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Medicine

आनुवंशिक विश्लेषण वंशानुगत Transthyretin Ala97Ser सम्बन्धित Amyloidosis

doi: 10.3791/57743 Published: June 9, 2018

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल वर्तमान वंशानुगत transthyretin amyloidosis के निदान के लिए बिंदु उत्परिवर्तन की उपस्थिति की पुष्टि, Ala97Ser, ताइवान में सबसे आम स्थानिकमारी वाले उत्परिवर्तन का उपयोग कर, एक उदाहरण के रूप में ।

Abstract

आनुवंशिक परीक्षण वंशानुगत transthyretin संबंधित amyloidosis के लिए सबसे विश्वसनीय परीक्षण है और transthyretin amyloidosis (ATTR) के अधिकांश मामलों में किया जाना चाहिए । ATTR विषम phenotypes के साथ एक दुर्लभ लेकिन घातक रोग है; इसलिए निदान कभी-कभार देरी होती है । ATTR के प्रारंभिक अभिव्यक्तियों के साथ-साथ उभरते उपचारों, उपयुक्त नैदानिक अध्ययनों, जिनमें transthyretin (TTR) आनुवंशिक परीक्षण शामिल हैं, के प्रकार और ATTR के वेरिएंट की पुष्टि करने के लिए अधिक ध्यान और व्यापक मांयता के साथ इसलिए मौलिक पूर्वानुमान में सुधार करने के लिए । पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) तरीकों के साथ आनुवंशिक विश्लेषण TTR बिंदु उत्परिवर्तनों की उपस्थिति की पुष्टि बहुत अधिक जल्दी और दक्षिणी दाग जैसे पारंपरिक तरीकों से सुरक्षित । इस के साथ साथ, हम ATTR Ala97Ser उत्परिवर्तन, ताइवान में सबसे आम स्थानिक उत्परिवर्तन के आनुवंशिक पुष्टि प्रदर्शित करता है । प्रोटोकॉल चार मुख्य कदम शामिल हैं: पूरे रक्त नमूना इकट्ठा, डीएनए निष्कर्षण, पीसीआर के साथ सभी चार TTR exons के आनुवंशिक विश्लेषण, और डीएनए अनुक्रमण.

Introduction

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Transthyretin (TTR) amyloidosis (ATTR) वंशानुगत प्रणालीगत amyloidosis1का सबसे आम रूप है, और एक autosomal की वजह से हो सकता है मुख्य रूप से Transthyretin (TTR) जीन2में उत्परिवर्तन विरासत में मिला । TTR उत्परिवर्तनों tetrameric प्रोटीन संरचना को अस्थिर और मोनोमर कि amyloid तंतुओं2में reइक्ट्ठा में अपनी पृथक्करण के लिए सीसा । से अधिक १०० amyloidogenic TTR उत्परिवर्तनों1दुनिया भर में सूचित किया गया है । पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) तरीकों के साथ आनुवंशिक विश्लेषण TTR बिंदु उत्परिवर्तन की उपस्थिति की पुष्टि और दक्षिणी ब्लाट3के साथ तुलना में रेडियोधर्मी लेबल जांच की हैंडलिंग से बचने सहित लाभ है । पीसीआर एक तेज, आसान, सस्ता और विश्वसनीय तकनीक है कि आधुनिक विज्ञान4में कई क्षेत्रों के लिए लागू किया गया है ।

इस प्रगतिशील और घातक रोग का शीघ्र निदान अपनी phenotypic विविधता को देखते हुए चुनौतीपूर्ण है. बढ़ती ध्यान और ATTR के प्रारंभिक अभिव्यक्तियों पर व्यापक मांयता के साथ ही साथ उभरते उपचार5, TTR आनुवंशिक परीक्षण सहित उचित नैदानिक अध्ययन इसलिए गंभीर रूप से पूर्वानुमान में सुधार मौलिक हैं । इसके अलावा, विभिन्न उत्परिवर्तनों विशेषता के विभिन्न penetrance के साथ जुड़े रहे हैं, शुरुआत की उम्र, प्रगति के पैटर्न, रोग गंभीरता, औसत अस्तित्व, जिगर प्रत्यारोपण की प्रभावकारिता, या TTR स्थिरता2,6, और स्नायविक और cardiological शामिल है, जो आनुवंशिक परामर्श7,8,9के लिए महान निहितार्थ है की चर डिग्री । वंशानुगत (उत्परिवर्ती) और जंगली प्रकार (गैर उत्परिवर्ती फार्म, बूढ़ा प्रणालीगत amyloidosis, एसएसए)-इसके अलावा, एक बहुत ही सटीक आनुवंशिक परीक्षण ATTR के दो अलग प्रकार के अंतर है कि केवल उपकरण है7। यह ATTR के प्रकार की पुष्टि करने के लिए आवश्यक है, क्योंकि चिकित्सा व्यापक रूप से बदलती हैं2. इसलिए, वहां एक बढ़ती आवश्यकता को TTR आनुवंशिक परीक्षण के stepwise प्रोटोकॉल का वर्णन है ।

