هذه الأسفار جزيء واحد في الموقع بروتوكول التهجين هو الأمثل لتقدير عدد جزيئات الحمض النووي الريبي في مهدها الخميرة أثناء النمو الخضري والانقسام الاختزالي.
جزيء واحد الأسفار في الموقع التهجين (سمفيش) تقنية قوية لدراسة التعبير الجيني في الخلايا المفردة بسبب قدرتها على كشف والعد الفردي من جزيئات الحمض النووي الريبي. مكملة لأساليب العميق القائم على التسلسل، سمفيش يوفر معلومات حول خلية إلى الاختلاف في وفرة نسخة وإضفاء الطابع المحلي على سوبسيلولار الحمض النووي الريبي معين. في الآونة الأخيرة، استخدمنا سمفيش لدراسة التعبير عن الجين NDC80 أثناء الانقسام الاختزالي في مهدها الخميرة وفي أي محضر اثنين isoforms موجودة و isoform نسخة قصيرة له التسلسل بأكمله مشتركة مع إيسوفورم طويلة. تحديد isoform محضر كل ثقة، الأمثل البروتوكولات المعروفة سمفيش وحصل على اتساق عالية ونوعية البيانات سمفيش للعينات التي اكتسبت خلال مهدها الخميرة الانقسام الاختزالي. هنا، يمكننا وصف هذا البروتوكول الأمثل، المعايير التي نستخدمها لتحديد ما إذا كان يتم الحصول على الجودة العالية للبيانات سمفيش، وبعض النصائح لتنفيذ هذا البروتوكول في سلالات الخميرة وظروف النمو الأخرى.
التنظيم الديناميكي للتعبير الجيني محركات تنمية الكائن حي، فضلا عن استجابتها للإجهاد البيئي، والعدوى، والتغيرات في التمثيل الغذائي. الدراسات التي تركز على تنظيم النسخي تعتمد على التكنولوجيات التي تقيس وفرة الجيش الملكي النيبالي. يتم استخدام أحد هذه الأساليب، ووصف الأسفار جزيء واحد في الموقع التهجين (سمفيش)، للكشف عن كل جزيئات الحمض النووي الريبي في الخلايا المفردة1،2. هذا الأسلوب يتيح قياس التغير خلية إلى خلية في التعبير الجيني وتصميم تعريب الجيش الملكي النيبالي داخل الخلايا.
في الأسلوب سمفيش الأكثر استخداماً، يتطلب الكشف جزيء الحمض النووي الريبي الفردية المسابير الحمض النووي قصيرة متعددة (غالباً ~ 48 20-مير المسابير) التي تعتبر مكملة لهدف الجيش الملكي النيبالي وهي مترافق بصبغة الفلورسنت نفس. نتائج ملزمة للتحقيق الفلورسنت واحدة في إشارة ضعيفة، ولكن الإشارة من فرقة تحقيقات جميع قوية. هذه الميزة بتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء إلى حد كبير لأنه على الرغم من أن تحقيق واحد يمكن أن يحمل ملزم خارج الهدف، مثل هذه الإشارات من المتوقع أن تكون ضعيفة للغاية مقارنة بالهدف جزيء الحمض النووي الريبي3. ضمن خطأ الكشف، يمكن عد عدد جزيئات الحمض النووي الريبي والمقارنة عبر مختلف ظروف النمو وبين طفرات مختلفة.
منذ تطورها الأولى، تم تكييف سمفيش لدراسة الجوانب المختلفة للجينات التعبير4، مثل النسخ استطالة1،2،5،6، النسخي انفجار7 الربط , 8 , 9والتعبير الجينية داخل الخلايا10،،من1112، والجيش الملكي النيبالي التعريب13،،من1415. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمنا هذا الأسلوب لدراسة التعبير عن isoforms نسخة اثنين من الجينات نفسها، التي isoform محاضر جلسات قصيرة (NDC80ORF) قد التسلسل بأكمله مشتركة مع إيسوفورم طويلة (NDC80لوتي )16. بشكل فريد isoforms مرناً اثنين، استخدمنا مسبار مجموعتين: مجموعة واحدة محددة لتسلسل فريد NDC80لوتي، ومجموعة أخرى، مترافق بصبغة الفلورسنت آخر، يربط منطقة مشتركة من isoforms اثنين. NDC80لوتي الجيش الملكي النيبالي هو تحديد كبقعة كولوكاليزيد مع كلا إشارات مضيئة، بينما NDC80ORF الجيش الملكي النيبالي هو الذي يحتوي على إشارة فقط من مجموعة التحقيق المشتركة. نظراً لأن عدد من NDC80ORF النصوص ويحسب باستخدام أسلوب “طرح”، كفاءة عالية من التهجين المسبار ونسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية ضرورية لتحديد البقع سمفيش ثقة وتقليل الخطأ نشر.
