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Medicine

Analyse génétique héréditaire Transthyretin Ala97Ser associés amylose

doi: 10.3791/57743 Published: June 9, 2018

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à confirmer la présence de mutation ponctuelle pour le diagnostic d’amylose héréditaire transthyrétine, Ala97Ser, la mutation la plus courante endémique à Taïwan, en prenant comme exemple.

Abstract

Les tests génétiques sont le test plus fiable pour la transthyrétine héréditaire associés amylose et doit être effectué dans la plupart des cas d’amylose transthyrétine (ATTR). ATTR est une maladie rare mais fatale avec des phénotypes hétérogènes ; par conséquent, le diagnostic est parfois retardé. Avec l’attention et la reconnaissance plus large sur les manifestations précoces d’ATTR ainsi que de nouveaux traitements, études diagnostiques appropriées, y compris la transthyrétine (TTR) génétique tester, pour confirmer les types et variantes de ATTR sont donc fondamentaux pour améliorer le pronostic. Des analyses génétiques avec des méthodes polymerase chain reaction (PCR) confirment la présence de mutations ponctuelles TTR beaucoup plus rapidement et plus sûr que les méthodes conventionnelles telles que la tache méridionale. Ici, nous démontrons confirmation génétique de la mutation Ala97Ser ATTR, la mutation la plus courante endémique à Taïwan. Le protocole comprend quatre grandes étapes : collecte des échantillons de sang total, extraction de l’ADN, l’analyse génétique de tous les quatre exons TTR avec PCR et séquençage de l’ADN.

Introduction

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Amylose (ATTR) de la transthyrétine (TTR) est la forme la plus courante d’amylose systémique héréditaire1et peut être causée par une mutation autosomique dominante héritée dans le gène de la transthyrétine (TTR)2. Les mutations de TTR déstabilisent la structure de la protéine tétramère et conduisent à sa dissociation en monomères qui réassemble en fibrilles amyloïdes2. Plus de 100 mutations de TTR amyloïdogène ont été signalés dans le monde1. Les analyses génétiques avec des méthodes polymerase chain reaction (PCR) confirment la présence de mutation ponctuelle TTR et ont des avantages, notamment en évitant la manipulation de la sonde radioactivement marqués par rapport à la tache méridionale3. PCR est une technique rapide, facile, bon marchée et fiable qui a été appliquée à nombreux domaines dans les sciences modernes,4.

Le diagnostic précoce de cette maladie progressive et mortelle est un défi compte tenu de son hétérogénéité phénotypique. Avec l’attention et la reconnaissance plus large sur les manifestations précoces de ATTR ainsi que les nouveaux traitements5, études diagnostiques appropriées y compris test génétique TTR sont donc critique fondamentales pour améliorer le pronostic. En outre, différentes mutations sont associées à différente pénétrance de ce trait, l’âge d’apparition, modes de progression, gravité de la maladie, la survie médiane, l’efficacité de la transplantation hépatique, ou TTR stabilisateurs2,6, et degrés variables de participation neurologique et cardiologique, ayant des répercussions sur grandes conseil génétique7,8,9. En outre, un test génétique très précis est le seul outil qui différencie les deux types distincts de ATTR : héréditaire (mutant) et type sauvage (forme non-mutant, amylose systémique sénile, SSA)7. Il est impératif de confirmer les types d’ATTR, parce que les traitements varient largement2. Il y a donc une nécessité croissante pour décrire le protocole par étapes des tests génétiques TTR.

L’approche moléculaire pour détecter la mutation sera illustrée à l’aide de Ala97Ser, la mutation la plus courante endémique à Taïwan, à titre d’exemple. Modifications dans l’étape d’extraction de l’ADN réduire le montant des trois solutions utilisées et donne une quantité suffisante d’ADN. Dans ce protocole, tous les quatre exons TTR ont été analysés, tandis que les régions y compris les 5' en amont, 3' en aval, promoteurs, introns, et régions non traduites (UTR) n’étaient pas séquencées.

