Enkelt molekyle fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analyser i spirende gær vegetativ vækst og meiose

Summary

Denne enkelt molekyle fluorescens i situ hybridisering protokol er optimeret til at opgøre antallet af RNA molekyler i spirende gær under vegetativ vækst og meiose.

Abstract

Enkelt molekyle fluorescens i situ hybridisering (smFISH) er en kraftfuld teknik til at studere genekspression i enkelte celler på grund af dens evne til at opdage og tæller enkelte RNA molekyler. Supplement til dyb sekventering-baserede metoder, smFISH indeholder oplysninger om den celle-til-celle variation i afskriften overflod og subcellulært lokalisering af en given RNA. For nylig, vi har brugt smFISH til at studere udtryk af genet NDC80 under meiose i spirende gær, i hvilke to udskrift isoformer eksisterer og kort udskrift isoform har sin hele sekvensen delt med den lange isoform. Du kan trygt identificere hver udskrift isoform, vi optimeret kendte smFISH protokoller og opnået høj konsistens og kvalitet af smFISH data for prøver erhvervet under spirende gær meiose. Her beskriver vi denne optimerede protokol, de kriterier, som vi bruger til at afgøre, om høj kvalitet af smFISH data er indhentet, og nogle tips for at gennemføre denne protokol i andre gærstammer og vækstbetingelser.

Introduction

Dynamisk regulering af genekspression driver udviklingen af en organisme, samt dens reaktion på miljømæssige stress, infektion og ændringer i stofskiftet. Undersøgelser, der fokuserer på transkriptionel regulering afhængige teknologier, der måler RNA overflod. En sådan metode, betegnes enkelt molekyle fluorescens i situ hybridisering (smFISH), der bruges til påvisning af individuelle RNA molekyler i enkelt celler^1,2. Denne metode giver mulighed for måling af celle til celle variabiliteten i genekspression og bestemmelse af intracellulære RNA lokalisering.

I den mest almindeligt anvendte smFISH teknik kræver påvisning af en individuel RNA-molekyle flere korte DNA-sonder (ofte ~ 48 20-mer sonder), som supplerer målet RNA og er konjugeret til den samme fluorescerende farvestof. Bindingen af en enkelt fluorescerende probe resulterer i svagt signal, men signalet fra ensemble af alle sonder er robust. Denne funktion i høj grad forbedrer signal-støj-forholdet fordi selv om en enkelt sonde kan udstille off mål bindende, sådant signal forventes at blive meget svag sammenlignet med target RNA-molekyle³. Inden for fejl af registrering, kan antallet af RNA molekyler tælles og sammenlignes på tværs af forskellige vækstbetingelser og blandt forskellige mutanter.

Siden sin første udvikling, er smFISH blevet tilpasset for at studere forskellige aspekter af gen expression⁴, såsom transskription brudforlængelse^1,2, splejsning^5,6, transcriptional sprængfyldt^{7 , 8 , 9}, intracellulære allel udtryk^10,11,12, og RNA lokalisering^13,14,15. For nylig, vi har brugt denne metode til at studere udtryk for to udskrift isoformer af det samme gen, hvor kort udskrift isoform (NDC80^ORF) har sin hele sekvensen delt med den lange isoform (NDC80^luti )¹⁶. Til entydigt for at identificere de to mRNA isoformer, vi brugte to sonde sæt: ét sæt er specifikke for den unikke sekvens af NDC80^luti, og det andet sæt, konjugeret med et andet fluorescerende farvestof, binder til det fælles område af de to isoformer. NDC80^luti RNA er identificeret som en colocalized spot med begge fluorescerende signaler, der henviser til den NDC80^ORF RNA er den, der indeholder kun signalet fra den fælles sonde sæt. Da antallet af de NDC80^ORF afskrifter beregnes efter en metode, "subtraktion", høj effektivitet af sonden hybridisering og et højt signal / støj-forhold er nødvendige for at selvsikkert identificere smFISH steder og reducere fejl formering.

Dette papir beskriver en optimeret protokol for at udføre smFISH i spirende gær Saccharomyces cerevisiae. I denne protokol, den celle nummer, fiksering tid, fordøjelsestid, fordøjelsen buffer, sonde koncentration og hybridisering buffer, der bruges til smFISH forsøgene blev optimeret SK1 stamme baggrund for S. cerevisiae gennemgår vegetativ vækst eller meiose. Vi bemærker imidlertid også i dette håndskrift: (1) metoden til at kontrollere kvaliteten af smFISH data efter billede erhvervelse og (2) trinnene i protokollen, som kan kræve yderligere optimering for forskellige stamme baggrunde og vækstbetingelser.

Protocol

Bemærk: Alle bufferne og de medier, der anvendes i denne protokol er angivet i tabel 1. Kreditoroplysninger til reagenserne, der er opført i Tabel af materialer.

Dag 1/dag 1-2:

Bemærk: For vegetativt kultur, dyrke celler til en OD₆₀₀ på 0,4 til 0,6 i en foretrukne medie. Meiotiske kultur, fremkalde celler til at gennemgå meiosen ved hjælp af en foretrukne metode (typisk dyrkning i en OD₆₀₀ af 1,85).