आणविक दृष्टिकोण उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए Ala97Ser, ताइवान में सबसे आम स्थानिकमारी वाले उत्परिवर्तन का उपयोग कर सचित्र होगा, एक उदाहरण के रूप में । डीएनए निष्कर्षण कदम में संशोधन तीन समाधान इस्तेमाल की राशि को कम करने और डीएनए की एक पर्याप्त मात्रा में पैदावार । इस प्रोटोकॉल में, सभी चार TTR exons विश्लेषण किया गया था, जबकि 5 ' नदी के ऊपर, 3 ' बहाव, प्रवर्तकों, introns, और unमराठीमध्ये क्षेत्रों (UTR) सहित क्षेत्रों अनुक्रम नहीं थे ।

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Protocol

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प्रयोगशाला में किए गए परीक्षण नैदानिक प्रयोगशाला सुधार संशोधन (CLIA) की १९८८ की आवश्यकताओं के अनुसार किया गया था, चांग गुंग मेमोरियल अस्पताल के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित विनियम और विश्वविद्यालय (license no. 100-4470A3 और 104-2462A3) । सभी मरीजों से कुशलक्षेम सहमति प्राप्त की गई ।

1. रक्त नमूना संग्रह

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध EDTA-इलाज ट्यूबों में पूरे खून ले लीजिए । धीरे मिश्रण और प्रसंस्करण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रक्त के नमूने की दुकान ।

2. परिधीय रक्त से डीएनए निष्कर्षण

जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के लिए एक डीएनए निष्कर्षण किट का प्रयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।

  1. ४.० मिलीलीटर रक्त के नमूने के लिए 1 समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें । 10 मिनट के लिए बर्फ पर नमूना मशीन ।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक । निकालें और supernatant ध्यान से त्यागें । 1 समाधान के 3 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।
  3. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फिर से २,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक और supernatant त्यागें । 2 समाधान के 3 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।
  4. pronase शेयर समाधान के 10 µ एल जोड़ें (२२५ मिलीग्राम/एमएल) १०० µ जी के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए/एमएल और मिश्रण अच्छी तरह से । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर मशीन ।
  5. 10 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब चिल । समाधान 3 के ०.८ मिलीलीटर जोड़ें नमूना और उलटा 3-5 बार । 5 मिनट के लिए बर्फ पर जगह का नमूना ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ३,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक । ध्यान से एक 15 मिलीलीटर बाँझ शंकु केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए supernatant हस्तांतरण ।
  7. 20 µ g/एमएल के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए RNase स्टॉक सॉल्यूशन (10 mg/एमएल) के 6 µ l को जोड़ें । 15 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
  8. isopropyl शराब की २.५ मिलीलीटर जोड़ें और धीरे से कई बार पलटना द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण डीएनए (किस्में सफेद, flocculent सामग्री के रूप होगा) । एक बड़े बोर प्लास्टिक का उपयोग करना, एक नया १.५ एमएल केंद्रापसारक ट्यूब के लिए डीएनए precipitant हस्तांतरण ।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक । supernatant सावधानी से छोड़ें । ७०% इथेनॉल के ५०० µ एल जोड़कर धो डीएनए गोली ।
  10. 1 मिनट के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक और supernatant त्यागें । कमरे के तापमान पर एयर सूखी डीएनए गोली । ddH2ओ के १०० µ एल जोड़ें और डीएनए को फिर से निलंबित करने के लिए 15 मिनट के लिए ६५ ° c पर मशीन ।

