Questa singola molecola fluorescenza in situ di ibridazione protocollo è ottimizzato per quantificare il numero di molecole di RNA in lievito durante la meiosi e crescita vegetativa.
Ibridazione di singola molecola fluorescenza in situ (smFISH) è una tecnica potente per studiare l’espressione genica in cellule singole grazie alla sua capacità di rilevare e contare le singole molecole di RNA. Complementari ai metodi basati su sequenziamento profondi, smFISH fornisce informazioni circa la variazione della cellula–cellula in abbondanza di trascrizione e la localizzazione subcellulare di un determinato RNA. Recentemente, abbiamo usato smFISH per studiare l’espressione del gene NDC80 durante la meiosi nel lievito gemmante, in cui trascrizione due isoforme esiste e l’isoforma breve trascrizione ha sua intera sequenza ha condiviso con l’isoforma lunga. Per identificare con sicurezza ogni isoforma di trascrizione, abbiamo ottimizzato smFISH noti protocolli ed abbiamo ottenuto alta consistenza e qualità dei dati di smFISH per i campioni acquisiti durante in erba lievito meiosi. Qui, Descriviamo questo protocollo ottimizzato, i criteri che utilizziamo per determinare se si ottiene alta qualità di dati di smFISH e alcuni suggerimenti per l’implementazione di questo protocollo in altri ceppi di lievito e le condizioni di crescita.
Regolazione dinamica dell’espressione genica guida lo sviluppo di un organismo, come pure la sua risposta a stress ambientali, infezione ed i cambiamenti nel metabolismo. Gli studi che si concentrano sulla regolazione trascrizionale si basano su tecnologie che misurano abbondanza di RNA. Un tale metodo, definito ibridazione di singola molecola fluorescenza in situ (smFISH), è utilizzato per il rilevamento delle singole molecole di RNA in cellule singole1,2. Questo metodo consente la misurazione della cellula–cellula variabilità nell’espressione genica e la determinazione della localizzazione intracellulare di RNA.
La tecnica più comunemente utilizzati smFISH, rilevazione di una singola molecola di RNA richiede sonde di DNA breve multiple (spesso ~ 48 20-mer sonde) che sono complementari a RNA dell’obiettivo e sono coniugati alla stessa tintura fluorescente. Associazione di una singola sonda fluorescente si traduce in segnale debole, ma il segnale dall’insieme di tutte le sonde è robusto. Questa caratteristica migliora notevolmente il rapporto segnale-rumore, perché anche se una singola sonda può esibire fuori bersaglio associazione, tale segnale dovrebbe essere molto debole rispetto a quella del bersaglio RNA molecola3. All’interno di errore di rilevazione, il numero di molecole di RNA può essere contato e confrontato tra diverse condizioni di crescita e tra diversi mutanti.
Dal suo primo sviluppo, smFISH è stato adattato per studiare vari aspetti dell’ espressione genica4, come trascrizione allungamento1,2,5,6, trascrizionale scoppio7 di splicing , 8 , 9, espressione allelica intracellulare10,11,12e RNA localizzazione13,14,15. Recentemente, abbiamo usato questo metodo per studiare l’espressione delle due isoforme di trascrizione del gene stesso, in cui l’isoforma breve trascrizione (NDC80ORF) ha la sua intera sequenza ha condiviso con l’isoforma lunga (NDC80luti )16. Per identificare in modo univoco le due isoforme di mRNA, abbiamo usato due sonda set: un set è specifico per la sequenza univoca di NDC80luti, e l’altro insieme, coniugato a un altro colorante fluorescente, si lega alla regione comune delle due isoforme. NDC80luti RNA viene identificato come un posto colocalized con entrambi i segnali fluorescenti, considerando che la NDC80ORF RNA è quella che contiene solo il segnale dal set sonda comune. Poiché il numero della NDC80ORF trascrizioni è calcolato con un metodo di “sottrazione”, ad alta efficienza dell’ibridazione della sonda e un alto rapporto segnale-rumore sono necessari con fiducia smFISH macchie di identificare e ridurre l’errore propagazione.
Questo articolo descrive un protocollo ottimizzato per l’esecuzione di smFISH nel lievito Saccharomyces cerevisiae. In questo protocollo, il numero di cellulare, tempo di fissazione, tempo di digestione, digestione buffer, sonda concentrazione e ibridazione buffer utilizzato per gli esperimenti di smFISH sono state ottimizzate per lo sfondo di SK1 ceppo di Saccharomyces cerevisiae in fase vegetativo crescita o meiosi. Tuttavia, notiamo anche in questo manoscritto: (1) il metodo per controllare la qualità dei dati di smFISH dopo l’acquisizione dell’immagine e (2) i passaggi nel protocollo che potrebbero richiedere ulteriore ottimizzazione per gli sfondi di ceppo diverso e le condizioni di crescita.
