimetría, así que el volumen adecuado depende de la cantidad de ampollas que se utilizará. - Confirmar con un microscopio invertido de luz que las células en el confluente de 60-80%, luego lavar el 100 mm placa de 2 x con 10 mL de temperatura ambiente con tampón fosfato salino (PBS).
- Añadir 3 mL de la tripsina de 37 ° C en la placa de 100 mm de las células y les incube durante 7-10 min a 37 ° C en la incubadora de la cultura de célula. Neutralizar la tripsina con 3 mL de DMEM de 37 ° C y suspender por suavemente pipeteo ~ 20 veces con una pipeta de 5 mL.
- Transferir los 6 mL de células resuspendidos en DMEM y tripsina en un tubo cónico de 15 mL estéril y centrifugar por 5 min a 175 x g. quitar el líquido sin perturbar el sedimento celulares.
- Resuspender el precipitado de células en ~ 5 mL de DMEM y pipetee cuidadosamente para asegurar las células son suficientemente disociados uno del otro.
- Quitar el ~ 100 μl de la muestra bien mezclada y realizar un conteo minucioso utilizando todos los campos de 8 en un hemocitómetro para determinar el número total de células. Luego calcular el volumen de resuspensión de las células para generar ~ 2 x 106 células por μl 50.
Nota: Esto asegurará que el 2 x 106 células se añaden a cada cámara del respirómetro con mínimo desplazamiento medio. - Centrifugar las células durante 5 min a 175 x g. Resuspender el pellet en el volumen calculado de DMEM de paso 3.7.
- Realizar un conteo para determinar el volumen requerido para inyectar 2 x 106 células por cámara en el respirómetro (esto debe ser ~ 50 μL). Almacenar las células para la medición respirométricos en hielo hasta que esté listo.
- Mientras que la muestra concentrada de células es en el hielo, determinar la dilución requerida para producir una concentración de 1 x 105 células/mL para la calorimetría.
- Mezclar bien la muestra y preparar 3 mL de las células 1 x 105 células/ml de DMEM cada ampolla.
Nota: El DMEM utilizado para la dilución de la muestra debe ser el medio equilibrado preparado en el paso 3.3.
4. calorimetría
- Asegúrese de que calorímetro está conectado a la computadora y la señal calorimétrica en μW es observable y estable.
- Añadir 2,5 mL de células 1 x 105 células/ml (~2.5 x 105 células) para cada ampolla, asegurando suficiente aire entre la tapa de la ampolla y el medio para permitir la difusión del gas.
- Inmediatamente apriete el tapón, usando alicates de ser necesario. Limpiar la ampolla sellada, con flujo de aire para remover cualquier suciedad externa y baje lentamente la ampolla hasta la posición 1 del calorímetro. Registrar el tiempo de que la ampolla se baja hasta la posición 1.
- Permiten la ampolla a sentarse en la posición 1 durante 15 minutos.
Nota: Durante este período de 15 minutos, las células son para ser inyectada en el respirómetro (paso 5). Esto asegura que el mismo intervalo de tiempo se utiliza para la producción de calor y consumo de oxígeno cuando se determina la proporción de CR. - Después de 15 minutos en posición 1, baje lentamente la referencia y la muestra ampollas en la posición 2. Registrar el tiempo que las ampollas fueron bajados y medida para por lo menos 30 minutos.
5. respirometría
- Durante el intervalo de 15 minutos en el que la ampolla está en la posición 1 en el calorímetro, comienzan los estudios respirométricos.
- Mezclar bien la muestra de células mediante pipeteo para asegurar una solución homogénea e inyectar < 50 μl de la muestra de células en cada compartimiento del respirómetro para una concentración final de 2 x 106 células/cámara. Registrar el tiempo que las células se inyectan en el respirómetro.
- Después de la inyección, las células HepG2 se revuelven continuamente a 37 ° C. Espere por lo menos 20-30 min para ambos una estabilización del flujo de oxígeno y una constante disminución en la concentración de oxígeno.
