Summary
Dit protocol beschrijft calorespirometry, de directe en gelijktijdige meting van zowel warmteafvoer en ademhaling, waarmee een noninvasive aanpak om te beoordelen van de energie-stofwisseling. Deze techniek wordt gebruikt ter beoordeling van de bijdrage van zowel aerobe en anaerobe emissieroutes naar energie gebruik door toezicht op de totale cellulaire energiestroom.
Abstract
Veel gebruikt in de biologische en biomedische basisonderzoek cellijnen handhaven energie homeostase door een combinatie van zowel aërobe en anaërobe ademhaling. De mate waarin beide trajecten tot het landschap van cellulaire energieproductie bijdragen is echter consequent over het hoofd gezien. Getransformeerde cellen gekweekt in het verzadigen van de niveaus van de glucose vaak Toon een verminderde afhankelijkheid op oxidatieve fosforylatie voor ATP productie, die wordt gecompenseerd door een toename van de substraat-niveau fosforylering. Deze verschuiving in metabole poise kunt cellen te verspreiden ondanks de aanwezigheid van mitochondriale toxines. De gewijzigde metabole poise getransformeerde cellen negeren, resultaten van een farmaceutische screening kunnen worden geïnterpreteerd sinds de potentieel mitotoxic effecten niet worden gedetecteerd met behulp van model cellijnen gekweekte in aanwezigheid van hoge glucose concentraties. Dit protocol beschrijft de koppeling van twee krachtige technieken, respirometrie en calorimetrie, waarmee voor de beoordeling van het kwantitatieve en noninvasive van zowel aerobe en anaerobe bijdragen aan cellulaire productie van ATP. Zowel aërobe en anaërobe ademhalingen genereren van warmte, die gecontroleerd via calorimetrie worden kan. Ondertussen, het meten van de snelheid van zuurstofverbruik kan beoordelen in welke mate van aërobe ademhaling. Wanneer zowel warmteafvoer en zuurstofverbruik gelijktijdig gemeten worden, kan de verhouding van de calorespirometric worden bepaald. De experimenteel verkregen waarde kan vervolgens worden vergeleken met de theoretische oxycaloric gelijkwaardig en de omvang van de anaërobe ademhaling kan worden beoordeeld. Calorespirometry biedt dus een unieke methode om een breed scala aan biologische vragen, met inbegrip van de Geneesmiddelenontwikkeling, microbiële groei en fundamentele Bioenergetica onder zowel normoxic als hypoxische voorwaarden te analyseren.
Introduction
In biologische systemen, de warmte-release of enthalpie verandering tijdens de stofwisseling is doorgaans bewaakt ofwel direct (via directe calorimetrie) of indirect via O2 verbruik en/of CO2 productie (via respirometrie). Helaas, wanneer deze technieken worden gebruikt in isolatie, kritische informatie gaat verloren, zoals de bijdrage van anaërobe emissieroutes naar de cellulaire metabolisme. Calorespirometry is een krachtige techniek die op de gelijktijdige meting van zowel de warmteafgifte en de ademhaling berust. Calorespirometric pionierswerk de anaërobe metabolisme in volledig zuurstofrijk zoogdiercellen onderzocht en aangetoond gelijktijdige bijdragen van zowel aerobe en anaerobe emissieroutes naar energie homeostase ondanks de veranderde cellen worden een volledig zuurstofrijk milieu1. Calorespirometry heeft inmiddels een breed scala aan biologische vragen vereffend. Enkele voorbeelden zijn de studie van dierlijke energetics op lage zuurstofniveaus, de effecten van zowel oestrogeen als herbicide op de kieuwen van tweekleppigen, het metabolisme van terrestrische organismen en de microbiële afbraak van organische bodem zaak2, 3 , 4 , 5 , 6. verder calorespirometry heeft geopenbaard hoe metabole conditionering vóór bevriezing verbetert de cryopreservatie van zoogdier-7cellen. Elk aanpak, zowel calorimetrie en respirometrie, toegenomen zelfstandig onze kennis van cellulaire en organisch Bioenergetica. Fundamentele biologische vragen die beantwoord kunnen worden door het gebruik van calorespirometry blijven echter relatief onontgonnen.
