Hybridation In Situ de Fluorescence de la molécule unique (smFISH) analyse en bourgeonnement levure croissance végétative et la méiose

Summary

Cette seule molécule fluorescence in situ hybridation protocole est optimisé afin de quantifier le nombre de molécules d’ARN dans la levure de bière au cours de la méiose et de la croissance végétative.

Abstract

Seule molécule fluorescence in situ hybridation (smFISH) est une technique puissante pour étudier l’expression des gènes dans des cellules individuelles en raison de sa capacité à détecter et compter les différentes molécules d’ARN. Complémentaire à la profondes méthodes basées sur le séquençage, smFISH fournit des informations sur la variation de cellule-cellule dans l’abondance de la transcription et la localisation subcellulaire d’un ARN donné. Récemment, nous avons utilisé smFISH pour étudier l’expression du gène NDC80 au cours de la méiose chez la levure de bière, dans lequel deux transcription isoformes existent et l’isoforme de transcription court a sa séquence entière partagée avec l’isoforme longue. Déterminer en toute confiance chaque isoforme de la transcription, nous avons optimisé des protocoles connus smFISH et obtenu haute consistance et la qualité des données de smFISH pour les échantillons acquis au cours du bourgeonnement levure la méiose. Nous décrivons ici, ce protocole optimisé, les critères que nous utilisons pour déterminer si la qualité des données de smFISH est obtenue et quelques conseils d’application du présent protocole dans d’autres souches de levures et de conditions de croissance.

Introduction

Régulation dynamique de l’expression des gènes entraîne le développement d’un organisme, ainsi que sa réponse au stress environnemental, l’infection et des changements dans le métabolisme. Les études qui portent sur la régulation transcriptionnelle fondés sur les technologies qui mesurent l’abondance RNA. Une de ces méthodes, appelée seule molécule fluorescence in situ hybridation (smFISH), est utilisée pour la détection de molécules d’ARN individuels dans des cellules individuelles^1,2. Cette méthode permet la mesure de la variabilité de la cellule-cellule dans l’expression des gènes et de la détermination de la localisation intracellulaire de l’ARN.

Dans la technique de smFISH plus couramment utilisés, détection d’une molécule d’ARN individuelle nécessite plusieurs sondes d’ADN courtes (souvent ~ 48 20-mer sondes) qui sont complémentaires à l’ARN cible et sont conjugués à la même colorant fluorescent. Fixation d’une seule sonde fluorescente résulte en signal faible, mais le signal provenant de l’ensemble de toutes les sondes est robuste. Cette fonctionnalité améliore considérablement le rapport signal-bruit, parce que même si une seule sonde peut exposer la liaison hors cible, tel signal devrait être très faible par rapport à celle de la cible ARN molécule³. Au sein de l’erreur de détection, le nombre de molécules d’ARN peut être compté et comparé entre les différentes conditions de croissance et entre différents mutants.

Depuis son premier développement, smFISH a été adapté pour étudier divers aspects de l' expression génique⁴, par exemple transcription élongation^1,2, épissage^5,6, transcription éclatement^{7 , 8 , 9}, expression allélique intracellulaire^10,11,12et RNA localization^13,14,15. Récemment, nous avons utilisé cette méthode pour étudier l’expression des deux isoformes de la transcription du même gène, dans lequel l’isoforme de transcription court (NDC80^ORF) a sa séquence entière partagée avec l’isoforme longue (NDC80^luti )¹⁶. Pour identifier de façon unique les deux isoformes de l’ARNm, nous avons utilisé deux ensembles de sonde : un jeu est spécifique à la séquence unique de NDC80^luti, et l’autre jeu, conjugué à un autre colorant fluorescent, se lie à la région commune des deux isoformes. Le NDC80^luti RNA est identifiée comme une tache colocalized avec les deux signaux fluorescents, tandis que le NDC80^ORF ARN est celui qui contient seulement le signal provenant de l’ensemble commun de la sonde. Puisque le nombre de la NDC80^ORF transcriptions est calculée par une méthode de « soustraction », rendement élevé de l’hybridation de la sonde et un rapport signal sur bruit élevé sont nécessaires d’identifier smFISH taches avec confiance et de réduire les erreurs propagation.

Cet article décrit un protocole optimisé pour effectuer des smFISH dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Dans ce protocole, le nombre de cellules, de temps de fixation, temps de digestion, digestion tampon, concentration de sonde et hybridation tampon utilisée pour les expériences de smFISH ont été optimisées pour le SK1 souche fond de S. cerevisiae subir végétatif croissance ou la méiose. Cependant, nous notons également dans ce manuscrit : (1) la méthode pour vérifier la qualité des données de smFISH après l’acquisition de l’image et (2) la procédure décrite dans le protocole qui peuvent nécessiter une optimisation supplémentaire pour les arrière-plans de souche différente et les conditions de croissance.

Protocol

Remarque : Tous les tampons et les supports utilisés dans le présent protocole sont répertoriés dans le tableau 1. Les informations sur le fournisseur pour les réactifs sont répertoriées dans la Table des matières.

Jour 1/jour 1-2 :

Remarque : Pour la culture végétative, la croissance de cellules à une OD₆₀₀ de 0,4 à 0,6 dans un milieu privilégié. Pour la culture méiotique, induire des cellules subissent la méiose à l’aide d’une méthode préférée (généralement mise en culture dans un OD₆₀₀ de 1,85).

