Singola molecola l'ibridazione In Situ (smFISH) analisi in crescita vegetativa lievito germogliante e meiosi

Summary

Questa singola molecola fluorescenza in situ di ibridazione protocollo è ottimizzato per quantificare il numero di molecole di RNA in lievito durante la meiosi e crescita vegetativa.

Abstract

Ibridazione di singola molecola fluorescenza in situ (smFISH) è una tecnica potente per studiare l'espressione genica in cellule singole grazie alla sua capacità di rilevare e contare le singole molecole di RNA. Complementari ai metodi basati su sequenziamento profondi, smFISH fornisce informazioni circa la variazione della cellula--cellula in abbondanza di trascrizione e la localizzazione subcellulare di un determinato RNA. Recentemente, abbiamo usato smFISH per studiare l'espressione del gene NDC80 durante la meiosi nel lievito gemmante, in cui trascrizione due isoforme esiste e l'isoforma breve trascrizione ha sua intera sequenza ha condiviso con l'isoforma lunga. Per identificare con sicurezza ogni isoforma di trascrizione, abbiamo ottimizzato smFISH noti protocolli ed abbiamo ottenuto alta consistenza e qualità dei dati di smFISH per i campioni acquisiti durante in erba lievito meiosi. Qui, Descriviamo questo protocollo ottimizzato, i criteri che utilizziamo per determinare se si ottiene alta qualità di dati di smFISH e alcuni suggerimenti per l'implementazione di questo protocollo in altri ceppi di lievito e le condizioni di crescita.

Introduction

Regolazione dinamica dell'espressione genica guida lo sviluppo di un organismo, come pure la sua risposta a stress ambientali, infezione ed i cambiamenti nel metabolismo. Gli studi che si concentrano sulla regolazione trascrizionale si basano su tecnologie che misurano abbondanza di RNA. Un tale metodo, definito ibridazione di singola molecola fluorescenza in situ (smFISH), è utilizzato per il rilevamento delle singole molecole di RNA in cellule singole^1,2. Questo metodo consente la misurazione della cellula--cellula variabilità nell'espressione genica e la determinazione della localizzazione intracellulare di RNA.

La tecnica più comunemente utilizzati smFISH, rilevazione di una singola molecola di RNA richiede sonde di DNA breve multiple (spesso ~ 48 20-mer sonde) che sono complementari a RNA dell'obiettivo e sono coniugati alla stessa tintura fluorescente. Associazione di una singola sonda fluorescente si traduce in segnale debole, ma il segnale dall'insieme di tutte le sonde è robusto. Questa caratteristica migliora notevolmente il rapporto segnale-rumore, perché anche se una singola sonda può esibire fuori bersaglio associazione, tale segnale dovrebbe essere molto debole rispetto a quella del bersaglio RNA molecola³. All'interno di errore di rilevazione, il numero di molecole di RNA può essere contato e confrontato tra diverse condizioni di crescita e tra diversi mutanti.

Dal suo primo sviluppo, smFISH è stato adattato per studiare vari aspetti dell' espressione genica⁴, come trascrizione allungamento^1,2,^5,6, trascrizionale scoppio⁷ di splicing ^{, 8 , 9}, espressione allelica intracellulare^10,11,12e RNA localizzazione^13,14,15. Recentemente, abbiamo usato questo metodo per studiare l'espressione delle due isoforme di trascrizione del gene stesso, in cui l'isoforma breve trascrizione (NDC80^ORF) ha la sua intera sequenza ha condiviso con l'isoforma lunga (NDC80^luti )¹⁶. Per identificare in modo univoco le due isoforme di mRNA, abbiamo usato due sonda set: un set è specifico per la sequenza univoca di NDC80^luti, e l'altro insieme, coniugato a un altro colorante fluorescente, si lega alla regione comune delle due isoforme. NDC80^luti RNA viene identificato come un posto colocalized con entrambi i segnali fluorescenti, considerando che la NDC80^ORF RNA è quella che contiene solo il segnale dal set sonda comune. Poiché il numero della NDC80^ORF trascrizioni è calcolato con un metodo di "sottrazione", ad alta efficienza dell'ibridazione della sonda e un alto rapporto segnale-rumore sono necessari con fiducia smFISH macchie di identificare e ridurre l'errore propagazione.

Questo articolo descrive un protocollo ottimizzato per l'esecuzione di smFISH nel lievito Saccharomyces cerevisiae. In questo protocollo, il numero di cellulare, tempo di fissazione, tempo di digestione, digestione buffer, sonda concentrazione e ibridazione buffer utilizzato per gli esperimenti di smFISH sono state ottimizzate per lo sfondo di SK1 ceppo di Saccharomyces cerevisiae in fase vegetativo crescita o meiosi. Tuttavia, notiamo anche in questo manoscritto: (1) il metodo per controllare la qualità dei dati di smFISH dopo l'acquisizione dell'immagine e (2) i passaggi nel protocollo che potrebbero richiedere ulteriore ottimizzazione per gli sfondi di ceppo diverso e le condizioni di crescita.

Protocol

Nota: Tutti i buffer e i media utilizzati in questo protocollo sono elencati nella tabella 1. Le informazioni sul fornitore per i reagenti è elencati nella Tabella materiali.

1 giorno/1 e 2 giorno:

Nota: Per cultura vegetativo, far crescere cellule a un OD₆₀₀ di 0,4 e 0,6 in un mezzo comodo. Per cultura meiotica, indurre le cellule per subire la meiosi utilizzando un metodo preferito (in genere la coltura in un OD₆₀₀ di 1.85).

