Summary
Qui, presentiamo un protocollo che dettagli gli aspetti tecnici e requisiti essenziali affinché robusta analisi di sequenza del gene di IG in pazienti con la leucemia linfocitaria cronica (CLL), basato sull'esperienza accumulata dell'iniziativa di ricerca europea su CLL (ERIC).
Abstract
Durante la maturazione delle cellule B, il complesso processo di ricombinazione di V (D) J del gene dell'immunoglobulina (IG) accoppiato con hypermutation somatico (SHM) dà luogo a una sequenza di DNA unica all'interno di ogni singola cellula di B. Dato che le malignità delle cellule di B il risultato di espansione clonale di una singola cella, geni IG rappresentano un'unica firma molecolare comune a tutte le cellule maligne all'interno di un singolo paziente; così, le riorganizzazioni di gene di IG possono essere utilizzate come marcatori clonali. Oltre a servire come un importante identificatore clonale, la sequenza del gene IG può agire come un 'timeline molecolare' poiché è associato a specifiche fasi di sviluppo e quindi riflette la storia della cellula B coinvolta nella trasformazione neoplastica. Inoltre, per determinate malignità, in particolare leucemia linfocitaria cronica (CLL), la sequenza del gene IG tiene capacità prognostica e potenzialmente predittive. Detto questo, estrapolare conclusioni significative dall'analisi di sequenza del gene IG sarebbe impossibile se strumenti e metodi robusti non erano disponibili per aiutare nella loro analisi. In questo articolo, sulla base della vasta esperienza dell'iniziativa europea di ricerca sul CLL (ERIC), dettagli gli aspetti tecnici e requisiti essenziali necessari per garantire l'analisi di sequenza di gene affidabile e riproducibile IG in CLL, un test che è ora raccomandato per tutti i pazienti CLL prima del trattamento. Più specificamente, le varie fasi analitiche sono descritti che vanno da identificare la riorganizzazione di gene clonotypic IG e la determinazione della sequenza del nucleotide per l'accurata interpretazione clinica dei dati di sequenza del gene di IG.
Introduction
Leucemia linfocitaria cronica (CLL), la forma più comune di leucemia negli adulti nei paesi occidentali, è caratterizzata dall'espansione clonale di cellule di B mature neoplastici1. Da una prospettiva clinica, il decorso della malattia è estremamente variabile, con alcuni pazienti vivendo una malattia aggressiva, che richiede un trattamento molto presto dopo la diagnosi e spesso recidivante o di essere refrattario alla terapia. Questo è in netto contrasto con una percentuale sostanziale di pazienti (circa il 30%) che presentano una malattia indolente, mai richiedono un trattamento e hanno un'aspettativa di vita simile a individui sani di pari età2. Questa eterogeneità clinica si riflette nella diversità delle anomalie molecolari trovati nei pazienti di CLL che guidano in ultima analisi, la patogenesi e la progressione di questa malattia3.
Stabilire che una diagnosi esatta di CLL è di solito semplice, tuttavia, l'eterogeneità clinica di cui sopra può ostacolare la gestione efficace dei pazienti con LLC e sottolinea la necessità di marcatori prognostici e predittivi che potrebbe contribuire a decisionale del trattamento2. Numerosi studi hanno tentato di perfezionare il pronostico di CLL, culminando in un'abbondanza di nuovi marcatori clinici e biologici, essendo proposto4. Lo stato mutazionale del gene clonotypic immunoglobulina pesante variabile (IGHV) è uno degli indicatori prognostici più robusti in CLL, in gran parte a causa del fatto che (i) rimane stabile nel tempo e come la malattia progredisce, e (ii) è indipendente da altro i parametri clinici e biologici5. Che nonostante ciò, gli indicatori molto pochi, se del caso, compreso lo stato mutazionale IGHV, sono attualmente applicati nella routine clinica al momento della diagnosi.
I primi rapporti sull'utilità clinica di sequenziamento del gene IG in data CLL già nel 1999, quando 2 studi indipendenti ha riferito che i pazienti con no o un carico minimo hypermutation somatico (SHM) (unmutated CLL, U-CLL) hanno una prognosi peggiore rispetto ai pazienti che trasportano un maggiore carico SHM (mutato CLL, M-CLL)6,7. Più specificamente, il gruppo U-CLL ha consistito dei casi che harboring geni IGHV clonotypic con pochi o nessun SHM e quindi un'alta percentuale identità al gene IGHV più germinale (≥ 98%), mentre M-CLL ha consistito dei casi con un più alto carico mutazionale (percentuale identità per la più gene IGHV di germline < 98%). Da questi primi studi, è stato continuamente dimostrato che U-CLL casi visualizzano un trattamento più breve di tempo-a-primo (TTFT) e la sopravvivenza globale (OS) rispetto a M-CLL.
Col senno di poi, questi studi seminali ha evidenziato il ruolo fondamentale del recettore delle cellule B (BcR) IG nella patobiologia CLL, spianando così la strada per ricerche approfondite in CLL-microambientali interazioni che, a sua volta, ha condotto ad un apprezzamento più completo di l'eterogeneità biologica di questa malattia8,9. Gli studi più recenti hanno fornito ulteriore supporto per l'importanza delle analisi immunogenetica in CLL rivelando che singoli casi possono cluster in sottogruppi a causa della condivisione (quasi) identiche sequenze del gene BcR IG, un fenomeno definito stereotypy BcR IG10 ,11,12,13. Raccogliendo la prova sostiene la nozione che i pazienti assegnati a stesso sottoinsieme stereotipato harbor simili dati proprietà che chiaramente li separano da altri pazienti CLL all'interno della stessa categoria SHM, ma con diverse sequenze del gene IG; infatti è stato segnalato che la categorizzazione dei pazienti CLL basato su assimilazione di BcR IG ulteriormente affina la segregazione di massa di pazienti affetti da LLC in U-CLL o M-CLL gruppi14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20.
Da un punto di vista clinico, è da nota che lo stato SHM del gene IGHV clonotypic sembra correlare con una risposta specifica alle chemio e immuno terapia. In particolari, pazienti di M-CLL trattati con una combinazione di fludarabina/ciclofosfamide/rituximab (FCR), il trattamento di parità aurea per pazienti affetti da LLC medicamente fit privo di difetti del gene TP53 , hanno esibito significativamente più libera da progressione Survival (PFS) e OS rispetto a U-CLL pazienti che hanno ricevuto il trattamento stesso, il21,22,23. Di conseguenza, identificazione dello status SHM è diventato importante in particolare per assistere nella gestione terapeutica di CLL pazienti , cioè, un marker predittivo, piuttosto che per valutare il decorso clinico della malattia cioè, un indicatore prognostico. Infatti, secondo il recente aggiornamento delle linee guida NCI-sponsorizzato dall'International Workshop on CLL, lo status SHM di geni IGHV riorganizzati dovrebbe essere determinato in tutti i casi di LLC prima dell'inizio del trattamento in entrambi pratica generale e clinica prove24. Inoltre, a causa della recente approvazione della agenti di trattamento novello e il numero crescente di farmaci nelle prove, lo stato SHM della molecola IG può svolgere un ruolo ancora maggiore nella gestione terapeutica dei pazienti con CLL in futuro vicino5.
Questo rapporto dettaglia tutti gli aspetti dell'analisi di sequenza del gene di IG, cominciando con la scelta del materiale adatto e che si conclude con l'interpretazione clinica dei risultati di sequenziamento. Valutazione approfondita di questi passaggi è importante nella routine diagnostica per la produzione di risultati affidabili e per garantire il paziente accurata stratificazione all'interno di studi clinici. Protocolli sono forniti per facilitare l'armonizzazione in materia di analisi di sequenza del gene di IG, garantendo così che i risultati sono comparabili tra i diversi laboratori.
Protocol
Il protocollo di ricerca è stato approvato dal comitato etico dell'Istituto Scientifico San Raffaele, Milano, Italia.
1. materiale di selezione
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Scelta del materiale di partenza
Nota: Nella maggior parte dei casi di CLL il conteggio delle cellule del tumore è elevato alla diagnosi (> 80-90%). Così, ordinamento delle cellule o arricchimento delle cellule leucemiche di solito non è necessario.- Se si utilizza sangue periferico (PB), il più comune materiale di scelta per l'analisi di sequenza del gene di IG, utilizzare un volume di sangue tra 10-20 mL.
- In alternativa, nei casi con un basso peso di cellula CLL, utilizzare ordinamento delle cellule di PB campioni o materiale da altri tessuti, come il midollo osseo (BM) o i linfonodi (LN).
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Tempo di campionamento
- Tempo di campionamento non è cruciale, dato che lo stato di IG SHM è stabile, ore di lavoro straordinario; detto questo, evitare di campionamento in determinati periodi, come subito dopo o durante la terapia, dato il basso numero di cellule di CLL può complicare l'analisi e portare a risultati inaffidabili.
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Deposito e raccolta di materiale
Nota: Raccolta e conservazione del materiale di partenza dipende fortemente la scelta del materiale.- Per campioni PB o BM, utilizzare provette EDTA o CPT (citrato-tris-pyridossalphosphate) per evitare l'inibizione del processo di amplificazione di PCR; in alternativa, utilizzare provette di eparina.
- Per esempi di LN, opzioni di raccolta sono entrambi sospensioni cellulari, biopsie dal tessuto congelato fresco o, in rari casi alla tessuti (FFPE) per la paraffina-incastonato formalina-fisso.
2. densità gradiente separazione
Nota: Se PB o BM è il materiale di partenza di scelta, che è lo scenario più frequente, è consigliabile isolamento di cellule mononucleate mediante separazione gradienti di densità.
- Aggiungere 200 µ l di EDTA (EDTA 0.5 M / pH 8.0) in una provetta di raccolta sterile 50 mL. Aggiungere 20 mL di PB e 15 mL di RPMI. Mix di pipettaggio (2 - 3 volte è sufficiente).
- Aggiungere 15 mL di mezzo di gradienti di densità ad un nuovo tubo di raccolta di 50 mL.
Nota: nel caso in cui il volume di PB è inferiore a 20 mL, i volumi di RPMI (passaggio precedente) e gradiente di densità devono essere modificati di conseguenza. - Strato lentamente nella soluzione da passo 2.1 così da non interrompere la sfumatura. Centrifugare a 800 x g per 20 minuti con il freno di centrifuga fuori.
- Raccogliere l'anello di cellule mononucleate che si è formata tra lo strato superiore del plasma/piastrine e il livello medio gradiente di densità utilizzando una pipetta Pasteur sterile, poi trasferire in una provetta di raccolta sterile 15 mL.
- Aggiungere RPMI ad un volume finale di 12 mL e mescolare. Centrifugare a 750 x g per 8 minuti. Scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare utilizzando 10 mL di RPMI e ripetere il punto 2.5.
- Sciogliere il pellet cellulare in 1 mL di PBS (DPBS, nessun calcio, senza magnesio). Eseguire un conteggio delle cellule usando un piatto di Neubauer mescolando 20 µ l di campione e 80 µ l di 01:10 soluzione di Türk.
- Se l'elaborazione a valle del campione non è prevista per il giorno stesso, centrifugare il campione a 750 x g per 8 minuti. Eliminare il surnatante e conservare il pellet cellulare a-80o C.
3. estrazione di acidi nucleici da
- Decidere su un substrato per l'analisi dello stato dei geni IG SHM. DNA genomico (gDNA) è la scelta più popolare come non c'è alcun bisogno di un passaggio di trascrizione d'inversione; in alternativa, l'uso di RNA/DNA (cDNA) complementari garantisce che, almeno a livello trascrizionale, la riorganizzazione di IG clonotypic produttivo, funzionale è la destinazione "favorita".
- Utilizzare uno dei numerosi disponibili in commercio kit adatti per l'estrazione di RNA gDNA o totale e la sintesi di cDNA (Vedi Tabella materiali).
- Valutare l'integrità del DNA o RNA usando sistemi di quantificazione degli acidi nucleici sensibili. Se utilizzando FFPE materiale per l'analisi, valutare la qualità e la quantità del cDNA/gDNA estratto dall'amplificazione di PCR di un gene housekeeping noti, ad esempio l'alfa del ricevitore acido retinoico (RARa), beta-actina, ecc.
4. amplificazione e sequenziamento delle riorganizzazioni di Gene IGHV-IGHD-IGHJ
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Selezione dell'iniettore IGH PCR
- Preferibilmente, eseguire PCR multiplex con IGHV sottogruppo specifico 5' primer e IGHJ gene specifico 3' primer25,26. Se i risultati sono sub-ottimale, preparare mix PCR separati utilizzando singolo IGHV sottogruppo specifico primer.
- Utilizzare primer 5' che tempri sia la regione leader situata immediatamente a Monte della riorganizzazione IG o entro la regione di codificazione del gene IGHV (ad es. quadro 1, FR1).
- Primer leader di utilizzo che consentono l'amplificazione dell'intero riorganizzate la sequenza del gene IGHV-IGHD-IGHJ, che a sua volta permetterà la stima accurata dei livelli di SHM. Così, si consigliano IGHV leader primer da ERIC nelle loro linee guida aggiornate per IG gene sequenza analisi27.
- In casi dove primer leader non riescono ad amplificare la riorganizzazione di IG clonotypic, utilizzare primer IGHV FR1. Tuttavia, gli iniettori quadro non amplificare la riorganizzazione di gene di IG clonotypic intero, che può portare a inesatta determinazione del livello di SHM. Per questo scenario, indicare chiaramente nella relazione clinica che l'uso di primer FR1 IGHV può sovrastimare la vera identità di percentuale al gene di germline più vicino.
- Per l'estremità 3', uso degli iniettori di consenso targeting i geni IGHJ, multisala imposta di iniettori di gene-specific IGHJ o primer specifici, a seconda del substrato. Sequenze dell'iniettore sono forniti nella tabella 1, mentre la Figura 1 illustra le varie posizioni per ricottura di primer.
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Amplificazione di PCR delle riorganizzazioni di gene IGHV-IGHD-IGHJ
- Preparare il mix di primer utilizzando quantità equimolari di ogni sottogruppo primer(s) per garantire amplificazione imparziale.