1. la Fixation et la Digestion de l’échantillon

1. Fixer un total de ~3.5 OD₆₀₀ des cellules à 3 % de formaldéhyde.
   1. Pour la culture végétale, ajouter 5,52 mL de culture à 480 µL de 37 % de formaldéhyde dans les tubes coniques 15 mL.
   2. Pour la culture méiotique, ajouter 1840 µL de culture à 160 µL de 37 % de formaldéhyde dans les tubes de microcentrifuge de 2 mL. Inverser ~ 5 fois pour mélanger.
      ATTENTION : Le formaldéhyde est toxique. Manipuler et l’éliminer conformément aux règlements institutionnels.
2. Placer les tubes sur un tambour de rouleau à température ambiante pendant 20 min. Pour échantillons méiotiques, après fixation à température ambiante pendant 20 min, continuent de fixation durant la nuit à 4 ° c, tournant.
   Remarque : La fixation d’une nuit ou plus augmente la reproductibilité et la qualité des données smFISH obtenues pour les échantillons de la méiose. Temps de fixation doit être optimisé.
3. Alors que les échantillons sont fixation, décongelez 200 mM vanadyle ribonucléosides Complexes (RVC) à 65 ° c pendant au moins 10 min.
4. Préparer le mélange maître digestion dans un tube de 15 mL : pour 1 échantillon, mélanger 425 µL de tampon B 40 µl de 200 mM VRC (chauffé à 65 ° c) ; pour 5 échantillons, mélanger 2125 µL de tampon B avec 200 µL de 200 mM VRC (chauffé à 65 ° c). Vortex ~ 5 s pour tout remettre en suspension le VRC avant d’ajouter au mélange maître, qui apparaîtra vert brunâtre clair après addition de VRC.
   NOTE : Ajout de VRC durant la digestion améliore la cohérence des résultats smFISH, potentiellement en inhibant le contaminant nucléase introduit par le mélange de zymolyase, qui est purifié à partir d’extrait brut. Le montant nécessaire à cette étape de VRC doit être optimisé.
5. Pour les échantillons végétatives, centrifuger les tubes à ~ 1057 x g pendant 3 min. Pour les échantillons méiotiques (après fixation au jour le jour), centrifuger à 21 000 x g pendant 1,5 min. décanter ou aspirer le surnageant pour déchets de formaldéhyde.
   Remarque : Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées à température ambiante.
6. Remettre en suspension les cellules dans 1,5 mL de froid tampon B par pipetage de haut en bas ou en inversant les tubes et pichenette pour mélanger. Transférer les échantillons végétatives aux tubes de 2 mL après remise en suspension.
7. Centrifuger à 21 000 x g pendant 1,5 min. Retirer la majeure partie du liquide par aspiration sous vide ou en pipettant également, laissant derrière eux de ~ 100 µL.
8. Remettre en suspension les cellules de 1,5 mL de froid tampon B.
9. Centrifuger à 21 000 x g pendant 1,5 min. Retirer la majeure partie du liquide par aspiration sous vide ou en pipettant également, laissant derrière eux de ~ 100 µL.
10. Remettre en suspension les cellules dans 1,5 mL de froid tampon B. Centrifuger à 21 000 x g pendant 1,5 min. aspirer le liquide complètement par le vide ou en pipettant également.
11. Remettre en suspension les cellules en 425 µL du mélange principal de la digestion et brièvement vortex pour remettre en suspension. Ajouter 5 µL de 100 t zymolyase de 10 mg/mL dans chaque tube.
    NOTE : Vortex le zymolyase chaque fois avant d’ajouter aux tubes. Ajouter zymolyase dans chaque tube individuellement, plutôt que d’ajouter au mélange maître. Les deux étapes aident à maintenir la cohérence de la digestion chez les tubes parce que zymolyase précipite rapidement.
12. Vortex 2-3 s pour mélanger. Placer les tubes sur un tambour de rouleau et digérer à 30 ° c pendant 15 à 30 min. Pour les cellules végétatives et les premiers stades de la méiose, cela prend habituellement environ 15 min, et pour la prophase méiotique et divisions méiotiques, cela prend habituellement environ 30 min.
    Remarque : Vérifiez le microscope toutes les 5 min après 15 min et arrêter la digestion lorsqu’environ 80 % des cellules apparaissent opaques et non réfraction. Partir de ce moment, les cellules sont très fragiles. Gérer les cellules doucement et évitez d’utiliser aspiration intra-utérine ou Vortex.
13. Centrifuger les tubes à ~ 376 x g pendant 3 min. Retirer le liquide complètement en pipettant également.
14. Resuspendre doucement les cellules avec 1 mL de tampon B en pipettant également monter et descendre 1 ou 2 fois pour mélanger.
15. Centrifuger les tubes à ~ 376 x g pendant 3 min. Retirer tampon B liquide de pipetage. Doucement remettre en suspension les cellules dans 1 mL d’éthanol à 70 % (dilué avec de l’eau exempte de RNase).
16. Incuber 3,5 à 4 heures à température ambiante.

2. l’hybridation

1. Ramener la formamide à température ambiante (pour 50 mL partie aliquote, il faut environ 30 min au bain-marie).
   Remarque : Ne pas ouvrir la bouteille de formamide jusqu'à ce que la bouteille atteigne la température de la pièce pour éviter l’oxydation du formamide.
   ATTENTION : Le Formamide est toxique. Manipuler et l’éliminer conformément aux règlements institutionnels.
2. Préparer le tampon de lavage 10 % formamide dans un tube conique de 15 mL.
3. Centrifuger les tubes à ~ 376 x g pendant 3 min. Retirer 500 µL d’éthanol à 70 % de pipetage. Doucement pipette up et down pour remettre en suspension les cellules restantes et ensuite transférer les cellules des tubes de faible adhérence.
   NOTE : Utilisant des tubes à basse adhérence grandement réduit la perte de cellules pendant les lavages ultérieurs.
4. Centrifuger les tubes à ~ 376 x g pendant 3 min. retirer tout l’éthanol par pipetage.
5. Ajouter 1 mL de tampon de lavage 10 % formamide et doucement pipette haut et en bas 2 ou 3 fois pour remettre les cellules en suspension.
6. Laissez les cellules de s’asseoir à la température ambiante pendant environ 20 min pendant la préparation de la Solution d’hybridation. Pour 1 échantillon, mélanger 50 µL de tampon d’hybridation (température ambiante), 5 µL de 200 mM VRC (chauffé à 65 ° c) et 1 µL de chaque sonde (200 nM final). Pour 5 échantillons, mélangez 250 µL de tampon d’hybridation (température ambiante), 25 µL de 200 mM VRC (chauffé à 65 ° c) et 5 µL de chaque sonde (200 nM final).
   1. Décongeler le tampon d’hybridation (congelés à-20 ° c) à température ambiante avant d’ouvrir le tube pour éviter l’oxydation du formamide.
   2. Après avoir ajouté le 200 mM RVC, Vortexer pendant 5-10 s avant d’ajouter les sondes, qui sont conçus et achetés dans le commerce et reconstitués selon les instructions du fabricant.
   3. Si les deux sondes sont conjointement mis en incubation, ajouter 1 µL de la 01:10 dilution de la sonde #1, ainsi que 1 µL de la 01:10 dilution du stock sonde #2, faire une dilution finale de ~ 1/500 pour chaque sonde. La concentration nécessaire pour le meilleur rapport de signal-bruit doit être optimisé (voir Discussion pour plus de détails).
7. Centrifuger les échantillons à ~ 376 x g pendant 3 min. Retirer le liquide surnageant dans les déchets dangereux en pipettant également.
8. Ajouter au moins 50 µL de Solution d’hybridation dans chaque tube. Feuilleter les tubes à mélanger.
9. Incuber à 30 ° c sur un tambour de rouleau au moins 16 heures dans l’obscurité.