وتصف هذه الورقة على بروتوكول أمثل لأداء سمفيش في مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae. في هذا البروتوكول وعدد الخلايا، ووقت التثبيت، وقت الهضم، والهضم المخزن المؤقت، وتركيز التحقيق والتهجين المخزن المؤقت المستخدم للتجارب سمفيش كانت الأمثل ل SK1 سلالة خلفية S. cerevisiae تمر الخضري النمو أو الانقسام. ومع ذلك، نلاحظ أيضا في هذه المخطوطة: (1) الطريقة التحقق من جودة البيانات سمفيش بعد الحصول على الصور، والخطوات (2) الواردة في البروتوكول التي قد تتطلب التحسين الإضافي للخلفيات سلالة مختلفة وظروف نمو.
بروتوكول المعروضة هنا مشتقة من الأخرى سمفيش نشرت البروتوكولات2،3،21،،من2223، وهو على وجه التحديد الأمثل لخلفية سلالة الخميرة SK1. وشملت المعلمات الأمثل عدد الخلايا، ومدة التثبيت، سرعة الطرد المركزي ومدة، ومدة الهضم، الهضم المخزن المؤقت، تركيز التحقيق، والتهجين المخزن المؤقت. كانت ليست الأمثل المعلمات الأخرى مثل درجة الحرارة التهجين ومدتها. في هذا القسم، ونحن نشاطر بعض الملاحظات التي تساعد على التكيف مع هذا البروتوكول لأي خلفية سلالة الخميرة وشروط النمو للفائدة.
جدار خلية الخميرة مهدها هو أحد التحديات الكبرى ضد الحصول على صور عالية الجودة سمفيش في مهدها الخميرة للخلية جدار يمنع اختراق التحقيق. الهضم غير مكتملة للجدار خلية زيمولياسي يؤدي إلى التهجين غير فعالة من تحقيقات وارتفاع خلية إلى تقلب في إشارة. غير أن الهضم الإفراط يمكن جعل الخلايا هشة جداً، المؤدية إلى كبير الخلية الخسارة خلال خطوات الغسيل والخلية في انفجار أثناء إعداد الشرائح للتصوير. ومن ثم، تحسين مدة الهضم أمر حاسم. نوصي بإجراء تجربة رائدة سمفيش بهضم نفس العينة لكميات مختلفة من الوقت. وفي حالتنا، حصلنا على البيانات سمفيش أفضل إذا توقفنا في الهضم عندما أصبح ~ 80% خلايا غير الانكسار. عادة، يمكن هضمها سلالات متحولة وراثية مختلفة لنفس الشرط النمو، مع توقيت مماثلة. ومع ذلك، تختلف مدة الهضم عند المقارنة بين ظروف نمو مختلفة ومراحل مختلفة من الانقسام في مهدها الخميرة. حالما يتم تحديد التوقيت، نوعية سمفيش استنساخه. ملاحظة للحصول على سلالات متحولة مع توليف جدار الخلية المعيبة و/أو تكوين، قد يتسنى إكمال الهضم في أقل من 15 دقيقة استخدام مجموعات مختلفة من زيمولياسي قد أيضا قليلاً تغيير توقيت الهضم.