1. prøve fiksering og fordøjelse

1. Lave en total ~3.5 OD₆₀₀ af celler i 3% formaldehyd.
   1. For vegetativt kultur, der tilsættes 5.52 mL kultur til 480 µL af 37% formaldehyd i 15 mL konisk rør.
   2. Meiotiske kultur, tilføje 1840 µL af kultur til 160 µL af 37% formaldehyd i 2-mL microcentrifuge rør. Invertere ~ 5 gange til mix.
      Forsigtig: Formaldehyd er giftige. Håndtere og bortskaffe ifølge institutionelle bestemmelser.
2. Sted rør på et roller tromle ved stuetemperatur i 20 min. For meiotiske prøver, efter fastsættelse ved stuetemperatur i 20 min., fortsætte fastsættelse natten over ved 4 ˚C, roterende.
   Bemærk: Den natten fiksering øger reproducerbarhed og kvaliteten af de smFISH data indhentet for meiotiske prøver. Fiksering tid skal optimeres.
3. Mens prøverne er fastsættelse, tø 200 mM Vanadyl Ribonucleoside komplekser (VRC) på 65 ˚C i mindst 10 min.
4. Forbereder fordøjelsen master mix i en 15 mL tube: for 1 prøve, bland 425 µL af Buffer B med 40 µL af 200 mM VRC (opvarmes til 65 ˚C); for 5 prøver, bland 2125 µL af Buffer B med 200 µL af 200 mM VRC (opvarmes til 65 ˚C). Vortex ~ 5 s til fuldt resuspend VRC før du tilføjer til master mix, som vises lys brunlig grønne efter VRC tilsætning.
   Bemærk: Tilsætning af VRC under fordøjelsen forbedrer sammenhængen i smFISH resultat, potentielt ved at hæmme det nukleasen forurenende stof, der er indført af zymolyase blanding, som er renset fra rå ekstrakt. Mængden af VRC påkrævet på dette trin skal optimeres.
5. Vegetative samples, centrifugeres rør ved ~ 1057 x g i 3 min. Meiotiske prøver (efter natten fiksering), centrifugeres ved 21.000 x g for 1,5 min. Decant eller Aspirér supernatanten til formaldehyd affald.
   Bemærk: Alle centrifugering trin udføres ved stuetemperatur.
6. Resuspend celler i 1,5 mL koldt Buffer B ved pipettering op og ned eller ved invertering af rør og bladre til at blande. Overføre vegetativ prøver 2-mL-rør efter resuspension.
7. Der centrifugeres ved 21.000 x g i 1,5 min. fjerne hovedparten af væsken ved vakuum aspiration eller ved pipettering, efterlod ~ 100 µL.
8. Resuspend celler i 1,5 mL koldt Buffer B.
9. Der centrifugeres ved 21.000 x g i 1,5 min. fjerne hovedparten af væsken ved vakuum aspiration eller ved pipettering, efterlod ~ 100 µL.
10. Resuspend celler i 1,5 mL koldt Buffer B. Centrifuge på 21.000 x g for 1,5 min. aspirat væske helt af vakuum eller pipettering.
11. Resuspend celler i 425 µL af fordøjelsen master mix, og kortvarigt vortex til resuspend. Tilføj 5 µL af 100T 10 mg/mL zymolyase til hvert rør.
    Bemærk: Vortex zymolyase hver gang før du tilføjer til rør. Føje zymolyase til hver tube individuelt, i stedet for at tilføje til master mix. Begge trin bidrage til at bevare fordøjelsen overensstemmelse mellem rørene fordi zymolyase udfældes hurtigt.
12. Vortex 2-3 s at blande. Sted rør på et roller tromle, og fordøje ved 30 ˚C til 15-30 min. Vegetative celler og meiotiske vorden, det tager normalt ~ 15 min og meiotiske prophase og meiotiske divisioner, det tager normalt ~ 30 min.
    Bemærk: Kontroller på mikroskopet hvert 5 min efter 15 min, og stopper fordøjelsen, når ~ 80% af celler vises ikke-transparente og ikke-refraktiv. Fra dette punkt på, celler er meget skrøbelige. Håndtere celler blidt og undgå at bruge vakuum aspiration eller vortexing.
13. Centrifugeres rør ved ~ 376 x g i 3 min. Fjern væsken helt af pipettering.
14. Forsigtigt resuspend celler med 1 mL Buffer B af pipettering op og ned 1 - 2 gange til mix.
15. Der centrifugeres rør ved ~ 376 x g i 3 min. Fjern Buffer B væske af pipettering. Forsigtigt resuspend celler i 1 mL af 70% ethanol (fortyndet med RNase-fri vand).
16. Inkuber ved stuetemperatur i 3.5-4 timer.

2. hybridisering

1. Bringe formamid til stuetemperatur (for 50 mL prøve, det tager ~ 30 min i vandbad).
   Bemærk: Må ikke åbne formamid flaske, indtil flasken når stuetemperatur for at undgå oxidation af formamid.
   Forsigtig: Formamid er giftigt. Håndtere og bortskaffe ifølge institutionelle bestemmelser.
2. Forberede 10% formamid wash buffer i en 15 mL konisk slange.
3. Der centrifugeres rør ved ~ 376 x g i 3 min. Fjern 500 µL af 70% ethanol af pipettering. Forsigtigt afpipetteres op og ned til resuspend de resterende celler, og derefter overføre cellerne til lav friktion rør.
   Bemærk: Ved hjælp af lav friktion rør kraftigt reducerer celletab under efterfølgende vasker.
4. Centrifugeres rør igen ved ~ 376 x g i 3 min. Fjern alle ethanol af pipettering.
5. Tilsættes 1 mL 10% formamid wash buffer, og forsigtigt afpipetteres op og ned 2 - 3 gange at resuspend cellerne.
6. Tillad cellerne til at sidde ved stuetemperatur for ~ 20 min mens de forbereder hybridisering løsning. 1 prøve, Bland 50 µL af hybridisering Buffer (værelse temp.), 5 µL af 200 mM VRC (opvarmes til 65 ˚C) og 1 µL af hver probe (200 nM finalen). For 5 prøver, bland 250 µL af hybridisering Buffer (værelse temp.), 25 µL af 200 mM VRC (opvarmes til 65 ˚C) og 5 µL af hver probe (200 nM finalen).
   1. Tø hybridisering Buffer (frosne på-20 ˚C) til stuetemperatur før åbning af røret for at forhindre formamid oxidation.
   2. Efter tilføjer 200 mM VRC, vortex for 5-10 Sørensen før tilføjer sonder, som er designet og købt kommercielt, og rekonstitueres efter producentens anvisninger.
   3. Hvis to sonder Co rugede, tilføje 1 µL 1:10 fortynding af sonden #1 stock, samt 1 µL 1:10 fortynding af sonden #2 lager, til at gøre en endelige fortynding af ~ 1: 500 for enten sonde. Koncentration behov for bedste signal / støj-forhold skal være optimeret (Se diskussion for detaljer).
7. Centrifugeres prøver ved ~ 376 x g i 3 min. Fjern supernatanten til farligt affald af pipettering.
8. Tilføj mindst 50 µL af hybridisering løsning til hvert rør. Svirp rør til at blande.
9. Der inkuberes ved 30 ˚C på en roller tromle i mindst 16 timer i mørke.