2/jour 3

3. laver et imagerie

1. Ramener la formamide à température ambiante.
2. Préparer 10 % formamide tampon de lavage (FWB) dans un tube conique de 15 mL.
3. Retirer les tubes de l’enrouleur de rouleau et rangez-les dans une boîte recouvert de papier pour protéger de la lumière.
4. Centrifuger les échantillons à ~ 376 x g pendant 3 min. Retirer le liquide surnageant dans les déchets dangereux en pipettant également.
5. Remettre en suspension dans 1 mL de 10 % FWB par pipetage doucement haut et en bas 2 - 3 fois.
6. Incuber à 30 ° c pendant 30 min (non rotative) dans la zone couvertes de papier.
7. Centrifuger les échantillons à ~ 376 x g pour 3 min. Retirez le surnageant de déchets dangereux en pipettant également et de laisser ~ 50 µL.
8. Pendant ce temps, préparer DAPI/FWB dans un tube conique de 15 mL : pour 1 échantillon, se mêlent 1000 µL de tampon de lavage 10 % formamide 1 µL de 5 mg/mL DAPI. Pour 10 échantillons, mélanger 10 mL de tampon de lavage 10 % formamide avec 10 µL de 5 mg/mL DAPI. Remettre en suspension dans 1 mL de DAPI/FWB par pipetage doucement haut et en bas 2 - 3 fois.
9. Incuber à 30 ° c pendant 30 min (non rotative) dans la zone couvertes de papier.
10. Décongeler les réactifs anti-eau de Javel sur la glace.
11. Centrifuger les échantillons à ~ 376 x g pendant 3 min. Retirer le surnageant complètement en pipettant également. Le cas échéant, centrifuger à nouveau pour retirer tout le liquide surnageant.
12. Pour les échantillons qui ne sont pas immédiatement imagés, resuspendre le culot dans 50 µL de tampon de GLOX sans enzymes. Pipette de haut en bas 3 ou 4 fois pour mélanger.
    1. Conserver tous les échantillons unimaged dans la zone couvertes de papier à 4 ° c jusqu’au moment d’image. Lorsque vous êtes prêt pour l’image, centrifuger les échantillons à ~ 376 x g pendant 2 min et retirez le surnageant complètement en pipettant également. Resuspendre dans GLOX avec enzymes comme ci-dessous.
13. Pour les échantillons étant imagés immédiatement, ajouter 15 à 20 µL de tampon GLOX avec des enzymes. Doucement pipette de haut en bas pour mélanger.
    Remarque : Le volume ajouté peut varier selon la taille du culot cellulaire. Nous vous recommandons resuspendant le culot dans 15 µL de tampon GLOX avec des enzymes et vérifier la densité cellulaire sur le microscope. Si les cellules sont trop denses (cellules agglutinées les unes sur les autres), ajoute le tampon GLOX supplémentaire avec des enzymes. Si les cellules sont trop rares, centrifuger l’échantillon et supprimer ~ 5 µL de tampon.
14. Pipette 5 µL sur une lamelle couvre-objet (18 mm x 18 mm, n ° 1) et de mettre la lamelle couvre-objet sur une diapositive.
15. Mettre une lingette de laboratoire sur le dessus de la diapositive où se trouve la lamelle. Appuyez doucement sur la lingette de laboratoire pour définir la diapositive (voir liquide se détacher de ses quatre bords de la lamelle).
16. Transférer la lame à la salle du microscope dans une boîte recouverte de papier d’aluminium.
17. Image en utilisant un microscope à fluorescence de grand champ à fort grossissement (X 60-100) et de forte ouverture numérique.
    Remarque : Afin de recueillir le nombre maximal de photons émis par les sondes smFISH, microscopes confocaux sont déconseillées, car elles limitent considérablement la quantité de lumière à collecter. Ici, les données ont été recueillies sur un microscope équipé d’une 100 X, objectif 1.4 de NA, à l’aide de filtres CY5 (EX632/22, EM679/34) photographié à 1,3 s, 100 % T ; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1,3 s, 100 % T ; et DAPI (EX390/18, EM435/48), 0,05 à 0,1 s, T. 32-50 % Une image de référence de champ lumineux devrait également être acquise. Acquérir des tranches de 15 à 25 avec une taille d’étape de 0,1 à 0,2 µm, d’entièrement au-dessous de la mise au point du champ de vision tout à fait indiqué ci-dessus, afin de vous assurer que toutes les taches de RNA sont prises en compte.

4. image Analysis

1. Analyser les données de smFISH avec smFISH publié des outils d’analyse tels que poissons-quant¹⁷ et StarSearch², ou avec des programmes sur mesure, selon les besoins de l’expérience.
   Remarque : Un pipeline bonne analyse devrait permettre aux utilisateurs de déterminer un seuil pour séparer les taches de RNA vrais de l’arrière-plan et statistiques telles que les coordonnées X, Y et Z de (facultatives) et l’intensité de chaque tache, le nombre de places dans chaque cellule de sortie et éventuellement des paramètres d’ajustement comme un moyen de filtrer les fausses détections.

Representative Results

Pour évaluer la façon dont le protocole smFISH travaillé (indiqué dans la Figure 1), nous avons conçu un ensemble de 54 sondes que la trame de lecture ouverte du gène NDC80 de tuiles (Figure 2 a, haut). La sonde placée à l’extrémité 5' le plus est dénommée Probe 1 ; celle qui suit, sonde 2 ; et la troisième, sonde 3, etc.. Les 27 sondes assignés un impair nombre (sonde 1, 3, 5...) sont tous conjugués à la teinture fluorescente CAL Fluor 590 (CF590) ; et les 27 sondes assigné un nombre pair (2 de Probe, 4, 6...), conjugué à la teinture fluorescente Quasar 670 (Q670). Par conséquent, ces ensembles de sondes alternatif sont souvent dénommés « impair/pair » sondes. Après hybridation, les deux ensembles de sonde doivent étiqueter la même transcription.

