Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att bekräfta förekomsten av punktmutation för diagnos av ärftliga transtyretinamyloidos, med Ala97Ser, den vanligaste endemiska mutationen i Taiwan, som exempel.
Abstract
Genetisk testning är det mest tillförlitliga testet för ärftliga transthyretin relaterade amyloidos och bör utföras i de flesta fall av transtyretinamyloidos (ATTR). ATTR är en sällsynt men dödlig sjukdom med heterogena fenotyper; diagnosen försenas därför ibland. Med ökande uppmärksamhet och bredare erkännande på tidiga manifestationer av ATTR samt framväxande behandlingar, lämpliga diagnostiska studier, inklusive transthyretin (TTR) genetiska test, för att bekräfta typerna och varianter av ATTR är därför grundläggande att förbättra prognosen. Genetiska analyser med polymeras-kedjereaktion (PCR) metoder bekräfta förekomsten av TTR punktmutationer mycket snabbare och säkrare än konventionella metoder såsom södra blot. Häri, visar vi genetiska bekräftelse av ATTR Ala97Ser mutation, vanligaste endemiska mutationen i Taiwan. Protokollet består av fyra huvudsakliga steg: samla hela blodprovet, DNA-extraktion, genetisk analys av alla fyra TTR exoner med PCR, och DNA-sekvensering.
Introduction
Transthyretin (TTR) amyloidos (ATTR) är den vanligaste formen av ärftlig systemisk amyloidos1och kan orsakas av en autosomalt dominant ärftlig mutation i genen transthyretin (TTR)2. TTR mutationer destabilisera tetrameriskt proteinstruktur och leda till dess dissociation i monomerer som slår samman i amyloida fibriller2. Mer än 100 amyloidogenic TTR mutationer har rapporterats världen över1. Genetiska analyser med polymeras-kedjereaktion (PCR) metoder förekomsten av TTR punktmutation och har fördelar inklusive att undvika hantering av radioaktivt märkt sonder i jämförelse med södra blot3. PCR är en snabb, lätt, billig och pålitlig teknik som har använts på många fält i moderna vetenskaper4.
Tidig diagnos av denna progressiva och dödlig sjukdom är utmanande med tanke på dess fenotypiska heterogenitet. Med ökande uppmärksamhet och bredare erkännande på tidiga manifestationer av ATTR samt den framväxande behandlingar5, är lämpliga diagnostiska studier inklusive TTR genetiska test därför kritiskt grundläggande att förbättra prognosen. Dessutom olika mutationer är associerade med olika penetrans av drag, debutåldern, mönster av sjukdomens svårighetsgrad, median överlevnad, progression, effekten av levertransplantation eller TTR stabilisatorer2,6, och varierande grader av neurologiska och kardiologiskt engagemang, som har stor betydelse för genetisk rådgivning7,8,9. Dessutom en mycket exakt genetiska test är det enda verktyget som skiljer de två distinkta typerna av ATTR: ärftlig (mutant) och vildtyp (icke-mutanta formen, senil systemisk amyloidos, SSA)7. Det är viktigt att bekräfta typerna av ATTR, eftersom behandlingarna varierar kraftigt2. Därför finns det en ökande nödvändighet att beskriva stegvis protokollet av TTR genetiska testet.
Den molekylära metoden att upptäcka mutationen kommer att illustreras med Ala97Ser, den vanligaste endemiska mutationen i Taiwan, som exempel. Ändringar i DNA extraktion steg minska mängden av de tre lösningarna som används och ger en tillräcklig mängd DNA. I detta protokoll, alla fyra TTR exoner analyserades, medan regioner inklusive 5' uppströms, 3' nedströms, initiativtagare, introner, och oöversatta regioner (UTR) var inte sekvenserade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Testning utföras i laboratorium genomfördes enligt kraven av kliniska laboratorium förbättring ändringsförslag (CLIA) 1988, de förordningar som godkänts av den institutionella i styrelsen av Chang Gung Memorial Hospital och Universitet (licens nr 100 - 4470A3 och 104-2462A3). Informerat samtycke erhölls från alla patienter.
1. blod provtagning
- Samla in helblod i kommersiellt tillgängliga behandlade med EDTA-rör. Blanda försiktigt och lagra blodprov vid 4 ° C fram till bearbetning.