- Ad esempio, quando si utilizza primer leader, due primer diversi sono utilizzati per amplificare le riorganizzazioni appartenendo al sottogruppo IGHV1. Pertanto, utilizzare una quantità di questi 2 primer (IGHV1L e IGHV1bL) che è che la metà rispetto a IGHV4L, che è il fondo unico per le riorganizzazioni del sottogruppo di IGHV4.
- Applicare l'approccio opposto nel caso i primer IGHJ1-2 e IGHJ4-5. Come questi iniettori di destinazione due sottogruppi differenti di gene IGHJ, raddoppiare la quantità rispetto al primer IGHJ3 e IGHJ6.
- Utilizzare la tabella 1 per determinare la quantità esatta primer durante la preparazione di miscele di primer pertinenti.
- Reagenti PCR mix come elencato nella tabella 2. Dopo la combinazione di tutti i reagenti PCR in un tubo PCR, aggiungere 0,5 µ l di Taq polimerasi e 100 ng di gDNA o 2 µ l di cDNA (cDNA dev'essere preparato usando 1 µ g di RNA).
Nota: Un enzima Taq con attività di correzione di bozze non è essenziale come il tasso di errore di amplificazione è estremamente basso e pertanto non influenzerà il livello di SHM. - Eseguire il protocollo PCR termico dettagliato nella tabella 3.
- Preparare il mix di primer utilizzando quantità equimolari di ogni sottogruppo primer(s) per garantire amplificazione imparziale.
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Valutazione di clonalità
Nota: Un passo critico successivo implica la valutazione il pattern di clonalità del prodotto della PCR. Nel valutare la clonalità nei pazienti con LLC, l'individuazione più comune è una singola picco/banda monoclonale.- Utilizzare metodi con alto-sensibilità, quali l'analisi del frammento o dell'eteroduplex, per clonalità valutazione28,29.
- Analisi del frammento
- Eseguire PCR multiplex utilizzando 5'-labeled IGHV leader o iniettori di PCR specifici sottogruppo FR1; Questo consente di ottenere prodotti di PCR che possono essere separati mediante elettroforesi capillare, permettendo la valutazione di clonalità del IGH PCR prodotti basato sulla loro complementarità IGHV determinazione regione 3 lunghezze (CDR3).
- Utilizzare il primer, reagenti e condizioni termiche identiche a quelli menzionati in precedenza (Vedi tabelle 1-3). Personalizzati 5 ´-etichettato primer fluorescente sono etichettati i oligos con una scelta di coloranti all'estremità 5'. Esempi di reporter coloranti 6-FAM, HEX, NED o TET. Quindi, 2 reazioni separate sono richieste basato sull'impiego di 3 differenti tinture per reazione.
- Valutare la dimensione dei prodotti di PCR su un gel di poliacrilammide del sei per cento (6%) (questa percentuale si traduce in risoluzione ottimale), usando 1 x TBE come un buffer in esecuzione. Eseguire a 80 V per 45 min.
Nota: È consigliabile che i prodotti di PCR possono migrare sul gel per un tempo sufficiente affinché i campioni monoclonali possono essere separati dallo sfondo policlonale e il marcatore del DNA può separare adeguatamente. Fattori quali la dimensione e lo spessore del gel possono influire sulla migrazione quindi nessuna singola impostazione (voltaggio e tempo) in grado di garantire un risultato ottimale che detto, impostazione della tensione a 80 V per 45 minuti è un buon punto di partenza, come si riduce al minimo il rischio del campione la migrazione troppo rapidamente e 'funzionante' fuori il gel. - Controllare i prodotti di PCR di circa 500 coppie di base quando si utilizza primer leader IGHV e 350 paia di basi quando si utilizza il mix di primer IGHV FR1.
Nota: In rari casi, casi di LLC sono stati trovati per trasportare prodotti di double, monoclonali e in casi ancora più rari, casi possono presentare un modello di oligoclonal. Agente intercalante come etidio bromuro (EtBr) o meno pericolose e più sensibile commercialmente disponibile macchie di DNA può essere utilizzato per la visualizzazione del DNA su gel di acrilammide utilizzando eccitazione UV o luce blu.
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Purificazione del prodotto PCR
Nota: I prodotti di PCR vengono purificati per eliminare qualsiasi sfondo policlonale provenienti da cellule B normali all'interno del campione CLL, nonché primer dimeri che possono portare al sequenziamento non ottimale. Utilizzare qualsiasi metodo che rimuove non incorporata dNTP e primer per PCR clean-up, come un trattamento enzimatico, ad esempio, Sap (fosfatasi alcalina del gambero) / Exo (Exonuclease io), o basata su colonne di purificazione.- Caricare il volume totale del prodotto della PCR su un gel di agarosio 3% basso punto di fusione.
- Permettono ai prodotti PCR di eseguire sul gel fino a quando non si separano dallo sfondo.
- Asportare le bande PCR sharp, prominente, purificare ed eluire. Se vengono rilevate due riorganizzazioni, entrambe le bande dovrebbero essere asportate ed ordinato separatamente.
- Per eseguire la pulitura Sap/Exo, seguire le istruzioni del produttore per quanto riguarda i volumi specifici da utilizzare; Tuttavia una reazione tipica può contenere 1 µ l Sap, 0. 5 µ l Exo e incubazione di 5 x 2 µ l tampone per reazione di PCR di 5-10 µ l. Mescolare delicatamente nel vortex ciascun campione e incubare su un blocco PCR a 37 ° C per 30 minuti. Inattivare gli enzimi da riscaldamento a 85 ° C per 15 minuti.
- Caricare una piccola quantità di prodotti di PCR su un gel di agarosio al 3% per valutare la purezza del prodotto.
5. Sanger sequenziamento
Nota: Esistono strategie, tuttavia, indipendentemente dall'approccio alla esatta, diretto sequenziamento di entrambi i filamenti diversi di sequenziamento è obbligatorio per garantire un risultato affidabile.
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Protocolli di sequenziamento generale
- Se l'amplificazione è stata eseguita utilizzando primers singola, procedere utilizzando l'appropriato IGHV - e IGHJ - o costante regione-specifico primer di sequenziamento. Questo approccio può anche essere adottato qualora multiplexed fluorescente con etichetta primer sono stati utilizzati e il prodotto PCR è stato valutato mediante analisi del frammento (primer di sequenziamento non deve essere etichettato).
- Se sono stati utilizzati primer multiplex e clonalità è stata valutata su un gel, quindi utilizzare un primer a valle nella prima fase di sequenziamento ad es. un consenso primer IGHJ con la sequenza 5'-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3 '. In alternativa, può essere utilizzato un primer CH se cDNA è stato utilizzato come substrato. Successivamente, utilizzare sottogruppo specifico IGHV leader o primer FR1 per il secondo passaggio di sequenziamento.
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Protocollo di sequenziamento di esempio
Nota: Esistono diversi protocolli di sequenziamento e un protocollo di esempio è descritto di seguito.- Diluire 33 ng del prodotto della PCR in un volume totale di 11,5 µ l utilizzando, per esempio, acqua sterile. Denaturare il prodotto PCR di riscaldamento a 95 ° C per 5 minuti. Mettere immediatamente in ghiaccio per 10 minuti per impedire la formazione di strutture secondarie.