Après détection spot, nous avons utilisé quelques mesures pour juger de la qualité de l’ensemble de données smFISH. Le premier était le degré et la qualité de colocalisation des sondes impair/pair. Dans notre cas, 88 % de tous les endroits smFISH épididymaire (Figure 2 a et 2 b), avec plus de 95 % des taches jumelés au sein de 2 pixels de l’autre (Figure 2, appariés), qui se trouve à la valeur attendue compte tenue de tout chromatique et détection aberration entre les deux canaux fluorescents. Par comparaison, moins de 10 % des taches non appariés a une distance plus proche voisin de moins de 2 pixels, montrant qu’il est peu probable d’identifie par erreur une paire spot (Figure 2). Les 12 % de taches non appariés ont été également réparties entre les deux canaux (Figure 2 b, comparez CF590 uniquement avec Q670 uniquement) ; et ainsi, nous avons conclu que pour ce gène 2,4 Ko avec un éventail d’expression entre zéro à 45 transcriptions par cellule, ~ 94 % des molécules d’ARN ont été correctement détectés dans chaque canal fluorescent. Si le protocole de smFISH ont été sous-optimal, on observerait (1) une plus grande fraction des taches smFISH avec un seul des deux signaux fluorescents (non-épididymaire), et/ou des cellules (2) avec un rapport signal-bruit très faible ou aucun signal du tout.

Nous avons ensuite demandé si la détection du signal smFISH faisait preuve de partialité en ce qui concerne le nombre total de molécules d’ARN par cellule. Dans une population, le nombre total d’un ARN particulière dans chaque cellule se trouve dans une distribution, avec certaines cellules contenant des molécules d’ARN plus que d’autres. Un protocole de bonne smFISH devrait détecter robuste de l’ARN sans se soucier si un nombre élevé ou faible nombre de molécules d’ARN est présent dans chaque cellule. Pour le vérifier, pour chaque cellule, nous avons calculé la fraction des taches smFISH avec signaux épididymaire et la fraction avec un seul des deux signaux fluorescents. Après un regroupement des cellules ayant le même nombre de points totales par cellule, nous avons calculé la fraction moyenne d’épididymaire (jumelé) ou des taches (CF590 seule ou Q670 uniquement) non logées dans un groupe donné et représentées graphiquement cette moyenne en fonction du nombre total de spots par cellule (Figure 3). Pour chaque catégorie de taches, les fractions étaient similaires sur l’ensemble du nombre total de places par cellule. Par exemple, en comparant les cellules avec un total de 20 taches fluorescentes par cellule par rapport à ceux avec un total de 30 points, les fractions moyennes des taches colocalized étaient semblables. Ce résultat suggère que notre protocole pourrait détecter des molécules d’une gamme d’ARN dans une cellule (jusqu'à au moins environ 40 molécules par cellule). Si le protocole a travaillé sous-optimal, on peut observer un biais. Par exemple, la fraction des spots avec un seul des deux signaux fluorescents pourrait augmenter le nombre total de places par cellulaire a augmenté.

En utilisant ce protocole optimisé, nous avons examiné l’expression du gène NDC80 qui code pour une protéine du kinétochore, dans différentes conditions de croissance. Le gène NDC80 exprime deux isoformes d’ARNm : l’isoforme longue ayant de transcription, NDC80^luti, possède une extension de ~ 400 paires de bases à l’extrémité 5' par rapport à court NDC80^ORF isoforme, mais les deux transcriptions partagent la région codante du gène NDC80 (voir le schéma de la Figure 4 a). Nous avons conçu deux séries de sondes : The CF 590 ensemble se lie à la région 5' unique de NDC80^luti; et l’ensemble de 670 Q se lie à la région commune de NDC80^luti et NDC80^ORF. Les transcriptions NDC80^luti ont été détectées comme les taches de smFISH où les signaux émis par les deux sondes ensembles épididymaire, tandis que le NDC80^ORF transcriptions étaient ceux avec le signal qu’à partir de 670 Q. En raison de la taille du segment unique de NDC80^luti, nous pourrions seulement tuile 20 sondes oligonucléotidiques le long de cette région, qui est moins que les sondes recommandées de 30 à 48. Ainsi, nous avons d’abord déterminé si cet ensemble sonde robuste pouvait détecter l’ARN dans notre protocole optimisé. Pour chaque canal fluorescent, nous représenté graphiquement le rapport signal sur bruit (SNR, défini comme l’écart des pixels entourant une place par rapport à l’intensité du spot) contre le signal détecté pour chaque place de smFISH et généré un nuage de points pour tous les spots identifié dans le champ de vision complet (images d’exemple Figure 4 a) et des parcelles dans la Figure 4 b. Deux populations distinctes ont été clairement identifiées pour les deux le 670 Q et la sonde CF 590 définit (optimisé, Figure 4 b), ce qui suggère que les taches de smFISH vrai (à l’intérieur de la zone grise) peuvent être séparées de la signal de fond. Notez que, dans l’État sous-optimal, cette séparation était moins évidente (Suboptimal, Figure 4 b).

Nous avons utilisé ces ensembles de deux sondes pour étudier l’expression des NDC80^luti et NDC80^ORFpendant la croissance végétative et la méiose. Dans les cellules végétatives, signal robuste de l’ensemble de sonde 670 Q a été détecté, mais pas de la CF 590 sonde (Figure 5 a, végétatif), souscrivant à l’observation par northern Blot qui seulement l’isoforme court a été exprimée au cours de la croissance végétative¹⁶ . Ce résultat suggère aussi que le jeu de sondes CF 590 est spécifique, rendement faible bruit de fond dans notre protocole optimisé smFISH. En revanche, un signal robuste de deux ensembles de sonde a été détecté dans la prophase méiotique et la majorité des taches avait épididymaire signal (Figure 5 a, la prophase méiotique). Ainsi qu’analyse par northern blot (Figure 5 b), cette observation confirme que l’isoforme longue NDC80^luti était exprimée spécifiquement lors de la méiose. Ces deux types d’ARNm ont été détectés dans le cytoplasme (à l’extérieur de la région DAPI), ce qui suggère que les deux ont été exportés du noyau, compatible avec le ribosome de profilage des données¹⁸.