Hess de wet bepaalt dat de totale enthalpie verandering van een reactie onafhankelijk van het pad tussen de eerste en laatste Staten is. Bijvoorbeeld, is de totale enthalpie verandering voor een biochemische weg de sommatie van de verandering van enthalpie van alle reacties binnen het traject. Calorimetrie biedt een real-time aanpak voor het meten van cellulaire warmteproductie, die lukraak zowel aërobe en anaërobe trajecten detecteert. Dit is gebaseerd op het fundament dat geen energie in het systeem, behalve door de muren van de experimentele ampul8wordt uitgewisseld. Een verandering in de warmteafgifte is gelijk aan de verandering in enthalpie verlost van alle metabole reacties in de ampul. Dus correleert een negatieve enthalpie met een verlies van warmte uit het systeem. Uitputtend onderzoek in de afgelopen vier decennia heeft gekenmerkt de thermodynamische landschap van zowel katabolisme en anabolisme. Deze omgeving wordt voorgesteld door een gestage stijging van de onderzoeksartikelen vinden onder de zoektermen "biologische" en "calorimetrie" als geïndexeerd door de Verenigde Staten nationale bibliotheek van geneeskunde (NLM) op de National Institutes of Health (PubMed). De zoekopdracht blijkt dat vóór 1970, een totaal van 27 publicaties referentie biologische calorimetrie; Ondertussen, in 2016 alleen, 546 publicaties gebruikt de techniek.
Colorimetrische methoden zijn gevestigde om warmteproductie. Echter wordt meer flexibiliteit verleend voor het oplossen van de respirometrische waarde. De respirometrische meting kan bestaan uit O2CO2, of zowel O2 en CO2. Verder, het meten van O2 of CO2 kan worden bereikt door verschillende technieken, waaronder optrodes, Clark-type elektroden en afstembare diode laser Absorptie spectroscopie7,9,10 ,11. Terwijl de CO2 productie is een waardevolle metriek in vele respirometrische studies, het medium voor gekweekte cellen vaak maakt gebruik van een bicarbonic buffersysteem voor pH control12,13. Voorkom complicaties van CO2 meting in het bicarbonaat-systeem, het volgende protocol voor de calorespirometry van cellen in cultuur maakt gebruik van O2 als de enige respirometrische parameter.
Gelijktijdig met het meten van zuurstof flux, bepaalde respirometers (Zie Tabel van materialen) zijn ontworpen voor gedetailleerde evaluaties van mitochondriale functie. Substraat-uncoupler-remmer-TITRATIES (SUIT) protocollen zijn goed ingeburgerd en zijn compatibel met experimenten ontworpen voor het meten van membraan potentiële of reactieve zuurstof soorten (ROS) vorming14. Het gepresenteerde protocol voor calorespirometry van cellen intact is compatibel met de invoering van chemische uncouplers zoals carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) en de F0F1ATP - synthase remmer oligomycin. Door de toevoeging van FCCP, kan zuurstofverbruik worden afgekoppeld van de ATP productie, wat handig is om de impact van potentiële therapeutics op mitochondriale peformance15. Bovendien, de toevoeging van oligomycin verlicht de omvang van de ademhaling van de lek. Dus, de respirometrische metingen tijdens calorespirometry zijn compatibel met uitgebreide protocollen ter verdere verheldering mitochondriale fysiologie.
De gelijktijdige meting van zowel warmteafvoer en zuurstof flux zorgt voor de berekening van de verhouding tussen de calorespirometric (CR). Deze verhouding wordt vervolgens vergeleken met de Thornton's constante of de theoretische oxycaloric equivalent, die tussen-430 te-480 kJ mol-1 afhankelijk van het cellijn of weefsel van belang en de aangevuld koolstof substraten1, varieert 16. dus, een meer negatieve CR verhouding onthult grotere bijdragen van anaërobe trajecten voor algemene metabole activiteit. Bijvoorbeeld, is de CR-verhouding voor routinematige spier weefsel ademhaling zonder de actieve uitvoering van werk varieert van-448 tot-468 kJ mol-1 die binnen het bereik valt van de theoretische oxycaloric gelijkwaardig17,18. Ondertussen, zoogdieren kankercellen gekweekt in medium dat is hoog in glucose weer verbeterde melkzuur gisting na de glycolyse en relatief lage mitochondriale betrokkenheid19. De resultaten van dit fenotype in CR verhoudingen in het bereik van-490 naar-800 kJ mol-1, tonen een verhoogde betrokkenheid van de anaërobe trajecten in het cellulaire metabolisme zoals aangegeven door negatiever CR verhoudingen1,7, 16,20.
Zowel commerciële als non-profit cel- en weefseltransplantaties distributeurs momenteel aanbod cellijnen uit meer dan 150 soorten, met bijna 4000 cellijnen afgeleid van mensen. Vereeuwigd cellijnen zijn handige hulpmiddelen voor het snel beoordelen van de toxiciteit van potentiële therapeutics, waarvan vele direct of indirect mitochondriale functies storen. Getransformeerde cuvetten tijdens drug screening kunnen beperkte voorspellende waarde gedeeltelijk vanwege het Warburg effect, een kenmerk van veel kankers. Vaak kankers ATP genereren van substraat-niveau fosforylatie en redox evenwicht door de productie van lactaat zonder volledig het mitochondrion onder aërobe omstandigheden19. Farmaceutische ontwikkeling is notoir dure en inefficiënte, met ongeveer 8 uit 9 verbindingen getest in menselijke klinische proeven niet bereikt markt goedkeuring21. Terwijl potentiële therapeutics eerste screening als gevolg van lage cytotoxiciteit cellijnen doorgeeft kan, is het mogelijk dat sommige van deze verbindingen mitotoxic zijn. Zonder een geschikte methode om te ontdekken hoe deze toxines kunnen afbreuk doen aan de energiebalans in primaire cellen die het Warburg effect niet weergeven, is kritische informatie vaak overdreven keek, blokkeringen therapeutische ontwikkeling in de vroege stadia.
