여기, 우리는 예를 들어 Ala97Ser, 대만, 가장 일반적인 발병 변이 사용 하 여 유전 transthyretin amyloidosis의 진단에 대 한 점 돌연변이의 존재를 확인 하는 프로토콜 제시.
유전자 검사 이며 유전 transthyretin에 대 한 가장 신뢰할 수 있는 테스트 관련 amyloidosis transthyretin amyloidosis (ATTR)의 대부분의 경우에서 수행 되어야 합니다. 속성은 유형이 다른 고기;와 희귀 하지만 치명적인 질병 따라서, 진단 때로는 지연 됩니다. 관심과 ATTR 신흥 치료의 초기 발현에 광범위 한 인식 증가 함께 transthyretin (TTR) 유전자를 포함 하 여 적절 한 진단 연구, 테스트, 종류를 확인 하 고 ATTR의 변종 따라서 예 후를 개선 하기 위해 근본적인. 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 방법으로 유전자 분석 TTR 점 돌연변이의 존재를 훨씬 더 신속 하 게 확인 하 고 남쪽 오 점 등 기존 방법 보다 안전. 여기, 우리가 ATTR Ala97Ser 돌연변이, 대만에서 가장 일반적인 발병 돌연변이의 유전자 확인을 보여 줍니다. 프로토콜 구성 4 가지 주요 단계: 수집 전 혈 견본, DNA 추출, PCR와 모든 4 개의 TTR exons의 유전자 분석 및 DNA 연속.
Transthyretin (TTR) amyloidosis (ATTR) 조직의 유전 amyloidosis1, 가장 일반적인 형태 이며 transthyretin (TTR) 유전자2상 염색체 지배적 상속 된 돌연변이 의해 발생할 수 있습니다. TTR 돌연변이 tetrameric 단백질 구조를 불안정 하 게 하 고 녹말 체 소2로 재어셈블합니다 단위체로 그것의 분리 이어질. 100 amyloidogenic TTR 변이 보고 전세계1되었습니다. 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 방법으로 유전자 분석 TTR 점 돌연변이의 존재를 확인 하 고 피하는 남쪽 오 점3에 비해 방사성 레이블이 프로브의 처리를 포함 하는 장점이 있다. PCR은 현대 과학4에 수많은 분야에 적용 된, 쉽게, 저렴 한, 빠르고 신뢰할 수 있는 기술입니다.
이 진보 및 치명적인 질병의 조기 진단의 phenotypic이 주어진 도전 이다. 관심과 ATTR 신흥 치료5의 초기 발현에 광범위 한 인식 증가, TTR 유전자 검사를 포함 한 적절 한 진단 연구는 따라서 비판적으로 예 후를 개선 하기 위해 근본적인. 또한, 다른 변이 특성의 다른 penetrance, 발병 연령, 진행, 질병의 심각도, 메디아 생존, 간 이식, 또는 TTR 안정기2,6, 효능의 패턴에 연관 된 고 가변도 신경학 적인 참여의 유전 상담7,,89에 대 한 큰 의미를가지고. 게다가, 매우 정확한 유전자 검사는 두 가지 유형의 속성을 구분 하는 유일한 도구: 유전 (돌연변이) 및 야생 유형 (비 돌연변이 형태, 치 조직의 amyloidosis, 특수)7. 그것은 치료2넓게 변화 하기 때문에, 속성의 종류를 확인 하는 것이 필수적입니다. 그러므로, TTR 유전자 검사의 stepwise 프로토콜을 설명 하는 증가 필요는 없다.
돌연변이 검출 하는 분자 접근 방식은 예를 들어 Ala97Ser, 대만, 가장 일반적인 발병 변이 사용 하 여 그림 것입니다. 수정 DNA 추출 단계에서 사용 되는 세 가지 솔루션의 양을 줄일 하 고 충분 한 양의 DNA 생성 합니다. 이 프로토콜에서 모든 4 개의 TTR exons 지역 5′ 상류 3′ 하류, 발기인, introns를 포함 하 여 동안, 분석 되었다 그리고 번역 되지 않은 영역 (UTR) 시퀀싱 하지 했다.
프로토콜 내에서 두 가지 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 백혈구 세포의 충분 한 수를 위해, hemodiluted 견본 피할된11이어야 한다. 둘째, 적절 한 PCR 뇌관의 사용이 이다 신뢰할 수 있는 결과12를 기본. 디자인 뇌관4,13; 뇌관 폭발 웹 도구를 사용 하는 우리 4 개의 TTR exons의 각 측에 40의 기본적인 쌍의 최소 처리 되어야 합…
The authors have nothing to disclose.
우리가 실험에서 그녀의 도움에 대 한 미스 신 재미 우 감사 하고자 합니다. 이 연구는 장 공 의학 연구 프로그램 (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373)와 IRB 100-4470A3, 104-2462A3, 대만에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
EDTA-treated tubes | BD | ||
DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
dye | BioLabs | B7021 | |
AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |