Denne enkelt molekyle fluorescens i situ hybridisering protokol er optimeret til at opgøre antallet af RNA molekyler i spirende gær under vegetativ vækst og meiose.
Enkelt molekyle fluorescens i situ hybridisering (smFISH) er en kraftfuld teknik til at studere genekspression i enkelte celler på grund af dens evne til at opdage og tæller enkelte RNA molekyler. Supplement til dyb sekventering-baserede metoder, smFISH indeholder oplysninger om den celle-til-celle variation i afskriften overflod og subcellulært lokalisering af en given RNA. For nylig, vi har brugt smFISH til at studere udtryk af genet NDC80 under meiose i spirende gær, i hvilke to udskrift isoformer eksisterer og kort udskrift isoform har sin hele sekvensen delt med den lange isoform. Du kan trygt identificere hver udskrift isoform, vi optimeret kendte smFISH protokoller og opnået høj konsistens og kvalitet af smFISH data for prøver erhvervet under spirende gær meiose. Her beskriver vi denne optimerede protokol, de kriterier, som vi bruger til at afgøre, om høj kvalitet af smFISH data er indhentet, og nogle tips for at gennemføre denne protokol i andre gærstammer og vækstbetingelser.
Dynamisk regulering af genekspression driver udviklingen af en organisme, samt dens reaktion på miljømæssige stress, infektion og ændringer i stofskiftet. Undersøgelser, der fokuserer på transkriptionel regulering afhængige teknologier, der måler RNA overflod. En sådan metode, betegnes enkelt molekyle fluorescens i situ hybridisering (smFISH), der bruges til påvisning af individuelle RNA molekyler i enkelt celler1,2. Denne metode giver mulighed for måling af celle til celle variabiliteten i genekspression og bestemmelse af intracellulære RNA lokalisering.
I den mest almindeligt anvendte smFISH teknik kræver påvisning af en individuel RNA-molekyle flere korte DNA-sonder (ofte ~ 48 20-mer sonder), som supplerer målet RNA og er konjugeret til den samme fluorescerende farvestof. Bindingen af en enkelt fluorescerende probe resulterer i svagt signal, men signalet fra ensemble af alle sonder er robust. Denne funktion i høj grad forbedrer signal-støj-forholdet fordi selv om en enkelt sonde kan udstille off mål bindende, sådant signal forventes at blive meget svag sammenlignet med target RNA-molekyle3. Inden for fejl af registrering, kan antallet af RNA molekyler tælles og sammenlignes på tværs af forskellige vækstbetingelser og blandt forskellige mutanter.
Siden sin første udvikling, er smFISH blevet tilpasset for at studere forskellige aspekter af gen expression4, såsom transskription brudforlængelse1,2, splejsning5,6, transcriptional sprængfyldt7 , 8 , 9, intracellulære allel udtryk10,11,12, og RNA lokalisering13,14,15. For nylig, vi har brugt denne metode til at studere udtryk for to udskrift isoformer af det samme gen, hvor kort udskrift isoform (NDC80ORF) har sin hele sekvensen delt med den lange isoform (NDC80luti )16. Til entydigt for at identificere de to mRNA isoformer, vi brugte to sonde sæt: ét sæt er specifikke for den unikke sekvens af NDC80luti, og det andet sæt, konjugeret med et andet fluorescerende farvestof, binder til det fælles område af de to isoformer. NDC80luti RNA er identificeret som en colocalized spot med begge fluorescerende signaler, der henviser til den NDC80ORF RNA er den, der indeholder kun signalet fra den fælles sonde sæt. Da antallet af de NDC80ORF afskrifter beregnes efter en metode, “subtraktion”, høj effektivitet af sonden hybridisering og et højt signal / støj-forhold er nødvendige for at selvsikkert identificere smFISH steder og reducere fejl formering.
Dette papir beskriver en optimeret protokol for at udføre smFISH i spirende gær Saccharomyces cerevisiae. I denne protokol, den celle nummer, fiksering tid, fordøjelsestid, fordøjelsen buffer, sonde koncentration og hybridisering buffer, der bruges til smFISH forsøgene blev optimeret SK1 stamme baggrund for S. cerevisiae gennemgår vegetativ vækst eller meiose. Vi bemærker imidlertid også i dette håndskrift: (1) metoden til at kontrollere kvaliteten af smFISH data efter billede erhvervelse og (2) trinnene i protokollen, som kan kræve yderligere optimering for forskellige stamme baggrunde og vækstbetingelser.