Calorespirometry is een praktische, noninvasive benadering voor het analyseren van de metabole activiteit in een verscheidenheid van biologische monsters, met inbegrip van cellen en weefsels. De kern van het voorgestelde protocol is compatibel met een scala aan toepassingen. Een complicatie, echter, is geconstateerd. Vereeuwigd cellen worden vaak gekweekt in een glucose-gratis medium aangevuld met galactose te vergroten van de bijdrage van oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) voor de productie van energie, om het sensibiliseren van de cellen aan potentiële mitotoxins22, 23. Dit metabole herprogrammering lijkt te verdoezelen analyse wanneer monsters worden geplaatst in de stimulatiedosis van het roestvrij staal gebruikt door de calorimeter15. Cellen gekweekt in een glucose medium blijven streven naar hoge metabole activiteit gedurende enkele uren. Ondertussen, cellen gekweekt in galactose medium verlagen de warmteproductie binnen 30 min van hun plaatsing in de ampul, beperkt tot vroege experimentele tijdstippen metingen te maken. Dit gedrag is helaas belemmert de gelegenheid om te evalueren van de cellulaire proliferatie. Ondanks deze specifieke beperking, de meeste toepassingen zijn compatibel met calorespirometric analyse en metabole Detailgegegevens verkregen kan worden door deze aanpak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. de celkweek
- Handhaven van menselijke hepatocellulaire carcinoom (HepG2) cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle's medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS) en extra substraten (10 mM glucose, 2 mM glutamine en 1 mM pyruvaat) bij 37 ° C in een cel cultuur incubator (5% CO2 , 95% lucht, vochtigheid van 100%).
Opmerking: Gebruik de bovenstaande DMEM formulering als DMEM in latere stappen voor respirometrie en Calorimetrie wordt verwezen. - Plaat van de cellen in 1 x 106 cellen per plaat van 100 mm cultuur en subcultuur hen elke 7 dagen of vóór het bereiken van 90% confluentie en vernieuwen van het medium om 3-4 dagen.
- De experimenten uitvoeren wanneer cellen 60-80% heuvels.
2. voorbereiding van de Respirometer en Calorimeter
- Pipetteer 2.2 mL van DMEM in de respirometer kamer, de stop volledig invoegen en aanpassen met het gereedschap spacer stop met het oog op verspreiding van de optimale zuurstof uit de lucht op gemiddeld.
- Roer voortdurend op 37 ° C tot zuurstofconcentratie (blauwe trace) en zuurstof flux (rode trace) stabiel zijn. Zorgen dat van de respirometer software is geprogrammeerd ter verantwoording voor de oplosbaarheid van zuurstof van het medium gebruikt in het experiment.
Opmerking: Verschillende media hebben verschillende zuurstof oplosbaarheid coëfficiënten (bijvoorbeeld, DMEM = 0.92). - Na stabilisatie van de zuurstofconcentratie in DMEM met de zaal open, selecteert u een stabiele deel van het spoor van de concentratie zuurstof en het kalibreren voor 100% lucht verzadiging.
- Kalibreren voor 0% zuurstof selecteren een stabiele deel van het spoor van de concentratie zuurstof wanneer geen zuurstof ontbreekt niet in de zaal. Voer deze stap na 20 µL titratie van 230 mM natrium dithioniet of nadat alle zuurstof wordt verbruikt door het biologische monster aan het einde van een experiment.
- Na de 100% lucht kalibratie van de respirometer, sluit u de stop en ervoor zorgen dat er geen luchtbellen in de vergaderzaal aanwezig zijn.
Opmerking: een lichte stijging van de zuurstof flux zal worden gedetecteerd in de gesloten kamer als de polarographic zuurstofsensor (POS) verbruikt zuurstof om te meten de gedeeltelijke druk van zuurstof. - Na ~ 10 min van de stop wordt gesloten, bevestigen dat de respirometer klaar voor HepG2 cellen is door het observeren van een stabiele zuurstof flux.
Opmerking: De calorimeter hier gebruikt maakt gebruik van RVS stimulatiedosis en vereist een ampul moet worden gebruikt als een verwijzing. - Voeg 2,5 mL H2O (dH2van O) [gelijk volume als de monsters (stap 4)] tot de ampul van de verwijzing van de calorimeter en draai van het GLB, met behulp van Tang, indien nodig. De verzegelde ampul met luchtstroom schoon en langzaam lager de ampul op positie 1 in het kanaal van de verwijzing van de calorimeter. Blijven op positie 1 tot biologische steekproef is bereid.