3. जीनोमिक डीएनए ठहराव

जीनोमिक डीएनए की मात्रा और गुणवत्ता का पता लगाने के लिए एक spectrophotometer ( सामग्री तालिकादेखें) का उपयोग करें ।

  1. spectrophotometer मशीन से जुड़ी कंप्यूटर में लॉग इन करें । सॉफ़्टवेयर खोलें ।
  2. spectrophotometer मशीन को प्रारंभ:
    1. spectrophotometer सॉफ्टवेयर पर "न्यूक्लिक एसिड" पर क्लिक करें ।
    2. एक डिस्पोजेबल कागज पोंछ और शुद्ध पानी के साथ कुरसी साफ ।
  3. रिक्त spectrophotometer:
    1. आसन पर शुद्ध पानी के 2 µ l को लोड करे ।
    2. spectrophotometer की ऊपरी बांह को कम करें और उसे जांचने के लिए "खाली" पर क्लिक करे ।
    3. जब यह किया जाता है, ऊपरी बांह उठा और एक पोंछ के साथ कुरसी सूखी ।
  4. नमूना उपाय:
    1. नमूना प्रकार पर "डीएनए-५०" क्लिक करें ।
    2. कुरसी पर डीएनए सैंपल के 2 µ l को लोड करे |
    3. ऊपरी बांह कम और A260/A280 अनुपात और नमूने की एकाग्रता को मापने के लिए "उपाय" पर क्लिक करें ।
    4. एक पोंछ और शुद्ध पानी के साथ प्रत्येक रन के बीच में कुरसी साफ ।
  5. डेटा एकत्र करने के लिए "प्रिंट स्क्रीन" पर क्लिक करें ।

4. उत्परिवर्तनों का आनुवंशिक विश्लेषण

पीसीआर4के साथ लक्ष्य डीएनए बढ़ाना । एक डीएनए पोलीमरेज़ किट का उपयोग कर एक 25 µ एल प्रतिक्रिया मिश्रण में पीसीआर प्रदर्शन ( सामग्री की तालिकादेखें) । तालिका 1 TTR जीन intronic प्राइमरों से पता चलता है ।

जीन प्राइमरी सीक्वेंस
Exon1 एफ: 5 '-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3 '
आर: 5 '-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3 '
Exon2 एफ: 5 '-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3 '
आर: 5 '-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3 '
Exon3 एफ: 5 '-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3 '
आर: 5 '-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3 '
Exon4 एफ: 5 '-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3 '
आर: 5 '-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3 '

तालिका 1. TTR जीन intronic प्राइमर । (NCBI संदर्भ अनुक्रम: nc_ 000018.10)

  1. टेबल 2 में रिएजेंट को ०.२ एमएल पीसीआर ट्यूब से जोड़ें ।
घटक मात्रा (µ एल) अंतिम एकाग्रता
10x बफर २.५ 1x
MgCl2 (25 मिमी) १.५ १.५ एमएम
३६० जीसी बढ़ाने वाला 1 -
३६० डीएनए पोलीमरेज़ ०.२ 2 यू रिएक्शन/
dNTP मिश्रण (25 मिमी प्रत्येक) 2 2 मिमी प्रत्येक
प्राइमरी एफ (10 µ एम) 1 ०.४ µ m
प्राइमरी आर (10 µ मी) 1 ०.४ µ m
डीएनए (१०० एनजी) 2
पीसीआर ग्रेड पानी १३.८ -
कुल मात्रा 25 -

तालिका 2. पीसीआर रिएक्शन शर्तें ।

  1. मिश्रण धीरे और संक्षेप में एक benchtop के लिए ट्यूब के नीचे सभी घटकों को इकट्ठा करने के लिए केंद्रापसारक । एक thermocycler में ट्यूब प्लेस ।
  2. 30 चक्र के लिए पीसीआर प्रदर्शन । प्रत्येक चक्र ९४ डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए एक विकार कदम के होते हैं, प्राइमरी एनीलिंग ५८ डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए, और ७२ डिग्री सेल्सियस पर ४५ s के लिए पोलीमरेज़ विस्तार ( तालिका 3देखें) ।
चरण तापमान (° c) समय चक्र
प्रारंभिक विकार ९५ 5 min 1
DNA विकार कदम ९४ 30 एस 30 चक्र
प्राइमरी एनीलिंग स्टेप ५८ 30 एस 30 चक्र
पोलीमरेज़ विस्तार कदम ७२ ४५ s 30 चक्र
पोस्ट बढ़ाव कदम ७२ 10 min 1
पीसीआर साइक्लिंग का अंत 4 अनिश्चित