1. la fissazione e la digestione del campione

1. Difficoltà un totale di ~3.5 OD₆₀₀ delle cellule in 3% di formaldeide.
   1. Per cultura vegetativo, aggiungere mL 5,52 della cultura a 480 µ l di formaldeide al 37% in provette coniche da 15 mL.
   2. Per cultura meiotica, µ l 1840 di cultura a 160 µ l di formaldeide al 37% in 2 mL microcentrifuga. Capovolgere ~ 5 volte per mescolare.
      Attenzione: La formaldeide è tossica. Gestire e smaltire secondo le normative istituzionali.
2. Inserire le provette su un rullo di tamburo a temperatura ambiente per 20 min. Per campioni meiotici, dopo aver sistemato a temperatura ambiente per 20 min, continuano a fissaggio durante la notte a 4 ˚ c, rotazione.
   Nota: La fissazione durante la notte aumenta la riproducibilità e la qualità dei dati smFISH ottenuti per i campioni meiotici. Tempo di fissaggio deve essere ottimizzato.
3. Mentre i campioni sono di fissaggio, scongelare 200 mM Vanadyl Ribonucleoside complessi (VRC) a 65 ˚ c per almeno 10 min.
4. Preparare il mix master digestione in una provetta da 15 mL: per 1 campione, mescolare 425 µ l di tampone B con 40 µ l di 200mm VRC (riscaldato a 65 ˚ c); per 5 campioni, mescolare 2125 µ l di tampone B con 200 µ l di 200mm VRC (riscaldato a 65 ˚ c). Vortice ~ 5 s per risospendere completamente il VRC prima di aggiungere il mix master, che apparirà verde brunastro chiaro dopo aggiunta di VRC.
   Nota: Aggiunta di VRC durante la digestione migliora l'uniformità dei risultati smFISH, potenzialmente inibendo il contaminante di nucleasi introdotto dalla miscela di zymolyase, che è purificata dal greggio estratto. La quantità di VRC necessaria a questo punto dovrebbe essere ottimizzata.
5. Per i campioni vegetativi, centrifugare le provette a ~ 1057 x g per 3 min. Per campioni meiotici (dopo la fissazione durante la notte), centrifugare a 21.000 x g per un minimo di 1,5 decantare o aspirare il supernatante a rifiuti di formaldeide.
   Nota: Tutte le fasi di centrifugazione vengono eseguite a temperatura ambiente.
6. Risospendere le cellule in 1,5 mL di tampone freddo B pipettando su e giù o invertendo i tubi e sfogliando per mescolare. Trasferire campioni vegetativi 2 mL provette dopo la risospensione.
7. Centrifuga a 21.000 x g per un minimo di 1,5 rimuovere la maggior parte del liquido tramite aspirazione a vuoto o di pipettaggio, lasciando dietro di sé ~ 100 µ l.
8. Risospendere le cellule in 1,5 mL di tampone freddo B.
9. Centrifuga a 21.000 x g per un minimo di 1,5 rimuovere la maggior parte del liquido tramite aspirazione a vuoto o di pipettaggio, lasciando dietro di sé ~ 100 µ l.
10. Risospendere le cellule in 1,5 mL di freddo Buffer B. Centrifugare a 21.000 x g per un minimo di 1,5 aspirato il liquido completamente dal vuoto o di pipettaggio.
11. Risospendere le cellule in 425 µ l di mix master di digestione e brevemente vortice per risospendere. Aggiungere 5 µ l di 100T 10mg/mL zymolyase ad ogni provetta.
    Nota: Vortex zymolyase ogni volta prima aggiunta ai tubi. Zymolyase aggiungere ad ogni provetta individualmente, invece di aggiungere al mix master. Entrambi i passaggi aiutano a mantenere la coerenza di digestione tra tubi perché zymolyase precipita rapidamente.
12. Vortice 2-3 s per mescolare. Posizionare i tubi su un tamburo rullo e digerire a 30 ˚ c per 15-30 min. Per cellule vegetative e prime fasi meiotic, prende solitamente ~ 15 min e per Profase Meiotica e divisioni meiotiche, prende solitamente ~ 30 min.
    Nota: Verificare sul microscopio ogni 5 min dopo 15 min ed interrompere la digestione quando ~ 80% delle cellule appaiono non trasparente e rifrangente. Da questo punto in poi, le cellule sono molto fragili. Gestire le celle delicatamente ed evitare tramite aspirazione a vuoto o tramite vortex.
13. Centrifugare le provette a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere il liquido completamente pipettando.
14. Risospendere delicatamente le cellule con 1 mL di tampone B pipettando su e giù 1 - 2 volte per mescolare.
15. Centrifugare le provette a ~ 376 x g per 3 min liquido rimuovere Buffer B pipettando. Risospendere delicatamente le cellule in 1 mL di etanolo al 70% (diluito con acqua priva di RNasi).
16. Incubare a temperatura ambiente per 3,5-4 ore.

2. ibridazione

1. Portare la formammide a temperatura ambiente (per aliquota di 50 mL, ci vogliono ~ 30 min in bagno d'acqua).
   Nota: Non aprire la bottiglia di formammide fino a quando la bottiglia raggiunge la temperatura ambiente per evitare l'ossidazione della formammide.
   Attenzione: Formammide è tossica. Gestire e smaltire secondo le normative istituzionali.
2. Preparare il tampone di lavaggio di formammide 10% in una provetta conica da 15 mL.
3. Centrifugare le provette a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere 500 µ l di etanolo al 70% di pipettaggio. Pipetta da delicatamente su e giù per risospendere le cellule rimanenti e quindi trasferire le cellule ai tubi a bassa aderenza.
   Nota: Utilizzando i tubi a bassa aderenza notevolmente riduce la perdita di cellule durante i lavaggi successivi.
4. Centrifugare le provette nuovamente a ~ 376 x g per 3 min. Rimuovi tutte l'etanolo di pipettaggio.
5. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio di 10% formammide e delicatamente dispensare su e giù 2 - 3 volte per risospendere le cellule.
6. Permettono alle cellule di riposare a temperatura ambiente per ~ 20 min durante la preparazione della soluzione di ibridazione. Per 1 campione, mescolare 50 µ l di tampone di ibridazione (camera Temp.), 5 µ l di 200mm VRC (riscaldato a 65 ˚ c) e 1 µ l di ciascuna sonda (200 nM finale). Per 5 campioni, mescolare 250 µ l di tampone di ibridazione (camera Temp.), 25 µ l di 200mm VRC (riscaldato a 65 ˚ c) e 5 µ l di ciascuna sonda (200 nM finale).
   1. Scongelare il tampone di ibridazione (congelato a-20 ° c) a temperatura ambiente prima dell'apertura del tubo per impedire l'ossidazione di formammide.
   2. Dopo aver aggiunto il 200mm VRC, vortexare per 5-10 s prima di aggiungere le sonde, che sono progettati e acquistati commercialmente e ricostituiti secondo le istruzioni del produttore.
   3. Se due sonde sono co-incubate, aggiungere 1 µ l del 01:10 diluizione di stock sonda #1, come pure 1 µ l del 01:10 diluizione dello stock sonda #2, per fare una diluizione finale di ~ 1: 500 per ogni sonda. La concentrazione necessaria per il migliore rapporto di segnale-rumore deve essere ottimizzato (vedi discussione per dettagli).
7. Centrifugare i campioni a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere il surnatante in rifiuti pericolosi pipettando.
8. Aggiungere almeno 50 µ l di soluzione di ibridazione ad ogni provetta. Scorri i tubi per mescolare.
9. Incubare a 30 ˚ c su un tamburo rullo per almeno 16 ore al buio.