- Aggiungere 8 µ l di master mix in ogni provetta con 0,5 µ l (corrispondente a 5 pmol) del primer.
- Come controllo, preparare una provetta contenente 8 µ l di master mix, il modello di controllo pUC18 0,5 µ l, 2 primer di sequenziamento 47 µ l (-) e 9,5 acqua sterile µ l. Il volume totale finale in ogni tubo dovrebbe essere 20 µ l.
- Utilizzare condizioni termiche in bicicletta per la reazione di sequenziamento come dettagliato nella tabella 4.
- Preparare la soluzione di arresto mescolando 2 µ l di acetato di sodio 3M (pH 5.2), 2 µ l EDTA 100 Mm (pH 8.0) e 1 µ l di glicogeno (concentrazione di 20 mg/mL), quindi aggiungere 5 µ l di ciascun campione. Trasferire il prodotto ad un nuovo tubo del microcentrifuge.
- Aggiungere 60 µ l di etanolo al 100% (-20 ° C) e mescolare delicatamente. Centrifugare a 14.000 rpm per 15 minuti (4 ° C). Scartare il surnatante.
- Aggiungere 100 µ l di etanolo al 70% (-20 ° C) e mescolare delicatamente. Centrifugare a 14.000 rpm per 10 minuti (4 ° C). Scartare il surnatante. Ripetere una volta.
- Asciugare il pellet per 90 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 40 µ l di sodio dodecil solfato soluzione (SDS) per ogni campione.
- Trasferire il campione ad una piastra di sequenziamento, coprire con striscia tappi o guarnizioni di nastro, caricare alla macchina ed eseguire Sanger sequenziamento. La piastra di sequenziamento è solitamente un 96 pozzetti, fondo v, piastra PCR a pieno-gonna compatibile con il sequencer. Le piastre possono essere con codice a barre a seconda se deve essere eseguita internamente il sequenziamento, presso una società commerciale o presso una centro accademico sequenziamento/piattaforma.
- Dopo la sequenziazione, 'cucire insieme' la 2 legge generati dalla procedura di sequenziamento individuali per formare un completo IGHV gene riarrangiamento cioè, la sequenza di consenso.
6. l'analisi di sequenza
Nota: L'attenzione di sezioni seguenti per l'output ottenuto dal IMGT/V-QUEST tool30 quando si analizzano riorganizzate sequenze di IG e IMGT/JunctionAnalysis31, entrambi i quali sono particolarmente rilevanti per segnalazione clinica e ricerca studi. IMGT/V-QUEST è uno strumento di allineamento che confronta l'utente presentato sequenze di IG con la directory di riferimento IMGT imposta30. L'output dello strumento comprende diverse sezioni all'interno del quale l'utente può definire alcuni parametri.
- Specificare la specie, per esempio, Homo sapiens (umane) e tipo di recettore o locus (ad es. IGH, IGK o IGL).
- Incollare le sequenze devono essere analizzate, in formato FASTA e tra cui intestazioni, nell'area di testo (in gruppi di fino a 50 sequenze per corsa). In alternativa, è disponibile un'opzione per immettere il percorso di un file locale contenente le sequenze FASTA.
- Scegliere una delle seguenti opzioni di 3 visualizzazione per i risultati:
- Visualizzazione dettagliata: scegliere questa opzione per ottenere i risultati per ogni sequenza singolarmente.
- Vista di sintesi: scegliere questa opzione per compilare una tabella riassuntiva ordinata per nome del gene e allele IGHV o da ordine della sequenza di input. Questa opzione fornisce anche un allineamento di sequenze che, qualsiasi batch inviato, sono assegnate alla stesso gene IGHV e allele.
- File di Excel: scegliere questa opzione per fornire tutti i file di output come fogli di calcolo incorporati in un unico file. Tutte le opzioni di visualizzazione hanno una grande selezione dei parametri di base e avanzate da scegliere, tuttavia soltanto i fattori più pertinenti per l'analisi di sequenza CLL IG sono discussi di seguito nella sezione 'Rappresentante risultati'.
7. arresto/AssignSubsets strumento
- Per studiare l'assimilazione di IG di BcR all'interno di CLL (ulteriori informazioni fornite di seguito nella sezione 'Rappresentante risultati'), inviare sequenze di IGHV-IGHD-IGHJ FASTA della strumento di arresto/AssignSubsets32. Lo strumento indica che l'assegnazione al CLL principali stereotipati sottoinsiemi. Lo strumento di sottoinsieme-assegnazione insieme con le istruzioni dettagliate sono disponibili sul sito Web arresto/AssignSubset32 e anche sul sito di ERIC sotto la scheda servizi.
Representative Results
Esempi riportati di seguito illustrano i risultati ottenuti da IG gene sequenziamento analisi segue la procedura descritta sopra. Anche se l'estrazione del DNA e/o RNA sono procedure di routine per la maggior parte dei laboratori clinici/ricerca, un primo passo fondamentale consiste nel verificare la qualità/quantità di gDNA e/o RNA utilizzando uno spettrofotometro o altra tecnologia adatta ad elevata sensibilità. Il passo cruciale successivo prevede l'amplificazione di PCR di clonotypic riorganizzazione di gene IGHV-IGHD-IGHJ. Come accennato in precedenza, solo l'uso di primer leader IGHV consente l'amplificazione della lunghezza completa della sequenza del gene IGHV riarrangiata, permettendo così il vero carico SHM da determinarsi; di conseguenza, IGHV leader primer sono la scelta del primer consigliato (Figura 2). In rari casi dove gli iniettori IGHV leader non possono amplificare la riorganizzazione di IG clonotypic, FR1 IGHV primer può essere utilizzato. Come evidenziato nella Figura 3, è possibile osservare diversi prodotti/fasce PCR, soprattutto quando gDNA è il materiale di partenza; Queste bande dovrebbero essere asportate ed ordinato separatamente. Se sia IGHV leader e primer FR1 IGHV non riescono a produrre risultati, l'analisi deve essere ripetuta utilizzando un nuovo campione di paziente (quando possibile). L'ultimo checkpoint prima del sequenziamento consiste nel determinare il clonality del campione usando l'analisi del frammento (Figura 4).
Sequenze ottenute dovrebbero essere analizzati usando il tool IMGT/V-QUEST30. I parametri selezionati dall'utente comprendono specie, tipo del ricevitore o locus, ricerca per inserimento e opzione di cancellazione, ecc e sono elencati unitamente al numero di sequenze analizzate. Ogni sequenza FASTA viene visualizzato e il V-dominio analizzato da IMGT/V-QUEST è evidenziato in verde. Inoltre, se la sequenza di input è nell'orientamento opposto (antisenso), il programma automaticamente fornisce la sequenza inversa complementare e segnalare questo sopra la sequenza FASTA.
Il risultato tabella riassuntiva è fornito direttamente sotto la sequenza FASTA, nella parte superiore della visualizzazione dettagliata pagina dei risultati e contiene informazioni importanti per la segnalazione clinica delle analisi di sequenza del gene di IG in CLL. Ogni riga di questa tabella è spiegato sotto.