तालिका 3. पीसीआर उत्पादों को बढ़ाना के लिए सायक्लिंग शर्तें ।

  1. जेल ट्रो के साथ visualizing द्वारा पीसीआर उत्पाद मान्य:
    1. एक १.२% agarose जेल तैयार करें:
      1. एक microwavable कुप्पी में 0.5 x TBE की १०० मिलीलीटर के साथ agarose पाउडर का १.२ ग्राम मिलाएं । agarose पूरी तरह से भंग हो गया है जब तक 2 मिनट के लिए माइक्रोवेव । ५५ डिग्री सेल्सियस के लिए agarose मिश्रण शांत हो जाओ ।
      2. एक ethidium ब्रोमाइड समाधान के 2 µ एल जोड़ें (10 मिलीग्राम/एमएल) agarose मिश्रण करने के लिए और धीरे से मिश्रण । के बारे में 5-7 mm के लिए एक जेल ट्रे में agarose मिश्रण डालो, तो कंघी (ओं) जगह में जोड़ें । इसे जमना (कम से कम 30 मिनट) और सावधानी से कंघी (ओं) को दूर करने की अनुमति दें ।
    2. नमूने लोड और एक agarose जेल चलाने के लिए:
      1. जेल और ट्रे को ट्रो सेल में रखें । जेल के कवर होने तक 0.5 x TBE के साथ ट्रो सेल भरें ।
      2. ध्यान से एक १०० बीपी डीएनए सीढ़ी के 2 µ एल लोड ( सामग्री की तालिकादेखें) जेल के एक लेन में आणविक आकार मार्कर के रूप में । लोड डाई/नमूना मिश्रण (पीसीआर उत्पाद मिश्रण के 5 µ एल के साथ 1 µ एल 6x लोडिंग डाई) अतिरिक्त गलियों में ।
      3. बिजली की आपूर्ति चालू करें । १०० वी में 25 मिनट के लिए जेल भागो ।
      4. ट्रो सेल से जेल को हटा दें । एक इमेजिंग प्रणाली में यूवी प्रकाश के तहत डीएनए टुकड़े कल्पना ।

5. डीएनए अनुक्रमण

  1. एक वाणिज्यिक किट और अनुक्रम वाणिज्यिक या एक स्वचालित sequencer के साथ का उपयोग कर पीसीआर उत्पादों को शुद्ध ( सामग्री की तालिकादेखें).
  2. न्यूक्लियोटाइड डेटाबेस10करने के लिए न्यूक्लियोटाइड क्वेरी की तुलना करने के लिए NCBI विस्फोट सर्वर के लिए न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम सबमिट करें । परिणाम प्रदर्शित होने के बाद, अनुक्रम संरेखण निष्पादित करें और अपेक्षित उत्परिवर्तन की पहचान ।

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Representative Results

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दो रोगियों की Agarose जेल ट्रो और एक स्वस्थ व्यक्तिगत पता चला अपेक्षित आकार के बैंड, TTR जीन के एक्सॉन 4 के लिए एक ४५४ बीपी पीसीआर उत्पाद सहित (चित्रा 1) ।

Figure 1
चित्रा 1 . जेल ट्रो चित्रण पीसीआर प्रवर्धित TTR जीन. सामांय: एक स्वस्थ व्यक्ति । लेन एम: १०० है आणविक आकार मार्कर के रूप में बीपी डीएनए सीढ़ी । गलियाँ 1:246 bp (एक्सॉन 1). फि ल्म 2:292 बीपी (एक्सॉन 2) । फि ल्म 3:299 बीपी (एक्सॉन 3) । फि ल्म 4:454 बीपी (एक्सॉन 4) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्रत्यक्ष अनुक्रमण TTR जीन के एक्सॉन 4 में जी के लिए एक न्यूक्लियोटाइड टी प्रतिस्थापन का खुलासा किया । यह एक alanine के परिणामस्वरूप यह बकवास उत्परिवर्तन दो रोगियों में एमिनो एसिड ९७ स्थिति में एक के लिए serine प्रतिस्थापन । इन दो रोगियों और एक स्वस्थ व्यक्ति के अनुक्रम chromatograms चित्रा 2में प्रदर्शन कर रहे हैं ।

