该单分子荧光原位杂交协议的优化, 以量化的 RNA 分子在萌芽期酵母在营养生长和减数分裂。
单分子荧光原位杂交 (smFISH) 是研究单细胞基因表达能力的一种强有力的技术, 因为它能够检测和计数单个 RNA 分子。与深度测序方法互补, smFISH 提供了有关转录丰度的细胞间变异和特定 RNA 亚单位定位的信息。最近, 我们用 smFISH 研究了在萌芽酵母减数分裂过程中基因NDC80的表达, 其中存在两个转录亚型, 短转录异构体具有与长异构体共享的整个序列。为了自信地识别每个转录异构体, 我们优化了已知的 smFISH 协议, 并获得了在酵母减数分裂过程中获得的样品的 smFISH 数据的高一致性和质量。在这里, 我们描述了这个优化的协议, 我们用来确定是否获得高质量的 smFISH 数据的标准, 以及在其他酵母菌株和生长条件下实现此协议的一些提示。
动态调控基因表达推动生物体的发展, 以及它对环境压力、感染和新陈代谢变化的反应。关注转录调控的研究依赖于测量 RNA 丰度的技术。其中一种方法, 称为单分子荧光原位杂交 (smFISH), 用于检测单个细胞中的单个 RNA 分子1,2。该方法允许测量基因表达中细胞对细胞的变异性和细胞内 RNA 定位的测定。
在最常用的 smFISH 技术中, 对单个 rna 分子的检测需要多个短 DNA 探针 (通常为 48 20 探针), 它们是与目标 RNA 互补的, 并与同一荧光染料相结合。单一荧光探针的结合导致微弱信号, 但所有探针的集合信号是健壮的。这一特性大大提高了信噪比, 因为即使一个探针可以显示出目标绑定, 这种信号与目标 RNA 分子3相比, 预计将非常微弱。在检测误差范围内, RNA 分子的数量可以在不同的生长条件和突变体之间进行计数和比较。
自第一次开发以来, smFISH 已适应研究基因表达式的各个方面4, 如转录伸长1,2, 拼接5,6, 转录爆裂7,8,9, 胞内位基因表达式10,11,12, RNA 本地化13,14,15。最近, 我们用这种方法研究了同一基因的两个转录亚型的表达式, 其中短转录异构体 (NDC80ORF) 具有与长异构体共享的整个序列 (NDC80luti)16。为了唯一地识别两个 mRNA 亚型, 我们使用了两个探针集: 一组特定于NDC80luti的唯一序列, 另一组与另一个荧光染料结合, 绑定到两个亚型的共同区域。NDC80luti rna 被标识为具有两个荧光信号的 colocalized 点, 而NDC80ORF RNA 是仅包含来自公共探测器集的信号的一个。由于NDC80ORF 成绩单的数量是用 “减法” 方法计算的, 因此有必要提高探针杂交的效率和高信噪比, 以自信地识别 smFISH 点并减少误差。传播。
本文介绍了一种优化的协议, 以执行 smFISH 在萌芽酵母酿酒酵母。在该协议中, 对 smFISH 实验中的细胞数、固定时间、消化时间、消化缓冲、探针浓度、杂交缓冲等进行了优化, SK1 了在营养的情况下,酵母的应变背景。生长或减数分裂。然而, 我们也在这篇手稿中注意到: (1) 在图像采集后检查 smFISH 数据质量的方法, (2) 协议中可能需要对不同应变背景和生长条件进行额外优化的步骤。
此处提供的协议来自其他已发布的 smFISH 协议2、3、21、22、23, 并专门针对酵母应变背景 SK1 进行了优化。优化后的参数包括细胞数、固定时间、离心速度和持续时间、消化时间、消化缓冲、探针浓度和杂交缓冲。其他参数, 如杂交温度和持续时间没有优化。在本节中, 我们分享了一些注释, 它将有助于使本议定书适应任何酵母菌的背景和感兴趣的生长条件。
发芽酵母细胞壁是在 smFISH 中获得高质量的图像的主要挑战, 因为细胞壁防止探针穿透。zymolyase 细胞壁的不完全消化导致探针的低效杂交和信号中细胞间的高细胞变异性。然而, 过度消化可能使细胞过于脆弱, 导致在洗涤步骤和细胞爆裂过程中显着细胞损失在幻灯片准备成像。因此, 优化消化时间是至关重要的。我们建议通过在不同的时间内消化相同的样品来进行 smFISH 试验。在我们的情况下, 我们得到了最好的 smFISH 数据, 如果我们停止消化时, 80% 的细胞变得不屈光。通常, 在相同的生长条件下, 不同基因突变株可以用相似的时间来消化。然而, 在发芽酵母的不同生长条件和减数分裂的不同阶段, 消化时间不同。一旦确定了时间, smFISH 的质量就会重现。注意, 对于有缺陷细胞壁合成和/或成分的突变株, 消化可能在15分钟以内完成. 使用不同批次的 zymolyase 也可能略微改变消化时间。
为了达到高信噪比, 需要最佳探针浓度。我们在商业上设计和购买我们的 smFISH 探头。好的探针 (通常是20市场) 应该有一个百分比的 GC 范围从35% 到 45%, 最小间距2基对探头之间, 低交叉反应性。我们使用了一个基于 web 的探头设计器从制造商生成一个探针列表, 如果有足够的探头可以选择, 我们将使用在酿酒基因组数据库中的爆破算法, 以消除超过17基对重叠的探头与其他基因组区域。我们为探测集选择了更 photostable 的荧光染料 (CAL 590), 该探测器组退火NDC80luti (CF 590) 的唯一区域, 因为在此集合中, 满足上述所有条件 (20 探针) 的探头数量低于制造商推荐的最小编号 (25 探头)。在根据制造商的指示重组探头解决方案后, 我们对库存溶液进行了1:10 稀释, 并将稀释溶液储存在 5-µL 整除数-20 ˚C。每个整除只使用一次。为了优化, 我们应该从1:10 稀释溶液中进行串行稀释, 并测试浓度产生最佳信噪比。我们建议从原来的股票做一个稀释系列 1:250, 1:500, 1:1000 和1:2000。在我们的例子中, 1:500 稀释因子导致最佳信噪比, 为 CF 590 和 Q 670 探针集。
最佳的固定时间也是成功 smFISH 的关键。我们发现, 夜间固定在4˚C, 而不是固定在室温20分钟, 大大提高了一致性和质量的 smFISH 结果的减数分裂样本。虽然我们没有测试如何过夜固定可能会影响营养样品, 室温固定在这种生长条件下工作良好。因此, 为了优化 smFISH 协议的新菌株或生长条件, 我们建议开始时, 在室温下固定时间和增加的固定时间, 如果遇到高变异性的信号。
与其他已发布的协议3,22,23相比, 我们的协议使用 RNase 抑制剂 VRC 在消化过程中和较高浓度的 VRC 在杂交期间。在这两个步骤中添加 VRC 提高了 smFISH 结果的一致性, 可能是通过更好地保留 RNA 分子对核酸酶活动, 这可能是由 zymolyase 混合 (酶是从粗提取物纯化, 可能含有 RNase污染物)。因此, 我们建议使用我们的协议中列出的 VRC 量, 或者更高浓度的 VRC 进行优化。
