Summary
Her presenterer vi en protokoll for å bekrefte tilstedeværelse av punkt mutasjon for diagnostisering av arvelige transthyretin amyloidose, med Ala97Ser, den vanligste endemisk mutasjonen i Taiwan, som eksempel.
Abstract
Genetisk testing er den mest pålitelige testen for arvelig transthyretin relatert amyloidose og skal utføres i de fleste tilfeller av transthyretin amyloidose (ATTR). ATTR er en sjelden, men dødelig sykdom med heterogene fenotyper; diagnosen er derfor noen ganger utsettes. Med økende oppmerksomhet og bredere anerkjennelse på tidlig manifestasjoner av ATTR samt nye behandlinger, passende diagnostiske undersøkelser, inkludert transthyretin (TTR) genetisk test for å bekrefte hvilke og varianter av ATTR er derfor grunnleggende å forbedre prognosen. Genetiske analyser polymerase kjedereaksjon (PCR) metoder bekrefte tilstedeværelse av TTR punkt mutasjoner mye raskere og sikrere enn konvensjonelle metoder som sørlige blot. Her viser vi genetisk bekreftelse av ATTR Ala97Ser mutasjon, vanligste endemisk mutasjon i Taiwan. Protokollen består av fire hovedtrinn: samle helblodprøve, DNA utvinning, genetisk analyse av alle fire TTR exons med PCR, og DNA sekvensering.
Introduction
Transthyretin (TTR) amyloidose (ATTR) er den vanligste formen for arvelig systemisk amyloidose1, og kan skyldes et autosomalt nesten kun arvet mutasjon i transthyretin (TTR) gen2. TTR mutasjoner destabilisere tetramerisk protein strukturen og føre til sin avstandtagen til monomerer som setter sammen igjen i amyloid fibrils2. Mer enn 100 amyloidogenic TTR mutasjoner har vært rapportert over hele verden1. Genetiske analyser polymerase kjedereaksjon (PCR) metoder bekrefte tilstedeværelse av TTR punkt mutasjon og har fordeler inkludert unngå håndtering av radioactively merket sonder med sørlige blot3. PCR er en rask, enkel, billig og pålitelig teknikk som brukes på mange felt i moderne vitenskap4.
Tidlig diagnostikk av denne progressive og fatal sykdommen er utfordrende gitt sin fenotypiske heterogenitet. Med økende oppmerksomhet og bredere anerkjennelse på tidlig manifestasjoner av ATTR samt nye behandlinger5, er passende diagnostiske undersøkelser inkludert TTR genetisk test derfor kritisk grunnleggende forbedre prognose. Videre ulike mutasjoner er knyttet til ulike penetrance av trekk, alder for debut, mønstre av progresjon, sykdommens alvorlighetsgrad, median overlevelse, effekten av leveren transplantasjon eller TTR stabilisatorer2,6, og variabel grader nevrologiske og cardiological engasjement, som har store konsekvenser for genetisk rådgiving7,8,9. Dessuten en svært nøyaktig genetisk test er det eneste verktøyet som skiller de to forskjellige typene ATTR: arvelig (mutant) og vill-type (ikke-mutant skjemaet, senile systemisk amyloidose, SSA)7. Det er viktig å bekrefte hvilke typer ATTR, fordi behandling varierer2. Derfor er det en økende nødvendighet å beskrive gradvis protokollen av TTR genetisk test.
Molekylær tilnærmingen å oppdage mutasjon vil bli belyst med Ala97Ser, den vanligste endemisk mutasjonen i Taiwan, som eksempel. Endringer i DNA utvinning trinn redusere tre løsninger brukes og gir en tilstrekkelig mengde DNA. I denne protokollen, alle fire TTR exons ble analysert, mens regioner, inkludert 5' oppstrøms, 3' nedstrøms, arrangører, introns, og uoversatt regioner (UTR) var ikke sekvensielt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Testing utført i laboratoriet ble utført i samsvar med kravene i den kliniske laboratoriet forbedring endringer (CLIA) 1988, regelverket godkjent av de institusjonelle gjennomgang styret av Chang Gung Memorial Hospital og University (lisens Nei 100 - 4470A3 og 104-2462A3). Informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
1. blod prøvetaking
- Samle fullblod i kommersielt tilgjengelig EDTA-behandlet rør. Bland forsiktig og lagre blodprøve på 4 ° C før behandling.