Figure 2
चित्रा 2 . एक स्वस्थ व्यक्ति के अनुक्रमण (जंगली प्रकार) और एक heterozygous जी > TTR जीन के एक्सॉन 4 में टी उत्परिवर्तन (रोगियों 1 और 2) । रोगी में तीर 1 और रोगी 2 chromatograms विभिन्न रंगों की दो अतिव्यापी चोटियों से संकेत मिलता है । दो चोटियों की ऊंचाई के बारे में आधा है अनुक्रम के बाकी । इस heterozygous प्रतिस्थापन, (G/T) रिवर्स अनुक्रम में पुष्टि की है, (सी/ इस आंकड़े के भागों हमारे पिछले प्रकाशन5में एक आंकड़ा से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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प्रोटोकॉल के भीतर दो महत्वपूर्ण चरण हैं । सबसे पहले, आदेश में सफेद रक्त कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या है, एक hemodiluted नमूना11से बचा जाना चाहिए । दूसरा, उपयुक्त पीसीआर प्राइमरों का उपयोग विश्वसनीय12प्राप्त करने के लिए मौलिक है । हम प्राइमर-ब्लास्ट वेब उपकरण का इस्तेमाल किया प्राइमरों4,13डिजाइन; चार TTR exons के प्रत्येक पक्ष पर न्यूनतम ४० आधार जोड़े को कवर किया जाना चाहिए । हम भी NCBI पर ब्लास्ट चलाने के लिए प्राइमरों की विशिष्टता की जांच करें ।

कुछ संशोधनों डीएनए निष्कर्षण कदम में किए गए हैं । सबसे पहले, इस्तेमाल तीन समाधान की राशि कम कर रहे हैं । इस संशोधन भी डीएनए की एक पर्याप्त राशि की पैदावार और समाधान बचाता है । दूसरा, isopropanol या १००% इथेनॉल दो डीएनए के वर्षण14,15में इस्तेमाल विकल्प हैं । इथेनॉल के साथ तुलना में, isopropanol कमरे के तापमान, जो15नमक के coprecipitation कम कर देता है पर डीएनए हाला । इसके अतिरिक्त, फ्रीजर तापमान पर लंबे समय तक वर्षा समय डीएनए उपज15को अधिकतम करने के लिए आवश्यक हो सकता है । तीसरा, ते बफर डीएनए reसस्पेंड करने के लिए डबल आसुत जल (ddH2ओ) के लिए प्रतिस्थापित कर रहा है । इस प्रोटोकॉल में डीएनए तैयारी बाद में पीसीआर के लिए प्रयोग किया जाता है तो भंडारण पर सुरक्षा एक चिंता का विषय नहीं है । इसके अलावा, EDTA जब पीसीआर15में डीएनए का उपयोग किया जाता है एंजाइम गतिविधि को बाधित करेगा ।

कम लागत और कम प्रतीक्षा समय के लिए, पीसीआर उत्पाद शुद्धि और अनुक्रमण एक जैव प्रौद्योगिकी कंपनी द्वारा प्रदर्शन किया गया । इस प्रोटोकॉल में सीमा मैनुअल तरीके, दोहराया केंद्रापसारक कदम भी शामिल होना चाहिए । एक स्वचालित न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण प्रणाली विकसित किया गया है, और काम के समय को कम करने और reproducibility और परिणाम16की गुणवत्ता में वृद्धि के लिए फायदेमंद है ।