Dag 2/3

3. vask og billedbehandling

1. Bringe formamid til stuetemperatur.
2. Forberede 10% formamid wash buffer (FWB) i en 15 mL konisk slange.
3. Fjerne rør fra roller tromle og placere dem i en folie-dækket for at beskytte mod lys.
4. Centrifugeres prøver ved ~ 376 x g i 3 min. Fjern supernatanten til farligt affald af pipettering.
5. Resuspend i 1 mL 10% FWB af pipettering forsigtigt op og ned 2 - 3 gange.
6. Der inkuberes ved 30 ˚C til 30 min (ikke roterende) i boksen folie-dækket.
7. Der centrifugeres prøver på ~ 376 x g til 3 min. Fjern supernatanten til farligt affald af pipettering, og forlade ~ 50 µL.
8. I mellemtiden forbereder DAPI/FWB i en 15 mL konisk slange: For 1 prøve, bland 1000 µL af 10% formamid wash buffer med 1 µL af 5 mg/mL DAPI. For 10 prøver, 10 mL 10% formamid vaskebuffer blandes med 10 µL af 5 mg/mL DAPI. Resuspend i 1 mL DAPI/FWB af pipettering forsigtigt op og ned 2 - 3 gange.
9. Der inkuberes ved 30 ˚C til 30 min (ikke roterende) i boksen folie-dækket.
10. Tø anti-blegemiddel reagenser på is.
11. Centrifugeres prøver ved ~ 376 x g i 3 min. Fjern supernatanten helt af pipettering. Hvis det er nødvendigt, centrifugeres igen for at fjerne alle supernatant.
12. Hold resuspenderes i 50 µL af GLOX Buffer uden enzymer for prøver, der ikke er afbildet straks. Med pipette overfoeres op og ned 3 - 4 gange at blande.
    1. Holde alle de unimaged prøver i boksen folie-dækket på 4 ˚C indtil klar til afbildning. Når du er klar til billede, centrifugeres prøver ved ~ 376 x g i 2 min og Fjern supernatanten helt af pipettering. Resuspend i GLOX med enzymer som nedenfor.
13. For prøver at blive afbildet straks, tilføje 15-20 µL af GLOX buffer med enzymer. Forsigtigt afpipetteres op og ned at blande.
    Bemærk: Lydstyrken tilføjet kan variere afhængigt af størrelsen på den celle pellet. Vi anbefaler resuspending pellet i 15 µL af GLOX buffer med enzymer og kontrollere celle tæthed på mikroskopet. Hvis celler er også tætte (celler sammenklumpning oven på hinanden), tilføjer ekstra GLOX buffer med enzymer. Hvis celler er alt for sparsomme, centrifugeres prøven og fjerne ~ 5 µL af buffer.
14. Med pipette overfoeres 5 µL ind på en coverslip (18 mm x 18 mm, nr. 1), og læg coverslip på et dias.
15. Sætte en laboratorium tørre oven på diaset, hvor coverslip er placeret. Tryk forsigtigt på laboratoriet tør at sætte dias (bør se flydende kommer fra alle fire kanter af coverslip).
16. Overføre diaset til mikroskop værelse i en boks, der er omfattet af aluminiumsfolie.
17. Billedet ved hjælp af wide-felt fluorescens mikroskop med høj forstørrelse (60-100 X) og høj numerisk blænde.
    Bemærk: For at indsamle det maksimale antal fotoner, der udsendes af smFISH sonder, Konfokal mikroskoper er ikke anbefales, da de i betydelig grad begrænse mængden af lys der skal indsamles. Her, de indsamles på et mikroskop udstyret med en 100 X, 1.4 NA mål, ved hjælp af filtre CY5 (EX632/22, EM679/34) afbildet på 1.3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T; og DAPI (EX390/18 EM435/48), 0,05-0,1 s, 32% - 50% T. En lysfelt referenceafbildning bør også erhverves. Erhverve 15-25 skiver med et trin størrelse på 0,1-0,2 µm, fra helt under fokus for synsfelt helt ovenfor, for at sikre, at alle af RNA steder er tegnede sig for.

4. billedanalyse

1. Analysere smFISH data med publicerede smFISH analyseværktøjer såsom fisk-quant¹⁷ og StarSearch²eller med skræddersyede programmer, afhængigt af de nøjagtige krav af eksperimentet.
   Bemærk: En god analyse rørledningen bør tillade brugere at bestemme en tærskel til at adskille de sande RNA steder fra baggrunden, og output statistikker som X, Y og Z (valgfri) koordinater og intensitet af hver plet, antallet af Steder i hver celle , og eventuelt passende parametre som en måde at bortfiltrere falsk opdagelse.

Representative Results

At evaluere, hvor godt smFISH protokollen arbejdede (skitseret i figur 1), vi har designet en række 54 sonder, som flise rammen åben læsning af NDC80 -genet (figur 2A, top). Sonden beliggende i den mest 5' ende omtales som sonden 1; den næste ene, sonde 2; og den tredie, sonde 3, osv. De 27 sonder tildelt et ulige antal (Probe 1, 3, 5...) er alle konjugeret til CAL Fluor 590 (CF590) fluorescerende farvestof; og de 27 sonder tildelt et lige antal (Probe 2, 4, 6...), konjugeret med Quasar 670 (Q670) fluorescerende farvestof. Derfor, disse skiftende sonde sæt er ofte omtales som "ulige/lige" sonder. Ved hybridisering, bør begge sonde sæt mærke den samme udskrift.