مطلوب تركيز التحقيق الأمثل لتحقيق نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية. نحن تصميم وشراء لدينا تحقيقات سمفيش تجارياً. يجب أن يكون جيد المسابر (غالباً 20-الصرف) نسبة مئوية من GC تتراوح بين 35 في المائة إلى 45 في المائة، الحد أدنى لتباعد 2 قاعدة أزواج بين المجسات ومنخفض ه. كنا مسبار المستندة إلى ويب مصمم من الشركة المصنعة لإنشاء قائمة تحقيقات، وإذا كانت هناك تحقيقات كافية للاختيار من بينها، سوف نستخدم الخوارزمية الانفجار في قاعدة بيانات الجينوم Saccharomyces إلى القضاء التحقيقات مع أكثر من 17 زوج قاعدي يتداخل مع المناطق الأخرى الجينوم. اخترنا أكثر فوتوستابل نيون صبغ (CAL فلور 590) لمجموعة التحقيق التي أنيالس إلى منطقة فريدة من نوعها في NDC80لوتي (CF 590) لأن في هذه المجموعة، كان أقل من عدد المجسات التي تستوفي جميع المعايير المذكورة أعلاه (20 المسابير) الحد الأدنى الذي أوصت به الشركة المصنعة (المسابر ~ 25). بعد إعادة تشكيل الحل مسبار اتباع إرشادات الشركة المصنعة، قدمنا 01:10 إضعاف الحل الأسهم وتخزينها في حل المخفف في مختبرين 5 ميليلتر في ˚C-20. واستخدمت كل قاسمة مرة واحدة فقط. للتحسين، واحدة ينبغي أن تجعل المسلسل تخفيف من 01:10 إضعاف الحل واختبار التركيز التي تعطي أفضل نسبة الإشارة إلى الضوضاء. ونحن نوصي بجعل سلسلة تمييع 1: 250، 1: 500، 1: 1000، و 1:2000 من المخزون الأصلي. وفي حالتنا، أدى عامل تخفيف 1: 500 أفضل نسبة الإشارة إلى الضجيج، لمجموعات التحقيق كل CF 590 و 670 ف.
وقت التثبيت الأمثل أيضا أهمية حاسمة لنجاح سمفيش في مهدها الخميرة. نحن العثور على هذا التثبيت بين عشية وضحاها في 4 ˚C بدلاً من إصلاح في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة، تحسنت بشكل ملحوظ الاتساق والجودة من نتائج العينات هو سمفيش. على الرغم من أننا لم تختبر كيف بين عشية وضحاها قد تؤثر على التثبيت عينات الخضري، عملت التثبيت في درجة حرارة الغرفة جيدا لهذا الشرط النمو. وهكذا، على النحو الأمثل في بروتوكول سمفيش لسلالات جديدة أو ظروف النمو، نوصي بدءاً من وقت التثبيت قصيرة في درجة حرارة الغرفة وزيادة فترة التثبيت إذا تم مصادفة تقلب عالية لإشارة.
مقارنة مع أخرى البروتوكولات المنشورة3،،من2223، لدينا بروتوكول يستخدم مثبط رناسي فكتوريا خلال الهضم وأعلى تركيز لفكتوريا خلال التهجين. إضافة فكتوريا في هاتين الخطوتين تحسين اتساق النتائج سمفيش، وربما من الأفضل الحفاظ على جزيئات الحمض النووي الريبي ضد نوكلاس النشاط الذي يمكن الأخذ بمزيج زيمولياسي (الإنزيم هو تنقيته من مستخلصات النفط الخام وقد تحتوي على رناسي الملوثات). وبالتالي، نوصي باستخدام مبلغ فكتوريا كما وردت في البروتوكول أو تركيزات أعلى حتى من فكتوريا للتحسين.
يمكن أن يكون جزء كبير من الخلايا فقدت خلال خطوات الغسيل في “المخزن المؤقت ب” واغسل ميثلامين المخزن المؤقت. لتقليل الخسائر في الخلية، واحد يمكن أن تزيد من سرعة الطرد المركزي. وفي حالتنا، باستخدام سرعة عالية (21,000 س ز) إلى بيليه لدينا عينات خلال “ب المخزن المؤقت” يغسل فقدان الخلية انخفاضا كبيرا. ومع ذلك، تصبح الخلايا هشة للغاية بعد الهضم زيمولياسي، ولذلك لا يوصي بتغيير سرعة الطرد المركزي. بدلاً من ذلك، فإننا نقترح استخدام أنابيب التصاق منخفضة من “الولايات المتحدة الأمريكية العلمية”، التي تساعد إلى حد كبير بيليه الخلايا أثناء يغسل في المخزن المؤقت للغسيل ميثلامين. عموما، يمكن استمرار تولد لدينا بروتوكول أحادي الطبقة الكثيفة ما يكفي لتصوير كفاءة الخلايا. بشكل عام، ينبغي أن تسفر عن 7 الحقول لعرض > 130 الخلايا مناسبة للقياس الكمي.