Pour déterminer si des données suffisantes ont été recueillies pour précisément de tenir compte de la variation biologique intrinsèque à notre ensemble de données, nous avons effectué l’analyse « bootstrap » en utilisant les statistiques de chaque cellule, qui comprenait (1) la fraction des taches colocalized par cellule et (2) la fraction des spots avec un des deux signaux fluorescents (CF 590 seulement et 670 Q seulement). Dans cette analyse, un programme choisis au hasard une seule cellule dans les 437 cellules quantifiés pour 500 itérations. Ensuite, la moyenne et la variance des statistiques respectifs liés à ces 500 cellules sélectionnées ont été calculés. Ce processus a ensuite été répété pour sélectionner au hasard des deux cellules de toutes les cellules, sans remplacement ; et puis pour sélectionner au hasard trois cellules, etc.. jusqu'à ce qu’un moitié de la taille de l’ensemble de données total a été atteint. La variance dans le jeu de données atteint un plateau après ~ 40 cellules, ce qui suggère que, après ce point la plupart de la variation de la moyenne est inhérente à des données, et non un artefact de sous-échantillonnage (Figure 6, encart). Cet effet devenue plus évident quand nous avons représenté graphiquement la variance de l’échantillon divisée par la moyenne de l’échantillon, en fonction du nombre de cellules prélevés dans chaque cycle d’itération (Figure 6). Avec les données présentées, le changement de variance devenue diminishingly petit après ~ 60 cellules. Le nombre de cellules quantifié dans une expérience smFISH doit dépasser le nombre minimal de cellules nécessaires pour atteindre une moyenne stable et un plateau de la variance. Dans notre cas, nous avons mesuré plus de 95 cellules par exemple, par réplicat. Le nombre total de cellules (> 400) a bien dépassé le nombre minimal de cellules (~ 60) nécessaire pour tenir compte de la moyenne de la population.

Avec une sur mesure Matlab programme¹⁶, cellules végétatives ont eu une durée médiane de 5 NDC80^ORF transcriptions par cellule, tandis que dans les cellules de la prophase méiotique, la médiane significativement chuté à 4 transcriptions par cellule (Wilcoxon bilatéral Test de somme de Rank, p = 0,026) (Figure 7). Le nombre médian de NDC80^luti transcrits par cellule était 21 transcriptions, et 100 % des cellules a exprimé les transcriptions NDC80^luti . Nous avons représenté graphiquement la fraction des cellules avec un nombre donné de transcriptions sous forme d’histogramme par étapes, la relative fréquence parce que le nombre de molécules d’ARNm est une quantité discrète. Le plus grand bac de chaque histogramme a été normalisé à la même hauteur.