Efter plet påvisning brugte vi et par målinger til at bedømme kvaliteten af smFISH data, der. Den første var graden og kvaliteten af colocalization for de ulige/lige sonder. I vores tilfælde colocalized 88% af alle smFISH pletterne (figur 2A og 2B), med mere end 95% af steder parret inden for 2 pixel fra hinanden (figur 2 c, parret), som er inden for den forventede værdi givet alle kromatisk og påvisning afvigelse mellem de to fluorescerende kanaler. Til sammenligning, færre end 10% af uparret steder havde en nærmeste nabo afstand på mindre end 2 pixel, viser, at sandsynligheden for misidentifying en spot par er lav (figur 2 c). 12% af uparret steder var ligeligt fordelt mellem de to kanaler (figur 2B, Sammenlign CF590 kun med Q670-only); og således vi konkluderet, at for denne 2,4 kb gen med en vifte af udtryk mellem nul til 45 udskrifter pr. celle, ~ 94% af RNA molekyler præcist blev registreret i hver fluorescerende kanal. Hvis smFISH protokol blev ikke optimalt, vil man iagttage (1) en større brøkdel af smFISH steder med kun én af de to fluorescerende signaler (ikke colocalized), og/eller (2) celler med en meget lav signal / støj-forhold eller intet signal overhovedet.

Vi spurgte dernæst, hvis påvisning af smFISH signal var forudindtaget med hensyn til det samlede antal RNA molekyler pr. celle. I en population ligger det samlede antal af en bestemt RNA i hver celle i en distribution med nogle celler husly mere RNA molekyler end andre. En god smFISH protokol skal håndfast afsløre RNA uanset om et højt antal eller lavt antal RNA-molekyler er til stede i hver celle. For at teste dette, for hver celle, beregnet vi brøkdel af smFISH steder med colocalized signaler og fraktion med kun én af de to fluorescerende signaler. Efter gruppering af de celler, der havde det samme antal samlede steder pr. celle, vi beregnet de gennemsnitlige brøkdel af colocalized (parret) eller ikke-colocalized (kun for CF590 eller Q670-only) steder i en given gruppe, og grafen dette gennemsnit som en funktion af det samlede antal Steder pr. celle (figur 3). For hver kategori af steder var fraktioner ens inden for hele spektret af det samlede antal steder pr. celle. For eksempel, blev sammenligne celler med ialt 20 fluorescerende steder pr. celle versus dem med i alt 30 steder, de gennemsnitlige brøkdele af de colocalized steder lignende. Dette resultat foreslået, at vores protokollen kunne registrere en vifte af RNA molekyler i en celle (op til mindst ~ 40 molekyler pr. celle). Hvis protokollen arbejdede suboptimally, kan man iagttage en bias. Eksempelvis kan brøkdel af steder med kun én af de to fluorescerende signaler øge det samlede antal steder pr. celle steg.

Bruger denne optimerede protokol, undersøgte vi udtryk af NDC80 -genet, som koder en kinetochore protein, i forskellige vækstbetingelser. NDC80 gen udtrykker to mRNA isoformer: lang undecoded udskrift isoform, NDC80^luti, har filtypenavnet ~ 400 basepar i slutningen 5' i forhold til kort NDC80^ORF isoform, men begge udskrifter del regionen kodning af NDC80 -genet (Se skematisk i figur 4A). Vi har designet to sæt af sonder: The CF 590 sæt binder sig til den unikke 5' region NDC80^luti; og Q 670 sæt binder til det fælles område af NDC80^luti og NDC80^ORF. NDC80^luti afskrifter blev opdaget som smFISH steder hvor signalerne fra både sonde sæt colocalized, der henviser til den NDC80^ORF afskrifter blev dem med signal kun fra Q 670. På grund af den unikke segment af NDC80^lutistørrelse kunne vi kun fliser 20 oligonukleotid sonder langs denne region, som er mindre end de anbefalede 30-48 sonder. Dermed, vi først bestemmes hvis denne sonde sæt håndfast kunne registrere RNA i vores optimeret protokol. For enten fluorescerende kanal, vi grafen signal / støj-forhold (SNR, defineret som variansen af pixels omkring en plet i forhold til spot intensiteten) mod signalet registreres for hver smFISH stedet, og genereret en scatterplot for alle steder identificeret i hele synsfelt (eksempel billeder i figur 4A ) og grunde i figur 4B. To forskellige populationer var klart identificeret for både den Q 670 og CF 590 sonden sætter (optimeret, figur 4B), hvilket tyder på, at de sande smFISH steder (inde i det grå område) kunne adskilles fra baggrunden signal. Bemærk at betingelsen suboptimal sådan adskillelse var mindre indlysende (Suboptimal, figur 4B).

Vi brugte disse to sonde sæt for at studere udtryk for NDC80^luti og NDC80^ORFunder vegetativ vækst og meiose. I vegetative celler, robust signal fra Q 670 sonde sæt blev fundet, men fra CF 590 sonde sæt ikke (figur 5A, vegetativ), enig med observation af nordlige blotting, kun en kort isoform blev udtrykt under vegetativ vækst¹⁶ . Dette resultat foreslog også, at CF 590 sonde sæt er specifikke, giver lave baggrund i vores optimeret smFISH protokol. Derimod robust signal fra begge sonde sæt blev fundet i meiotiske prophase, og fleste af steder var colocalized signal (figur 5A, meiotiske prophase). Sammen med nordlige skamplet analyse (figur 5B) bekræftet denne observation, at den lange isoform NDC80^luti blev udtrykt specifikt i meiose. Disse to typer af mRNAs blev opdaget i cytoplasma (uden for regionen DAPI), hvilket tyder på, at begge blev eksporteret fra kernen, overensstemmelse med ribosomet profilering data¹⁸.