Protokollen præsenteres her er afledt af andre udgivne smFISH protokoller2,3,21,22,23, og er specielt optimeret til gær stamme baggrund SK1. Parametrene optimeret inkluderet celle nummer, fiksering varighed, centrifugering hastighed og varighed, fordøjelsen varighed, fordøjelsen buffer, sonde koncentration og hybridisering buffer. Andre parametre såsom hybridisering temperatur og varighed var ikke optimeret. I dette afsnit deler vi et par noter, der ville hjælpe med at tilpasse denne protokol til enhver gær stamme baggrund og interesse vækstbetingelser.
Cellevæggen af spirende gær er en stor udfordring mod at opnå høj kvalitet smFISH billeder i spirende gær, fordi cellevæggen forhindrer sonde penetration. Ufuldstændig fordøjelse af cellevæggen af zymolyase fører til ineffektive hybridisering af sonder og høj celle til celle variabilitet i signal. Men over fordøjelsen kan gøre celler for skrøbelige, fører til betydelige celle tab under vask trin og celle brister under dias forberedelse til billedbehandling. Således er optimere fordøjelsen varighed afgørende. Vi anbefaler, at gennemføre en pilot smFISH eksperiment ved at fordøje den samme prøve for forskellige mængder af tid. I vores tilfælde opnået vi de bedste smFISH data hvis vi stoppede fordøjelsen når ~ 80% af celler blev ikke-brydningsindeks. Typisk, for den samme vækst betingelse, forskellige genetiske mutantstammen kan fordøjes med lignende timing. Varigheden af fordøjelsen adskiller sig dog sammenlignet blandt forskellige vækstbetingelser og forskellige stadier af meiose i spirende gær. Når timingen er fastslået, er at kvaliteten af smFISH reproducerbare. Bemærk kan at for mutantstammen med defekte cellevæg syntese og/eller sammensætning, fordøjelsen kan udfyldes på mindre end 15 min. brug af forskellige batches af zymolyase også lidt ændre fordøjelsen timing.
Optimal sonde koncentration er nødvendig for at opnå et højt signal / støj-forhold. Vi designet og købt vores smFISH sonder kommercielt. God sonder (ofte 20-mers) bør have en procentdel af GC spænder fra 35% til 45%, en minimumafstand af 2 basepar mellem sonder og lav krydsreaktivitet. Vi brugte en web-baseret sonde designer fra producenten til at generere en liste af sonder, og hvis der var nok sonder at vælge imellem, vi ville bruge BLAST algoritme i Saccharomyces genom Database hen til eliminere sonderne med mere end 17 basepar overlappede med andre genomisk regioner. Vi valgte den mere photostable fluorescerende farvestof (CAL Fluor 590) for de sonde der anneals til den unikke region NDC80luti (CF 590) fordi i dette sæt, antallet af sonder, der opfyldte alle de ovenstående kriterier (20 sonder) var lavere end den minimumsantal, der anbefales af producenten (~ 25 sonder). Efter erstatningsgodtgørelse sonde løsning efter producentens anvisninger, vi gjorde en 1:10 fortynding af stamopløsningen og gemt den fortyndede opløsning i 5-µL alikvoter ved-20 ˚C. Hver delprøve blev brugt kun en gang. For optimering, bør man gøre serielle fortyndinger fra 1:10 fortyndet løsning og test hvilken koncentration giver det bedste signal / støj-forhold. Vi anbefaler, at gøre en fortyndingsrække af 1:250, 1: 500, 1:1000 og 1: 2000 fra det oprindelige lager. I vores tilfælde resulterede en 1: 500 fortyndingsfaktoren i det bedste signal-støj-forholdet for både CF 590 og Q 670 sonde sæt.
Optimal fiksering tid er også afgørende for vellykket smFISH i spirende gær. Vi fandt at natten fiksering på 4 ˚C, snarere end fastsættelse ved stuetemperatur i 20 min., væsentligt forbedret sammenhæng og kvalitet af smFISH resultaterne meiotiske prøver. Men vi ikke har testet, hvordan natten fiksering kan påvirke vegetativ prøver, fiksering ved stuetemperatur fungeret godt for denne vækst tilstand. Således, for at optimere smFISH protokol for nye stammer eller vækstbetingelser, anbefaler vi starter med korte fiksering tid ved stuetemperatur og øge fiksering tid hvis høj variation af signal er stødt.
Sammenlignet med andre publicerede protokoller3,22,23, bruger vores protokol RNase-hæmmer VRC under fordøjelsen og en højere koncentration af VRC under hybridisering. Tilsætning af VRC i disse to trin forbedret sammenhængen i smFISH resultaterne, eventuelt ved bedre bevare RNA molekyler mod nukleasen aktivitet, som kan indføres ved zymolyase mix (enzymet er renset fra rå ekstrakter og kan indeholde RNase forurenende stoffer). Dermed, vi anbefaler at bruge mængden af VRC som anført i vores protokol eller endnu højere koncentrationer af VRC for optimering.