3. bereiding van HepG2 cellen respirometrie en Calorimetrie
- Bevestigen dat de respirometer en de calorimeter worden voorbereid en gekalibreerd. Warme DMEM en trypsine tot 37 ° C in een waterbad.
- Voeg DMEM aan een vers 100 mm plaat en plaats in de incubator te voorzien in de evenwichtsinstelling van het medium voor zowel de temperatuur als de CO2 .
Opmerking: Dit medium zal worden gebruikt voor het experiment calorimetrie, zodat het juiste volume is afhankelijk van het aantal stimulatiedosis dat zal worden gebruikt. - Bevestigen met een omgekeerde lichte Microscoop dat de cellen bij 60-80% heuvels, dan wassen de 100-mm plaat 2 x met 10 mL kamertemperatuur-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voeg 3 mL van de Trypsine van 37 ° C op de 100-mm plaat van cellen en hen uit te broeden voor 7-10 min bij 37 ° C in de cel cultuur incubator. Neutraliseren van de trypsine met 3 mL 37-° C DMEM en door zachtjes pipetteren het ~ 20 keer met een 5 mL-pipet op te schorten.
- Breng de 6 mL geresuspendeerde cellen in DMEM en trypsine in een steriele 15 mL conische buis en Centrifugeer het voor 5 min op 175 x g. de vloeistof afzuigen zonder verstoring van de cel-pellet.
- Resuspendeer de pellet cel in ~ 5 mL van DMEM en Pipetteer grondig te zorgen van de cellen voldoende van elkaar worden losgekoppeld.
- Verwijderen van ~ 100 µL van het goed gemengd monster en het uitvoeren van een telling van de grondige cel met behulp van alle 8 velden op een hemocytometer om te bepalen van het totale aantal cellen. Vervolgens het volume voor resuspensie van de cellen te berekenen om te genereren van ~ 2 x 106 cellen per 50 µL.
Opmerking: Dit zal ervoor zorgen dat 2 x 106 cellen worden toegevoegd aan elke kamer van het respirometer met minimale middellange waterverplaatsing. - Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten op 175 x g. resuspendeer de pellet in de berekende hoeveelheid DMEM uit stap 3.7.
- Het uitvoeren van een aantal van de cellen om te bepalen van de omvang die nodig is om te injecteren van 2 x 106 cellen per zaal in de respirometer (dit moet ~ 50 µL). De cellen voor de respirometrische meting op ijs totdat u opslaan.
- Terwijl het geconcentreerde cel monster op ijs is, bepalen de verdunning nodig voor de productie van een concentratie van 1 x 105 cellen/mL voor de calorimetrie.
- Het monster goed mengen en voorbereiden van ~ 3 mL van de cellen in 1 x 105 cellen/mL in DMEM op elke ampul.
Opmerking: De DMEM gebruikt voor de monsterverdunning moet het equilibrated medium bereid in stap 3.3.
4. calorimetrie
- Ervoor zorgen dat calorimeter is aangesloten op de computer en de colorimetrische signaal in μW waarneembare en stabiel.
- Toevoegen van 2.5 mL van de cellen bij 1 x 105 cellen/mL (~2.5 x 105 cellen) aan elke ampul, het waarborgen van voldoende lucht is tussen het deksel van de ampul en het medium te maken voor de diffusie van het gas.
- Draai onmiddellijk het GLB, met behulp van Tang, indien nodig. Reinig de verzegelde ampul, met behulp van luchtstroom te verwijderen van alle externe puin, en langzaam lager de ampul op positie 1 van de calorimeter. Neem de tijd die de ampul is verlaagd naar positie 1.
- Laat de ampul te zitten op positie 1 gedurende 15 minuten.
Opmerking: In deze periode 15 min cellen zijn om te worden geïnjecteerd in de respirometer (stap 5). Dit zorgt ervoor dat het dezelfde tijdsinterval wordt gebruikt voor zowel warmteproductie en zuurstofverbruik wanneer de CR-verhouding wordt bepaald. - Na 15 min op positie 1, langzaam lager de referentie- en het monster stimulatiedosis naar positie 2. Het opnemen van de tijd die werden de stimulatiedosis verlaagd en de maatregel voor minstens 30 min.
5. respirometrie
- Tijdens het 15-min interval waarin de ampul op positie 1 in de calorimeter is, beginnen de respirometrische studies.
- Grondig Meng de cel monster door pipetteren om te zorgen voor een homogene oplossing en injecteren < 50 µL van het monster van de cel in elke kamer van het respirometer voor een eindconcentratie van ~ 2 x 106 cellen/kamer. Neem de tijd die de cellen worden ingespoten in de respirometer.