For at bestemme, hvis tilstrækkelige data er indsamlet nøjagtigt konto for den biologiske variation iboende at vores datasæt, udførte vi bootstrap analyse ved hjælp af statistikker for hver celle, som omfattede (1) brøkdel af de colocalized steder pr. celle og (2) brøkdel af steder med en af de to fluorescerende signaler (CF 590 kun og Q 670 kun). I denne analyse udvalgt et program tilfældigt én celle fra 437 kvantificerede celler for 500 gentagelser. Næste, gennemsnitlige og variansen af de respektive statistikker forbundet med disse 500 markerede celler blev beregnet. Denne proces blev derefter gentages for at tilfældigt vælge to celler fra alle cellerne, uden udskiftning; og derefter til at tilfældigt vælge tre celler, osv. indtil en halvdelen af den samlede datasæt størrelse blev nået. Variansen i datasættet plateaued efter ~ 40 celler, tyder på, at efter dette punkt meste af variation i betyder er iboende til dataene i stedet for en artefakt af undersampling (figur 6, inset). Denne effekt blev mere indlysende, når vi grafen eksempelvariansen divideret med stikprøvens middelværdi, som en funktion af antallet af celler i hvert iteration cyklus (figur 6). Med de data, der vises, blev ændringen i variansen diminishingly lille efter ~ 60 celler. Antallet af celler kvantificeret i et smFISH eksperiment bør overstige det minimum antal celler kræves for at opnå en stabil middelværdi og et plateau af variansen. I vores tilfælde kvantificeres vi over 95 celler pr. sample, pr. replikat. Det samlede antal celler (> 400 celler) overskredet godt Mindsteantallet af celler (~ 60 celler) kræves for at afspejle population.

Med en specialfremstillet Matlab program¹⁶, vegetative celler fandtes for at have en median 5 NDC80^ORF udskrifter pr. celle, mens i meiotiske prophase celler, medianen betydeligt faldt til 4 udskrifter pr. celle (to-sidede Wilcoxon Rang summen test, p = 0.026) (figur 7). Den mediane antal NDC80^luti udskrifter pr. celle var 21 udskrifter, og 100% af cellerne udtrykt NDC80^luti udskrifter. Vi grafen brøkdel af celler med et givet antal udskrifter som en trinvis, relative hyppighed histogrammet, fordi antallet af mRNA molekyler er et diskret antal. Den største placering af hver histogram var normaliseret til samme højde.