Riepilogo risultati. La prima riga nella tabella dei risultati indica la funzionalità della sequenza di input: una sequenza di IG riorganizzate può essere produttivi o improduttivi (Figura 5A e 5B). Una riorganizzazione di gene di IG è improduttivo se fermano i codoni sono presenti all'interno della V-D-J-regione (per VH) o il V-J-area (per VL) e/o se il riarrangiamento è out-of-frame a causa di inserimenti/eliminazioni. Un terzo di uscita viene fornito quando la funzionalità non può essere determinata, cioè, se la giunzione IGHV-IGHD-IGHJ non potrebbe essere identificata; in questo caso, il riassunto dei risultati sarebbe leggere come 'Nessuna riorganizzazione trovata' o 'Nessuna giunzione trovato'. È importante notare che solo produttiva e, così, le riorganizzazioni funzionali dovrebbero essere ulteriormente analizzate. Se la suola amplificato riarrangiamento IG non è funzionale (improduttivo o 'nessuna riorganizzazione trovata'), il processo di amplificazione di PCR deve essere ripetuto. Se il risultato resta negativo deve essere ottenuto un nuovo campione del paziente.
V-GENE e allele. La riga 'V-GENE e allele' indica il più vicino gene IGHV di germline e allele con relativo punteggio di allineamento e l'identità delle percentuali. Se parecchi geni e alleli dare lo stesso punteggio alto, tutti sono elencati. L'identità delle percentuali tra la sequenza inviata e il più vicino IGHV gene e allele è di particolare importanza poiché determina lo stato SHM. Questo valore viene calcolato dal primo nucleotide della V-regione all'estremità 3' del V-regione escluse CDR3. Se vengono utilizzati primers IGHV FR1, la sequenza corrispondente a quello del primer sempre dovrebbe essere rimosso per assicurare più accurato un risultato possibile. Dovrebbe essere notato che una percentuale bassa identità (< 85%) può derivare da un inserimento o l'eliminazione (ulteriormente discusso sotto) e questo dovrebbe essere il caso una nota di 'Warning' verrà visualizzato nella riga 'Riassunto dei risultati' per avvisare l'utente.
J-GENE e allele. Come descritto per il V-gene e allele sopra, la riga 'J-GENE e allele' indica la più gene di germline IGHJ e allele con relativo punteggio di allineamento e l'identità delle percentuali. Tuttavia, come il gene IGHJ è piuttosto breve e relativa estremità 5' potrebbe sono stati tagliati a causa di attività esonucleasi, scelte alternative vengono cercate anche dallo strumento, basato sul più alto numero di nucleotidi identici consecutivi.
D-GENE e allele di IMGT/JunctionAnalysis. L'aveva-GENE e allele di IMGT/JunctionAnalysis' indica il più vicino germline IGHD gene e allele con la struttura di lettura D-regione identificata tramite lo strumento nella sequenza di utente. IMGT/JunctionAnalysis31 fornisce un'analisi dettagliata e accurata della giunzione ed è stato integrato nell'interfaccia dello strumento IMGT/V-QUEST. Questo strumento gestisce tutti gli aspetti di difficoltà collegata a IGHD gene e allele identificazione cioè, (i) la breve durata della D-regione; (ii) l'uso di 2 o anche 3 lettura cornici; (iii) rifilatura di exonuclease ad entrambe le estremità del gene; e (iv) la presenza di mutazioni.
FR-IMGT lunghezze, lunghezze di CDR-IMGT e giunzione AA. Questa riga fornisce la lunghezza del IGHV FRs e CDRs indicato tra parentesi quadre e separati da punti e lo svincolo dell'aminoacido (AA). Illustra la sequenza di AA della giunzione (i) una riorganizzazione in - o out-of-frame (out-of-frame posizioni sono indicate dal simbolo '#'), (ii) la presenza o l'assenza di codoni di stop (un codone di stop è indicato da un asterisco ' *') e (iii) la presenza o l'assenza della ancoraggi di VH CDR3-IMGT: C (2 °-CYS 104) e W (J-TRP 118).
Ipermutazioni somatiche sono costituiti principalmente da modifiche di singolo nucleotide, tuttavia, piccoli inserimenti ed eliminazioni all'interno della regione di V possono essere osservate, anche se a un molto più basso di frequenza33. Quando utilizzando i parametri di default IMGT/V-QUEST, inserimenti ed eliminazioni non vengono automaticamente rilevate; Tuttavia, forti indicazioni che una sequenza può trasportare tali alterazioni, vale a dire, un'identità bassa percentuale e/o diverse lunghezze di IGHV CDR1-IMGT e CDR2-IMGT tra la sequenza di utente inviato e la più vicina germline gene e allele, vengono rilevati dalla strumento e un avviso di allarme viene visualizzata sotto la tabella di riepilogo dei risultati (Figura 5).
IMGT fornisce un'opzione chiamata 'Ricerca per inserimenti ed eliminazioni' nella sezione 'Parametri avanzati' situata sotto la sezione 'Visualizza i risultati'. In casi dove vengono visualizzati avvisi pertinenti, si consiglia di utilizzare questa funzionalità. Quando gli inserimenti e le eliminazioni vengono rilevate, i dettagli completi del ritrovamento sono fornite nella sezione 'Risultato riepilogo' tra cui (i) dove l'inserimento o l'eliminazione è situato cioè, VH FR-IMGT o CDR-IMGT; (ii) il numero di nucleotidi inseriti o eliminati; (iii) la sequenza (solo per gli inserimenti); (iv) se si è verificato un frameshift; (v) il codone di V-regione da cui si inizia l'inserimento o l'eliminazione; e (vi) la posizione del nucleotide colpite nell'inviato sequenza (Figura 5). Per gli inserimenti, lo strumento rimuove il insertion(s) dalla sequenza utente inviato e poi ri-analizza la sequenza utilizzando i parametri standard di IMGT/V-QUEST. Se le eliminazioni vengono rilevate, lo strumento aggiunge le lacune, rappresentate da punti, per sostituire i nucleotidi eliminati prima di ripetere l'analisi.
Come per ogni test diagnostico o prognostico eseguite nei laboratori clinici, norme rigorose e un elevato livello di riproducibilità sono della massima importanza. L'output IMGT/V-QUEST fornisce gran parte delle informazioni necessarie per la notifica dei risultati delle analisi di sequenza del gene di IG in CLL, vale a dire, (i) il IGHV, IGHD e IGHJ geni e alleli utilizzati; (ii) la funzionalità del clonotypic IGHV-IGHD-IGHJ gene riarrangiamento cioè, se il riarrangiamento è produttivo o improduttivo; e gene IGHV (iii) l'identità delle percentuali del riarrangiati e allele rispetto alle più gene IGHV germinale e allele. Per i dettagli completi per quanto riguarda la segnalazione clinica dei geni IG in CLL, interpretazione del problematico o casi tecnicamente impegnativo e consigli per la determinazione precisa e robusta della condizione SHM del gene IGHV in CLL, il lettore è diretto di recente aggiornato ERIC linee guida e rapporti27,34.