- Na de injectie, zijn de HepG2 cellen voortdurend geroerd bij 37 ° C. Wacht ten minste 20-30 min voor beide een stabilisatie van de flux van zuurstof en een gestage afname van het gehalte aan zuurstof.
- Selecteer het tabblad O2 flux per V aan de rechterkant van het scherm en Markeer een stabiele gedeelte van zuurstof flux. Selecteer merken, vervolgens statistieken en registratie van de gegevens voor O2 flux per V. Deze opname zal worden gebruikt in de berekening van de CR-verhouding.
Opmerking: De stappen 5.5 en 5.6 zijn optioneel. Lek ademhaling en maximale afgekoppeld ademhaling zal worden onthuld door titraties van oligomycin en FCCP. - Injecteren van 1 µL van 4mg/mL oligomycin in elke kamer en laat ~ 10 min voor de stabilisatie van de flux van het zuurstof. Record stabiele lek ademhalingsfrequentie door na stappen uitgevoerd in 5.4 door te wijzen op een stabiele gedeelte van de zuurstof flux trace na toevoeging van de oligomycin.
- Titreer 2-µL injecties van 0,2 mM FCCP in elke kamer, waardoor zuurstof flux stabilisatie na elke injectie. Totdat de titraties de maximale flux is bereikt, zoals aangegeven door een lichte daling in de daaropvolgende FCCP titratie. Record de stabiele ademhalingsfrequentie tijdens de maximale flux.
6. berekening van de verhouding van de Calorespirometric
- Uitvoeren van een telling van de laatste cel van de monsters die voorbereid op een ~ 1 x 105 cellen/mL met behulp van alle 8 velden van een hemocytometer om te bepalen van het totale aantal cellen aan de ampul (2,5 mL) toegevoegd.
- Bepalen een tijd naar record maten van zowel de respirometer waartegen stabiele signalen aanwezig op dezelfde tijdstippen zijn als de calorimeter. Referentie die de tijd geregistreerd wanneer de ampul werd verlaagd naar positie 2 en de tijd van de injectie van cellen in de respirometer.
- De warmteproductie opnemen door het plaatsen van de cursor over de trace warmteafgifte voor de gerespecteerde ampul aan de tijd bepaald in stap en uitdrukkelijke als μW/miljoen cellen weer te geven. Zuurstof verbruiksgegevens verzamelen en ervoor te zorgen dat het wordt uitgedrukt als pmol O,2 x s-1 x miljoen cellen.
- Voor het berekenen van de CR-verhouding, μW eerst omzetten in kJ/s, en vervolgens verdelen kJ/s over mol van O2/s te verkrijgen van de CR-verhouding uitgedrukt in kJ/mol O2. Opmerking: De CR-verhouding wordt gepresenteerd in kJ/mol O2.
(Zie aanvullende bestand 1)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De reproduceerbaarheid van de metingen van de calorespirometric is afhankelijk van een goede en consequente monstervoorbereiding. Monsters van celcultuur bereid mag niet dienen als de platen zijn begroeid, zoals cellen onjuist als gevolg van samendoen worden kunnen. Verdere, verlaagde warmte stromen als gevolg van de beperkte substraat diffusie in de geklonterd cellen kunnen optreden. Bij het gebruik van Adherente cellen, daarom kritisch te selecteren van een plaat met de confluentie tussen 60-80% en het medium 24 h vóór het experiment te wijzigen.
Goede instrumentale kalibratie en onderhoud staan ook kritisch tegenover voor informatieve en reproduceerbaar calorespirometric metingen. Door het volgen van de fabrikant gevestigd schoonmaak protocol voor de respirometer, uitgebreide wast met ethanol ten uitvoer worden gelegd om ervoor te zorgen dat residuele hydrofobe uncouplers remmers worden verwijderd en niet ten van de metingen door gedeeltelijk koste doen remmende of ontkoppelingseiwit mitochondriën. Wanneer de kamer van de respirometer voorafgaand aan de meting van het monster functioneert, moet zowel de zuurstofconcentratie en de zuurstof flux sporen stabiel als afgebeeld in Figuur 1. Als de POS behoefte aan de dienst van de sensor is, zal niet de zuurstof flux stabiliseren, zoals te zien in Figuur 2. Metingen moeten niet worden uitgevoerd wanneer de POS is niet correct verwerkt. Bovendien, moeten de stimulatiedosis gebruikt in de calorimeter worden gereinigd, gesteriliseerd, en gedroogd vóór gebruik, zoals biologische verontreiniging met de warmteproductie van het monster interfereren kan.