2. DNA-extraktion från perifert blod
Använda en DNA Extraction Kit för genomisk DNA extraktion (se Tabell för material).
- Tillsätt 10 mL av lösning 1 4,0 mL blod. Inkubera provet på is i 10 min.
- Centrifugera provet vid 2000 x g i 5 min vid 4 ° C. Avlägsna och Kassera supernatanten noggrant. Återsuspendera pelleten i 3 mL lösning 1.
- Centrifugera provet vid 2000 x g i 5 minuter vid 4 ° C igen och Kassera supernatanten. Återsuspendera pelleten i 3 mL lösning 2.
- Tillsätt 10 µL av pronase stamlösning (225 mg/mL) att få en slutlig koncentration på 100 µg/mL och blanda väl. Inkubera vid 37 ° C över natten.
- Chill röret på is för 10 min. Lägg till 0,8 mL lösning 3 till provet och Invertera 3 - 5 gånger. Placera provet på is för 5 min.
- Centrifugera provet vid 3 000 x g under 15 minuter vid 4 ° C. Försiktigt överför supernatanten till en 15 mL steril koniskt centrifugrör.
- Tillsätt 6 µL av RNase stamlösning (10 mg/mL) att få en slutlig koncentration på 20 µg/mL. Inkubera vid 37 ° C i 15 min.
- Tillsätt 2,5 mL isopropylalkohol och blanda grundligt genom att försiktigt vända flera gånger för att fällningen DNA (delar av vita, flockig material bildar). Använda en stor-bore Pipettera, överföra den DNA fällningsmedel till en ny 1,5 mL centrifugrör.
- Centrifugera vid 12 000 x g under 3 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten noggrant. Tvätta DNA pelleten genom att lägga till 500 µL av 70% etanol.
- Centrifugera vid 12 000 x g i 1 min och Kassera supernatanten. Luften torr DNA pelleten i rumstemperatur. Tillsätt 100 µL av ddH2O och inkubera vid 65 ° C i 15 min att resuspendera DNA.
3. genomiskt DNA kvantifiering
Använda en spektrofotometer (se Tabell för material) för att upptäcka kvantitet och kvalitet av genomisk DNA.
- Logga in på datorn som är ansluten till spektrofotometer maskinen. Öppna programvaran.
- Initiera spektrofotometer maskinen:
- Klicka ”Nucleic Acid” på programvaran spektrofotometer.
- Ren piedestalen med en engångspappersprodukter torka och renat vatten.
- Tom spektrofotometern:
- Ladda 2 µL av renat vatten på piedestal.
- Lägre överarmen spektrofotometerns och klicka på ”tomt” för att kalibrera den.
- När det är klart, lyft överarmen och torka piedestal med en torka.
- Mäta provet:
- Klicka på ”DNA-50” på Provtyp.
- Ladda 2 µL av DNA-prov på piedestal.
- Sänk övre armen och klicka på ”åtgärd” för att mäta A260/A280 kvoten och koncentrationen av provet.
- Ren piedestalen mellan varje körning med en torka och renat vatten.
- Klicka på ”Print Screen” för att samla in data.
4. genetiska analyser av mutationer
Förstärka mål-DNA med PCR-4. Utföra PCR i en 25 µL reaktion blandning med en DNA-polymeras kit (se Tabell för material). Tabell 1 visar genen TTR intronic primers.
| gen | Primer sekvens |
| Exon1 | F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3' |
| Exon2 | F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3' R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3' |
| Exon3 | F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3' R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3' |
| Exon4 | F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3' R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3' |
Tabell 1. TTR-genen intronic primers. (NCBI referens sekvens: NC_000018.10)
- Lägga till reagenserna i tabell 2 i en 0,2 mL PCR-rör.
| Komponenter | Volym (µL) | Slutlig koncentration |
| 10 x buffert | 2.5 | 1 x |
| MgCl2 (25 mM) | 1.5 | 1,5 mM |
| 360 GC Enhancer | 1 | - |
| 360 DNA-polymeras | 0,2 | 2 U/reaktion |
| dNTP Mix (25 mM varje) | 2 | 2 mM varje |
| Primer F (10 µM) | 1 | 0,4 ΜM |
| Primer R (10 µM) | 1 | 0,4 ΜM |
| DNA (100 ng) | 2 | |
| PCR-grade vatten | 13,8 | - |
| Totala volymen | 25 | - |
Tabell 2. PCR-reaktion villkor.