Infine, grazie alla nostra conoscenza crescente assimilazione di BcR IG in CLL, un ulteriore requisito consigliato per la segnalazione clinica delle riorganizzazioni di gene di IG in CLL riguarda l'assegnazione delle cause ai sottoinsiemi di major stereotipato. Ora si raccomanda di stato nella relazione clinica se la riorganizzazione di gene IGHV produttiva analizzata può essere assegnata a uno dei principali sottoinsiemi stereotipati, cioè sottoinsiemi #1, #2, #4 e #812,27. Assegnazione ai principali sottoinsiemi CLL stereotipato deve essere eseguita con l'utilizzo del tool (Figura 6) arresto/AssignSubsets32.
| 5' IGHV FR1 primer | Sequenza più superelegante | Quantità per 60 μL di miscela primer | |
| IGHV1 | CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG | 10 | |
| IGHV2 | CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG | 10 | |
| IGHV3 | GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG | 10 | |
| IGHV4 | CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG | 10 | |
| IGHV5 | GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC | 10 | |
| IGHV6 | CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG | 10 | |
| Iniettori di leader IGHV 5' | |||
| IGHV1L | AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGG | 5 | |
| IGHV1bL | AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAG(C/A) | 5 | |
| IGHV2aL | AC AAATCGATACCACCATGGACACACTTTGCT (A/C) | 5 | |
| IGHV2bL | AAATCGATACCACCATGGACATACTTTGTTCCAC | 5 | |
| IGHV3aL | AAATCGATACCACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC | 5 | |
| IGHV3bL | AAATCGATACCACCACCATGGA(A/G)(C/T)T(G/T)(G/T)G(G/A)CT(G/C/T) (A/C/T) GC | 5 | |
| IGHV4L | AAATCGATACCACCATGAAACACCTGTGGTTCTT | 10 | |
| IGHV5L | AAATCGATACCACCATGGGGTCAACCGCCATC | 10 | |
| IGHV6L | AAATCGATACCACCATGTCTGTCTCCTTCCTC | 10 | |
| 3' primer IGHJ | |||
| IGHJ1-2 | TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC | 20 | |
| IGHJ3 | TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC | 10 | |
| IGHJ4-5 | TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC | 20 | |
| IGHJ6 | TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC | 10 | |
Tabella 1. Sequenze dell'iniettore e le quantità per l'amplificazione di PCR di clonotypic riorganizzazione di gene IGHV-IGHD-IGHJ.
| Reagente | Volume (µ l) |
| RB 10 buffer 10x | 5 |
| MgCl2 (50 mM) | 3 |
| dNTP (10 mΜ) | 2 |
| Mix di primer IGHV leader/FR1 (10 μM) | 3 |
| Mix di primer IGHJ (10 μM) | 3 |
| H2O | 31,5 |
| Volume totale | 47,5 |
Tabella 2. Reagenti per l'amplificazione di PCR di clonotypic riorganizzazione di gene IGHV-IGHD-IGHJ.
| Temperatura | Durata | Numero di cicli | Descrizione |
| 94 ° C | 5 minuti | 1 | attivazione della polimerasi |
| 94 ° C | 1 minuto | 39 | denaturazione |
| 59 ° C | 1 minuto | ricottura | |
| 72 ° C | 1,5 minuti | estensione | |
| 72 ° C | 10 minuti | 1 | estensione finale |
| 18 ° C | ∞ | 1 | conservazione |
Tabella 3. Condizioni termiche di ciclismo per l'amplificazione di PCR di clonotypic riorganizzazione di gene IGHV-IGHD-IGHJ.
| Temperatura | Durata | Numero di cicli | Descrizione |
| 94 ° C | 5 minuti | 1 | attivazione della polimerasi |
| 96 ° C | 20 secondi | 30 | denaturazione |
| 50 ° C | 20 secondi | ricottura | |
| 60 ° C | 4 minuti | estensione | |
| 4 ° C | ∞ | 1 | conservazione |
Tabella 4. Condizioni termiche in bicicletta per la reazione di sequenziamento del gene di IG.
Figura 1. Rappresentazione schematica di una riorganizzazione di gene IGHV-IGHD-IGHJ con primer varie sedi indicate di ricottura. 5' primer IGHV tempri la sequenza leader che si trova a Monte della sequenza codificante IGHV. 5' primer di quadro (FR) IGHV tempri l'inizio della regione FR1, che si trova all'interno del gene IGHV riarrangiato, considerando che i primer IGHJ 3' temprano fino alla fine del gene IGHJ riarrangiato. UTR: regione non tradotta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. L'amplificazione di PCR della riorganizzazione di gene IGHV-IGHD-IGHJ in 7 campioni di pazienti utilizzando 5' IGHV leader primers. La corsia di ottava rappresenta un controllo positivo considerando che il controllo negativo per la PCR è stato caricato la nona corsia. Il prodotto PCR previsto è circa 500 paia di basi in dimensioni quando si utilizza primer leader IGHV. L'asterisco nell'ultima colonna del gel indica il DNA ladder 100 bp. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. L'amplificazione di PCR della riorganizzazione di gene IGHV-IGHD-IGHJ in 13 campioni di pazienti utilizzando primers IGHV FR1. La quattordicesima corsia contiene il controllo positivo, mentre il controllo negativo è stato caricato sulla corsia XV. Come evidenziato nella corsia 2, per cui il DNA è stato il materiale di partenza, si sono osservati diverse fasce PCR, che dovrebbero essere asportate e sequenziato separatamente. Campioni in corsie 5, 7 e 13 dato risultati policlonali (testimoniate lo striscio nel gel) e, pertanto, deve essere ripetuto il passaggio PCR. In caso di una seconda PCR amplificare la IG riarrangiati geni l'analisi devono essere eseguita su un nuovo campione (se possibile) o utilizzando un primer diverso set. Il prodotto PCR previsto è circa 350 paia di basi in dimensioni quando si utilizza IGHV FR1 primer mix. L'asterisco nell'ultima colonna del gel indica il DNA ladder 100 bp. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Valutazione della clonalità mediante analisi genescan. In analisi genescan, monoclonale PCR prodotti danno luogo ad un picco dominante di prodotti fluorescenti di identiche dimensioni (pannello superiore), mentre i prodotti di PCR policlonali causare una più normale distribuzione delle dimensioni del prodotto (pannello inferiore). Le tracce di rosse sono cime da una scaletta di DNA fluorescente-etichetta che viene caricato nella stessa iniezione capillare del campione analizzato. I frammenti di dimensioni standard sono soggetti alla medesima forza elettroforetica del campione e sono quindi esposti alle stesse condizioni di iniezione. La spaziatura uniforme dei frammenti dimensioni standard conferma la vocazione di dimensioni precise. Le tracce blue rappresentano il monoclonale (pannello superiore) o policlonale natura (pannello inferiore) dei campioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Esempi di tabelle di riepilogo il risultato fornite da IMGT/V-QUEST. (A) tabella Riepilogo dei risultati per una riorganizzazione di gene IGHV-IGHD-IGHJ produttiva (nessun codon(s) di arresto e una giunzione di sequenza in-frame). Il V-GENE e allele e la J-GENE e allele identificato nella sequenza di utente di IMGT/V-QUEST in questo caso sono IGHV4 - 34 * 01 e IGHJ6 * 02 (sulla base della più alta valutazione del Punteggio di allineamento). L'identità delle percentuali è 99,65% a causa di una singola mutazione somatica. Il D-GENE e allele identificato da IMGT/JunctionAnalysis è il IGHD3 - 3 * 01 nella lettura telaio 1. Le lunghezze delle regioni 