Giorno 2/3 giorno

3. lavaggio e imaging

1. Portare formammide a temperatura ambiente.
2. Preparare il tampone di lavaggio di 10% formammide (FWB) in una provetta conica da 15 mL.
3. Togliere le provette dal tamburo rullo e metterli in una scatola rivestita di lamina al riparo dalla luce.
4. Centrifugare i campioni a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere il surnatante in rifiuti pericolosi pipettando.
5. Risospendere in 1 mL di 10% FWB pipettando delicatamente su e giù 2 - 3 volte.
6. Incubare a 30 ˚ c per 30 min (non rotante) nella casella coperto di stagnola.
7. Centrifugare i campioni a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere il surnatante per rifiuti pericolosi pipettando e lasciare ~ 50 µ l.
8. Nel frattempo, preparare DAPI/FWB in una provetta conica da 15 mL: per 1 esempio, mescolare 1000 µ l di tampone di lavaggio di 10% formammide con 1 µ l di 5 mg/mL DAPI. Per 10 campioni, mescolare 10 mL di tampone di lavaggio 10% formammide con 10 µ l di 5 mg/mL DAPI. Risospendere in 1 mL di DAPI/FWB pipettando delicatamente su e giù 2 - 3 volte.
9. Incubare a 30 ˚ c per 30 min (non rotante) nella casella coperto di stagnola.
10. Scongelare i reagenti anti-candeggina sul ghiaccio.
11. Centrifugare i campioni a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere il surnatante completamente pipettando. Se necessario, centrifugare nuovamente per rimuovere tutti del surnatante.
12. Per i campioni che non sono imaged immediatamente, risospendere il pellet in 50 µ l di tampone di GLOX senza enzimi. Dispensare su e giù 3 - 4 volte per mescolare.
    1. Mantenere tutti i campioni unimaged nella finestra coperto di stagnola a 4 ˚ c fino al momento dell'immagine. Quando si è pronti all'immagine, centrifugare i campioni a ~ 376 x g per 2 minuti e rimuovere il surnatante completamente pipettando. Risospendere in GLOX con enzimi come di seguito.
13. Per i campioni essere imaged immediatamente, aggiungere 15-20 µ l di tampone GLOX con enzimi. Pipetta da delicatamente su e giù per mescolare.
    Nota: Il volume aggiunto può variare a seconda della dimensione del pellet cellulare. Si consiglia di risospendere il pellet in 15 µ l di tampone GLOX con enzimi e controlla la densità delle cellule al microscopio. Se le cellule sono troppo dense (cellule che ragruppa una sopra l'altra), aggiunta tampone GLOX extra con enzimi. Se le celle sono troppo radi, centrifugare il campione e rimuovere ~ 5 µ l di tampone.
14. Pipettare 5 µ l su un vetrino coprioggetti (18 mm x 18 mm, n ° 1) e mettere il vetrino coprioggetto in una diapositiva.
15. Mettere un panno di laboratorio sopra la diapositiva dove sono collocato il vetrino coprioggetti. Premere delicatamente il panno di laboratorio per impostare diapositiva (dovrebbe vedere liquido venuta fuori da tutti e quattro i bordi del coprivetrino).
16. Trasferire la diapositiva alla Camera microscopio in una scatola rivestita con foglio di alluminio.
17. Immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza grandangolari con alto ingrandimento (60-100x) e apertura numerica elevata.
    Nota: Per raccogliere il massimo numero di fotoni emessi dalle sonde smFISH, microscopi confocali non sono consigliate, come limitare significativamente la quantità di luce per essere raccolti. Qui, i dati sono stati raccolti su un microscopio equipaggiato con un 100 X, 1,4 obiettivo NA, usando filtri CY5 (EX632/22, EM679/34) ripreso a 1.3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T; e DAPI (EX390/18, EM435/48), 0.05-0.1 s, T. 32% - 50% Dovrebbe essere acquisita anche un'immagine di riferimento di campo chiaro. Acquisire fette di 15-25 con una dimensione di passaggio di 0.1-0.2 µm, da interamente sotto il fuoco del campo di vista interamente sopra, al fine di garantire che tutti i punti di RNA sono contabilizzati.

4. image Analysis

1. Analizzare i dati di smFISH con smFISH pubblicati tra gli strumenti di analisi come pesce-quant¹⁷ e StarSearch², o con programmi personalizzati, a seconda dei requisiti esatti dell'esperimento.
   Nota: Una pipeline di buona analisi dovrebbe consentire agli utenti di determinare una soglia per separare il vero spot di RNA dallo sfondo e statistiche quali le coordinate X, Y e Z (facoltative) e l'intensità di ogni spot, il numero di punti in ogni cella di output e possibilmente raccordo parametri come un modo per filtrare i falsi rilevamenti.

Representative Results

Per valutare quanto bene il protocollo di smFISH lavorato (evidenziata in Figura 1), abbiamo progettato una serie di 54 sonde che affianca l'open reading frame del gene NDC80 (Figura 2A, parte superiore). La sonda che si trova presso l'estremità 5' è indicata come sonda 1; quello successivo, sonda 2; e la terza, quella sonda 3, ecc. Le 27 sonde assegnato uno strano numero (sonda 1, 3, 5...) sono tutti coniugati alla tintura fluorescente CAL Fluor 590 (CF590); e le 27 sonde assegnate un numero pari (sonda 2, 4, 6...), coniugata con il colorante fluorescente Quasar 670 (Q670). Quindi, questi insiemi di sonda alternati sono spesso noti come sonde "dispari". Dopo l'ibridazione, entrambi gli insiemi sonda dovrebbero etichettare la trascrizione stessa.