- Seleccione la ficha de flujo de O2 por la V a la derecha de la pantalla, resalte una parte estable del flujo de oxígeno. Seleccione marcas, entonces las estadísticas y datos de registro para el flujo de O2 por V. Esta grabación se utilizará en el cálculo de la proporción de CR.
Nota: Los pasos 5.5 y 5.6 son opcionales. Respiración de fuga y máxima respiración desacoplada se revelará por titulaciones de oligomycin y FCCP. - Inyectar 1 μl de oligomycin 4mg/mL en cada cámara y permiten ~ 10 minutos para la estabilización del flujo de oxígeno. Tasa de respiración de fuga estable registro siguiendo los pasos realizados en 5.4 poniendo una porción estable de la traza de flujo de oxígeno después de la adición de oligomycin.
- Valorar las inyecciones de 2 μl de 0,2 mM FCCP en cada cámara, permitiendo para la estabilización del flujo de oxígeno después de cada inyección. Continuar con las valoraciones hasta que se alcanza el flujo máximo, según lo indicado por un ligero descenso en la valoración posterior del FCCP. Registrar la frecuencia de respiración estable durante el flujo máximo.
6. cálculo del coeficiente de Calorespirometric de
- Realizar un conteo final de las muestras preparadas en ~ 1 x 105 células/mL, utilizando todos los campos de un hemocitómetro para determinar el número total de células a la ampolla (2,5 mL) 8.
- Determinar un tiempo récords medidas del calorímetro y respirómetro que estable las señales están presentes en momentos idénticos. Referencia el tiempo registrado cuando la ampolla fue bajada a la posición 2 y el tiempo de la inyección de células en el respirómetro.
- Grabar la producción de calor colocando el cursor sobre la traza muestra salida de calor para la ampolla respetada en el momento determinado en el paso y expresa como μW/millón de células. Recoger datos de consumo de oxígeno y garantizar que se expresa como pmol O2 x s-1 x millones de células.
- Para calcular la proporción de CR, primero convertir MW a kJ/s y luego dividir kJ/s sobre mol de O2/s para obtener la relación CR expresada en kJ/mol O2. Nota: La proporción de CR se presenta en kJ/mol O2.
(véase la archivo adicional 1)
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Representative Results
La reproducibilidad de las mediciones de calorespirometric depende de una preparación adecuada y constante. Muestras preparadas a partir de cultivos celulares deben no utilizarse si las placas son muy crecidas, como recuentos de células pueden ser inexactos debido a la aglutinación. Además, flujos de calor reducida debido a la difusión limitada de sustrato en las células agrupadas pueden ocurrir. Por lo tanto, al utilizar células adherentes, es fundamental seleccionar una placa con la confluencia entre 60-80% y cambiar el medio de 24 h antes del experimento.
Mantenimiento y calibración de instrumental adecuado también son críticos para las medidas informativas y reproducible calorespirometric. Siguiendo el fabricante establecido protocolo de limpieza para el respirómetro, extensa lavados con etanol se ponen en ejecución para asegurarse de que los inhibidores de la residual uncouplers hidrofóbicos se quitan y no pongan en peligro las medidas por parte mitocondrias inhibiendo o desacoplar. Cuando la cámara del respirómetro está funcionando antes de la medición de la muestra, la concentración de oxígeno y los rastros de flujo de oxígeno deben ser estables como se muestra en la figura 1. Si la posición es que necesitan servicio de sensor, el flujo de oxígeno no se estabiliza como se ve en la figura 2. Las mediciones no deben realizarse cuando el POS no es atendida correctamente. Además, las ampollas utilizadas en el calorímetro deben ser limpiados, esterilizados y secados antes de su uso, como la contaminación biológica puede interferir con la producción de calor de la muestra.