4 quadro (FRs) così come le 3 regioni determinante di complementarità (CDRs) sono indicate tra parentesi. La sequenza dell'amminoacido (AA) della giunzione IGHV-D-J è anche fornita. In questo esempio la giunzione comprende 22 AAs. (B) tabella Riepilogo dei risultati per una sequenza di riarrangiamento del gene IGHV-IGHD-IGHJ che è improduttiva a causa di una giunzione di out-of-frame. Una X per la lunghezza di CDR3-IMGT indica che per questa sequenza la lunghezza non può essere determinata. I segni di '#' osservati nella sequenza di giunzione AA indicano un frameshift. (C) tabella Riepilogo dei risultati l'allarme basso identità di V-regione (60,94%) e che indica che l'opzione 'inserimenti ed eliminazioni' nella sezione 'Parametri avanzati' dovrebbe essere usato. (D) tabella Riepilogo dei risultati per il caso di germline bassa percentuale identità illustrata in (C) dopo aver ripetuto l'analisi di sequenza utilizzando l'opzione 'Cerca per inserimenti ed eliminazioni'. La percentuale di identità corretta viene visualizzata tra parentesi è calcolata considerando l'inserimento come un singolo evento mutazionale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 6. Tabella di relazione di sottoinsieme assegnazione generato dallo strumento di arresto/AssignSubsets. Le sequenze di FASTA IG da 10 pazienti con LLC (A1-A10) sono state presentate per lo strumento di arresto/AssignSubsets. Caso A4 è stato assegnato a sottoinsieme CLL stereotipati #2 (pazienti all'interno di questo gruppo sono noti per avere una prognosi indipendentemente dal carico SHM) con elevata fiducia. Sette casi sequenze non erano assegnate a un sottoinsieme di stereotipato principale e quindi classificati come non assegnato. Due delle sequenze inviate (A7 e A8) non poteva essere usato per l'assegnazione del sottoinsieme e invece sono state classificate come saltato/malsana a causa di problemi con la sequenza, cioè, a causa di una giunzione di out-of-frame o la presenza di codoni di stop. Un'esauriente spiegazione delle intestazioni di tabella e lo strumento è disponibile presso il sito Web di arresto/AssignSubsets32. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Lo studio dei geni IG in CLL è stato vitale non solo per fornire una migliore comprensione nella patobiologia di malattia ma anche per migliorare la stratificazione del rischio del paziente. È quindi fondamentale che la procedura multi-step di analisi di sequenza del gene di IG e successiva interpretazione dei dati di sequenza viene eseguite in un modo standardizzato. La disponibilità di materiale paziente adeguata e sufficiente e i tempi di campionamento non dovrebbe avere un impatto sulla capacità di eseguire analisi mutazionale del gene IG, dal momento che il test può essere eseguito su PB e su ogni campione con un alto conteggio delle cellule del tumore CLL. La separazione di cellule mononucleari di anima usando metodi di separazione gradiente è effettuata ordinariamente nei laboratori diagnostici, e come sempre, cura dovrebbe essere presa quando si aggiunge la soluzione di sangue/RPMI nella provetta contenente il gradiente; Questa operazione deve essere eseguita in modo lento e delicato per evitare di disturbare il gradiente e prevenire la perdita di cellule.
A seguito di separazione cellulare, vengono estratti gli acidi nucleici. Sia gDNA e cDNA sono adatti per l'analisi SHM della riorganizzazione clonotypic IGH, tuttavia, ci sono vantaggi e svantaggi per l'utilizzo di qualsiasi materiale. Il flusso di lavoro di laboratorio procede più rapidamente quando si utilizza gDNA poiché nessuna trascrizione inversa deve essere eseguita prima dell'amplificazione di PCR. Detto questo, utilizzando gDNA come substrato per la PCR può provocare l'amplificazione delle riorganizzazioni sia produttive e improduttive, che, a sua volta, può portare a ulteriori laboratorio hands-on, cioè, purificazione o l'asportazione del gel di più prodotti PCR e sequenziamento individuo di tutte le riorganizzazioni. Quando si confrontano gli approcci gDNA e cDNA, per quest'ultimo, un passaggio di trascrizione inversa deve essere eseguita prima di procedere con l'amplificazione di PCR. Tuttavia, in questo caso, per la maggior parte dei casi, solo le riorganizzazioni produttive di IG saranno amplificate e successivamente sequenziate. Così, solo un unico prodotto PCR sarà purificato e sequenziato, mentre l'interpretazione dei risultati è più semplice.
L'efficienza di amplificazione dipende in larga misura la qualità del gDNA/cDNA, che dovrebbero essere valutato utilizzando un metodo di quantificazione sensibili e i primer utilizzati. I primers utilizzati sono fondamentali per l'intera procedura analitica perché la determinazione accurata del livello di SHM può essere raggiunto solo amplificando l'intera sequenza del gene IGHV riarrangiato. Un riarrangiamento full-length può essere valutato solo se vengono utilizzati 5' primer di leader IGHV, giustificando così le recenti raccomandazioni da ERIC per l'uso di leader primer27. L'uso di primers alternativi, che conducono all'amplificazione delle riorganizzazioni di gene IGHV-IGHD-IGHJ incomplete, non è appropriato per l'analisi mutazionale del gene IGHV e quindi fortemente sconsigliato. La sola eccezione relativamente ai casi che ripetutamente producono risultati negativi quando IGHV leader gli iniettori sono utilizzati e analisi del materiale nuovo paziente è non possibile o anche fa non dare risultati. Se l'uso di diversi campioni dei pazienti e/o materiale (gDNA/cDNA) e vari primer imposta ancora non riescono a produrre un prodotto PCR, possibili ragioni potrebbero essere che il carico delle cellule del tumore è troppo basso o che linfocitosi non è a causa di un clone CLL (nel qual caso il immunophenotype deve essere rivalutato). Primer usati per l'analisi deve sempre essere indicato nel rapporto clinico.
Come CLL deriva dall'accumulazione delle cellule di B monoclonali recanti la stessa riorganizzazione di gene IGHV-IGHD-IGHJ, per la stragrande maggioranza del clonality casi valutazione rivelerà un unico picco monoclonale, vale a dire, un singolo clone. In rare occasioni, doppio riorganizzazioni o anche modelli di oligoclonal possono essere osservati35. In tali casi, l'elettroforesi del gel non è la tecnica preferita per la valutazione di clonalità e metodi più sensibili come l'analisi del frammento devono essere applicati. Una volta confermata la clonalità, il passaggio finale prima del sequenziamento si riferisce alla purificazione del prodotto della PCR per garantire che le sequenze di alta qualità sono ottenute. Infine, lo strumento IMGT/V-QUEST è la risorsa consigliata per l'analisi di sequenza IG di ERIC. Come i database IMGT sono costantemente aggiornati e relazione risultati in maniera coerente e ben commentato, questo strumento garantisce analisi standardizzate e facilita l'analisi comparativa tra diverse strutture cliniche o accademici.