Figur 1: Flow-chart til smFISH protokol. Celler er fastsat med formaldehyd ved stuetemperatur i 20 min eller på 4 ˚C natten, vegetativ vækst prøver og meiotiske prøver, henholdsvis. Efter vask i Buffer B tre gange, er celler fordøjet af zymolyase indtil ~ 70-90% af celler er fordøjet. De udtog prøver er derefter vaskes en gang med Buffer B til at fjerne zymolyase og efterfølgende permeabilized i 70% ethanol (EtOH) for ~3.5 timer. For at forberede hybridisering, inkuberes prøver først i 10% formamid vaskebuffer (FWB) for ~ 20 min. Næste, prøverne er genopslemmes i ~ 50 µL af hybridisering løsning, der indeholder de fluorescerende sonder i natten inkubation i mørke ved 30 ˚C. Efter hybridisering, prøverne inkuberes i 10% FWB for 30 min til at vaske væk overskydende sonder, og derefter inkuberes i 10% FWB med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) at plette DNA. For stikprøven afbildet umiddelbart efter FWB/DAPI inkubation, er prøven genopslemmes i GLOX buffer suppleret med katalase, Trolox og glucose stavbakterier (GLOX + enz); der henviser til, at de andre prøver er genopslemmes i GLOX buffer uden enzymer, og opbevares ved 4 ˚C op til ~ 3 timer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: vurdering af smFISH kvalitet ved hjælp af ulige/lige sonder. (A) top: Skematisk til ulige/lige sonden sætter. Fifty-fire oligonukleotid sonder flisebelægning NDC80 genet blev designet. De ulige sonder var mærket med en fluorophore (CF590, vist i magenta) og de lige sonder, med en anden fluorophore (Q670, vist i grøn). Bund: Repræsentant smFISH billeder af meiotiske prophase celler anskaffes ved hjælp af de ulige/lige sonde sæt. Prøverne blev taget 6 timer efter celler (UB8144) blev overført til sporulering medium, en tid, da disse celler blev arresteret i meiotiske prophase. DNA var plettet med DAPI (vist i blåt). Billeder er vist som maksimal intensitet fremskrivninger af z-stakke. Skalalinjen: 5 µm. (B) procentdel af parret eller uparret smFISH steder fremstillet ved hjælp af de ulige/lige sonde sæt. Alt af 428 meiotiske prophase celler blev analyseret, pooling fra to uafhængige forsøg. Dette tal er ændret fra figur 2-figur tillæg 4 af Chen et al. ¹⁶ (C) A kumulative tæthed funktion (CDF) af afstanden mellem hvert par af parret steder og afstanden mellem de nærmeste nabo til en uparret spot. For hvert registrerede spot i et fluorescerende kanal, "k nærmeste nabo" algoritme blev anvendt til at identificere det nærmeste opdaget stedet — og afstanden til det sted — i den supplerende kanal. Lokaliseringer, der var gensidig nærmeste naboer blev anset for at være parret, og en ny liste blev genereret optagelse de parrede, kun CF590- og Q670-kun opdagelser. For hver kategori af opdagelser, blev et CDF-histogram af afstandene afbildet i Matlab, bekræfter, at korrekt parret steder faktisk var meget tættere på afstand end dem uden en tilsvarende øje i anden kanalen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: brøkdele af parrede og uparrede steder, som en funktion af den samlede RNA nummer pr. celle. For at teste, hvis påvisning og binding af smFISH steder var forudindtaget på forskellige udtryk niveauer, blev individuelle celler grupperet efter total RNA udtryk. De gennemsnitlige brøkdele af parret, kun CF590- og Q670-kun opdagelser blev beregnet for hver gruppe af celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Vurdering af de smFISH data genereret ved hjælp af sonder designet til NDC80^luti og NDC80^ORF mRNAs. Q 670 sonder (vist med grønt) krydse sig i fælles området delt mellem NDC80^luti og NDC80^ORF mRNAs, hvorimod CF 590 sonder (vist i magenta) krydse til den unikke 5' region NDC80^luti . (A) repræsentant smFISH billeder af NDC80^luti og NDC80^ORF i meiotiske prophase, erhvervet under optimeret versus suboptimal betingelser. Stammer UB8144 (optimeret betingelse) og UB1337 (suboptimal betingelse) blev tilskyndet til at gennemgå meiosen og fast under meiotiske prophase. Disse to stammer harbor synkronisering af forskellige systemer til at fremkalde meiose, men brug af enten system påvirker ikke smFISH kvalitet (data ikke vist). I betingelsen suboptimal blev celler fastsat ved stuetemperatur i 20 min. (ingen natten fiksering), fordøjes med zymolyase uden VRC suppleres, og hybridiseret i en lavere koncentration af VRC. Billeder er vist som maksimal intensitet fremskrivninger af z-stakke. DNA var plettet med DAPI (vist i blåt). Skalalinjen: 5 µm. (B) Scatterplots visning af signal-støj-forhold (SNR) og signalet fra hver smFISH spot opdaget i synsfeltet præsenteret i figur 4A, for enten fluorescerende kanal og for vilkårene for optimeret eller suboptimal. I betingelsen optimeret var to populationer af smFISH steder til stede. Sande smFISH steder var placeret inde i det grå område, adskillelse fra baggrunden signal. I betingelsen suboptimal individuelle mRNAs var svært at skelne ved øjet og adskillelse mellem den sande steder og baggrund efter kører spot afsløring software var mindre indlysende. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Udtryk for NDC80^luti og NDC80^ORF afskrifter styres tidsligt. (A) repræsentant smFISH billeder af NDC80^luti og NDC80^ORF under vegetativ vækst og meiose. Vegetativ prøverne blev taget når celler (UB8144) voksede eksponentielt i næringsstof rig medium. Meiotiske prophase prøver blev taget 6 timer efter celler (UB8144) blev overført til sporulering medium, en tid, da disse celler blev arresteret i meiotiske prophase. Q 670 sonder (vist med grønt) krydse sig i fælles området delt mellem NDC80^luti og NDC80^ORF mRNAs, hvorimod CF 590 sonder (vist i magenta) krydse til den unikke 5' region NDC80^luti . DNA var plettet med DAPI (vist i blåt). Hver celle var iscenesat af sin Zip1-NGL signal, en markør for meiotiske prophase. Vores smFISH protokol bevarer stærke normal god landbrugspraksis signal uden yderligere ændringer. Vegetativ vækst: Zip1-normal god landbrugspraksis negativ. Meiotiske prophase: Zip1-normal god landbrugspraksis positive. Billeder er vist som maksimal intensitet fremskrivninger af z-stakke. Skalalinjen: 5 µm. Dette tal er ændret fra figur 2 c af Chen et al. ¹⁶. (B) NDC80^ORF, NDC80^lutiog Ndc80 protein (Ndc80p) niveau under meiose (UB4074). NDC80^luti og NDC80^ORF niveauer blev bestemt af nordlige skamplet, og Ndc80p blev der fastsat af anti-V5 immunblot på de angivne tidspunkter. Hxk1p, lastning kontrol for immunblot. Som stamme UB8144, denne stamme også havne den pGAL-NDT80 GAL4-ER synkronisering system^19,20. Celler blev overført til sporulering medium på 0 timer og frigivet fra pachytene anholdelse af β-estradiol tillæg 6 timer senere. NDC80^luti afskriften var håndfast opdaget i S/meiotiske prophase, mens de NDC80^ORF afskrifter blev overvejende nuværende forud meiotiske post (0 timer) og i de meiotiske divisioner (7-9 timer). Dette tal er ændret fra figur 6J af Chen et al. ¹⁶ Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figur 6: systemgenerere analyse udført meiotiske prophase prøverne vist i Figur 5 . Alle de kvantificerede celler blev samlet, og et givet antal (n) af celler blev tilfældigt udtaget 500 gange. Middelværdi og 95% konfidensinterval blev beregnet for brøkdel af parrede og uparrede mRNA pr. celle. Disse data blev afbildet for hvert valg af nummer n (indsatser). Plateau i variansen blev visualiseret ved plotte eksempelvariansen divideret med gennemsnitlige, som en funktion af antallet af celler (n) stikprøven. Det samlede antal celler målt (437 celler) væsentligt oversteg det nummer hvor fejlen plateaued (~ 60 celler), der angiver, at yderligere data ikke ville forbedre tillid i målingerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7: kvantificering af de smFISH data vist i Figur 5 , tegnet som relative hyppighed histogrammer af celler med et bestemt antal NDC80^luti og NDC80^ORF udskrifter pr. celle, ved hjælp af dataene, samlet fra tre uafhængige forsøg. Den stiplede linje angiver den mediane antal NDC80^luti og NDC80^ORF udskrifter pr. celle. Hver histogram var normaliseret, således at den maksimale bin højde var den samme på tværs af alle histogrammer. Et samlet antal på 637 celler blev analyseret for vegetativ vækst og 437 for meiotiske prophase. To-sidet Wilcoxon rang summen test blev udført for NDC80^luti og NDC80^ORFhenholdsvis sammenligne vegetative og meiotiske prophase prøver. Dette tal er ændret fra figur 2D af Chen et al. ¹⁶ Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Buffer B (1 L lager: 1,2 M sorbitol; 0,1 M kalium fosfat buffer, pH 7,5)	1 x
Nukleasen-frit vand	500 mL
Sorbitol	218.6 g
KH2PO4	2.18 g
K2HPO4	14,62 g
Nukleasen-frit vand	Bringe til 1 L endelige rumfang
* Opbevar ved 4 ˚C i 50 mL alikvoter efter filter sterilisering
Zymolyase 100T (10 mg/mL)
* Opbevar ved-20 ˚C i delprøver
Opløse 10 mg zymolyase pulver i 1 mL MilliQ vand
E. coli tRNA (10 mg/mL)
* Opbevar ved-20 ˚C i delprøver
Opløse 10 mg tRNA pulver i 1 mL MilliQ vand
70% ethanol (50 mL)	1 x (mL)
Ren ethanol	35
Nukleasen-frit vand	15
* Opbevares ved stuetemperatur
Hybridisering Buffer (10 mL)	1 x (mL)
50% dextran sulfat	2
E. coli tRNA (10 mg/mL)	1
200 mM Vanadyl ribonucleoside komplekse (VRC)	0,1
BSA, 50 mg/mL	0,04
20 x SSC	1
Formamid	1
Nukleasen-frit vand	4,86
* Opbevar ved-20 ˚C i 250-µL eller 500 µL delprøver
10% formamid vaskebuffer (10 mL)	1 x (mL)
Formamid ved stuetemperatur	1
20 x SSC	1
Nukleasen-frit vand	8
* gøre friske, vortex for 20-30s at blande
10% glukose løsning
* Opbevar ved 4 ˚C i delprøver efter filter sterilisering
1 g glukose i 10 mL nukleasen-gratis vand opløses
Glucose stavbakterier
* Opbevar ved-20 ˚C i delprøver
Opløse 3,7 mg glucose stavbakterier i 1 mL 50 mM NaOAc, pH 5
Anti-blegemiddel (GLOX) Buffer, uden enzymer (1 mL)	1 x (µL)
10% glukose i nukleasen-frit vand	40
1 M Tris, pH 8,0	10
20 x SSC	100
Nukleasen-frit vand	850
* gøre friske, kan også gemme delprøver på 4 ˚C
Anti-blegemiddel (GLOX) Buffer, med enzymer (50 µL)	1 x (µL)
Katalase (vortex mildt, det afregner nemt)	0,5
Glucose stavbakterier	0,5
100 mM Trolox (opløst i ethanol)	1
GLOX buffer	50
* gøre frisk hver gang, forberede sig på isen, kan opbevares ved 4 ˚C til 2-3 timer