2. DNA utvinning fra perifert blod
Bruke en DNA utvinning Kit for genomisk DNA utvinning (se Tabell for materiale).
- Legge til 10 mL løsning 1 4.0 mL blod prøven. Inkuber prøven på is 10 min.
- Sentrifuge prøven 2000 x g i 5 min på 4 ° C. Fjerne og slette nedbryting nøye. Resuspend pellet i 3 mL løsning 1.
- Sentrifuge prøven 2000 x g i 5 min på 4 ° C igjen og kast nedbryting. Resuspend pellet i 3 mL løsning 2.
- Legge til 10 µL pronase lager løsningen (225 mg/mL) å få en endelig konsentrasjon 100 µg/ml og bland godt. Ruge på 37 ° C over natten.
- Chill røret på is 10 min. Legg 0,8 mL løsning 3 til prøven og invertere 3 - 5 ganger. Plasser prøven på is 5 min.
- Sentrifuge prøven 3000 x g i 15 min på 4 ° C. Nøye overføre nedbryting slik 15 mL steril konisk sentrifuge.
- Legge til 6 µL av RNase lager løsning (10 mg/mL) for å få en endelig konsentrasjon på 20 µg/mL. Ruge på 37 ° C i 15 min.
- Legge til 2,5 mL av isopropyl alkohol og bland grundig ved å forsiktig snu flere ganger for å utløse DNA (tråder hvit, flocculent materiale vil danne). Bruke en stor bar Pipetter, overføre DNA-precipitant til en ny 1,5 mL sentrifuge tube.
- Sentrifuger 12.000 x g i 3 minutter på 4 ° C. Kast nedbryting nøye. Vask DNA pellet ved å legge 500 µL av 70% etanol.
- Sentrifuge 12.000 x g for 1 min og kast nedbryting. Luften tørr DNA pellet ved romtemperatur. Legg 100 µL ddH2O og ruge ved 65 ° C i 15 minutter for å resuspend DNA.
3. genomisk DNA kvantifisering
Bruker et spektrofotometer (se Tabell for materiale) å oppdage kvantitet og kvalitet av genomisk DNA.
- Logge på datamaskinen som er koblet til spektrofotometer maskinen. Åpne programvaren.
- Initialisere spektrofotometer maskinen:
- Klikk "Nucleic Acid" spektrofotometer programvaren.
- Rengjør sokkelen med disponibel papir tørke og renset vann.
- Tom på spektrofotometer:
- Legg 2 µL renset vann på sokkelen.
- Lavere øvre arm av spektrofotometeret og klikk "Blank" for å kalibrere den.
- Når det er gjort, løft overarmen og tørr pedestal med en tørke.
- Måle prøven:
- Klikk "DNA-50" Sample type.
- Legg 2 µL av DNA-prøve på sokkelen.
- Lavere øvre arm og klikk "Tiltak" for å måle A260/A280 forholdet og konsentrasjonen av prøven.
- Rengjør sokkelen mellom hver kjøre tørke og renset vann.
- Klikk "Print Screen" for å hente dataene.
4. genetiske analyser av mutasjoner
Forsterke målet DNA med PCR4. Utføre PCR i en 25 µL reaksjon blanding med en DNA Polymerase kit (se Tabell for materiale). Tabell 1 viser TTR genet intronic primere.
| genet | Primer sekvens |
| Exon1 | F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3 " R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3 " |
| Exon2 | F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3 " R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3 " |
| Exon3 | F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3 " R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3 " |
| Exon4 | F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3 " R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3 " |
Tabell 1. TTR genet intronic primere. (NCBI referanse sekvensen: NC_000018.10)
- Legge til reagenser i tabell 2 slik 0,2 mL PCR.
| Komponenter | Volum (µL) | Siste konsentrasjon |
| 10 x Buffer | 2.5 | 1 x |
| MgCl2 (25 mM) | 1.5 | 1.5 mM |
| 360 GC Enhancer | 1 | - |
| 360 DNA Polymerase | 0,2 | 2 U/reaksjon |
| dNTP blanding (25 mM hver) | 2 | 2 mM |
| Primer F (10 µM) | 1 | 0,4 ΜM |
| Primer R (10 µM) | 1 | 0,4 ΜM |
| DNA (100 ng) | 2 | |
| PCR-grade vann | 13.8 | - |
| Totalt volum | 25 | - |
Tabell 2. PCR reaksjonen forhold.