- Blanda försiktigt och centrifugera kort på en bänkmonterade centrifug att samla alla komponenter till botten av röret. Placera röret i en termocykler.
- Utföra PCR för 30 cykler. Varje cykel består av en denaturering steg för 30 s vid 94 ° C, primer glödgning för 30 s vid 58 ° C, och polymeras förlängning för 45 s vid 72 ° C (se tabell 3).
| Steg | Temperatur (° C) | Tid | cykel |
| Inledande denaturering | 95 | 5 min | 1 |
| DNA denaturering steg | 94 | 30 s | 30 cykler |
| Primer glödgning steg | 58 | 30 s | 30 cykler |
| Polymeras förlängning steg | 72 | 45 s | 30 cykler |
| Post töjning steg | 72 | 10 min | 1 |
| Slutet av PCR Cykling | 4 | Obestämd |
Tabell 3. Cykling för förstärkande PCR-produkter.
- Validera PCR-produkten genom att visualisera med gelelektrofores:
- Förbered en 1,2% agarosgel:
- Blanda 1,2 g agaros pulver med 100 mL 0,5 x TBE i en mikrovågssäker kolv. Mikrovågsugn för 2 min tills Agarens är helt upplöst. Kyla ner agaros blandningen till 55 ° C.
- Tillsätt 2 µL av en etidiumbromid bromid lösning (10 mg/mL) till agaros blandningen och blanda försiktigt. Häll agaros blandningen i en gel bricka till cirka 5-7 mm, och Lägg sedan i comb(s) på plats. Låt det stelna (minst 30 min) och ta försiktigt bort comb(s).
- Läsa in prover och köra en agarosgel:
- Placera gel och fack i cellen elektrofores. Elektrofores cellen fylls med 0,5 x TBE tills gelen är täckt.
- Noggrant läsa 2 µL av en 100 bp DNA stege (se Tabell för material) in i ett körfält av gelen som molekylstorlek markör. Load färgämne/prov blandningen (5 µL av PCR-produktmix med 1 µL 6 x lastning färgämne) i ytterligare körfält.
- Slå på strömmen. Kör gelen för 25 min vid 100 V.
- Ta bort gelen från cellen elektrofores. Visualisera DNA fragment under UV-ljus i ett bildsystem.
- Förbered en 1,2% agarosgel:
5. DNA-sekvensering
- Rena PCR-produkter använder ett kommersiella kit och sekvens kommersiellt eller med en automatisk sequencer (se Tabell för material).
- Skicka nukleotidsekvenser till NCBI BLAST servern att jämföra nukleotid frågan till nukleotid databaser10. Efter resultaten visas, utför sekvens linjeföring och identifiera förväntade mutationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Agaros gelelektrofores av två patienter och en hälsosam enskilda avslöjade band av de förväntade storlekar, inklusive en 454 bp PCR-produkt för exon 4 av TTR-genen (figur 1).
Figur 1 . Gel-elektrofores föreställande PCR amplifieras TTR-genen. Normal: en frisk individ. Lane M: 100 bp DNA stege som molekylstorlek markör. Lanes 1:246 bp (exon 1). Körfält 2:292 bp (exon 2). Lanes 3:299 bp (exon 3). Lanes 4:454 bp (exon 4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Sekvensering avslöjas en nukleotid T substitution för G i exon 4 av TTR-genen. Denna missense mutation resulterade i en alanin-till-serine substitution på aminosyran ståndpunkt 97 i två patienter. Sekvens kromatogram av dessa två patienter och en frisk individ demonstreras i figur 2.
Figur 2 . Sekvensering av en frisk individ (vildtyp) och en heterozygot G > T mutation i exon 4 av TTR-genen (patienter 1 och 2). Pilarna i de Patient 1 och patienten 2 kromatogram anger två överlappande toppar i olika färger. De två topparna är ungefär halva höjden av resten av sekvensen. Detta heterozygot substitution, (G/T) bekräftas i omvänd ordning, (C/A). Delar av denna siffra har ändrats från en figur i vår föregående publikation5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns två kritiska steg i protokollet. Först, för att ha tillräckligt antal vita blodkroppar, ett hemodiluted exemplar bör undvikas11. Andra, användning av lämplig PCR primers är grundläggande för att få tillförlitliga resultat12. Vi använde Primer-BLAST webbverktyg för att designa de primers4,13; minst 40 baspar på varje sida av de fyra TTR exonerna bör omfattas. Vi kör även BLAST på NCBI att kontrollera specificiteten av primers.