Figure 1 : diagramme pour le protocole de smFISH. Cellules sont fixées avec le formaldéhyde à température ambiante pendant 20 min ou à 4 ° c du jour au lendemain, pour des échantillons de la croissance végétative et méiotique, respectivement. Après un lavage en tampon B trois fois, les cellules sont digérés par zymolyase jusqu'à ce qu’environ 70 % - 90 % des cellules sont digérés. Les échantillons digérés sont ensuite lavées une fois avec le tampon B d’enlever le zymolyase et perméabilisées par la suite dans 70 % d’éthanol (EtOH) pendant ~3.5 heures. Pour parer à l’hybridation, les échantillons sont incubés tout d’abord dans le tampon de lavage de formamide de 10 % (FWB) pendant environ 20 min. Ensuite, les échantillons sont remis en suspension dans environ 50 µL de Solution d’hybridation, qui contient les sondes fluorescentes, pour une nuit d’incubation à 30 ° c dans l’obscurité. Après hybridation, les échantillons sont incubés dans FWB 10 % pendant 30 min pour évacuer l’excès sondes et ensuite incubés dans 10 % FWB avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) sur la tache de l’ADN. Pour l’exemple imagé immédiatement après l’incubation FWB/DAPI, l’échantillon est remis en suspension dans le tampon GLOX additionné de catalase, Trolox et glucose oxydase (GLOX + enz) ; considérant que, les autres échantillons sont remis en suspension dans le tampon GLOX sans enzymes et stockés à 4 ° c jusqu'à environ 3 heures. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : évaluation de la qualité de smFISH à l’aide de sondes impair/pair. (A) haut : Schéma pour les ensembles de sonde impair/pair. Cinquante-quatre sondes carrelage le gène de NDC80 ont été conçus. Les sondes impaires sont marquées avec un fluorophore (CF590, montré en magenta) et les sondes de paires, avec un autre fluorophore (Q670, en vert). En bas : Images représentant smFISH des cellules de la prophase méiotique acquis en utilisant les ensembles de sonde impair/pair. Échantillons ont été prélevés à 6 heures après que les cellules (UB8144) ont été transférés au milieu de sporulation, un temps où ces cellules ont été arrêtés à la prophase méiotique. L’ADN a été coloré au DAPI (représentée en bleu). Images apparaissent comme les projections de l’intensité maximale de z-cheminées. Barre d’échelle : 5 µm. (B) pourcentage des taches de même couleur ou non appariés smFISH obtenus en utilisant les ensembles de sonde impair/pair. Un total de 428 prophase méiotique cellules ont été analysées, mise en commun de deux expériences indépendantes. Ce chiffre est modifié par rapport à la Figure 2-supplément figure 4 de Chen et al. ¹⁶ (C) A cumulé densité fonction (CDF) de la distance entre chaque paire de taches appariés et la distance entre le voisin le plus proche d’un endroit non apparié. Pour chaque place détecté dans un canal fluorescent, l’algorithme « k plus proches voisins » a été appliqué pour identifier le spot détecté plus proche — et la distance que vous souhaitez survoler — dans le canal complémentaire. Localisations qui étaient mutuelles la plus proche voisins étaient réputées être couplé, et une nouvelle liste a été générée en enregistrant les détections appariées, CF590 seule et Q670-uniquement. Pour chaque catégorie de détections, un histogramme de la CDF des distances a été tracé en Matlab, confirmant que correctement appariées spots en effet ont été beaucoup plus proches en distance que celles sans un correspondant à l’autre canal. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : nombre de Fractions de spots appariées et non appariées, en fonction de l’ARN total par cellule. Pour tester si la détection et l’appariement des taches smFISH était partiale aux niveaux d’expression différents, les cellules individuelles ont été regroupés par la totale expression de RNA. Les fractions moyennes des détections appariées, CF590 seule et Q670-seule ont été calculées pour chaque groupe de cellules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Évaluation de la qualité des données générées en utilisant les sondes conçues pour NDC80^luti smFISH et NDC80^ORF mRNA. Les sondes de 670 Q (indiqués en vert) s’hybrident à la région commune partagée entre NDC80^luti et NDC80^ORF mRNA, alors que les sondes CF 590 (montrés en magenta) s’hybrider à la région unique de 5' de NDC80^luti . (A) smFISH représentant des images de NDC80^luti et NDC80^ORF en prophase méiotique, acquis moins optimisé par rapport aux conditions suboptimales. Souches UB8144 (optimisé condition) et UB1337 (État sous-optimal) ont été amenées à subir la méiose et fixés au cours de la prophase méiotique. Ces deux souches hébergent les systèmes de synchronisation différents pour induire la méiose, mais l’utilisation d’un système n’affecte pas la qualité de smFISH (données non présentées). En l’État sous-optimal, les cellules ont été fixées à température ambiante pendant 20 min (aucune fixation au jour le jour), digérée avec zymolyase sans VRC complétée et hybridé dans une plus faible concentration de VRC. Images apparaissent comme les projections de l’intensité maximale de z-cheminées. L’ADN a été coloré au DAPI (représentée en bleu). Barre d’échelle : 5 µm. les diagrammes de dispersion (B) afficher le rapport signal sur bruit (SNR) et le signal de chaque spot smFISH détecté dans le champ de vision présenté dans la Figure 4 a, canal fluorescent, ainsi que les conditions optimisées ou sous-optimale. En l’état optimisé, deux populations des taches smFISH étaient présentes. Les taches de véritable smFISH sont trouvaient à l’intérieur de la zone grise, sépare le signal de fond. En l’État sous-optimal, différents mRNAs étaient difficiles à distinguer à le œil, et la séparation entre le vrais taches et le fond après avoir exécuté le logiciel de détection spot était moins évidente. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Expression de NDC80^luti et NDC80^ORF transcriptions sont contrôlées dans le temps. (A) smFISH représentant des images de NDC80^luti et NDC80^ORF pendant la croissance végétative et la méiose. Végétatives échantillons ont été prélevés lorsque des cellules (UB8144) ont été en croissance exponentielle dans un milieu riche en nutriments. La prophase méiotique échantillons ont été prélevés les 6heures après que cellules (UB8144) ont été transférés au milieu de sporulation, un temps où ces cellules ont été arrêtés à la prophase méiotique. Les sondes de 670 Q (indiqués en vert) s’hybrident à la région commune partagée entre NDC80^luti et NDC80^ORF mRNA, alors que les sondes CF 590 (montrés en magenta) s’hybrident à l’unique région 5' du NDC80^luti . L’ADN a été coloré au DAPI (représentée en bleu). Chaque cellule a été mis en scène par son signal Zip1-GFP, un marqueur de la prophase méiotique. Notre protocole de smFISH conserve le signal fort de GFP sans modification supplémentaire. La croissance végétative : négatif Zip1-GFP. La prophase méiotique : positif Zip1-GFP. Images apparaissent comme les projections de l’intensité maximale de z-cheminées. Barre d’échelle : 5 µm. Ce chiffre est modifié par rapport à la Figure 2 de Chen et al. ¹⁶. (B) NDC80^ORF, NDC80^lutiet Ndc80 la teneur en protéines (Ndc80p) au cours de la méiose (UB4074). NDC80^luti et NDC80^ORF niveaux ont été déterminés par northern blot et Ndc80p niveau a été déterminé par immunoblot anti-V5 sur les points de l’heure indiquée. Hxk1p, contrôle d’immunoblot de chargement. Comme la souche UB8144, cette souche héberge également le pGAL-NDT80 GAL4-ER synchronisation système^19,20. Les cellules ont été transférés au milieu de sporulation à 0 heure et libérés d’arrestation pachytène par addition de β-estradiol 6 heures plus tard. La transcription NDC80^luti détecta robuste en prophase méiotique/S, tandis que le NDC80^ORF transcriptions était principalement présent avant son entrée méiotique (0 heure) et au cours des divisions méiotiques (7-9 heures). Ce chiffre est modifié par rapport à la Figure 6J de Chen et al. ¹⁶ S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 6 : Bootstrap analyse effectuée pour les échantillons de la prophase méiotique montrés Figure 5 . Toutes les cellules chiffrés ont été regroupées, et un nombre donné (n) des cellules ont été choisis au hasard de 500 fois. La moyenne et l’intervalle de confiance à 95 % ont été calculés pour la fraction de l’ARNm appariées et non appariées par cellule. Ces données ont été tracées pour chaque choix du nombre n (en médaillon). Le plateau de variance a été visualisé en traçant la variance de l’échantillon divisée par la moyenne, en fonction du nombre de cellules (n) échantillonné. Le nombre total de cellules mesurées (437) dépassé largement le nombre au cours de laquelle l’erreur atteint un plateau (~ 60 cellules), ce qui indique que des données supplémentaires n’améliorerait pas la confiance dans les mesures. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Quantification des données smFISH montrées Figure 5 , graphiques comme les histogrammes de fréquence relative des cellules avec un nombre donné de NDC80^luti et NDC80^ORF transcriptions par cellule, en utilisant les données regroupées à partir de trois expériences indépendantes. La ligne pointillée indique le nombre médian de NDC80^luti et NDC80^ORF transcriptions par cellule. Chaque histogramme a été normalisée afin que la hauteur maximale bin était le même dans toutes les histogrammes. Un nombre total de 637 cellules ont été analysé pour la croissance végétative et 437 de la prophase méiotique. Test de Wilcoxon somme de Rank bilatéral a été réalisée pour NDC80^luti et NDC80^ORF, respectivement, en comparant des échantillons de la prophase méiotique et végétatifs. Ce chiffre est modifié de la Figure 2D de Chen et al. ¹⁶ S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Mémoire tampon B (stock 1 L : 1,2 M sorbitol ; tampon de phosphate de potassium 0,1 M, pH 7,5)	1 x
Eau exempte de nucléase	500 mL
Sorbitol	218,6 g
KH2PO4	2,18 g
K2HPO4	14,62 g
Eau exempte de nucléase	Porter au volume final de 1 L
* Conserver à 4 ° c en aliquotes 50 mL après filtre stérilisant
Zymolyase 100 t (10 mg/mL)
* Conserver à-20 ° c en aliquotes
Dissoudre la poudre de zymolyase de 10 mg dans 1 mL d’eau MilliQ
E. coli ARNt (10 mg/mL)
* Conserver à-20 ° c en aliquotes
Dissoudre la poudre tRNA 10 mg dans 1 mL d’eau MilliQ
éthanol à 70 % (50 mL)	1 x (mL)
Éthanol pur	35
Eau exempte de nucléase	15
* Stocker à température ambiante
Tampon d’hybridation (10 mL)	1 x (mL)
Sulfate de dextran 50 %	2
E. coli ARNt (10 mg/mL)	1
200 mM vanadyle ribonucléosides complexes (VRC)	0,1
BSA, 50 mg/mL	0,04
20 x SSC	1
Formamide	1
Eau exempte de nucléase	4.86
* Conserver à-20 ° c en aliquotes 250 µL ou 500 µL
tampon de lavage 10 % formamide (10 mL)	1 x (mL)
Formamide à température ambiante	1
20 x SSC	1
Eau exempte de nucléase	8
* faire frais, vortex pendant 20-30 secondes pour mélanger
solution de glucose 10 %
* Conserver à 4 ° c en aliquotes après filtre stérilisant
Dissoudre 1 g de glucose dans 10 mL d’eau exempte de nucléase
Glucose oxydase
* Conserver à-20 ° c en aliquotes
Dissoudre la glucose-oxydase 3,7 mg dans 1 mL de 50 mM NaOAc, pH 5
Tampon anti-eau de Javel (GLOX), sans enzymes (1 mL)	1 x (µL)
10 % de glucose dans de l’eau exempte de nucléase	40
1 M Tris, pH 8,0	10
20 x SSC	100
Eau exempte de nucléase	850
* faire frais, peut également stocker des aliquotes à 4 ° c
Tampon anti-eau de Javel (GLOX), avec des enzymes (50 µL)	1 x (µL)
Catalase (vortex légèrement, il s’installe facilement)	0,5
Glucose oxydase	0,5
100 mM Trolox (dissous dans l’éthanol)	1
Tampon GLOX	50
* faire frais chaque fois, préparer sur glace, peuvent être stockés à 4 ° c pendant 2-3 heures