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Protocol

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Les tests effectués en laboratoire a été réalisée conformément aux exigences de la clinique laboratoire amélioration amendements (CLIA) de 1988, le règlement approuvé par le Conseil institutionnel d’examen de Chang Gung Memorial Hospital et Université (licence n° 100 - 4470A3 et 2462A3-104). Le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients.

1. prélèvement d’échantillons de sang

  1. Collecter le sang dans des tubes de traitées à l’EDTA disponibles dans le commerce. Mélanger doucement et stocker l’échantillon de sang à 4 ° C jusqu’au traitement.

2. ADN Extraction du sang périphérique

Utiliser un Kit d’Extraction d’ADN pour l’extraction d’ADN génomique (voir Table des matières).

  1. Ajouter 10 mL de Solution 1 pour l’échantillon de sang de 4,0 mL. Incuber l’échantillon sur la glace pendant 10 min.
  2. Centrifuger l’échantillon à 2 000 x g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer et jeter le surnageant avec soin. Resuspendre le culot dans 3 mL de Solution 1.
  3. Centrifuger l’échantillon à 2 000 x g pendant 5 min à 4 ° C à nouveau et jeter le surnageant. Resuspendre le culot dans 3 mL de Solution 2.
  4. Ajouter 10 µL de solution mère de la pronase (225 mg/mL) jusqu'à obtenir une concentration finale de 100 µg/mL et bien mélanger. Incuber à 37 ° C pendant la nuit.
  5. Refroidir le tube sur la glace pendant 10 min. Ajouter 0,8 mL de la Solution 3 à l’échantillon et inverser les 3 - 5 fois. Placer l’échantillon sur la glace pendant 5 min.
  6. Centrifuger l’échantillon à 3 000 g pendant 15 min à 4 ° C. Transvaser avec soin le surnageant dans un tube à centrifuger conique stérile 15 mL.
  7. Ajouter 6 µL de solution mère de RNase (10 mg/mL) jusqu'à obtenir une concentration finale de 20 µg/mL. Incuber à 37 ° C pendant 15 min.
  8. Ajouter 2,5 mL d’alcool isopropylique et mélanger soigneusement en retournant doucement plusieurs fois à précipiter l’ADN (brins de matière blanche, floculant seront incluse). À l’aide d’une pipette de gros calibre, transférer le précipitant de l’ADN dans un nouveau tube de centrifugation de 1,5 mL.
  9. Centrifuger à 12 000 x g pendant 3 min à 4 ° C. Jeter le liquide surnageant avec soin. Granule d’ADN laver en ajoutant 500 µL d’éthanol 70 %.
  10. Centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min et jeter le surnageant. Sécher à l’air granule d’ADN à température ambiante. Ajouter 100 µL de ddH2O et incuber à 65 ° C pendant 15 min remettre en suspension l’ADN.

3. Quantification de l’ADN génomique

Utiliser un spectrophotomètre (voir Table des matières) pour détecter la quantité et la qualité de l’ADN génomique.

  1. Connectez-vous à l’ordinateur relié à la machine du spectrophotomètre. Ouvrez le logiciel.
  2. Initialiser la machine du spectrophotomètre :
    1. Cliquez sur « Acide nucléique » sur le logiciel du spectrophotomètre.
    2. Nettoyer le socle avec un chiffon de papier jetables et eau purifiée.
  3. Vierges du spectrophotomètre :
    1. Charger 2 µL d’eau purifiée sur le piédestal.
    2. Abaissez le bras supérieur du spectrophotomètre et cliquez sur « En blanc » pour étalonner.
    3. Quand c’est fait, soulevez le bras supérieur et sécher le piédestal avec une lingette.
  4. Mesurer l’échantillon :
    1. Cliquez sur « ADN-50 » sur le Type d’échantillon.
    2. Charger 2 µL de l’échantillon d’ADN sur le piédestal.
    3. Abaissez le bras supérieur, puis cliquez sur « Mesure » pour mesurer le ratio A260/A280 et la concentration de l’échantillon.
    4. Nettoyer le socle entre chaque série avec une lingette et eau purifiée.
  5. Cliquez sur « Print Screen » pour collecter les données.