Celsteekproeven zijn bereid na de juiste kalibratie en de voorbereiding van zowel de respirometer als de calorimeter. Ten eerste, de stop in de respirometer is gesloten en de zaal wordt gecontroleerd om ervoor te zorgen dat geen luchtbellen aanwezig zijn. Vervolgens zijn HepG2 cellen geconcentreerd op ~ 2 x 10 µL van de6/50 voor respirometrie en onmiddellijk geplaatst op ijs. Voor calorimetrie, worden HepG2 cellen uit de geconcentreerde steekproef verdund in geëquilibreerd DMEM ~ 1 x 105 cellen/mL. Nadat de cellen worden grondig gemengd door pipetteren, wordt 2,5 mL van de schorsing toegevoegd aan een steriele ampul. De ampul is strak verzegeld, en eventuele externe puin wordt verwijderd door het opblazen van de ampul met een stroom van lucht door een luchtpomp. De ampul wordt dan langzaam verlaagd naar positie 1, waar het blijft gedurende 15 minuten. Na 15 minuten is verstreken, zowel de referentie- en het monster stimulatiedosis zijn dan langzaam verlaagd naar positie 2 en metingen beginnen kunnen te registreren zodra de warmte output is stabiel (Figuur 3).
Een laatste cel telling is uitgevoerd nadat de cellen worden toegevoegd aan zowel de calorimeter en de respirometer om te bepalen van het exacte aantal cellen in de calorimeter geïntroduceerd. De warmteproductie wordt vervolgens uitgedrukt per miljoen cellen. Als de HepG2 cellen worden gekweekt bij gebrek aan glucose en galactose wordt aangevuld om mitochondriale betrekken, de cellen niet binnen de calorimeter vermenigvuldigen, maar in plaats daarvan het verminderen van hun metabole activiteit na ongeveer 30 minuten in de ampul. Dit beperkt de CR berekening op het vroegste tijdstip waarop de warmteafgifte werd gemeten (Figuur 4).
Het is cruciaal voor het opnemen van de tijd die de cellen worden toegevoegd aan de ampul zodat de metingen van warmte productie en zuurstof verbruik worden verzameld op dezelfde tijdstippen. Als deze voorzorgsmaatregel niet genomen, belangrijke experimentele fouten kunnen worden ingevoerd in de bepaling van de CR-verhouding. Tijdens de periode van 15-min, terwijl de ampul bevindt zich op positie 1 in de calorimeter, de cellen zijn voldoende gemixt door pipetteren hen, en 2 x 106 cellen worden ingespoten in de respirometer via een spuit van Hamilton. Zuurstof flux stabiliseert na ongeveer 15 min en zuurstof concentratie gestaag (Figuur 5 daalt). Nogmaals, het is cruciaal dat het tijdstip waarop het monster injectie is geregistreerd voor data-analyse. De flux gestabiliseerde zuurstof van de cellen fungeert als de surrogaat voor zuurstofverbruik bij de berekening van de CR-verhouding. Extra titraties worden uitgevoerd om te beoordelen van de lek ademhaling (1 µL oligomycin) aangegeven door een val van hoogte een lagere stroom van zuurstof en de maximale afgekoppeld ademhaling (3-5 titraties van 2 µL FCCP) aangegeven door de mislukking te verhogen van de ademhaling na opeenvolgende FCCP titraties. Een onvolledige ontkoppelen of een remming van de ademhaling niet worden waargenomen als de voorraad FCCP (Figuur 6) is verlopen.
Figuur 1:100 % lucht kalibratie van respirometer en de status van polarographic zuurstofsensor (POS). De signalen voor de zuurstofconcentratie (blauwe lijn) en de zuurstof-flux (rode lijn), die zowel voor de 100% lucht-kalibratie stabiliseren. De stabiele lijnen geven aan dat de respirometer klaar voor kalibratie is. De kalibratie moet worden uitgevoerd in DMEM, en niet met H2O. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: POS behoefte aan service. Na de stabilisatie van de zuurstofconcentratie (blauwe trace) mislukt de zuurstof-flux (rode trace) te stabiliseren. De POS mag niet worden gebruikt voor experimenten en dienst dient te worden toegepast zoals beschreven door de fabrikant. Een toenemende instabiliteit van de zuurstof flux correleert met een toegenomen vraag naar POS service. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Ongeveer 2.5 x 105 HepG2 cellen gekweekt in glucose medium vertonen tekenen van proliferatie in de calorimeter. Laden ~2.5 x 105 HepG2 cellen gekweekt in de aanwezigheid van glucose per ampul genereert een constante warmteproductie van -20 tot-28 μW met behulp van de instelling van de 30-μW op het instrument en een grotere warmteproductie na verloop van tijd correleert met cellulaire proliferatie binnen de ampul. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Ongeveer 2.5 x 105 HepG2 cellen gekweekt in galactose medium niet vermenigvuldigen en warmte productie daalt na verloop van tijd. Laden ~2.5 x 105 HepG2 cellen gekweekt in galactose per ampul resulteert in een directe warmteproductie van ~-20 μW. Echter de warmteproductie vermindert na verloop van tijd en beperkt CR-verhouding metingen op de punten van de vroege tijd van het experiment. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Routine, rekken en ademhaling van HepG2 cellen lekken. Zodra de cellen waren geïnjecteerd in de respirometer, zuurstofconcentratie gestaag gedaald (blauwe trace). Na de stabilisatie van de zuurstof-flux (rode trace) tijdens de routine ademhaling van onbeschadigde cellen, is de oligomycin voor de remming van de F0F1-ATP-synthase toegevoegd. Dit wordt aangegeven door de stabilisering van de zuurstof flux na toevoeging van de oligomycin, die lek ademhaling onthult. Ongeveer 3-5 titraties van FCCP moeten worden uitgevoerd aan het afkoppelen van de ademhaling van de ATP-synthese en onthullen elektronentransport systeemcapaciteit (ETS). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: mislukte afkoppelen van de HepG2 cel ademhaling. Na toevoeging van cellen flux zuurstof gestabiliseerde (rode trace) tijdens routinematige ademhaling en zuurstof concentratie gestaag gedaald (blauwe lijn). Titratie van FCCP resulteerde in een onvolledige afkoppelen en de uiteindelijke remming, verhindert dat de maximale capaciteit van de ETS wordt bereikt. FCCP was waarschijnlijk besmet of gedegradeerd uit de langetermijnopslag. Indien waargenomen, moet een verse FCCP voorraad worden voorbereid. Ook bevestigen dat oligomycin doet niet remmen ETS capaciteit tijdens het afkoppelen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van calorespirometry is aan de bijdragen van aërobe en anaërobe emissieroutes naar de metabole activiteit kwantitatief te evalueren en het verkrijgen van een samengestelde weergave van cellulaire energie flux. Dit wordt bereikt door een gelijktijdige meting van de warmteafgifte en zuurstof flux gevolgd door een vergelijking van de berekende CR-verhouding met de theoretische oxycaloric gelijkwaardig. Verschillende kritische stappen moeten worden overwogen voor reproduceerbare en betrouwbare gegevens. Het onderhoud van een steriele, gezonde celcultuur is van cruciaal belang. Besmetting door bacteriën of schimmels kan resulteren in verduisterde warmte productie of zuurstof verbruik, waardoor de CR-verhouding zinloos. Verdere, onjuiste cel telt, arme monster mengen, of geklonterd cellen kunnen ook resulteren in een onjuiste CR-ratio. Een belangrijke stap met betrekking tot de respirometer is goede monstervoorbereiding zodat de injectie lager dan 50 µL in volume is. Dit volume zorgt voor een minimale hoeveelheid medium wordt verplaatst van de kamer en het zuurstofverbruik correct wordt toegeschreven aan 2 x 106 cellen. Zodra routine ademhaling wordt waargenomen, wordt het voorgestelde protocol compatible met twee extra titraties (oligomycin en FCCP), die licht werpen op lek ademhaling en ETS capaciteit van het mitochondrium. Voor deze toepassing, kan buitensporige toevoeging van FCCP remming van de ademhaling en voorkomen van maximale flux; Daarom moeten ten minste 3-5 titraties worden uitgevoerd vóór het bereiken van de maximale afgekoppeld ademhaling.
Onderhoud en juiste kalibratie van zowel de respirometer als de calorimeter is essentieel voor calorespirometry. Het protocol van de titratie voor achtergrond zuurstofverbruik wordt sterk aanbevolen en is uitgevoerd met stapsgewijs titraties van dithioniet te bereiken van verminderde zuurstofniveaus binnen de zaal. Dit is een essentiële maatregel is om te bevestigen strak verzegelde kamers en corrigeren voor terug diffusie van zuurstof in de kamers, vooral als de metingen worden uitgevoerd op een lage zuurstof-spanning. Uitvoeren van een test van de roerder vóór toevoeging van de cellen kan geven ook informatie over het reactievermogen van de POS. Responsiviteit is slecht of de zuurstof flux is niet stabiel (Figuur 2), de POS-service vereist is. Onjuiste schoonmaak van de kamers respirometer kunt achterlaten verschilbedragen remmers of uncouplers, die invloed kunnen hebben op de latere experimenten. Luchtbellen in de verzegelde zaal zijn ook geschikt voor interfereren met de metingen en tijdens het afsluiten van de zaal of monster injectie kunnen worden ingevoerd als luchtbellen op de spuit aanwezig zijn. Van de calorimeter protocol is directer, maar het is ook gevoelig voor experimentele fouten. Bijvoorbeeld, zal de onjuiste verzegeling van de ampul verdamping optreden welke wijzigingen massaal warmtestroom toestaan.