Se preparan muestras de células después de la calibración adecuada y la preparación del respirómetro y el calorímetro. En primer lugar, el tapón en el respirómetro se cierra y la cámara es inspeccionada para asegurarse que no hay burbujas de aire están presentes. Luego, células HepG2 se concentra a ~ 2 x 10650 μl de respirometría y colocar inmediatamente en hielo. Para Calorimetría, células HepG2 de la muestra concentrada se diluyen en medio DMEM en ~ 1 x 105 células/mL. Después de que las células estén completamente mezcladas mediante pipeteo, 2,5 mL de la suspensión se agrega a una ampolla estéril. La ampolla es cerrada, y se quita cualquier suciedad externa soplando la ampolla con una corriente de aire de una bomba de aire. La ampolla se baja lentamente hasta la posición 1, donde permanece durante 15 minutos. Después de transcurrido 15 min ampollas de la referencia y la muestra entonces se bajan lentamente a la posición 2 y mediciones pueden comenzar a grabar una vez que el calor de la salida es estable (figura 3).
Un conteo final se realiza después de que las células se agregan en el calorímetro y el respirómetro para determinar el número exacto de las células que se introduce en el calorímetro. La producción de calor se expresa entonces por millones de células. Si las células HepG2 se cultivan en ausencia de glucosa y galactosa se complementa para aumentar la participación mitocondrial, las células no proliferan dentro del calorímetro, pero en cambio disminuyan su actividad metabólica después de 30 minutos en la ampolla. Esto restringe el cálculo de CR para el momento más temprano en que se midió la disipación de calor (figura 4).
Es crítico para registrar la hora de que añadir las células a la ampolla de modo que las mediciones de consumo producción y oxígeno calor se recogen en momentos idénticos. Si no se toma esta precaución, se pueden introducir errores experimentales importantes en la determinación de la proporción de CR. Durante el período de 15 minutos, mientras que la ampolla está en la posición 1 en el calorímetro, las células se mezclan suficientemente mediante pipeteo les, y 2 x 106 células se inyectan en el respirómetro a través de una jeringa Hamilton. Flujo de oxígeno se estabiliza después de aproximadamente 15 minutos y el oxígeno concentración declina constantemente (figura 5). Otra vez, es fundamental que se registra el tiempo de la inyección de la muestra para análisis de datos. El flujo de oxígeno estabilizado de las células sirve como sustituto para el consumo de oxígeno en el cálculo de la proporción de CR. Titulaciones adicionales se realizan para evaluar la respiración de la fuga (1 μl oligomycin) indicada por una gota a un menor flujo de oxígeno y la respiración desacoplada máxima (3-5 titulaciones de 2 μl FCCP) indicada por el fracaso en aumentar la respiración después de sucesivas Valoraciones del FCCP. Desacoplar incompleta o una inhibición de la respiración no puede ser observado si el stock FCCP ha caducado (figura 6).
Calibración de aire Figura 1:100 % del estado del sensor de oxígeno polarográfico (POS) y respirómetro. Las señales para la concentración de oxígeno (línea azul) y el flujo de oxígeno (línea roja) tanto estabilizan antes de la calibración de aire 100%. Las líneas estables indican que el respirómetro está listo para la calibración. La calibración debe realizarse en DMEM y no en H2O. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: POS que necesitan servicio. Después de la estabilización de la concentración de oxígeno (trazo azul), el flujo de oxígeno (trazo rojo) no se puede estabilizar. El POS no debe utilizarse para la experimentación y servicio debe aplicarse según lo descrito por el fabricante. Una mayor inestabilidad del flujo de oxígeno se correlaciona con una mayor demanda de servicio de la posición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Aproximadamente 2.5 x 10 células5 HepG2 cultivadas en medio glucosa muestran signos de proliferación en el calorímetro. ~2.5 x 105 HepG2 células cultivadas en presencia de glucosa por ampolla de carga genera una producción constante de calor de -20 a-28 MW mediante el ajuste de 30 MW en el instrumento y una producción de calor creciente con el tiempo se correlaciona con la proliferación celular dentro de la ampolla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Aproximadamente 2.5 x 10 células5 HepG2 cultivadas en medio de galactosa no proliferan y disminuye con el tiempo la producción de calor. Carga de ~2.5 x 105 HepG2 células cultivadas en galactosa por resultados de la