Dopo il rilevamento del posto, abbiamo usato alcune misure per giudicare la qualità del set di dati smFISH. Il primo era il grado e la qualità di colocalizzazione per le sonde/dispari. Nel nostro caso, 88% di tutti i punti di smFISH colocalized (Figura 2A e 2B), con più del 95% dei punti entro massimo 2 pixel di ogni altro (Figura 2, accoppiato), che è all'interno del valore atteso dato ogni cromatica e rilevamento aberrazione tra i due canali fluorescenti. In confronto, meno del 10% dei punti spaiati aveva una distanza più vicina-vicino di casa di meno di 2 pixel, mostrando che la probabilità di errore un paio di spot è bassa (Figura 2). Il 12% di punti spaiati sono stati equamente diviso tra i due canali (Figura 2B, confronta i CF590 solo con la sola Q670); e quindi, abbiamo concluso che per questo gene 2.4 kb con una gamma di espressione tra zero a 45 trascrizioni per cella, ~ 94% delle molecole di RNA sono stati accuratamente rilevati in ciascun canale fluorescente. Se il protocollo di smFISH sono stati suboptimale, uno dovrebbe osservare (1) una maggiore frazione delle macchie smFISH con solo uno dei due segnali fluorescenti (non colocalized), e/o (2) le cellule con un rapporto segnale-rumore molto basso o nessun segnale a tutti.

Abbiamo poi chiesto se il rilevamento del segnale smFISH è stato distorto rispetto al numero totale di molecole di RNA per cella. In una popolazione, il numero totale di un particolare RNA in ogni cella si trova in una distribuzione, con alcune cellule che harboring più molecole di RNA rispetto ad altri. Un protocollo di buona smFISH robustamente dovrebbe rilevare il RNA indipendentemente se un numero alto o basso numero di molecole di RNA è presente in ogni cellula. Per verificare ciò, per ogni cella, abbiamo calcolato la frazione dei luoghi smFISH con segnali colocalized e la frazione con solo uno dei due segnali fluorescenti. Dopo il raggruppamento di cellule che avevano lo stesso numero di punti totali per ogni cella, abbiamo calcolato la media frazione di colocalized (accoppiato) o non-colocalized macchie (CF590-Q670 sola o) in un determinato gruppo e rappresentati graficamente questa media in funzione del numero totale di spot per cella (Figura 3). Per ogni categoria di punti, le frazioni erano simili su tutta la gamma del numero totale di punti per ogni cella. Per esempio, confrontando le cellule con un totale di 20 punti fluorescenti per cella contro quelli con un totale di 30 punti, le frazioni media delle macchie colocalized erano simili. Questo risultato ha indicato che il nostro protocollo potrebbe rilevare una molecole di gamma di RNA in una cella (fino a almeno 40 ~ molecole per cella). Se il protocollo lavorato suboptimale, si potrebbe osservare un bias. Ad esempio, potrebbe aumentare la frazione delle macchie con uno solo dei due segnali fluorescenti come il numero totale di punti per ogni cella è aumentato.

Usando questo protocollo ottimizzato, abbiamo esaminato l'espressione del gene NDC80 , che codifica per una proteina del cinetocore, in diverse condizioni di crescita. Il gene NDC80 esprime due isoforme di mRNA: l'isoforma di trascrizione lungo non decodificati, NDC80^luti, ha un'estensione di ~ 400 paia di basi all'estremità 5' in confronto a breve NDC80^ORF isoforma, ma entrambe le trascrizioni condividono la regione di codificazione del gene NDC80 (Vedi schema in Figura 4A). Abbiamo progettato due set di sonde: The CF 590 insieme associa nella regione 5' unica di NDC80^luti; e il set di 670 Q si lega alla regione comune di NDC80^luti e NDC80^ORF. Le trascrizioni di NDC80^luti sono state rilevate come le macchie di smFISH dove i segnali da entrambi sonda imposta colocalized, considerando che la NDC80^ORF trascrizioni erano quelli con il segnale solo da Q 670. A causa delle dimensioni del segmento unico del NDC80^luti, abbiamo potuto solo piastrelle 20 sonde del oligonucleotide lungo questa regione, che è di meno che le sonde consigliate 30 a 48. Così, abbiamo determinato in primo luogo se questo set di sonde robustamente potrebbe rilevare RNA nel nostro protocollo ottimizzato. Per o canale fluorescente, abbiamo rappresentato graficamente il rapporto segnale-rumore (SNR, definita come la varianza dei pixel che circondano un punto riguardante l'intensità spot) contro il segnale rilevato per ogni spot di smFISH e generato un scatterplot per tutti i punti identificato nell'intero campo visivo (immagini di esempio nella Figura 4A ) e trame in Figura 4B. Due popolazioni distinte sono stati chiaramente identificati per entrambi i 670 Q e la sonda CF 590 imposta (ottimizzato, Figura 4B), suggerendo che le macchie di vera smFISH (all'interno dell'area grigia) potrebbero essere separate dal segnale di fondo. Si noti che, in condizioni non ottimali, tale separazione era meno evidente (Suboptimal, Figura 4B).

Abbiamo usato questi insiemi di due sonde per studiare l'espressione di NDC80^luti e NDC80^ORFdurante la crescita vegetativa e meiosi. In cellule vegetative, robusto segnale dal set sonda Q 670 è stato rilevato, ma non dal 590 CF sonda impostato (Figura 5A, vegetativo), concordando con l'osservazione di Macchiarsi nordico che solo l'isoforma corta è stato espresso durante la crescita vegetativa¹⁶ . Questo risultato ha anche suggerito che il set di sonde CF 590 è specifico, producendo basso fondo nel nostro protocollo ottimizzato smFISH. Al contrario, robusto segnale da entrambi i set sonda è stata rilevata nella profase meiotica, e la maggior parte dei luoghi aveva colocalized segnale (Figura 5A, Profase Meiotica). Insieme ad analisi mediante northern blot (figura 5B), questa osservazione ha confermato che l'isoforma lunga NDC80^luti è stato espresso in particolare nella meiosi. Questi due tipi di mRNA sono stati rilevati nel citoplasma (di fuori della regione DAPI), suggerendo che entrambi sono stati esportati dal nucleo, coerenza con il ribosoma profiling dati¹⁸.