Come immunogenetici analisi in CLL ha prognostico e, in particolare, implicazioni predittive, robusta analisi della riorganizzazione di gene IGHV-IGHD-IGHJ tra cui l'assegnazione ai principali sottoinsiemi CLL stereotipato, non è più solo auspicabile, ma di fondamentale importanza. Ciò è particolarmente evidente in questa epoca di approcci terapeutici e le potenzialità che l'analisi del gene IG ha per guidare il trattamento decisioni5,21,22,23,36,37 ,38, come ufficialmente indicato dal recente aggiornamento delle linee guida NCI-sponsorizzato dall'International Workshop on CLL24. Che ha detto, rigorosi standard sono garantiti, soprattutto come determinazione dello status della clonotypic SHM riorganizzate gene IGHV nei pazienti con LLC non è una questione banale e coinvolge un processo multi-step. Soprattutto, determinate fasi sperimentali, in particolare la scelta dei primer, resa risultati superiori quando specifiche opzioni e/o approcci siano rispettati, altri aspetti tecnici sono favorevoli ad un certo grado di flessibilità, come ad esempio la scelta dei materiali o il Metodo per valutare la clonalità, dovuto al fatto che conducono a sottili differenze, se del caso, per quanto riguarda i risultati finali.
Nell'ultimo decennio, ERIC ha cercato di promuovere la standardizzazione e l'armonizzazione dei vari metodi pertinenti alla predizione e diagnostica CLL. Questo si riflette le raccomandazioni pubblicate e gli orientamenti per analisi immunogenetica27,34, numerosi laboratori didattici organizzati ed eventi, l'istituzione di una rete di IG, come pure un forum online esperto per discutere e fornire indicazioni sull'interpretazione di sequenza genica IG in CLL. L'obiettivo generale di ERIC attraverso queste azioni è quello di promuovere la gestione clinica ottimale e cura del paziente. Malgrado gli sforzi intensi, questo compito è lungi dall'essere completa e infatti è diventata più complesso a causa lo sviluppo del romanzo high throughput sequenziamento puntato profilatura immuni. Tuttavia, anche se rimangono problemi, intensi sforzi per la standardizzazione robusto di analisi del gene IG in CLL continuano e sono attualmente al centro delle attività in corso all'interno di ERIC.
Disclosures
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi rilevante di divulgare.
Acknowledgments
Ringraziamo i membri attuali e del passato dei nostri gruppi di ricerca, il gruppo IgCLL ed ERIC, per l'impegno e l'entusiasmo nello studio immunogenetica in CLL. Vorremmo anche riconoscere la fiduciosa collaborazione di tutti i membri dell'iniziativa IMGT/CLL-DB e, in particolare, il Professor Marie-Paule Lefranc e Dr Veronique Giudicelli, Laboratoire d'Immunogenetique Moleculaire, LIGM, Universite Montpellier II, Montpellier, Francia e IMGT, il sistema di informazioni internazionale di immunogenetica, per le loro enormi sostenere e aiutare con analisi di sequenza del gene di IG. Questo lavoro è stato supportato in parte dalle concessioni dal TRANSCAN-179 romanzo JTC 2016; Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant #20246 e speciale programma molecolare clinica oncologia-5 per mille #9965), Milano, Italia; Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) n. 2015ZMRFEA, MIUR, Roma, Italia; L'associazione svedese del cancro, il Consiglio di ricerca svedese, Knut e Alice Wallenberg Foundation, Karolinska Institutet, Università di Uppsala, Uppsala University Hospital e Cancer Research Foundation del Leone, Uppsala; Programma ODYSSEUS, attuato nell'ambito di "Azione per la strategica sviluppo su the ricerca e settore tecnologico", finanziato dal programma operativo "Competitività, imprenditorialità e innovazione" (QRSN 2014-2020) e co-finanziato dalla Grecia e l'Unione europea (Fondo europeo di sviluppo regionale).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA: Tube Stopper | ThermoFisher scientific | 02-689-4 | material storage |
| BD Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tube - Sodium Heparin | Becton Dickinson | 362753 | material storage |
| BD Vacutainer Heparin Blood Collection Tubes FAQ | Daigger Scientific | 366480 | material storage |
| UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575038 | cell processing |
| Centrifuge tubes 15 mL CS500 | Corning | 352096 | cell processing |
| Centrifuge tubes PP 50 mL CS500 | Corning | 352070 | cell processing |
| RPMI Medium 1640 (1X) liquid | Invitrogen | 21875-091 | cell processing |
| Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL | STEMCELL Technologies | 17-1440-02 | cell processing |
| Serological pipettes 5 mL | Sarstedt | 861,253,001 | cell processing |
| Serological pipettes 10 mL | Sarstedt | 861,254,001 | cell processing |
| Serological pipettes 25 mL | Sarstedt | 861,685,001 | cell processing |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X) | Invitrogen | 14190250 | cell processing |
| Neubauer plate | Marienfeld-Superior | 640010 | cell processing |
| Tuerk solution | Sigma-Aldrich | 93770 | cell processing |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K1820-01 | DNA extraction |
| QIAamp RNA Blood Mini Kit | Qiagen | 52304 | RNA extraction |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA extraction |
| 5X first-strand buffer | Invitrogen | P/N Y02321 | cDNA synthesis |
| Random Primers, 20 µg | Promega | C1181 | cDNA synthesis |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen | 10777019 | cDNA synthesis |
| DTT | Invitrogen | P/N Y00147 | cDNA synthesis |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | cDNA synthesis |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | cDNA synthesis, PCR |
| PCR Buffer | Invitrogen | O00065 | PCR |
| MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) | ThermoFisher scientific | AB0359 | PCR |
| Taq DNA Polymerase, recombinant | Invitrogen | 10342-020 | PCR |
| Applied Biosystems 5′ Labeled Primers | ThermoFisher scientific | - | PCR/Clonality assessment |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | PCR product quantification |
| UltraPure TBE Buffer, 10X | ThermoFisher scientific | 15581044 | gel electrophoresis |
| UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL | ThermoFisher scientific | 15585011 | gel electrophoresis |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher scientific | S33102 | gel electrophoresis |
| 10X BlueJuice Gel Loading Buffer | Invitrogen | 16500100 | gel electrophoresis |
| DNA Ladder 1000 bp/1 kb ladder BLUE ready-to-use | Geneon | 305-105 | gel electrophoresis |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher scientific | 16500500 | gel electrophoresis |
| Agarose low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414-250G | gel electrophoresis |
| Novex TBE Gels, 10%, 10 well | ThermoFisher scientific | EC6275BOX | gel electrophoresis |
| ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent | ThermoFisher scientific | 78201.1.mL | PCR product clean-up |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | PCR product clean-up |
| GenomeLab DTCS Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | Sanger sequencing |
| Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 | ThermoFisher scientific | R1181 | Sanger sequencing |
| Glycogen, molecular biology grade | ThermoFisher scientific | R0561 | Sanger sequencing |
| Ethanol absolute | EMD Millipore | 1024282500 | Sanger sequencing |
| SafeSeal tube 1.5 mL | Sarstedt | 72,706 | general use |
| Multiply-Pro cup 0.2 mL, PP | Sarstedt | 72,737,002 | general use |
| Centrifuge | equipment | ||
| PCR machine | equipment | ||
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | equipment |
References
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