ampolla en una producción de calor inmediata de ~-20 MW. Sin embargo, la producción de calor disminuye con el tiempo y restringe las medidas CR-relación a los puntos de tiempo temprano del experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: rutina, desacoplado y perder la respiración de las células HepG2. Una vez que las células fueron inyectadas en el respirómetro, concentración de oxígeno disminuido constantemente (trazo azul). Después de la estabilización del flujo de oxígeno (trazo rojo) durante la respiración habitual de las células intactas, oligomycin fue agregado para inhibir la F0F1ATP - sintasa. Esto es indicado por la estabilización del flujo de oxígeno después de la adición de oligomycin, que revela la pérdida de respiración. Deben realizarse aproximadamente 3-5 valoraciones de FCCP para desacoplar la respiración de la síntesis de ATP y para revelar la capacidad del sistema (ETS) de transporte de electrones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: desacoplar fracasada de la respiración celular HepG2. Después de la adición de las células, el oxígeno flujo estabilizado (trazo rojo) durante rutina respiración y oxígeno concentración disminuida constantemente (línea azul). Titulación del FCCP dio lugar a una incompleta desacoplar y eventual inhibición, impidiendo que se alcanzó la capacidad máxima de ETS. FCCP probablemente contaminado o degradado de almacenamiento a largo plazo. Si observa una acción FCCP fresca debe ser preparada. Además, confirman que oligomycin no inhibe la capacidad ETS durante el desacoplamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El objetivo de calorespirometry es evaluar cuantitativamente la contribución de las vías aeróbicas y anaeróbicas a actividad metabólica y obtener una vista compuesta de flujo de la energía celular. Esto se logra mediante una medición simultánea de la disipación de calor y flujo de oxígeno, seguido por una comparación de la proporción de CR calculada con la oxycaloric teórica equivalente. Deben considerarse varios pasos críticos para datos reproducibles y confiables. El mantenimiento de un cultivo celular estéril y saludable es fundamental. Contaminación por bacterias u hongos puede resultar en el consumo de oxígeno o producción de calor malversados, representar la proporción de CR sin sentido. Además, incorrecto recuento, muestra mala mezcla, o también pueden resultar células agrupadas en una incorrecta relación de CR. Un paso crítico en relación con el respirómetro es preparación de la muestra adecuada para que la inyección está por debajo de 50 μL en el volumen. Este volumen asegura una cantidad mínima de medio es desplazada de la cámara y el consumo de oxígeno se atribuye correctamente a 2 x 106 células. Una vez que se observa la respiración habitual, el protocolo propuesto es compatible con dos Titulaciones adicionales (oligomycin y FCCP), que iluminan la fuga la respiración y la capacidad ETS de la mitocondria. Para esta aplicación, adición excesiva de FCCP puede inhibir la respiración y prevenir flujo máximo; por lo tanto, se deben realizar al menos 3-5 valoraciones antes de alcanzar la máxima respiración desacoplada.
Mantenimiento y adecuada calibración del respirómetro y calorímetro es fundamental para calorespirometry. El protocolo de valoración para el consumo de oxígeno del fondo es muy recomendable y se realiza con titulaciones escalonadas de ditionito a alcanzar niveles de disminución del oxígeno dentro de la cámara. Se trata de una medida esencial para confirmar compartimientos herméticos y corregir para la posterior difusión de oxígeno en las cámaras, sobre todo si las mediciones se realizan en una tensión de oxígeno baja. También, realizar una prueba de agitador antes de la adición de células puede proporcionar información sobre la capacidad de respuesta de la posición. Si la respuesta es pobre o el flujo de oxígeno no es estable (figura 2), servicio a la posición se requiere. Una limpieza inadecuada de las cámaras del respirómetro puede dejar atrás cantidades residuales de inhibidores o uncouplers, que pueden afectar a posteriores experimentos. Burbujas de aire en la cámara de sellado son también capaces de interferir con las mediciones y pueden ser introducidas durante el cierre de la cámara o durante la inyección de la muestra si hay burbujas de aire dentro de la jeringa. Protocolo del calorímetro es más directo, pero también es susceptible a errores experimentales. Por ejemplo, el cierre incorrecto de la ampolla permite evaporación ocurra que masivamente cambios de flujo de calor.