Il protocollo presentato qui è derivato da altri protocolli pubblicati smFISH2,3,21,22,23ed è specificamente ottimizzato per lo sfondo del ceppo di lievito SK1. I parametri ottimizzati incluso il numero di cellulare, durata di fissazione, velocità di centrifugazione e durata, durata di digestione, buffer di digestione, sonda concentrazione e tampone di ibridazione. Altri parametri come la temperatura di ibridazione e durata non sono state ottimizzate. In questa sezione, condividiamo alcune note che aiuterebbero a adattare il presente protocollo a qualsiasi sfondo del ceppo di lievito e le condizioni di crescita di interesse.
La parete cellulare del lievito è una grande sfida contro ottenere immagini di alta qualità smFISH in lievito perché la parete cellulare impedisce la penetrazione della sonda. La digestione incompleta della parete delle cellule di zymolyase conduce alla inefficiente ibridazione del probe e alta variabilità della cellula–cellula nel segnale. Tuttavia, digestione eccessiva può rendere le cellule troppo fragile, portando a significativi cella perdita durante le fasi di lavaggio e delle cellule di scoppio durante la preparazione del vetrino per l’imaging. Così, ottimizzando la durata della digestione è cruciale. Si consiglia di condurre un esperimento pilota smFISH digerendo lo stesso campione per diverse quantità di tempo. Nel nostro caso, abbiamo ottenuto i migliori dati di smFISH se ci siamo fermati la digestione quando ~ 80% delle cellule è diventato non-rifrangente. In genere, per la stessa condizione di crescita, diversi ceppi mutanti genetici possono essere digeriti con tempi simili. Tuttavia, la durata della digestione differisce rispetto tra le diverse condizioni di crescita e le diverse fasi della meiosi nel lievito gemmante. Una volta determinata la tempistica, la qualità del smFISH è riproducibile. Nota che ceppi mutanti con la sintesi della parete cellulare difettoso e/o composizione, digestione potrebbe essere completata in meno di 15 minuti di uso di diversi lotti di zymolyase cambiano anche leggermente i tempi di digestione.
Concentrazione ottimale sonda è necessario per raggiungere un elevato rapporto segnale-rumore. Abbiamo progettato e acquistato le nostre sonde smFISH commercialmente. Buone sonde (spesso 20-mers) dovrebbero avere una percentuale di GC che vanno dal 35% al 45%, una distanza minima di 2 paia di basi tra sonde e bassa reattività crociata. Abbiamo usato una finestra di progettazione web-based sonda dal produttore per generare un elenco di sonde, e se c’erano abbastanza sonde da scegliere, useremmo l’algoritmo BLAST nel Database del genoma di Saccharomyces per eliminare le sonde con più di 17 coppie di basi sovrapposte con altre regioni genomiche. Abbiamo scelto il più fotostabile colorante fluorescente (CAL Fluor 590) per il set di sonda che accoppia alla regione unica di NDC80luti (CF 590) perché in questo set, il numero di sonde che ha soddisfatto tutti i criteri di cui sopra (20 Sonde) era inferiore al numero minimo consigliato dal produttore (~ 25 sonde). Dopo ricostituzione la soluzione della sonda seguendo le istruzioni del produttore, abbiamo fatto un 01:10 diluizione della soluzione di riserva e memorizzato la soluzione diluita in aliquote di 5-µ l a-20 ˚ c. Ogni aliquota è stata usata solo una volta. Per l’ottimizzazione, uno dovrebbe fare seriale diluizioni dal 01:10 diluito soluzione e prova che la concentrazione produce il miglior rapporto segnale-rumore. Si consiglia di effettuare una serie di diluizione di 1: 250, 1: 500, 1: 1000 e 1: 2000 dallo stock originale. Nel nostro caso, un fattore di diluizione di 1: 500 ha provocato il miglior rapporto segnale-rumore, per il CF 590 e la Q 670 set sonda.
Tempo di fissaggio ottimale è anche critico per il successo smFISH in lievito. Abbiamo trovato quella fissazione durante la notte a 4 ˚ c, anziché fissaggio a temperatura ambiente per 20 min, ha migliorato significativamente la coerenza e la qualità dei risultati smFISH per campioni meiotici. Anche se non è stato testato come una notte fissazione potrebbe avere un impatto campioni vegetativi, fissazione a temperatura ambiente ha funzionato bene per questa condizione di crescita. Così, per ottimizzare il protocollo smFISH per nuovi ceppi o condizioni di crescita, si consiglia a partire con il tempo breve fissazione a temperatura ambiente e aumentando il tempo di fissazione se alta variabilità del segnale viene rilevato.
Rispetto ad altri protocolli pubblicati3,22,23, il nostro protocollo utilizza l’inibitore di RNAsi VRC durante digestione e una maggiore concentrazione di VRC durante l’ibridazione. Aggiunta di VRC in questi due passaggi migliorato la consistenza dei risultati smFISH, possibilmente con una migliore conservazione molecole di RNA contro attività di nucleasi, che possono essere introdotti mediante il mix di zymolyase (l’enzima è purificata da estratti grezzi e può contenere RNasi contaminanti). Pertanto, si consiglia di utilizzare la quantità di VRC come elencati nel nostro protocollo o persino più alte concentrazioni di VRC per l’ottimizzazione.