En betydelig del af cellerne kan gå tabt under vask skridt i både Buffer B og formamid wash buffer. For at reducere celletab, kunne man øge centrifugering hastighed. I vores tilfælde vasker ved hjælp af en høj hastighed (21.000 x g) for at sammenpresse vores prøver under Buffer B betydeligt reduceret celletab. Dog bliver celler meget skrøbelig efter zymolyase fordøjelse, så ændre centrifugering hastighed ikke anbefales. I stedet, vi foreslår at bruge lav friktion rør fra USA videnskabelige, som i høj grad hjælper sammenpresse cellerne under vasker i formamid wash buffer. Samlet set kan vores protokol konsekvent generere en éncellelag af cellerne tætte nok til effektiv billeddannelse. Typisk, 7 felter synspunkt bør give > 130 celler egnet til kvantificering.
Endelig er det vigtigt at fastslå de optimale parametre til og udgange fra billedanalyse. For at registrere smFISH steder, offentliggjorte analyse programmer almindeligt filtrere for raw-billeder ved hjælp af Gaussisk kerne fjerne baggrunden signal, og beder brugerne til at bestemme signal-støj-forholdet til brug for hvert sæt af billeder2,17. Desværre, der er i øjeblikket ikke en fælles standard, de korrekte parametre bestemmes, og så nogle empiriske test af disse forskellige indstillinger er nødvendige. Hvis du vil angive de parametre, der er nødvendige for hvert af disse trin, skal man iterativt input forskellige sæt af parametre og tjekke hvor godt resultaterne fra hvert sæt kampe, fra manuel optælling i et par repræsentative celler. Når et sæt af parametre, der er fundet, kan det bruges til de fleste af billederne opnået trods forskellige vækstbetingelser og genetiske baggrunde.
Derudover kan man teste hvis maksimal intensitet projektion af smFISH billeder kan udføres før kvantificering22. Dette trin forenkler spot opdagelse algoritme og reducerer billeddannelse tid, selv på bekostning af nogle potentielt nyttige oplysninger om enkelte steder, såsom deres subcellulært lokalisering. I vores tilfælde var antallet af mRNA molekyler produceret af NDC80 -gen lav nok, at steder var godt adskilt efter denne behandling (ikke ualmindeligt for udskrifter i spirende gær3,7). I tilfælde hvor colocalization analyse er kritisk skal analyse rørledningen bestemme placeringen af hver smFISH plet i hver kanal til at vurdere colocalization. Afhængigt af de specifikke spørgsmål bliver bedt, andre oplysninger såsom intensiteten af hver plet skal muligvis også udvindes fra pipeline for yderligere analyse. Optimere nøglen trin i protokollen og billede analyse rørledningen er afgørende for at opnå høj kvalitet af smFISH data til at undersøge spørgsmålet om interesse.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Anne Dodson og Stephanie Heinrich for råd om, hvordan du optimerer smFISH protokol, Xavier Darzacq til hjælp med analyse platform, Haiyan Huang for forslag om den statistiske analyse. Dette arbejde blev støttet af midler fra March of Dimes (5-FY15-99), Pew Charitable Trusts (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) og Glenn Foundation til EÜ og et NSF Graduate Research Fellowship Grant. DGE-1106400 til JC.
BSA, RNase-free (50 mg/mL) | Ambion | AM2616 | Store at -20 °C. |
Catalase | Sigma | C3515 | Store at 4 °C for short-term. Vortex before use. |
DAPI | Sigma | D9564 | Store at -20 °C after reconstitution in water. Protect from light. |
50% Dextran Sulfate | Milli Pore | S4030 | Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience. |
E. coli tRNA | Sigma | R4251 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water. |
Ethanol (100%, 200 proof) | various | Flammable. | |
37% Formaldehyde | Fisher | F79-500 | Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution. |
Formamide | Ambion | AM9342 | Store at 4 °C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution. |
Glucose | various | Store at 4 °C after dissolving in nuclease-free water. | |
Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5. |
Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | Store at room temperature. |
Potassium phosphate (monobasic and dibasic) | various | Store at room temperature. | |
Probe library, diluted in TE, pH 8.0 | Biosearch Technologies | Store at -20 °C in aliquots (5 µL) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light. | |
Sorbitol | various | Store at room temperature. | |
20X SSC | Ambion | AM9763 | Store at room temperature. |
TE, pH 8.0 | Ambion | AM9849 | Store at room temperature. |
1 M Tris, pH 8.0 | Ambion | AM9856 | Store at room temperature. |
Trolox | Sigma | 238813 | Store at -20 °C in aliquots. |
200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | NEB | S1402S | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer. |
Zymolyase 100T | MP Biomedicals | 08320932 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water. |
Low-adhesion tubes | USA Scientific | 1415-2600 | Store at room temperature. |