Per determinare se sono stati raccolti dati sufficienti per rappresentare accuratamente la variazione biologica intrinseca al nostro set di dati, abbiamo effettuato l'analisi bootstrap utilizzando le statistiche di ogni cella, che comprendeva (1) la frazione della colocalized punti per ogni cella e (2) la frazione delle macchie con uno dei due segnali fluorescenti (CF 590 solo e Q 670 solo). In questa analisi, un programma selezionato casualmente una cella da 437 cellule quantificate per 500 iterazioni. Successivamente, sono state calcolate la media e la varianza delle rispettive statistiche associate a questi 500 celle selezionate. Questo processo è stata poi ripetuto per selezionando in modo casuale due celle da tutte le cellule, senza sostituzione; e poi per la selezione casuale di tre celle, ecc. fino a quando uno la metà della dimensione del set di dati totale è stato raggiunto. La varianza nel set di dati plateaued dopo ~ 40 cellule, suggerendo che, dopo questo punto la maggior parte della variazione nella media è intrinseca di dati anziché un artefatto di sottocampionamento (Figura 6, interno). Questo effetto è diventato più evidente quando abbiamo rappresentato graficamente la varianza del campione divisa per la media del campione, in funzione del numero di cellule campionate in ogni ciclo di iterazione (Figura 6). Con i dati riportati, il cambiamento nella varianza è diventato attenuandosi piccolo dopo ~ 60 celle. Il numero delle cellule quantificato in un esperimento di smFISH deve superare il numero minimo di cellule necessarie per conseguire una media stabile e su un altopiano della varianza. Nel nostro caso, abbiamo quantificato oltre 95 cellule per campione, per replica. Il numero totale di cellule (> 400) ben superato il numero minimo di cellule (~ 60) necessario per riflettere la media della popolazione.

Con un su misura per il programma di Matlab¹⁶, cellule vegetative sono state trovate per avere una mediana di 5 NDC80^ORF trascrizioni per cella, considerando che in cellule Profase Meiotica, la mediana significativamente è sceso a 4 trascrizioni per cella (a due code Wilcoxon Somma di Rank test, p = 0,026) (Figura 7). Il numero mediano di NDC80^luti trascrizioni per cella era 21 trascrizioni, e 100% delle cellule ha espresso le trascrizioni NDC80^luti . Siamo rappresentati graficamente la frazione delle cellule con un determinato numero di trascrizioni come un istogramma di frequenza relativa, graduale, perché il numero di molecole di mRNA è una discreta quantità. Il più grande bidone di ciascun istogramma è stato normalizzato alla stessa altezza.