Una parte significativa delle cellule può essere persa durante le fasi di lavaggio in tampone B e il tampone di lavaggio di formammide. Per ridurre la perdita di cellule, uno potrebbe aumentare la velocità di centrifugazione. Nel nostro caso, usando un’ad alta velocità (21.000 x g) per appallottolare i nostri campioni durante il tampone B lava perdita delle cellule significativamente ridotta. Tuttavia, le cellule diventano molto fragili dopo zymolyase digestione, quindi non è consigliabile modificare la velocità di centrifugazione. Al contrario, si consiglia di utilizzare i tubi di bassa aderenza da scientifica USA, che molto utile per agglomerare le cellule durante i lavaggi in tampone di lavaggio di formammide. Nel complesso, il nostro protocollo è in grado di generare costantemente un monostrato di cellule abbastanza dense per l’imaging efficiente. In genere, 7 campi di vista dovrebbe produrre > 130 celle adatte per la quantificazione.
Infine, è importante determinare i parametri ottimali per e le uscite necessarie da analisi dell’immagine. Per rilevare punti di smFISH, programmi di analisi pubblicata filtrare le immagini raw con kernel gaussiano per rimuovere il segnale di fondo e chiedono agli utenti di determinare il rapporto segnale-rumore da utilizzare per ogni set di immagini2,17. Purtroppo, non c’è attualmente un unico standard con cui vengono determinati i parametri appropriati, e così alcune prove empiriche di queste diverse impostazioni è necessaria. Per impostare i parametri necessari per ognuno di questi passaggi, è necessario in modo iterativo diversi set di parametri di input e controllare quanto bene i risultati ottenuti da ogni insieme che corrisponde dal conteggio manuale in alcune cellule rappresentante. Una volta che viene trovato un set di parametri, può essere utilizzato per la maggior parte delle immagini ottenute nonostante le diverse condizioni di crescita e di ambiti di provenienza genetici.
Inoltre, uno può testare se-intensità massima di proiezione delle immagini smFISH può essere eseguita prima di quantificazione22. Questo passaggio semplifica l’algoritmo di rilevamento spot e riduce notevolmente i tempi di formazione immagini, anche se a costo di alcune informazioni potenzialmente utili su singoli punti, ad esempio la loro localizzazione subcellulare. Nel nostro caso, il numero di molecole di mRNA prodotta dal gene NDC80 era abbastanza basso che le macchie erano ben separate dopo questa elaborazione (non è rara per le trascrizioni in erba lievito3,7). In casi dove la colocalizzazione analisi è critico, la pipeline di analisi ha bisogno determinare la posizione di ogni spot di smFISH in ogni canale per valutare colocalizzazione. In base alle specifiche domande viene chiesto, altre informazioni come l’intensità di ogni spot possono anche bisogno di essere estratto dalla pipeline per ulteriori analisi. Ottimizzando la chiave interviene il protocollo e la pipeline di analisi di immagine è fondamentale per ottenere alta qualità di smFISH dati per studiare la questione di interesse.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Anne Dodson e Stephanie Heinrich per consigli su come ottimizzare il protocollo smFISH, Xavier Darzacq per aiutare con la piattaforma di analisi, Haiyan Huang per suggerimenti sull’analisi statistica. Questo lavoro è stato sostenuto dal March of Dimes (5-FY15-99), Pew Charitable Trusts (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) e Glenn Foundation a EÜ e un NSF Graduate Research Fellowship Grant No. DGE-1106400 JC.
BSA, RNase-free (50 mg/mL) | Ambion | AM2616 | Store at -20 °C. |
Catalase | Sigma | C3515 | Store at 4 °C for short-term. Vortex before use. |
DAPI | Sigma | D9564 | Store at -20 °C after reconstitution in water. Protect from light. |
50% Dextran Sulfate | Milli Pore | S4030 | Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience. |
E. coli tRNA | Sigma | R4251 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water. |
Ethanol (100%, 200 proof) | various | Flammable. | |
37% Formaldehyde | Fisher | F79-500 | Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution. |
Formamide | Ambion | AM9342 | Store at 4 °C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution. |
Glucose | various | Store at 4 °C after dissolving in nuclease-free water. | |
Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5. |
Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | Store at room temperature. |
Potassium phosphate (monobasic and dibasic) | various | Store at room temperature. | |
Probe library, diluted in TE, pH 8.0 | Biosearch Technologies | Store at -20 °C in aliquots (5 µL) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light. | |
Sorbitol | various | Store at room temperature. | |
20X SSC | Ambion | AM9763 | Store at room temperature. |
TE, pH 8.0 | Ambion | AM9849 | Store at room temperature. |
1 M Tris, pH 8.0 | Ambion | AM9856 | Store at room temperature. |
Trolox | Sigma | 238813 | Store at -20 °C in aliquots. |
200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | NEB | S1402S | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer. |
Zymolyase 100T | MP Biomedicals | 08320932 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water. |
Low-adhesion tubes | USA Scientific | 1415-2600 | Store at room temperature. |