Vissa ändringar i steget för DNA-extraktion. Det första av de tre lösningar som används är minskas. Denna ändring också ger en tillräcklig mängd DNA och sparar lösningar. För det andra, isopropanol eller 100% etanol är de två alternativen som används i utfällning av DNA14,15. Jämfört med etanol, fällningar isopropanol DNA vid rumstemperatur, vilket minskar coprecipitation av salt15. Dessutom kan längre nederbörd gånger vid frys temperaturer behövas för att maximera de DNA kapacitet15. För det tredje, ersätta TE buffert dubbel destillerat vatten (ddH2O) att resuspendera DNA. DNA preparatet i detta protokoll används för efterföljande PCR så skydd på lagring inte är ett problem. Dessutom kommer EDTA hämmar enzymaktivitet när DNA används i PCR-15.
För en lägre kostnad och mindre väntetid utfördes PCR-produkt rening och sekvensering av ett biotekniskt företag. Begränsningen i detta protokoll bör de manuella metoder, inklusive upprepade centrifugering steg. Ett automatiserat nukleinsyra utvinningssystem har utvecklats och är fördelaktigt för att minska arbetstiden och öka reproducerbarhet och kvaliteten på de results16.
Hos alla patienter med amyloid insättningar, bör differentialdiagnos av systemisk amyloidoses utföras. Masspektrometri (MS) kan tillämpas för att avgöra den protein-subenheten och klassificera sjukdomen som immunglobulin ljus-kedjan amyloidos (AL, med en medianöverlevnad som underlägsen ATTR)17 eller transthyretin-relaterade amyloidos18, 19, som direkt nedströms genetisk testning inte kan göra, särskilt för de patienter för vilka ärftliga ATTR inte initialt misstänktes19.
Mass spectrometry-baserade proteomiska analys har använts för screening och typning av TTR amyloidos19,20,21. MS ensam är dock inte tillräckliga för att utesluta en sjukdomsframkallande mutation hos patienter med ärftlig ATTR22, eftersom några av de atypiska eller sällsynta TTR varianterna inte kan avskiljas genom MS-baserad analys av amyloid insättningar exemplaret eller serum prover i en biomedicinska19,23. Dessutom försvårar möjligt urvalsfel och den ojämna fördelningen av amyloida fibriller kan leda till ett falskt negativa vävnad biopsier5,21,24, nedströms proteomiska analysen. Därför, DNA-test, det mest tillförlitliga testet för ATTR, bör utföras i de flesta fall av ATTR5,22, liksom i alla idiopatisk progressiva axonal neuropati eller distal symmetrisk smärtsamma små-fiber neuropati 25 , 26.
Andra faktorer som kan fenotypisk variation för ATTR och guide framtida inriktningar innehåller posttranslationella modifieringen (PTMs) varianter förekommer i serum och ATTR fibrill sammansättning27,28. Även om ärftliga ATTR är en monogenetic sjukdom, har betydande variation även bland dem med samma mutation eller inom samma familj observerats27. Genetisk heterogenitet ensam misslyckas att belysa olika uppkomsten och patologi ATTR28. Därför både genetiska och proteomikmetoder bör utnyttjas när dessa faktorer beaktas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Miss Shin-kul Wu för hennes hjälp i experimenten. Denna studie stöddes av ett bidrag från Chang Gung Medical Research Program (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) och IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA-treated tubes | BD | ||
| DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
| dye | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
References
- Planté-Bordeneuve, V., Said, G. Familial amyloid polyneuropathy. The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).
- Planté-Bordeneuve, V., et al. Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study. Journal of Neurology. 264 (2), 268-276 (2017).
- Nichols, W. C., Benson, M. D. Hereditary amyloidosis: detection of variant prealbumin genes by restriction enzyme analysis of amplified genomic DNA sequences. Clinical Genetics. 37 (1), 44-53 (1990).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Hsu, H. C., et al. Phenotypic expressions of hereditary Transthyretin Ala97Ser related Amyloidosis (ATTR) in Taiwanese. BMC Neurology. 17 (1), 178 (2017).