Figura 1: Flow-Chart per il protocollo di smFISH. Le cellule sono fissate con formaldeide a temperatura ambiente per 20 minuti o a 4 ˚ c durante la notte, per esempi di crescita vegetativa e meiotica, rispettivamente. Dopo il lavaggio in tampone B tre volte, le cellule vengono digerite da zymolyase fino a circa il 70% - 90% delle cellule sono digeriti. I campioni digeriti sono poi lavati una volta con tampone B per rimuovere il zymolyase e successivamente permeabilizzati in 70% di etanolo (EtOH) per ~3.5 ore. Per preparare per l'ibridazione, campioni vengono incubati in primo luogo nel 10% formammide tampone di lavaggio (FWB) per ~ 20 min. Successivamente, i campioni sono risospesi in ~ 50 µ l di soluzione di ibridazione, che contiene le sonde fluorescenti, per una notte incubazione al buio a 30 ˚ c. Dopo l'ibridazione, i campioni sono incubati in 10% FWB per 30 min per lavare via le sonde in eccesso e poi incubati in 10% FWB con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per macchiare il DNA. Per l'esempio ripreso immediatamente dopo l'incubazione di FWB/DAPI, il campione è risospeso nel buffer GLOX completati con catalasi, Trolox ed il glucosio ossidasi (GLOX + enz); considerando che, altri esempi sono risospese nel buffer GLOX senza enzimi e conservati a 4 ° c fino a ~ 3 ore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: valutazione della qualità smFISH usando le sonde dispari. (A) top: Schema per il set di sonda/dispari. Sonde del oligonucleotide cinquantaquattro affiancamento del gene di NDC80 sono stati progettati. Le sonde dispari sono state etichettate con un fluoroforo (CF590, mostrato in magenta) e le sonde pari, con un altro fluoroforo (Q670, visualizzato in verde). Fondo: Rappresentante smFISH immagini di cellule Profase Meiotica acquisite utilizzando i set di sonda/dispari. Campioni sono stati prelevati 6 ore dopo celle (UB8144) sono state trasferite a mezzo di sporulazione, un tempo, quando queste cellule sono state arrestate nella profase meiotica. DNA è stato macchiato con DAPI (mostrato in blu). Immagini vengono visualizzate come le proiezioni di massima intensità degli z-stack. Barra della scala: 5 µm. (B) percentuale dei punti smFISH accoppiati o spaiati ottenuta utilizzando i set di sonda/dispari. Un totale di 428 Profase Meiotica celle sono stati analizzati, pool da due esperimenti indipendenti. Questa figura è stata modificata da Figura 2-supplemento di figura 4 di Chen et al. ¹⁶ (C) A cumulativo densità funzione (CDF) della distanza tra ogni coppia di punti accoppiati e distanza tra il punto più vicino di un spot spaiati. Per ogni punto rilevato in un canale fluorescente, l'algoritmo "k vicinato" è stata applicata per identificare il punto rilevato più — e la distanza fino a quel punto — nel canale complementare. Localizzazioni che erano reciproci vicini sono stati considerati per essere accoppiato, ed è stato generato un nuovo elenco i rilevamenti accoppiati, CF590-, Q670 sola e di registrazione. Per ogni categoria di rilevamenti, un istogramma CDF delle distanze era tracciato in Matlab, confermando che correttamente accoppiati punti infatti erano molto più vicini a distanza rispetto a quelli senza una corrispondente posto in altro canale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: numero di frazioni di macchie accoppiati e non accoppiati, in funzione del RNA totale per la cellula. Per verificare se la rilevazione e l'associazione dei punti smFISH era prevenuto a livelli di espressione diversa, le singole celle sono state raggruppate per espressione di RNA totale. Le frazioni di media di rilevamenti accoppiati, CF590-, Q670 sola e sono state calcolate per ogni gruppo di celle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Valutazione della qualità dei dati smFISH generati utilizzando le sonde progettate per NDC80^luti e NDC80^ORF mRNAs. Le sonde Q 670 (mostrate in verde) si ibridano nella regione comune condiviso tra NDC80^luti e NDC80^ORF mRNA, mentre le sonde CF 590 (mostrate in magenta) si ibridano nella regione 5' unica di NDC80^luti . (A) immagini di smFISH rappresentante di NDC80^luti e NDC80^ORF nella profase meiotica, acquisito meno ottimizzato rispetto a condizioni non ottimali. Ceppi UB8144 (ottimizzato condizione) e UB1337 (condizione non ottimale) sono state indotte per subire la meiosi e risolto durante la profase meiotica. Questi due ceppi harbor sistemi di sincronizzazione diversi per indurre la meiosi, ma l'uso di entrambi i sistemi non pregiudica la qualità di smFISH (dati non mostrati). In condizioni non ottimali, le cellule erano fissate a temperatura ambiente per 20 minuti (nessuna fissazione durante la notte), digerito con zymolyase senza VRC completati ed ibridato in una concentrazione più bassa di VRC. Immagini vengono visualizzate come le proiezioni di massima intensità degli z-stack. DNA è stato macchiato con DAPI (mostrato in blu). Barra della scala: 5 µm. (B) scatterplot visualizzando il rapporto segnale-rumore (SNR) e il segnale di ogni smFISH spot rilevati nel campo visivo presentato in Figura 4A, o canale fluorescente, nonché per le condizioni non ottimali o ottimizzate. Nelle condizioni ottimizzate, erano presenti due popolazioni dei luoghi smFISH. Le macchie di smFISH vero sono state situate all'interno dell'area grigia, separa il segnale di fondo. In condizioni non ottimali, singoli mRNA era difficili da distinguere ad occhio, e la separazione tra il vero spot e lo sfondo dopo aver eseguito il software di rilevamento spot era meno evidente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Espressione di NDC80^luti e NDC80^ORF trascrizioni sono temporaneamente controllate. (A) immagini di smFISH rappresentante di NDC80^luti e NDC80^ORF durante la crescita vegetativa e meiosi. Quando le cellule (UB8144) erano in crescita esponenziale in mezzo nutritivo ricco, sono stati prelevati campioni vegetativi. Profase Meiotica campioni sono stati prelevati 6 ore dopo celle (UB8144) sono state trasferite a mezzo di sporulazione, un tempo, quando queste cellule sono state arrestate nella profase meiotica. Le sonde Q 670 (mostrate in verde) si ibridano nella regione comune condiviso tra NDC80^luti e NDC80^ORF mRNA, mentre le sonde CF 590 (mostrate in magenta) ibridano ad unico 5' regione di NDC80^luti . DNA è stato macchiato con DAPI (mostrato in blu). Ogni cella è stato messo in scena dal segnale di Zip1-GFP, un indicatore per la profase meiotica. Il nostro protocollo di smFISH conserva segnale forte di GFP senza ulteriori modifiche. Crescita vegetativa: Zip1-GFP negativo. Profase Meiotica: Zip1-GFP positiva. Immagini vengono visualizzate come le proiezioni di massima intensità degli z-stack. Barra della scala: 5 µm. Questa figura è stata modificata da Figura 2 di Chen et al. ¹⁶. (B) NDC80^ORF, NDC80^lutie il livello di proteina (Ndc80p) Ndc80 durante la meiosi (UB4074). NDC80^luti e NDC80^ORF livelli sono stati determinati mediante northern blot e Ndc80p livello è stato determinato da immunoblot anti-V5 presso i punti di tempo indicato. Hxk1p, caricamento controllo per immunoblot. Come ceppo UB8144, questo ceppo inoltre harbors il GAL4 pGAL-NDT80-ER sincronizzazione sistema^19,20. Cellule sono state trasferite al medium di sporulazione alle ore 0 e rilasciate dall'arresto di pachitene da aggiunta di β-estradiolo 6 ore più tardi. La trascrizione NDC80^luti robustamente è stata rilevata nella profase meiotica/S, mentre il NDC80^ORF trascrizioni era prevalentemente presente prima dell'entrata meiotica (0 ore) e durante le divisioni meiotiche (7-9 ore). Questa figura è stata modificata da Figura 6J di Chen et al. ¹⁶ Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 6: Bootstrap analisi eseguita per esempi di Profase Meiotica di Figura 5 . Tutte le celle quantificate sono state riunite, e un determinato numero (n) delle cellule sono state campionate casualmente 500 volte. La media e il 95% intervallo di confidenza sono stati calcolati per la frazione di mRNA accoppiati e non accoppiati per cella. Questi dati sono stati tracciati per ogni scelta del numero n (Inset). L'altopiano in varianza è stata visualizzata tracciando la varianza del campione divisa per la media, in funzione del numero di cellule (n) campionate. Il numero totale di cellule misurata (437) notevolmente ha superato il numero al quale l'errore stabilizzato (~ 60 celle), che indica che i dati aggiuntivi non migliorerebbe la fiducia nelle misure. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: quantificazione dei dati smFISH mostrati Figura 5 , nel grafico come gli istogrammi di frequenza relativa delle cellule con un determinato numero di NDC80^luti e NDC80^ORF trascrizioni per cella, utilizzando i dati riuniti da tre esperimenti indipendenti. La linea tratteggiata indica il numero mediano di NDC80^luti e NDC80^ORF trascrizioni per cella. Ogni istogramma è stato normalizzato in modo che l'altezza massima bin era lo stesso in tutti gli istogrammi. Un numero totale di 637 cellule sono stato analizzato per crescita vegetativa e 437 per Profase Meiotica. Due code Wilcoxon Rank Sum test è stato eseguito per NDC80^luti e NDC80^ORF, rispettivamente, confrontando campioni di Profase Meiotica e vegetativa. Questa figura è stata modificata da Figura 2D di Chen et al. ¹⁶ Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Tampone B (1 L di brodo: 1,2 M sorbitolo; 0.1 M tampone fosfato di potassio, pH 7.5)	1 x
Acqua priva di nucleasi	500 mL
Sorbitolo	218,6 g
KH2PO4	2,18 g
K2HPO4	14,62 g
Acqua priva di nucleasi	Portare al volume finale di 1L
* Conservare a 4 ˚ c in aliquote da 50 mL dopo filtro sterilizzante
Zymolyase 100T (10 mg/mL)
* Conservare a-20 ˚ c in aliquote
Sciogliere la polvere di zymolyase 10 mg in 1 mL di acqua MilliQ
E. coli tRNA (10 mg/mL)
* Conservare a-20 ˚ c in aliquote
Sciogliere la polvere di tRNA di 10 mg in 1 mL di acqua MilliQ
etanolo al 70% (50 mL)	1 x (mL)
Etanolo puro	35
Acqua priva di nucleasi	15
* Conservare a temperatura ambiente
Tampone di ibridazione (10 mL)	1 x (mL)
50% Destrano solfato	2
E. coli tRNA (10 mg/mL)	1
ribonucleoside di Vanadyl 200mm complesse (VRC)	0.1
BSA, 50 mg/mL	0,04
20 x SSC	1
Formammide	1
Acqua priva di nucleasi	4.86
* Conservare a-20 ˚ c in aliquote 250-µ l o 500-µ l
tampone di lavaggio 10% formammide (10 mL)	1 x (mL)
Formammide a temperatura ambiente	1
20 x SSC	1
Acqua priva di nucleasi	8
* rendere fresco, vortice per 20-30 anni per mescolare
soluzione glucosata al 10%
* Conservare a 4 ° c in aliquote dopo filtro sterilizzante
Sciogliere 1 g di glucosio in 10 mL di acqua priva di nucleasi
Glucosio ossidasi
* Conservare a-20 ˚ c in aliquote
Sciogliere l'ossidasi di glucosio 3,7 mg in 1 mL di 50mm NaOAc, pH 5
Anti-candeggina (GLOX) Buffer, senza enzimi (1 mL)	1 x (µ l)
10% di glucosio in acqua priva di nucleasi	40
1 M Tris, pH 8.0	10
20 x SSC	100
Acqua priva di nucleasi	850
* rendere fresca, potete anche conservare le aliquote a 4 ˚ c
Anti-candeggina (GLOX) Buffer, con enzimi (50 µ l)	1 x (µ l)
Catalasi (vortice leggermente, si installa facilmente)	0,5
Glucosio ossidasi	0,5
100 mM Trolox (disciolto in etanolo)	1
Buffer di GLOX	50
* rendere fresca ogni volta, preparare il ghiaccio, può essere conservato a 4 ° c per 2-3 ore

Tabella 1. Buffer e media

Discussion

Il protocollo presentato qui è derivato da altri protocolli pubblicati smFISH^2,3,21,22,23ed è specificamente ottimizzato per lo sfondo del ceppo di lievito SK1. I parametri ottimizzati incluso il numero di cellulare, durata di fissazione, velocità di centrifugazione e durata, durata di digestione, buffer di digestione, sonda concentrazione e tampone di ibridazione. Altri parametri come la temperatura di ibridazione e durata non sono state ottimizzate. In questa sezione, condividiamo alcune note che aiuterebbero a adattare il presente protocollo a qualsiasi sfondo del ceppo di lievito e le condizioni di crescita di interesse.

La parete cellulare del lievito è una grande sfida contro ottenere immagini di alta qualità smFISH in lievito perché la parete cellulare impedisce la penetrazione della sonda. La digestione incompleta della parete delle cellule di zymolyase conduce alla inefficiente ibridazione del probe e alta variabilità della cellula--cellula nel segnale. Tuttavia, digestione eccessiva può rendere le cellule troppo fragile, portando a significativi cella perdita durante le fasi di lavaggio e delle cellule di scoppio durante la preparazione del vetrino per l'imaging. Così, ottimizzando la durata della digestione è cruciale. Si consiglia di condurre un esperimento pilota smFISH digerendo lo stesso campione per diverse quantità di tempo. Nel nostro caso, abbiamo ottenuto i migliori dati di smFISH se ci siamo fermati la digestione quando ~ 80% delle cellule è diventato non-rifrangente. In genere, per la stessa condizione di crescita, diversi ceppi mutanti genetici possono essere digeriti con tempi simili. Tuttavia, la durata della digestione differisce rispetto tra le diverse condizioni di crescita e le diverse fasi della meiosi nel lievito gemmante. Una volta determinata la tempistica, la qualità del smFISH è riproducibile. Nota che ceppi mutanti con la sintesi della parete cellulare difettoso e/o composizione, digestione potrebbe essere completata in meno di 15 minuti di uso di diversi lotti di zymolyase cambiano anche leggermente i tempi di digestione.

Concentrazione ottimale sonda è necessario per raggiungere un elevato rapporto segnale-rumore. Abbiamo progettato e acquistato le nostre sonde smFISH commercialmente. Buone sonde (spesso 20-mers) dovrebbero avere una percentuale di GC che vanno dal 35% al 45%, una distanza minima di 2 paia di basi tra sonde e bassa reattività crociata. Abbiamo usato una finestra di progettazione web-based sonda dal produttore per generare un elenco di sonde, e se c'erano abbastanza sonde da scegliere, useremmo l'algoritmo BLAST nel Database del genoma di Saccharomyces per eliminare le sonde con più di 17 coppie di basi sovrapposte con altre regioni genomiche. Abbiamo scelto il più fotostabile colorante fluorescente (CAL Fluor 590) per il set di sonda che accoppia alla regione unica di NDC80^luti (CF 590) perché in questo set, il numero di sonde che ha soddisfatto tutti i criteri di cui sopra (20 Sonde) era inferiore al numero minimo consigliato dal produttore (~ 25 sonde). Dopo ricostituzione la soluzione della sonda seguendo le istruzioni del produttore, abbiamo fatto un 01:10 diluizione della soluzione di riserva e memorizzato la soluzione diluita in aliquote di 5-µ l a-20 ˚ c. Ogni aliquota è stata usata solo una volta. Per l'ottimizzazione, uno dovrebbe fare seriale diluizioni dal 01:10 diluito soluzione e prova che la concentrazione produce il miglior rapporto segnale-rumore. Si consiglia di effettuare una serie di diluizione di 1: 250, 1: 500, 1: 1000 e 1: 2000 dallo stock originale. Nel nostro caso, un fattore di diluizione di 1: 500 ha provocato il miglior rapporto segnale-rumore, per il CF 590 e la Q 670 set sonda.