Tabel 1. Buffere og medier

Discussion

Protokollen præsenteres her er afledt af andre udgivne smFISH protokoller^2,3,21,22,23, og er specielt optimeret til gær stamme baggrund SK1. Parametrene optimeret inkluderet celle nummer, fiksering varighed, centrifugering hastighed og varighed, fordøjelsen varighed, fordøjelsen buffer, sonde koncentration og hybridisering buffer. Andre parametre såsom hybridisering temperatur og varighed var ikke optimeret. I dette afsnit deler vi et par noter, der ville hjælpe med at tilpasse denne protokol til enhver gær stamme baggrund og interesse vækstbetingelser.

Cellevæggen af spirende gær er en stor udfordring mod at opnå høj kvalitet smFISH billeder i spirende gær, fordi cellevæggen forhindrer sonde penetration. Ufuldstændig fordøjelse af cellevæggen af zymolyase fører til ineffektive hybridisering af sonder og høj celle til celle variabilitet i signal. Men over fordøjelsen kan gøre celler for skrøbelige, fører til betydelige celle tab under vask trin og celle brister under dias forberedelse til billedbehandling. Således er optimere fordøjelsen varighed afgørende. Vi anbefaler, at gennemføre en pilot smFISH eksperiment ved at fordøje den samme prøve for forskellige mængder af tid. I vores tilfælde opnået vi de bedste smFISH data hvis vi stoppede fordøjelsen når ~ 80% af celler blev ikke-brydningsindeks. Typisk, for den samme vækst betingelse, forskellige genetiske mutantstammen kan fordøjes med lignende timing. Varigheden af fordøjelsen adskiller sig dog sammenlignet blandt forskellige vækstbetingelser og forskellige stadier af meiose i spirende gær. Når timingen er fastslået, er at kvaliteten af smFISH reproducerbare. Bemærk kan at for mutantstammen med defekte cellevæg syntese og/eller sammensætning, fordøjelsen kan udfyldes på mindre end 15 min. brug af forskellige batches af zymolyase også lidt ændre fordøjelsen timing.

Optimal sonde koncentration er nødvendig for at opnå et højt signal / støj-forhold. Vi designet og købt vores smFISH sonder kommercielt. God sonder (ofte 20-mers) bør have en procentdel af GC spænder fra 35% til 45%, en minimumafstand af 2 basepar mellem sonder og lav krydsreaktivitet. Vi brugte en web-baseret sonde designer fra producenten til at generere en liste af sonder, og hvis der var nok sonder at vælge imellem, vi ville bruge BLAST algoritme i Saccharomyces genom Database hen til eliminere sonderne med mere end 17 basepar overlappede med andre genomisk regioner. Vi valgte den mere photostable fluorescerende farvestof (CAL Fluor 590) for de sonde der anneals til den unikke region NDC80^luti (CF 590) fordi i dette sæt, antallet af sonder, der opfyldte alle de ovenstående kriterier (20 sonder) var lavere end den minimumsantal, der anbefales af producenten (~ 25 sonder). Efter erstatningsgodtgørelse sonde løsning efter producentens anvisninger, vi gjorde en 1:10 fortynding af stamopløsningen og gemt den fortyndede opløsning i 5-µL alikvoter ved-20 ˚C. Hver delprøve blev brugt kun en gang. For optimering, bør man gøre serielle fortyndinger fra 1:10 fortyndet løsning og test hvilken koncentration giver det bedste signal / støj-forhold. Vi anbefaler, at gøre en fortyndingsrække af 1:250, 1: 500, 1:1000 og 1: 2000 fra det oprindelige lager. I vores tilfælde resulterede en 1: 500 fortyndingsfaktoren i det bedste signal-støj-forholdet for både CF 590 og Q 670 sonde sæt.