在缓冲 B 和甲酰胺洗涤缓冲液的洗涤步骤中, 细胞的很大一部分可以丢失。为了减少细胞损耗, 可以提高离心速度。在我们的情况下, 使用高速 (2.1万 x g) 颗粒我们的样品在缓冲 B 洗涤明显减少细胞损失。然而, zymolyase 消化后细胞变得非常脆弱, 所以不建议改变离心速度。相反, 我们建议使用来自美国科学的低粘附管, 这大大有助于在洗涤过程中, 在甲酰胺洗涤缓冲细胞颗粒。总的来说, 我们的协议可以持续地生成一层足够致密的细胞来进行高效成像。通常, 7 的视野应该产生 > 130 细胞适合量化。
最后, 确定图像分析所需的最佳参数和输出是很重要的。为了检测 smFISH 点, 发布的分析程序通常用高斯内核过滤原始图像, 以删除背景信号, 并要求用户确定每组图像的信噪比,2,17。不幸的是, 目前还没有一个单一的标准来确定正确的参数, 因此需要对这些不同设置进行一些经验测试。要设置每个步骤所需的参数, 需要迭代地输入不同的参数集, 并检查从每个集合中获得的结果与几个代表性单元中的手动计数是否匹配。一旦找到一组参数, 它可以用于大多数的图像, 尽管不同的生长条件和遗传背景。
此外, 可以测试在量化22之前是否可以执行 smFISH 图像的最大强度投影。这一步简化了光斑检测算法, 并大大减少了成像时间, 但在一些潜在有用的信息, 如个别斑点, 如其亚细胞定位的成本。在我们的例子中, 由NDC80基因产生的 mRNA 分子数量足够低, 这一处理后斑点很好地分离 (在萌芽的酵母3,7) 的成绩单上并不少见。在定位分析至关重要的情况下, 分析管道需要确定每个 smFISH 点在每个通道中的位置, 以评估定位。根据所要求的具体问题, 其他信息, 如每个点的强度可能也需要从管道中提取, 以便进一步分析。优化协议和图像分析管线的关键步骤, 对于获取高品质的 smFISH 数据, 研究感兴趣的问题至关重要。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢安妮多德森和斯蒂芬妮的建议如何优化 smFISH 协议, 泽维尔 Darzacq 为帮助与分析平台, 海盐黄提出的统计分析建议。这项工作得到了来自3月的钱 (5 FY15-99), 皮尤慈善信托基金 (00027344), 达蒙罗扬癌症研究基金会 (35-15) 和格伦基金会的资助, EÜ, 和 NSF 研究生研究金赠款号。DGE-1106400 到 JC。
BSA, RNase-free (50 mg/mL) | Ambion | AM2616 | Store at -20 °C. |
Catalase | Sigma | C3515 | Store at 4 °C for short-term. Vortex before use. |
DAPI | Sigma | D9564 | Store at -20 °C after reconstitution in water. Protect from light. |
50% Dextran Sulfate | Milli Pore | S4030 | Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience. |
E. coli tRNA | Sigma | R4251 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water. |
Ethanol (100%, 200 proof) | various | Flammable. | |
37% Formaldehyde | Fisher | F79-500 | Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution. |
Formamide | Ambion | AM9342 | Store at 4 °C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution. |
Glucose | various | Store at 4 °C after dissolving in nuclease-free water. | |
Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5. |
Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | Store at room temperature. |
Potassium phosphate (monobasic and dibasic) | various | Store at room temperature. | |
Probe library, diluted in TE, pH 8.0 | Biosearch Technologies | Store at -20 °C in aliquots (5 µL) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light. | |
Sorbitol | various | Store at room temperature. | |
20X SSC | Ambion | AM9763 | Store at room temperature. |
TE, pH 8.0 | Ambion | AM9849 | Store at room temperature. |
1 M Tris, pH 8.0 | Ambion | AM9856 | Store at room temperature. |
Trolox | Sigma | 238813 | Store at -20 °C in aliquots. |
200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | NEB | S1402S | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer. |
Zymolyase 100T | MP Biomedicals | 08320932 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water. |
Low-adhesion tubes | USA Scientific | 1415-2600 | Store at room temperature. |