- Bland forsiktig og kort sentrifuge på en Borstemmaskin sentrifuge samle alle komponenter på bunnen av røret. Sett røret i en thermocycler.
- Utføre PCR for 30 sykluser. Hver syklus består av et rødsprit skritt for 30 er på 94 ° C, primer annealing for 30 s på 58 ° C og polymerase utvidelse for 45 s ved 72 ° C (se tabell 3).
| Trinn | Temperatur (° C) | Tid | syklus |
| Første rødsprit | 95 | 5 min | 1 |
| DNA rødsprit trinn | 94 | 30 s | 30 sykluser |
| Primer annealing trinn | 58 | 30 s | 30 sykluser |
| Polymerase forlengelsen trinn | 72 | 45 s | 30 sykluser |
| Innlegget forlengelse trinn | 72 | 10 min | 1 |
| Slutten av PCR sykling | 4 | Ubestemt |
Tabell 3. Sykling betingelser for forsterke PCR produkter.
- Validere PCR produktet ved å visualisere med gel geleelektroforese:
- Forbered en 1,2% agarose gel:
- Bland 1,2 g agarose pulver med 100 mL 0,5 x TBE i en mikrobølgeovn bolle. Mikrobølgeovnen i 2 minutter før agarose er fullstendig oppløst. Kjøle ned agarose blandingen til 55 ° C.
- Legg 2 µL av en ethidium bromide løsning (10 mg/mL) til agarose blandingen og bland forsiktig. Hell agarose blandingen i en gel brett til ca 5-7 mm, og deretter legge til comb(s) på plass. Tillate det å stivne (minst 30 min) og fjern forsiktig comb(s).
- Laste prøver og kjøre en agarose gel:
- Plasser gel og brett i geleelektroforese cellen. Fyll geleelektroforese cellen med 0,5 x TBE til gel er dekket.
- Nøye laste 2 µL av en 100 bp DNA stigen (se Tabell for materiale) i ett kjørefelt av gel som molekylær størrelse markør. Last fargestoff/sample blanding (5 µL av PCR produktsammensetning med 1 µL 6 x lasting fargestoff) inn i flere baner.
- Slå på strømforsyningen. Kjør gel for 25 min 100 V.
- Fjerne gel fra geleelektroforese cellen. Visualisere DNA fragmenter under UV-lys i en tenkelig system.
- Forbered en 1,2% agarose gel:
5. DNA sekvensering
- Rense PCR produkter med en kommersiell kit og sekvens kommersielt eller med en automatisk sequencer (se Tabell for materiale).
- Sende nukleotid sekvenser til NCBI BLAST serveren sammenligne nukleotid spørringen til nukleotid databaser10. Når resultatet vises, utføre sekvens justeringer og identifisere forventede mutasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Agarose gel geleelektroforese av to pasienter, og en sunn personlige avslørt av de forventede størrelsene, inkludert et 454 bp PCR produkt for ekson 4 av TTR genet (figur 1).
Figur 1 . Gel geleelektroforese viser PCR forsterket TTR genet. Normal: en frisk person. Lane M: 100 bp DNA stigen som molekylær størrelse markør. Baner 1:246 bp (ekson 1). Baner 2:292 bp (ekson 2). Baner 3:299 bp (ekson 3). Baner 4:454 bp (ekson 4). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Direkte sekvensering avslørte en nukleotid T substitusjon for G i ekson 4 av TTR genet. Denne eks. missense mutasjon resulterte i en alanin til serine substitusjon på aminosyre posisjon 97 i to pasienter. Rekkefølgen chromatograms av disse to pasienter og en frisk person er vist i figur 2.
Figur 2 . Sekvensering av en frisk person (vill-type) og en heterozygote G > T mutasjon i ekson 4 av TTR genet (pasienter 1 og 2). Pilene i chromatograms pasient 1 og pasienten 2 angir to overlappende toppene i forskjellige farger. De to toppene er omtrent halvparten av høyden i resten av sekvensen. Denne heterozygote substitusjon, (G/T) er bekreftet i omvendt rekkefølge, (C/A). Deler av dette tallet er endret fra en figur i våre tidligere publikasjoner5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er to avgjørende skritt i protokollen. Først for å få tilstrekkelig antall hvite blodlegemer, bør en hemodiluted prøven være unngått11. Andre er bruk av riktig PCR primer grunnleggende for å få pålitelige resultater12. Vi brukte Primer-BLAST web verktøyet for å designe primere4,13; minimum 40 base parene på hver side av de fire TTR-exons bør dekkes. Vi har også kjøre BLAST på NCBI å sjekke spesifisitet primerne.