- Barroso, F. A., et al. Long-term safety and efficacy of tafamidis for the treatment of hereditary transthyretin amyloid polyneuropathy: results up to 6 years. Amyloid. 24 (3), 194-204 (2017).
- Rapezzi, C., et al. Disease profile and differential diagnosis of hereditary transthyretin-related amyloidosis with exclusively cardiac phenotype: an Italian perspective. European Heart Journal. 34 (7), 520-528 (2013).
- Mariani, L. L., et al. Genotype-phenotype correlation and course of transthyretin familial amyloid polyneuropathies in France. Annals of Neurology. 78 (6), 901-916 (2015).
- Hammarström, P., Jiang, X., Hurshman, A. R., Powers, E. T., Kelly, J. W. Sequence-dependent denaturation energetics: A major determinant in amyloid disease diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, suppl 4 16427-16432 (2002).
- Johnson, M., Zaretskaya, I., Raytselis, Y., Merezhuk, Y., McGinnis, S., Madden, T. L. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 5-9 (2008).
- Fox, A. J., et al. Next generation sequencing for the detection of actionable mutations in solid and liquid tumors. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Date, Y., Nakazato, M., Kangawa, K., Shirieda, K., Fujimoto, T., Matsukura, S. Detection of three transthyretin gene mutations in familial amyloidotic polyneuropathy by analysis of DNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. Journal of the Neurological Sciences. 150 (2), 143-148 (1997).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
- Buckingham, L., Flaws, M. L. Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications. , F.A. Davis Co. Philadelphia. (2012).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Rapezzi, C., et al. Systemic cardiac amyloidoses: disease profiles and clinical courses of the 3 main types. Circulation. 120 (13), 1203-1212 (2009).
- Gertz, M. A., Dispenzieri, A., Sher, T. Pathophysiology and treatment of cardiac amyloidosis. Nature Reviews Cardiology. 12 (2), 91-102 (2015).
- Vrana, J. A., et al. Clinical diagnosis and typing of systemic amyloidosis in subcutaneous fat aspirates by mass spectrometry-based proteomics. Haematologica. 99 (7), 1239-1247 (2014).
- Nakamura, M., et al. Identification of a new transthyretin variant (Ile49) in familial amyloidotic polyneuropathy using electrospray ionization mass spectrometry and nonisotopic RNase cleavage assay. Human Heredity. 49 (4), 186-189 (1999).
- Ueda, M., Ando, Y. Recent advances in transthyretin amyloidosis therapy. Translational Neurodegeneration. 3, 19 (2014).
- Brown, E. E., et al. Genetic testing improves identification of transthyretin amyloid (ATTR) subtype in cardiac amyloidosis. Amyloid. 24 (2), 92-95 (2017).
- Tasaki, M., et al. Rapid detection of wild-type and mutated transthyretins. Annals of Clinical Biochemistry. 53 (4), 508-510 (2015).
- Plante-Bordeneuve, V., et al. Diagnostic pitfalls in sporadic transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP). Neurology. 69 (7), 693-698 (2007).
- Hsu, J. L., et al. A prospective, observational study of patients with uncommon distal symmetric painful small-fiber neuropathy. PLoS ONE. 12 (9), 0183948 (2017).
- Salvi, F., Pastorelli, F., Plasmati, R., Bartolomei, I., Dall'Osso, D., Rapezzi, C. Genotypic and phenotypic correlation in an Italian population of hereditary amyloidosis TTR-related (HA-TTR): Clinical and neurophysiological aids to diagnosis and some reflections on misdiagnosis. Amyloid. 19, suppl 1 58-60 (2012).
- Suhr, O. B., Lundgren, E., Westermark, P. One mutation, two distinct disease variants: Unravelling the impact of transthyretin amyloid fibril composition. Journal of Internal Medicine. 281 (4), 337-347 (2017).
- Vilà-Rico, M., et al. Quantitative analysis of post-translational modifications in human serum transthyretin associated with familial amyloidotic polyneuropathy by targeted LC-MS and intact protein MS. Journal of Proteomics. 127, 234-246 (2015).