Le tableau 1. Tampons et medias

Discussion

Le protocole présenté ici est dérivé d’autres protocoles de smFISH publié^2,3,21,22,23et a été spécifiquement optimisé pour le fond de la souche de levure SK1. Les paramètres optimisés inclus le nombre de cellules, durée de fixation, vitesse de centrifugation et durée, durée de la digestion, tampon de digestion, concentration de sonde et tampon d’hybridation. D’autres paramètres comme la température d’hybridation et de la durée n’étaient pas optimisés. Dans cette section, nous partageons quelques notes qui permettraient d’adapter ce protocole à n’importe quel fond de souche de levure et les conditions de croissance d’intérêt.

La paroi cellulaire de la levure de bière est un des défis majeurs contre l’obtention d’images de haute qualité smFISH dans la levure de bière parce que la paroi cellulaire empêche la pénétration de la sonde. Une digestion incomplète de la paroi cellulaire par zymolyase mène à inefficace hybridation des sondes et forte variabilité de cellule-à signal. Cependant, digestion excessive peut rendent les cellules trop fragile, conduisant à l’importante perte de cellules au cours des étapes de lavage et éclatement au cours de la préparation pour l’imagerie de cellules. Ainsi, il est essentiel d’optimiser la durée de la digestion. Il est recommandé de mener une expérience pilote smFISH de digérer l’échantillon même pour des quantités différentes de temps. Dans notre cas, nous avons obtenu les meilleures données smFISH si nous nous sommes arrêtés la digestion lorsqu’environ 80 % des cellules sont devenus non réfraction. En général, pour les mêmes conditions de croissance, différentes souches mutantes génétiques peuvent être digérées avec un timing similaire. Toutefois, la durée de la digestion se distingue par comparaison entre les différentes conditions de croissance et les différentes étapes de la méiose chez la levure de bière. Une fois que le calendrier est déterminé, la qualité de smFISH est reproductible. Remarque que pour les souches mutantes avec la synthèse de la paroi de cellules défectueuses et/ou la composition, la digestion peut être complétée en moins de 15 min. utilisation des différents lots de zymolyase peut aussi légèrement changer le moment de la digestion.

Concentration optimale de sonde est nécessaire pour obtenir un rapport signal sur bruit élevé. Nous avons conçu et acheté nos sondes de smFISH dans le commerce. Bonnes sondes (souvent 20-mers) devraient avoir un pourcentage de GC allant de 35 % à 45 %, un espacement minimum de 2 paires de bases entre les sondes et faible réactivité croisée. Nous avons utilisé un concepteur de sonde sur le web du fabricant pour générer une liste de sondes, et s’il y avait assez de sondes au choix, nous utiliserions l’algorithme BLAST dans la base de données du génome Saccharomyces pour éliminer les sondes avec plus de 17 paires de bases que se chevauchés avec d’autres régions génomiques. Nous avons choisi le plus PhotoStation colorant fluorescent (CAL Fluor 590) pour l’ensemble de la sonde qui recuits à la région unique de NDC80^luti (CF 590) parce que dans cette série, le nombre de sondes qui satisfait tous les critères ci-dessus (20 sondes) était inférieur à la nombre minimum recommandé par le fabricant (~ 25 sondes). Après reconstitution de la solution de sonde suivant les instructions du fabricant, nous avons fait un 01:10 dilution de la solution mère et stocké de la solution diluée en aliquotes de 5 µL à-20 ° c. Chaque aliquote a été utilisé qu’une seule fois. Pour l’optimisation, on devrait faire série dilutions à partir du 01:10 dilué de solution et test dont la concentration donne le meilleur rapport signal sur bruit. Nous recommandons de faire une série de dilution de 1/250, 1/500, 1/1000 et 1 : 2000 de la souche originale. Dans notre cas, un facteur de dilution de 1/500 a entraîné le meilleur rapport signal-bruit, pour les ensembles de sondes CF 590 tant Q 670.