Een van de beperkingen van deze methode is dat niet alle cellen kunnen worden gekweekt in suspensie en vele cellijnen zijn aanhangend aan de cel cultuur plaat of substraat. Om uit te voeren experimenten, moeten de gekoppelde cellen enzymatisch worden verdreven van de plaat door middel van dissociatie agenten zoals trypsine. Cellen in deze staat mogelijk niet in de logaritmische groeifase en hun fysiologie kan worden gewijzigd. Dus, latere analyse via die de calorimeter en respirometer van onlangs trypsinized cellen kunnen beoordelen verstoord cellulaire activiteiten. Een beperking in het gepresenteerde colorimetrische protocol is verder de bezinking van cellen in de ingesloten stimulatiedosis, hetgeen tot lokale hypoxie rond de cellen als gevolg van de trage zuurstof diffusie in waterige oplossingen leiden kunnen. We hebben vastgesteld dat ~ 3 x 105 cellen de bovengrens die compatibel is met de stimulatiedosis die in dit protocol worden gebruikt is. Verhoging van het aantal cellen kunt genereren een hypoxische omgeving van de bezinking van de cellen, afbreuk te doen aan de resultaten. Optimalisatie is zo kritisch als een andere cellijn wordt onderzocht en alternatieve benaderingen moeten worden beschouwd zoals de vergroting van de middelhoge dichtheid om de bezinking van cellen24. Stimulatiedosis beschikbaar zijn die vergunning roeren; het is echter van cruciaal belang om te zorgen voor dat een minimale signal-to-noise verhouding is aanwezig tijdens het roeren. Bovendien warmtemeters naast degene die werkzaamheden in loondienst in dit protocol zijn compatibel met calorespirometry en hun vermogens kunnen worden dan wat wij hebben voorgesteld. Een andere beperking van calorespirometric analyse via een twee-kamer respirometer is het onvermogen voor een high-throughput analyse, die zou het meest relevant zijn voor de farmaceutische ontwikkeling. Deze beperking wordt echter gecompenseerd door de capaciteit voor een hoge resolutie karakterisering van de compound van invloed op de luchtwegen keten en mitochondriale fysiologie.
De capaciteit voor zowel hoge-resolutie en gelijktijdige meting van output en zuurstof warmtestroom van hetzelfde monster is een belangrijke kracht van deze methode. Een potentiële goudstandaard bij het gebruik van Adherente cellen zou moeten beide cultuur en analyseren van cellen die zijn geteeld op microcarrier kralen in suspensie. Deze methode zou voorkomen dat de negatieve gevolgen van de dissociatie van het celoppervlak cultuur en voor de analyse van de cellulaire functies in verschillende fasen van de groeikromme (logaritmische fase vs. contact-geremd fase7) toestaan. Helaas, met behulp van microcarrier kralen kunnen problematisch vanwege de hoge roeren snelheid nodig in de respirometer en de mogelijkheden voor het slijpen van de parels samen met cellen onder de roer-bar. Ondanks deze beperkingen blijft een breed scala aan toepassingen verenigbaar met calorespirometry. In het bijzonder, is deze methode klaar om de farmaceutische ontwikkeling beter te vergemakkelijken door het snel identificeren van mitotoxic verbindingen in gekweekte cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de National Science Foundation subsidie CHE-160944 Mary E. Konkle en Michael A. Menze.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HepG2 Cells | American Type Culture Collection | HB-8065 | Cells used for calorespirometry |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | Respirometer |
| LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) | Thermometric AB | Thermometric was purchased by TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | 100x solution added to DMEM medium |
| Fetal Bovine Serum - Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | Added to 10% in DMEM medium |
| Trypsn-EDTA (0.25%) | Thermofisher Scientific | 25200072 | Cell dissociation reagent |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Sigma Aldrich | O4876 | Mitochondrial Inhibitor |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | Mitochondrial Uncoupler |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning Corporation | 430167 | Tissue culture dish |
| Glucose, powder | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose for DMEM medium |
| Galactose, powder | Fischer Scientific | BP656500 | Galactose for DMEM medium |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher Scientific | 25030081 | Glutamine for DMEM medium |
| DMEM, no glucose | Thermofisher Scientific | 11966025 | Cell culture medium |
References
- Gnaiger, E., Kemp, R. B. Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux. Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).
- Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications. Chemistry & Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).
- Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).
- Wadso, L., Hansen, L. D. Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems. Methods. 76, 11-19 (2015).
- Gnaiger, E. Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry. Strategies for Gas Exchange and Metabolism. Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. , Cambridge University Press. London. 149-171 (1991).
- Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism. Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).
- Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation. Cryobiology. 61, 79-88 (2010).
- Webb, P. Human Calorimetry. , ABC-CLIO, LCC. Santa Barbara, CA. In Volume 7 of Endocrinology and Metabolism Series (1985).
- Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism. Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).
- Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis. Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).
- Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry. Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).
- Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry. Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).
- Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues. Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone. Cell and Tissue Research. , (2017).
- Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells. Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).
- Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat. The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).
- Paul, R. J. Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C. Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Kemp, R. B. Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells. Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).
- Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death. Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).
- Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64, 985-993 (2004).
- Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures. Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).