Tempo di fissaggio ottimale è anche critico per il successo smFISH in lievito. Abbiamo trovato quella fissazione durante la notte a 4 ˚ c, anziché fissaggio a temperatura ambiente per 20 min, ha migliorato significativamente la coerenza e la qualità dei risultati smFISH per campioni meiotici. Anche se non è stato testato come una notte fissazione potrebbe avere un impatto campioni vegetativi, fissazione a temperatura ambiente ha funzionato bene per questa condizione di crescita. Così, per ottimizzare il protocollo smFISH per nuovi ceppi o condizioni di crescita, si consiglia a partire con il tempo breve fissazione a temperatura ambiente e aumentando il tempo di fissazione se alta variabilità del segnale viene rilevato.

Rispetto ad altri protocolli pubblicati^3,22,23, il nostro protocollo utilizza l'inibitore di RNAsi VRC durante digestione e una maggiore concentrazione di VRC durante l'ibridazione. Aggiunta di VRC in questi due passaggi migliorato la consistenza dei risultati smFISH, possibilmente con una migliore conservazione molecole di RNA contro attività di nucleasi, che possono essere introdotti mediante il mix di zymolyase (l'enzima è purificata da estratti grezzi e può contenere RNasi contaminanti). Pertanto, si consiglia di utilizzare la quantità di VRC come elencati nel nostro protocollo o persino più alte concentrazioni di VRC per l'ottimizzazione.

Una parte significativa delle cellule può essere persa durante le fasi di lavaggio in tampone B e il tampone di lavaggio di formammide. Per ridurre la perdita di cellule, uno potrebbe aumentare la velocità di centrifugazione. Nel nostro caso, usando un'ad alta velocità (21.000 x g) per appallottolare i nostri campioni durante il tampone B lava perdita delle cellule significativamente ridotta. Tuttavia, le cellule diventano molto fragili dopo zymolyase digestione, quindi non è consigliabile modificare la velocità di centrifugazione. Al contrario, si consiglia di utilizzare i tubi di bassa aderenza da scientifica USA, che molto utile per agglomerare le cellule durante i lavaggi in tampone di lavaggio di formammide. Nel complesso, il nostro protocollo è in grado di generare costantemente un monostrato di cellule abbastanza dense per l'imaging efficiente. In genere, 7 campi di vista dovrebbe produrre > 130 celle adatte per la quantificazione.

Infine, è importante determinare i parametri ottimali per e le uscite necessarie da analisi dell'immagine. Per rilevare punti di smFISH, programmi di analisi pubblicata filtrare le immagini raw con kernel gaussiano per rimuovere il segnale di fondo e chiedono agli utenti di determinare il rapporto segnale-rumore da utilizzare per ogni set di immagini^2,17. Purtroppo, non c'è attualmente un unico standard con cui vengono determinati i parametri appropriati, e così alcune prove empiriche di queste diverse impostazioni è necessaria. Per impostare i parametri necessari per ognuno di questi passaggi, è necessario in modo iterativo diversi set di parametri di input e controllare quanto bene i risultati ottenuti da ogni insieme che corrisponde dal conteggio manuale in alcune cellule rappresentante. Una volta che viene trovato un set di parametri, può essere utilizzato per la maggior parte delle immagini ottenute nonostante le diverse condizioni di crescita e di ambiti di provenienza genetici.

Inoltre, uno può testare se-intensità massima di proiezione delle immagini smFISH può essere eseguita prima di quantificazione²². Questo passaggio semplifica l'algoritmo di rilevamento spot e riduce notevolmente i tempi di formazione immagini, anche se a costo di alcune informazioni potenzialmente utili su singoli punti, ad esempio la loro localizzazione subcellulare. Nel nostro caso, il numero di molecole di mRNA prodotta dal gene NDC80 era abbastanza basso che le macchie erano ben separate dopo questa elaborazione (non è rara per le trascrizioni in erba lievito^3,7). In casi dove la colocalizzazione analisi è critico, la pipeline di analisi ha bisogno determinare la posizione di ogni spot di smFISH in ogni canale per valutare colocalizzazione. In base alle specifiche domande viene chiesto, altre informazioni come l'intensità di ogni spot possono anche bisogno di essere estratto dalla pipeline per ulteriori analisi. Ottimizzando la chiave interviene il protocollo e la pipeline di analisi di immagine è fondamentale per ottenere alta qualità di smFISH dati per studiare la questione di interesse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA, RNase-free (50 mg/mL)	Ambion	AM2616	Store at -20 °C.
Catalase	Sigma	C3515	Store at 4 °C for short-term. Vortex before use.
DAPI	Sigma	D9564	Store at -20 °C after reconstitution in water. Protect from light.
50% Dextran Sulfate	Milli Pore	S4030	Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.
E. coli tRNA	Sigma	R4251	Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water.
Ethanol (100%, 200 proof)	various		Flammable.
37% Formaldehyde	Fisher	F79-500	Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.
Formamide	Ambion	AM9342	Store at 4 °C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.
Glucose	various		Store at 4 °C after dissolving in nuclease-free water.
Glucose oxidase	Sigma	G2133	Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.
Nuclease-free water	Ambion	AM9932	Store at room temperature.
Potassium phosphate (monobasic and dibasic)	various		Store at room temperature.
Probe library, diluted in TE, pH 8.0	Biosearch Technologies		Store at -20 °C in aliquots (5 µL) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.
Sorbitol	various		Store at room temperature.
20X SSC	Ambion	AM9763	Store at room temperature.
TE, pH 8.0	Ambion	AM9849	Store at room temperature.
1 M Tris, pH 8.0	Ambion	AM9856	Store at room temperature.
Trolox	Sigma	238813	Store at -20 °C in aliquots.
200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)	NEB	S1402S	Store at -20 °C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.
Zymolyase 100T	MP Biomedicals	08320932	Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water.
Low-adhesion tubes	USA Scientific	1415-2600	Store at room temperature.