Optimal fiksering tid er også afgørende for vellykket smFISH i spirende gær. Vi fandt at natten fiksering på 4 ˚C, snarere end fastsættelse ved stuetemperatur i 20 min., væsentligt forbedret sammenhæng og kvalitet af smFISH resultaterne meiotiske prøver. Men vi ikke har testet, hvordan natten fiksering kan påvirke vegetativ prøver, fiksering ved stuetemperatur fungeret godt for denne vækst tilstand. Således, for at optimere smFISH protokol for nye stammer eller vækstbetingelser, anbefaler vi starter med korte fiksering tid ved stuetemperatur og øge fiksering tid hvis høj variation af signal er stødt.

Sammenlignet med andre publicerede protokoller^3,22,23, bruger vores protokol RNase-hæmmer VRC under fordøjelsen og en højere koncentration af VRC under hybridisering. Tilsætning af VRC i disse to trin forbedret sammenhængen i smFISH resultaterne, eventuelt ved bedre bevare RNA molekyler mod nukleasen aktivitet, som kan indføres ved zymolyase mix (enzymet er renset fra rå ekstrakter og kan indeholde RNase forurenende stoffer). Dermed, vi anbefaler at bruge mængden af VRC som anført i vores protokol eller endnu højere koncentrationer af VRC for optimering.

En betydelig del af cellerne kan gå tabt under vask skridt i både Buffer B og formamid wash buffer. For at reducere celletab, kunne man øge centrifugering hastighed. I vores tilfælde vasker ved hjælp af en høj hastighed (21.000 x g) for at sammenpresse vores prøver under Buffer B betydeligt reduceret celletab. Dog bliver celler meget skrøbelig efter zymolyase fordøjelse, så ændre centrifugering hastighed ikke anbefales. I stedet, vi foreslår at bruge lav friktion rør fra USA videnskabelige, som i høj grad hjælper sammenpresse cellerne under vasker i formamid wash buffer. Samlet set kan vores protokol konsekvent generere en éncellelag af cellerne tætte nok til effektiv billeddannelse. Typisk, 7 felter synspunkt bør give > 130 celler egnet til kvantificering.

Endelig er det vigtigt at fastslå de optimale parametre til og udgange fra billedanalyse. For at registrere smFISH steder, offentliggjorte analyse programmer almindeligt filtrere for raw-billeder ved hjælp af Gaussisk kerne fjerne baggrunden signal, og beder brugerne til at bestemme signal-støj-forholdet til brug for hvert sæt af billeder^2,17. Desværre, der er i øjeblikket ikke en fælles standard, de korrekte parametre bestemmes, og så nogle empiriske test af disse forskellige indstillinger er nødvendige. Hvis du vil angive de parametre, der er nødvendige for hvert af disse trin, skal man iterativt input forskellige sæt af parametre og tjekke hvor godt resultaterne fra hvert sæt kampe, fra manuel optælling i et par repræsentative celler. Når et sæt af parametre, der er fundet, kan det bruges til de fleste af billederne opnået trods forskellige vækstbetingelser og genetiske baggrunde.

Derudover kan man teste hvis maksimal intensitet projektion af smFISH billeder kan udføres før kvantificering²². Dette trin forenkler spot opdagelse algoritme og reducerer billeddannelse tid, selv på bekostning af nogle potentielt nyttige oplysninger om enkelte steder, såsom deres subcellulært lokalisering. I vores tilfælde var antallet af mRNA molekyler produceret af NDC80 -gen lav nok, at steder var godt adskilt efter denne behandling (ikke ualmindeligt for udskrifter i spirende gær^3,7). I tilfælde hvor colocalization analyse er kritisk skal analyse rørledningen bestemme placeringen af hver smFISH plet i hver kanal til at vurdere colocalization. Afhængigt af de specifikke spørgsmål bliver bedt, andre oplysninger såsom intensiteten af hver plet skal muligvis også udvindes fra pipeline for yderligere analyse. Optimere nøglen trin i protokollen og billede analyse rørledningen er afgørende for at opnå høj kvalitet af smFISH data til at undersøge spørgsmålet om interesse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA, RNase-free (50 mg/mL)	Ambion	AM2616	Store at -20 °C.
Catalase	Sigma	C3515	Store at 4 °C for short-term. Vortex before use.
DAPI	Sigma	D9564	Store at -20 °C after reconstitution in water. Protect from light.
50% Dextran Sulfate	Milli Pore	S4030	Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.
E. coli tRNA	Sigma	R4251	Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water.
Ethanol (100%, 200 proof)	various		Flammable.
37% Formaldehyde	Fisher	F79-500	Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.
Formamide	Ambion	AM9342	Store at 4 °C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.
Glucose	various		Store at 4 °C after dissolving in nuclease-free water.
Glucose oxidase	Sigma	G2133	Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.
Nuclease-free water	Ambion	AM9932	Store at room temperature.
Potassium phosphate (monobasic and dibasic)	various		Store at room temperature.
Probe library, diluted in TE, pH 8.0	Biosearch Technologies		Store at -20 °C in aliquots (5 µL) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.
Sorbitol	various		Store at room temperature.
20X SSC	Ambion	AM9763	Store at room temperature.
TE, pH 8.0	Ambion	AM9849	Store at room temperature.
1 M Tris, pH 8.0	Ambion	AM9856	Store at room temperature.
Trolox	Sigma	238813	Store at -20 °C in aliquots.
200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)	NEB	S1402S	Store at -20 °C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.
Zymolyase 100T	MP Biomedicals	08320932	Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water.
Low-adhesion tubes	USA Scientific	1415-2600	Store at room temperature.