Temps de fixation optimale est également critique pour le succès smFISH dans la levure de bière. Nous trouvé que la fixation pendant la nuit à 4 ° c, plutôt que fixation à température ambiante pendant 20 min, nettement amélioré la cohérence et la qualité des résultats smFISH pour les échantillons de la méiose. Bien que nous n’avons pas testé comment du jour au lendemain la fixation peut influer sur les échantillons végétatives, fixation à la température ambiante a bien fonctionné pour cette condition de croissance. Ainsi, pour optimiser le protocole smFISH de nouvelles souches ou de conditions de croissance, nous vous recommandons commençant par temps de fixation courte à température ambiante et en augmentant le temps de fixation si forte variabilité du signal est rencontrée.

Par rapport aux autres protocoles publiés^3,22,23, notre protocole utilise l’inhibiteur de RNase VRC au cours de la digestion et une concentration plus élevée de VRC au cours de l’hybridation. Ajout de VRC dans ces deux étapes a amélioré la cohérence des résultats smFISH, peut-être de mieux préserver les molécules d’ARN contre activité nucléasique, qui peuvent être apportés par le mélange de zymolyase (l’enzyme est purifié à partir des extraits bruts et peut contenir la RNase contaminants). Ainsi, nous recommandons d’utiliser la quantité de VRC énumérés dans notre protocole ou encore des concentrations plus élevées de VRC pour l’optimisation.

Une partie importante des cellules peut être perdue au cours des étapes de lavage en tampon B et le tampon de lavage de formamide. Pour réduire la perte de cellules, on pourrait augmenter la vitesse de centrifugation. Dans notre cas, en utilisant une vitesse élevée (21 000 x g) pour granuler nos échantillons au cours de la mémoire tampon B lave la perte de cellules sensiblement réduite. Cependant, les cellules deviennent très fragiles après digestion zymolyase, changement de vitesse de centrifugation n’est donc pas recommandé. Au lieu de cela, nous vous suggérons d’utiliser les tubes de faible adhérence des scientifiques aux USA, qui grandement aident les cellules à pellets pendant les lavages dans le tampon de lavage de formamide. Dans l’ensemble, notre protocole peut générer systématiquement une monocouche de cellules suffisamment denses pour l’imagerie efficace. En règle générale, les 7 champs de vue devrait produire > 130 cellules appropriés pour la quantification.

Enfin, il est important de déterminer les paramètres optimaux pour et les sorties nécessaires d’analyse d’images. Pour détecter les points de smFISH, analyse publiée programmes couramment filtrent les images raw avec un noyau gaussien pour supprimer le signal de fond et demandent aux utilisateurs de déterminer le ratio signal-bruit d’utiliser pour chaque ensemble d’images^2,17. Malheureusement, il n’y a pas actuellement d’une norme unique par lequel les paramètres sont déterminés, et quelques essais empiriques de ces différents paramètres est donc nécessaire. Pour définir les paramètres nécessaires pour chacune de ces étapes, on a besoin de manière itérative différents jeux de paramètres d’entrée et vérifiez bien les résultats obtenus par chaque jeu correspond à celui de comptage manuel dans quelques cellules représentatives. Une fois un ensemble de paramètres est retrouvé, il peut être utilisé pour la plupart des images obtenues malgré les différentes conditions de croissance et les antécédents génétiques.

En outre, on peut tester si l’intensité maximale de projection des images smFISH peut être effectuée avant quantification²². Cette étape simplifie l’algorithme de détection spot et réduit considérablement les temps d’imagerie, mais au détriment des informations potentiellement utiles sur des spots individuels, tels que leur localisation subcellulaire. Dans notre cas, le nombre de molécules d’ADN messagère produite par le gène NDC80 était assez bas pour que les taches étaient bien distincts après ce traitement (pas rare pour les transcriptions en bourgeonnement levure^3,7). Dans le cas où l’analyse de colocalisation est critique, le pipeline de l’analyse doit déterminer l’emplacement de chaque spot de smFISH dans chaque canal pour évaluer la colocalisation. Selon les questions spécifiques posées, autres informations telles que l’intensité de chaque spot peuvent également devoir être extrait à partir du pipeline pour une analyse ultérieure. Optimisation de la clé dans le protocole et le pipeline de l’analyse d’image est crucial dans l’obtention de la qualité des données smFISH pour étudier la question des intérêts.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA, RNase-free (50 mg/mL)	Ambion	AM2616	Store at -20 °C.
Catalase	Sigma	C3515	Store at 4 °C for short-term. Vortex before use.
DAPI	Sigma	D9564	Store at -20 °C after reconstitution in water. Protect from light.
50% Dextran Sulfate	Milli Pore	S4030	Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.
E. coli tRNA	Sigma	R4251	Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water.
Ethanol (100%, 200 proof)	various		Flammable.
37% Formaldehyde	Fisher	F79-500	Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.
Formamide	Ambion	AM9342	Store at 4 °C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.
Glucose	various		Store at 4 °C after dissolving in nuclease-free water.
Glucose oxidase	Sigma	G2133	Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.
Nuclease-free water	Ambion	AM9932	Store at room temperature.
Potassium phosphate (monobasic and dibasic)	various		Store at room temperature.
Probe library, diluted in TE, pH 8.0	Biosearch Technologies		Store at -20 °C in aliquots (5 µL) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.
Sorbitol	various		Store at room temperature.
20X SSC	Ambion	AM9763	Store at room temperature.
TE, pH 8.0	Ambion	AM9849	Store at room temperature.
1 M Tris, pH 8.0	Ambion	AM9856	Store at room temperature.
Trolox	Sigma	238813	Store at -20 °C in aliquots.
200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)	NEB	S1402S	Store at -20 °C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.
Zymolyase 100T	MP Biomedicals	08320932	Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water.
Low-adhesion tubes	USA Scientific	1415-2600	Store at room temperature.