4. génétique analyse des mutations

Amplifier l’ADN de cible avec le PCR4. Effectuer des PCR dans une réaction de 25 µL mélange en utilisant une ADN polymérase nécessaire (voir la Table des matières). Le tableau 1 montre le gène TTR intronic amorces.

gène Séquence d’amorce
Exon1 F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3'
R : 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3'
Exon2 F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3'
R : 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3'
Exon3 F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3'
R : 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3'
Exon4 F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3'
R : 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'

Tableau 1. Amorces intronic de gène TTR. (Séquence de référence NCBI : NC_000018.10)

  1. Ajouter les réactifs dans le tableau 2 dans un tube PCR de 0,2 mL.
Composants Volume (µL) Concentration finale
10 x tampon 2.5 1 x
MgCl2 (25 mM) 1.5 1,5 mM
360 GC Enhancer 1 -
360 l’ADN polymérase 0,2 2 U/réaction
dNTP Mix (25 mM) 2 2 mM chaque
Apprêt F (10 µM) 1 0,4 ΜM
Primer R (10 µM) 1 0,4 ΜM
ADN (100 ng) 2
Eau de PCR-qualité 13,8 -
Volume total 25 -

Le tableau 2. Conditions de réaction PCR.

  1. Mélanger doucement et centrifuger brièvement sur une centrifugeuse de paillasse pour recueillir tous les éléments au fond du tube. Placer le tube dans un thermocycleur.
  2. Effectuer PCR de 30 cycles. Chaque cycle se compose d’une étape de dénaturation pendant 30 s à 94 ° C, amorce un recuit pour 30 s à 58 ° C et l’extension de la polymérase pour 45 s à 72 ° C (voir tableau 3).
Étape Température (° C) Temps cycle
Dénaturation initiale 95 5 min 1
Étape de dénaturation de l’ADN 94 30 s 30 cycles
Étape de recuit apprêt 58 30 s 30 cycles
Étape de polymérisation en extension 72 45 s 30 cycles
Étape d’élongation post 72 10 min 1
Fin du PCR cyclisme 4 Indéfinie

Tableau 3. Conditions de cyclisme pour amplifier des produits PCR.

  1. Valider le produit PCR en visualisant avec électrophorèse :
    1. Préparer un gel d’agarose à 1.2 % :
      1. Mélanger 1,2 g de poudre d’agarose avec 100 mL de 0,5 x TBE dans une fiole pour four à micro-ondes. Four à micro-ondes pendant 2 min jusqu'à dissolution complète de l’agarose. Refroidir le mélange de gel d’agarose à 55 ° C.
      2. Ajouter 2 µL d’une solution de bromure d’éthidium (10 mg/mL) au mélange d’agarose et mélanger doucement. Versez le mélange de gel d’agarose dans un bac en gel d’environ 5-7 mm, puis ajouter la comb(s) en place. Laisser solidifier (au moins 30 min) et retirer soigneusement comb(s).
    2. Charger des échantillons et exécuter un gel d’agarose :
      1. Placer le gel et le plateau dans la cellule de l’électrophorèse. Remplir la cellule électrophorèse avec 0,5 x TBE jusqu'à ce que le gel est couvert.
      2. Soigneusement charger 2 µL d’un ADN bp 100 ladder (voir Table des matières) dans le seule voie du gel comme marqueur de poids moléculaire. Mélange de colorant/témoin charge (5 µL de la gamme de produits PCR avec 1 µL 6 x chargement colorant) dans les voies additionnelles.
      3. Allumez l’alimentation. Exécutez le gel pendant 25 min à 100 V.
      4. Retirer le gel de la cellule de l’électrophorèse. Visualiser les fragments d’ADN sous ultraviolets dans un système d’imagerie.