وأخيراً، من المهم تحديد بارامترات الأمثل والنواتج المطلوبة من تحليل الصور. عادة للكشف عن بقع سمفيش، برامج تحليل المنشورة تصفية صور raw باستخدام نواة الضبابي لإزالة الإشارات الخلفية، وأطلب من المستخدمين لتحديد نسبة الإشارة إلى الضوضاء لاستخدام لكل مجموعة من الصور2،17. ولسوء الحظ، لا توجد حاليا معيار واحد الذي يتم تحديد المعلمات الصحيحة، وحتى بعض الاختبارات التجريبية لهذه الإعدادات المختلفة ضروري. لتعيين معلمات اللازمة لكل خطوة من هذه الخطوات، يحتاج المرء تكراري مجموعات مختلفة من معلمات الإدخال والتحقق من مدى يطابق النتائج التي تم الحصول عليها من كل مجموعة من العد اليدوي في بعض الخلايا الممثل. حالما يتم العثور على مجموعة واحدة من المعلمات، يمكن استخدامه بالنسبة للصور التي تم الحصول عليها على الرغم من ظروف النمو المختلفة والخلفيات الوراثية.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن اختبار واحد إذا كان الإسقاط كحد أقصى-كثافة الصور سمفيش يمكن أن يؤديها قبل القياس الكمي22. هذه الخطوة يبسط خوارزمية الكشف الموضعي، ويقلل كثيرا من وقت التصوير، ولو على حساب بعض المعلومات يمكن أن تكون مفيدة حول النقاط الفردية، مثل التعريب سوبسيلولار بهم. وفي حالتنا، كان عدد مرناً الجزيئات التي تنتجها الجينات NDC80 منخفضة بما يكفي أن البقع جيدا تم فصل بعد هذا التجهيز (ليس من غير المألوف للنصوص في مهدها الخميرة3،7). في الحالات التي يكون فيها تحليل كولوكاليزيشن الحرجة، يحتاج خط الأنابيب التحليل تحديد موقع كل بقعة سمفيش في كل قناة لتقييم كولوكاليزيشن. اعتماداً على الأسئلة المحددة التي يجري طلب، معلومات أخرى مثل الكثافة من كل بقعة قد تحتاج أيضا إلى أن تستخلص من خط الأنابيب لمزيد من التحليل. أمثلية المفتاح خطوات في البروتوكول وأنابيب تحليل الصورة أمر حاسم في الحصول على الجودة العالية للبيانات سمفيش لدراسة مسألة الفائدة.
The authors have nothing to disclose.
ونحن نشكر دودسون Anne وستيفاني هاينريش لإسداء المشورة بشأن كيفية تحسين بروتوكول سمفيش، دارزاكق كزافييه للمساعدة في تحليل منهاج العمل، هوانغ هاي لاقتراحات بشأن التحليل الإحصائي. هذا العمل كان تدعمها الأموال من مارس الدايمات (5-FY15-99) والخيرية بيو (00027344)، مؤسسة أبحاث السرطان رونين ديمون (35-15) وغلين مؤسسة EÜ، وجبهة الخلاص الوطني الدراسات العليا البحوث زمالة منحة رقم 1106400 تأيين لجيمي كارتر.
BSA, RNase-free (50 mg/mL) | Ambion | AM2616 | Store at -20 °C. |
Catalase | Sigma | C3515 | Store at 4 °C for short-term. Vortex before use. |
DAPI | Sigma | D9564 | Store at -20 °C after reconstitution in water. Protect from light. |
50% Dextran Sulfate | Milli Pore | S4030 | Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience. |
E. coli tRNA | Sigma | R4251 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water. |
Ethanol (100%, 200 proof) | various | Flammable. | |
37% Formaldehyde | Fisher | F79-500 | Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution. |
Formamide | Ambion | AM9342 | Store at 4 °C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution. |
Glucose | various | Store at 4 °C after dissolving in nuclease-free water. | |
Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5. |
Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | Store at room temperature. |
Potassium phosphate (monobasic and dibasic) | various | Store at room temperature. | |
Probe library, diluted in TE, pH 8.0 | Biosearch Technologies | Store at -20 °C in aliquots (5 µL) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light. | |
Sorbitol | various | Store at room temperature. | |
20X SSC | Ambion | AM9763 | Store at room temperature. |
TE, pH 8.0 | Ambion | AM9849 | Store at room temperature. |
1 M Tris, pH 8.0 | Ambion | AM9856 | Store at room temperature. |
Trolox | Sigma | 238813 | Store at -20 °C in aliquots. |
200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | NEB | S1402S | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer. |
Zymolyase 100T | MP Biomedicals | 08320932 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water. |
Low-adhesion tubes | USA Scientific | 1415-2600 | Store at room temperature. |