Noen endringer er gjort i DNA utvinning trinn. Først, reduseres mengden av de tre løsningene brukes. Denne endringen også gir en tilstrekkelig mengde DNA og lagrer løsninger. Andre isopropanol eller 100% etanol er de to alternativene i nedbør av DNA14,15. Sammenlignet med etanol, precipitates isopropanol DNA i romtemperatur, noe som reduserer coprecipitation salt15. I tillegg kan lengre nedbør tid fryser temperaturer være nødvendig å maksimere DNA avkastning15. Tredje erstattet TE buffer dobbel destillert vann (ddH2O) å resuspend DNA. DNA forberedelse i denne protokollen brukes for påfølgende PCR slik beskyttelse på lagring ikke er en bekymring. Også, EDTA vil hemme enzym aktivitet når DNA brukes i PCR15.
For en lavere pris og mindre ventetid, ble PCR produktet rensing og sekvensering utført av et bioteknologiselskap. Begrensning i denne protokollen skal de manuelle metodene, inkludert gjentatte sentrifugering trinnene. En automatisert nukleinsyre utvinning systemet er utviklet, og er gunstig for å redusere arbeidstid og øke reproduserbarhet og kvaliteten på resultatene16.
I alle pasienter med amyloid innskudd, skal differensialdiagnose av systemisk amyloidoses utføres. Massespektrometri (MS) kan brukes for å bestemme protein delenhet og klassifisere sykdommen som immunglobulin lys-kjeden amyloidose (AL, med en gjennomsnittlig overlevelse underlegne ATTR)17 eller transthyretin-relaterte amyloidose18, 19, som direkte nedstrøms genetisk testing ikke, spesielt for de pasientene som arvelig ATTR ikke var opprinnelig mistenkt19.
Masse massespektrometri-baserte proteomic analyse er brukt for screening og skrive TTR amyloidose19,20,21. MS alene er imidlertid ikke tilstrekkelig til å utelukke en sykdomsfremkallende mutert pasienter med arvelig ATTR22, fordi noen av variantene av atypisk eller sjeldne TTR ikke kan skilles med baserte analyse av amyloid prøven eller serum prøvene i en kliniske laboratoriet19,23. Videre gjør mulig prøvetaking feil og den ujevne fordelingen av amyloid fibrils kan føre til en falsk negativt vev biopsier5,21,24, nedstrøms proteomic analysen vanskelig. Derfor bør DNA-testing, mest pålitelige testen for ATTR, utføres i de fleste tilfeller ATTR5,22og idiopatisk progressiv axonal Perifer nevropati eller distale symmetrisk smertefulle små-fiber neuropathy 25 , 26.
Andre faktorer som kan knyttet til fenotypiske variasjon for ATTR og guide fremtid retninger inkludere post-translasjonell modifikasjon (PTMs) varianter stede i serum og ATTR fibril komposisjon27,28. Selv om arvelig ATTR er en monogenetic sykdom, er betydelig variasjon selv blant dem med samme mutasjonen eller i samme familie observert27. Genetisk heterogenitet alene unnlater å belyse de ulike utbruddet og patologi av ATTR28. Derfor både genetiske og Proteomikk metoder skal benyttes når disse faktorene tatt i betraktning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Miss Shin-moro Wu for henne hjelp i forsøkene. Denne studien ble støttet av et stipend fra Chang Gung Medical Research Program (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) og IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA-treated tubes | BD | ||
| DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
| dye | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
References
- Planté-Bordeneuve, V., Said, G. Familial amyloid polyneuropathy. The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).
- Planté-Bordeneuve, V., et al. Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study. Journal of Neurology. 264 (2), 268-276 (2017).