5. séquençage de l’ADN

  1. Purifier les produits PCR à l’aide d’une trousse commerciale et séquencer dans le commerce ou avec un séquenceur automatique (voir Table des matières).
  2. Présenter des séquences de nucléotides dans le serveur de NCBI BLAST pour comparer la requête nucléotidique au nucléotide bases10. Une fois les résultats affichés, effectuer des alignements de séquences et d’identifier la mutation attendue.

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Representative Results

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Gel d’agarose de deux patients et une saine des bandes individuelles ont révélé des montants attendus, y compris un produit PCR bp 454 de l’exon 4 du gène TTR (Figure 1).

Figure 1
Figure 1 . Électrophorèse sur gel, dépeignant la PCR amplifiés gène TTR. Normal : un individu sain. Échelle d’ADN bp 100 M: Lane comme marqueur de poids moléculaire. Voies 1:246 bp (exon 1). Voies 2:292 bp (exon 2). Voies 3:299 bp (exon 3). Voies 4:454 bp (exon 4). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Séquençage direct divulguées une substitution de T nucléotide pour G dans l’exon 4 du gène TTR. Cette mutation faux-sens conduit à une substitution d’alanine-à-sérine en acides aminés position 97 dans deux patients. Chromatogrammes de la séquence de ces deux patients et un individu sain sont illustrés dans la Figure 2.

Figure 2
Figure 2 . Séquençage d’un individu sain (type sauvage) et un hétérozygote G > mutation de T dans l’exon 4 du gène TTR (patients 1 et 2). Des chromatogrammes Patient 1 et 2 du Patient, les flèches indiquent deux pics qui se chevauchent de différentes couleurs. Les deux sommets sont environ la moitié de la hauteur du reste de la séquence. Cette substitution hétérozygote, (G/T) est confirmée dans l’ordre inverse, (c/a). Certaines parties de ce chiffre ont été modifiés d’un personnage dans notre précédente publication5. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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Il y a deux étapes cruciales au sein du protocole. Tout d’abord, afin d’avoir un nombre suffisant de globules blancs, un spécimen de hémodilué devrait être évité11. Deuxièmement, l’utilisation des amorces PCR appropriées est fondamentale pour obtenir des résultats fiables,12. Nous avons utilisé l’outil web de Primer-BLAST pour concevoir les amorces4,13; un minimum de 40 paires de bases sur chaque côté des exons TTR quatre devrait être couverts. Nous organisons également BLAST sur NCBI pour vérifier la spécificité des amorces.

Certaines modifications sont apportées lors de l’étape d’extraction de l’ADN. Tout d’abord, le montant des trois solutions utilisées sont réduits. Cette modification a aussi conduit à une quantité suffisante d’ADN et enregistre les solutions. Deuxièmement, l’isopropanol ou 100 % éthanol sont les deux alternatives utilisées dans la précipitation de l’ADN14,15. Par rapport à l’éthanol, isopropanol précipite l’ADN à température ambiante, ce qui réduit la coprécipitation de sel15. En outre, longs de précipitations à des températures de congélation peuvent être nécessaire pour maximiser le rendement de l’ADN15. En troisième lieu, tampon TE est substitué à l’eau bidistillée (ddH2O) remettre en suspension l’ADN. La préparation de l’ADN dans le présent protocole est utilisée pour PCR ultérieure protection sur le stockage n’est pas un sujet de préoccupation. En outre, EDTA inhibent l’activité enzymatique lorsque l’ADN est utilisé en PCR15.

Pour un coût moindre et moins de temps d’attente, séquençage et la purification du produit PCR ont été effectuées par une société de biotechnologie. La limitation dans le présent protocole devrait être les méthodes manuelles, y compris les étapes de centrifugation répétées. Un système d’extraction automatisée des acides nucléiques a été développé et est bénéfique pour la réduction du temps de travail et en augmentant la reproductibilité et la qualité des résultats16.

Chez tous les patients avec des dépôts amyloïdes, diagnostic différentiel des amyloses systémiques doit être effectué. Spectrométrie de masse (MS) peut être appliquée pour déterminer la sous-unité de la protéine et de classer la maladie comme l’amylose chaîne légère d’immunoglobuline (AL, avec une médiane de survie inférieure à ATTR)17 ou amylose liée à la transthyrétine18, 19, qui invitent le dépistage génétique en aval ne peut pas faire, en particulier pour les patients pour lesquels ATTR héréditaire n’était pas initialement soupçonné19.

Analyse protéomique basé sur la spectrométrie de masse a été utilisé pour le dépistage et le typage des TTR amylose19,20,21. Néanmoins, MS seule n’est pas suffisante pour exclure une mutation pathogène chez les patients avec l’ATTR héréditaire22, car certaines des variantes TTR atypiques ou rares ne peuvent pas être séparés par basées sur l’analyse des dépôts amyloïdes échantillons échantillon ou sérum dans un laboratoire clinique19,23. En outre, les erreurs d’échantillonnage possible et la répartition inégale de la substance amyloïde fibrilles peuvent mener à un faux négatif tissulaires biopsies5,21,24, complique l’analyse protéomique en aval. Par conséquent, analyses d’ADN, le test le plus fiable pour ATTR, doit être effectuée dans plupart des cas d’ATTR5,22, ainsi que dans toute neuropathie axonale progressive idiopathique ou distale neuropathie douloureuse symétrique de petites fibres 25 , 26.

D’autres facteurs qui peuvent liée à la variation phénotypique pour ATTR et guide les orientations futures incluent des variantes de modification post-traductionnelle (PTMs) présents dans le sérum et ATTR fibrille composition27,28. ATTR héréditaire est une maladie monogénique, une variabilité considérable même parmi ceux ayant la même mutation ou au sein de la même famille a été observée27. Une hétérogénéité génétique seule ne parvient pas à élucider l’apparition diverse et la pathologie de l' ATTR28. Par conséquent, les deux génétiques et protéomique méthodes doivent être utilisées lorsque ces facteurs sont pris en compte.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Miss Fun-Shin Wu pour son aide dans les expériences. Cette étude a été financée par une subvention du programme de recherche médicale Chang Gung (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) et IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Taiwan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA-treated tubes BD
DNA Extraction Kit Stratagen 200600
NanoDrop ND2000 spectrophotometer  Thermo Fisher Scientific NanoDrop 2000
Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Kimtech Science Kimwipes
AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit Applied Biosystems 4398823
TTR gene intronic primers  Exon1 F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’
Exon1 R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’
Exon2 F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’
Exon2 R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’
Exon3 F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’
Exon3 R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’
Exon4 F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’
Exon4 R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’
thermocycler Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700
electrophoresis cell  ADVANCE Mupid-2plus
DNA ladder Protech PT-M1-100
dye BioLabs B7021
AlphaImager EC Alpha Innotech AlphaImager EC
automatic sequencer  Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer

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References

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Hsu, H. C., Liao, M. F., Hsu, J. L., Lee, Y. L., Ro, L. S. Genetic Analysis of Hereditary Transthyretin Ala97Ser Related Amyloidosis. J. Vis. Exp. (136), e57743, doi:10.3791/57743 (2018).More

Hsu, H. C., Liao, M. F., Hsu, J. L., Lee, Y. L., Ro, L. S. Genetic Analysis of Hereditary Transthyretin Ala97Ser Related Amyloidosis. J. Vis. Exp. (136), e57743, doi:10.3791/57743 (2018).

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