Una de las limitaciones de este método es que no todas las células pueden ser cultivadas en suspensión y muchas líneas celulares son adherentes a la placa de cultivo celular o sustrato. Para realizar experimentos, las células adjuntas que enzimáticamente retirar de la placa mediante el uso de agentes de disociación como la tripsina. Las células en este estado pueden no estar en la fase de crecimiento logarítmico y puede alterar su fisiología. Así, el análisis posterior mediante que el calorímetro y el respirómetro de células recientemente tripsinizaron pueden evaluar interrumpió las actividades celulares. Además, una limitación en el protocolo presentado calorimétrica es la sedimentación de células en las ampollas de cerrado, que pueden llevar a la hipoxia local alrededor de las células por difusión lenta del oxígeno en soluciones acuosas. Hemos determinado que ~ 3 x 105 células es el límite máximo compatible con las ampollas utilizadas en el presente Protocolo. Aumentar el número de células puede generar un ambiente hipóxico de la sedimentación de las células, comprometiendo los resultados. Por lo tanto, la optimización es crítica si se investiga una línea de células diferentes y alternativas deben considerarse como el aumento de la densidad media para reducir la sedimentación de células24. Ampollas están disponibles que permiten revolver; sin embargo, es fundamental para garantizar que una relación señal / ruido mínima está presente durante la agitación. Además, Calorímetros además de la empleada en este protocolo son compatibles con calorespirometry y su capacidad puede estar más allá de lo que hemos presentado. Otra limitación del análisis calorespirometric por medio de un respirómetro dos cámaras es la imposibilidad de un análisis de alto rendimiento, que serían más relevante para el desarrollo farmacéutico. Sin embargo, esta limitación se compensa por la capacidad para una alta resolución caracterización de la influencia de los compuestos de la cadena respiratoria y fisiología mitocondrial.
La capacidad de medición de alta resolución y simultánea del flujo de la salida y el oxígeno del calor de la misma muestra es una fuerza importante de este método. Un potencial estándar de oro cuando utilizando células adherentes sería tanto cultura y analizar las células cultivadas en la cuenta de la potencia de suspensión. Este método evitaría el impacto negativo de la disociación de la superficie de cultivo celular y permiten el análisis de las funciones celulares en diferentes fases de la curva de crecimiento (fase logarítmica vs contacto inhibido fase7). Por desgracia, con perlas de potencia puede ser problemático debido a la alta velocidad de agitación en el respirómetro y el potencial para la molienda de los granos junto con las células debajo de la barra de agitación. A pesar de estas limitaciones, una amplia gama de aplicaciones sigue siendo compatible con calorespirometry. En particular, este método va a facilitar el mejor desarrollo farmacéutico identificando rápidamente los compuestos mitotoxic en células cultivadas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado en parte por la subvención de la National Science Foundation 160944 Mary E. Konkle y Michael A. Menze.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HepG2 Cells | American Type Culture Collection | HB-8065 | Cells used for calorespirometry |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | Respirometer |
| LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) | Thermometric AB | Thermometric was purchased by TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | 100x solution added to DMEM medium |
| Fetal Bovine Serum - Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | Added to 10% in DMEM medium |
| Trypsn-EDTA (0.25%) | Thermofisher Scientific | 25200072 | Cell dissociation reagent |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Sigma Aldrich | O4876 | Mitochondrial Inhibitor |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | Mitochondrial Uncoupler |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning Corporation | 430167 | Tissue culture dish |
| Glucose, powder | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose for DMEM medium |
| Galactose, powder | Fischer Scientific | BP656500 | Galactose for DMEM medium |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher Scientific | 25030081 | Glutamine for DMEM medium |
| DMEM, no glucose | Thermofisher Scientific | 11966025 | Cell culture medium |
References
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