- Nichols, W. C., Benson, M. D. Hereditary amyloidosis: detection of variant prealbumin genes by restriction enzyme analysis of amplified genomic DNA sequences. Clinical Genetics. 37 (1), 44-53 (1990).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Hsu, H. C., et al. Phenotypic expressions of hereditary Transthyretin Ala97Ser related Amyloidosis (ATTR) in Taiwanese. BMC Neurology. 17 (1), 178 (2017).
- Barroso, F. A., et al. Long-term safety and efficacy of tafamidis for the treatment of hereditary transthyretin amyloid polyneuropathy: results up to 6 years. Amyloid. 24 (3), 194-204 (2017).
- Rapezzi, C., et al. Disease profile and differential diagnosis of hereditary transthyretin-related amyloidosis with exclusively cardiac phenotype: an Italian perspective. European Heart Journal. 34 (7), 520-528 (2013).
- Mariani, L. L., et al. Genotype-phenotype correlation and course of transthyretin familial amyloid polyneuropathies in France. Annals of Neurology. 78 (6), 901-916 (2015).
- Hammarström, P., Jiang, X., Hurshman, A. R., Powers, E. T., Kelly, J. W. Sequence-dependent denaturation energetics: A major determinant in amyloid disease diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, suppl 4 16427-16432 (2002).
- Johnson, M., Zaretskaya, I., Raytselis, Y., Merezhuk, Y., McGinnis, S., Madden, T. L. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 5-9 (2008).
- Fox, A. J., et al. Next generation sequencing for the detection of actionable mutations in solid and liquid tumors. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Date, Y., Nakazato, M., Kangawa, K., Shirieda, K., Fujimoto, T., Matsukura, S. Detection of three transthyretin gene mutations in familial amyloidotic polyneuropathy by analysis of DNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. Journal of the Neurological Sciences. 150 (2), 143-148 (1997).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
- Buckingham, L., Flaws, M. L. Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications. , F.A. Davis Co. Philadelphia. (2012).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Rapezzi, C., et al. Systemic cardiac amyloidoses: disease profiles and clinical courses of the 3 main types. Circulation. 120 (13), 1203-1212 (2009).
- Gertz, M. A., Dispenzieri, A., Sher, T. Pathophysiology and treatment of cardiac amyloidosis. Nature Reviews Cardiology. 12 (2), 91-102 (2015).
- Vrana, J. A., et al. Clinical diagnosis and typing of systemic amyloidosis in subcutaneous fat aspirates by mass spectrometry-based proteomics. Haematologica. 99 (7), 1239-1247 (2014).
- Nakamura, M., et al. Identification of a new transthyretin variant (Ile49) in familial amyloidotic polyneuropathy using electrospray ionization mass spectrometry and nonisotopic RNase cleavage assay. Human Heredity. 49 (4), 186-189 (1999).
- Ueda, M., Ando, Y. Recent advances in transthyretin amyloidosis therapy. Translational Neurodegeneration. 3, 19 (2014).
- Brown, E. E., et al. Genetic testing improves identification of transthyretin amyloid (ATTR) subtype in cardiac amyloidosis. Amyloid. 24 (2), 92-95 (2017).
- Tasaki, M., et al. Rapid detection of wild-type and mutated transthyretins. Annals of Clinical Biochemistry. 53 (4), 508-510 (2015).
- Plante-Bordeneuve, V., et al. Diagnostic pitfalls in sporadic transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP). Neurology. 69 (7), 693-698 (2007).
- Hsu, J. L., et al. A prospective, observational study of patients with uncommon distal symmetric painful small-fiber neuropathy. PLoS ONE. 12 (9), 0183948 (2017).
- Salvi, F., Pastorelli, F., Plasmati, R., Bartolomei, I., Dall'Osso, D., Rapezzi, C. Genotypic and phenotypic correlation in an Italian population of hereditary amyloidosis TTR-related (HA-TTR): Clinical and neurophysiological aids to diagnosis and some reflections on misdiagnosis. Amyloid. 19, suppl 1 58-60 (2012).
- Suhr, O. B., Lundgren, E., Westermark, P. One mutation, two distinct disease variants: Unravelling the impact of transthyretin amyloid fibril composition. Journal of Internal Medicine. 281 (4), 337-347 (2017).
- Vilà-Rico, M., et al. Quantitative analysis of post-translational modifications in human serum transthyretin associated with familial amyloidotic polyneuropathy by targeted LC-MS and intact protein MS. Journal of Proteomics. 127, 234-246 (2015).