amyloid जमा के साथ सभी रोगियों में, प्रणालीगत amyloidoses के विभेदक निदान किया जाना चाहिए । मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) प्रोटीन उपइकाई निर्धारित करने के लिए लागू किया जा सकता है और immunoglobulin प्रकाश के रूप में रोग वर्गीकृत-श्रृंखला amyloidosis (अल, एक औसत अस्तित्व ATTR के लिए अवर के साथ)17 या transthyretin-18amyloidosis से संबंधित, 19, जो प्रत्यक्ष बहाव आनुवंशिक परीक्षण नहीं कर सकते, विशेष रूप से उन रोगियों जिनके लिए वंशानुगत ATTR शुरू में19संदिग्ध नहीं था के लिए ।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित proteomic विश्लेषण TTR amyloidosis19,20,21के स्क्रीनिंग और टाइपिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है । फिर भी, अकेले एमएस वंशानुगत ATTR22के साथ रोगियों में एक रोगजनक उत्परिवर्तन बाहर करने के लिए पर्याप्त नहीं है, क्योंकि कुछ असामान्य या दुर्लभ TTR वेरिएंट के amyloid जमा नमूना या सीरम नमूनों के एमएस आधारित विश्लेषण से अलग नहीं किया जा सकता है एक नैदानिक प्रयोगशाला19,23. इसके अलावा, संभव नमूना त्रुटियों, और amyloid तंतुओं के असमान वितरण एक झूठी नकारात्मक ऊतक बायोप्सी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं5,21,24, बहाव proteomic विश्लेषण मुश्किल बना. इसलिए, डीएनए परीक्षण, ATTR के लिए सबसे विश्वसनीय परीक्षण, ATTR के अधिकांश मामलों में किया जाना चाहिए5,22, के रूप में अच्छी तरह के रूप में किसी भी अज्ञातहेतुक प्रगतिशील axonal परिधीय न्यूरोपैथी या बाहर सममित दर्दनाक छोटे फाइबर न्यूरोपैथी 25 , 26.

ATTR और गाइड भविष्य दिशाओं के लिए phenotypic भिन्नता के लिए संबंधित अन्य कारकों में पोस्ट-शोधों संशोधन (PTMs) वेरिएंट में मौजूद सीरम और ATTR फाइब्रिल रचना27,28शामिल हैं । हालांकि वंशानुगत ATTR एक monogenetic रोग है, काफी परिवर्तनशीलता भी एक ही उत्परिवर्तन या एक ही परिवार के भीतर के साथ उन लोगों के बीच27मनाया गया है । आनुवंशिक विविधता अकेले ATTR28की विविध शुरुआत और विकृति स्पष्ट करने में विफल रहता है । इसलिए, आनुवंशिक और प्रोटियोमिक् दोनों तरीकों का उपयोग किया जाना चाहिए जब इन कारकों को ध्यान में रखा जाता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उसके प्रयोगों में मदद के लिए मिस शिन-फन वू शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस अध्ययन में चांग गुंग मेडिकल रिसर्च प्रोग्राम (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) और आईआरबी 100-4470A3, 104-2462A3, ताइवान से अनुदान का समर्थन किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA-treated tubes BD
DNA Extraction Kit Stratagen 200600
NanoDrop ND2000 spectrophotometer  Thermo Fisher Scientific NanoDrop 2000
Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Kimtech Science Kimwipes
AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit Applied Biosystems 4398823
TTR gene intronic primers  Exon1 F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’
Exon1 R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’
Exon2 F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’
Exon2 R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’
Exon3 F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’
Exon3 R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’
Exon4 F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’
Exon4 R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’
thermocycler Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700
electrophoresis cell  ADVANCE Mupid-2plus
DNA ladder Protech PT-M1-100
dye BioLabs B7021
AlphaImager EC Alpha Innotech AlphaImager EC
automatic sequencer  Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer

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References

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आनुवंशिक विश्लेषण वंशानुगत Transthyretin Ala97Ser सम्बन्धित Amyloidosis
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Hsu, H. C., Liao, M. F., Hsu, J. L., Lee, Y. L., Ro, L. S. Genetic Analysis of Hereditary Transthyretin Ala97Ser Related Amyloidosis. J. Vis. Exp. (136), e57743, doi:10.3791/57743 (2018).More

Hsu, H. C., Liao, M. F., Hsu, J. L., Lee, Y. L., Ro, L. S. Genetic Analysis of Hereditary Transthyretin Ala97Ser Related Amyloidosis. J. Vis. Exp. (136), e57743, doi:10.3791/57743 (2018).

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