Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Membran ombygging av gigantiske blemmer svar på lokaliserte kalsium Ion graderinger

Published: July 16, 2018 doi: 10.3791/57789
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry and Chemical Engineering, Chalmers University of Technology

Summary

Vi presenterer en teknikk for kontaktløse micromanipulation av blemmer, bruker lokaliserte kalsium ion graderinger. Microinjection av en kalsium ion løsning, i en gigantisk lipid vesicle, benyttes til oppussing lipid membran, som resulterer i produksjon av membran rørformede utstikkende deler.

Abstract

I en rekke grunnleggende celleprosesser, som membran smugling og apoptose, skjer cellemembranen figur overganger samtidig med lokale variasjoner i kalsium konsentrasjon. Molekylær hovedkomponentene i prosessen har blitt identifisert; imidlertid bestemte samspillet mellom kalsium ion graderinger og lipider inni cellen membranen er langt mindre kjent, hovedsakelig på grunn av den komplekse naturen av biologiske celler og vanskelig av observasjon ordninger. For å oppnå dette, er en syntetisk tilnærming implementert for å avdekke lokaliserte effekten av kalsiumioner på cellemembranen imiterer. Etablere en etterligne slik forholdene i en celle er et severalfold problem. Først er en tilstrekkelig biomimetic modell med aktuelle dimensjoner og membran sammensetning nødvendig for å fange de fysiske egenskapene til cellene. Andre er en micromanipulation oppsett nødvendig for å levere en liten mengde kalsiumioner til en bestemt membran plassering. Endelig er en observasjon plan nødvendig å oppdage og registrere svaret av lipid membranen eksterne stimulering. Denne artikkelen inneholder en detaljert biomimetic tilnærming for å studere kalsium ion-membran samhandling, hvor en lipid vesicle system, bestående av en gigantisk unilamellar vesicle (GUV) koblet til en multilamellar vesicle (MLV), utsettes for en lokalisert kalsium Gradert dannet ved å bruke en microinjection. Dynamikken i ioniske påvirker membranen ble observert bruker fluorescens mikroskopi og innspilt på video bildefrekvens. Som følge av membran stimulering, buet sterkt membran rørformede utstikkende deler (MTPs) dannet inne GUV, orientert fra membranen. Beskrevet tilnærming induserer remodeling av lipid membran og MTP produksjonen på en helt kontaktløse og kontrollert måte. Denne tilnærmingen introduserer å ta detaljene av kalsium ion-membran samspill, gir nye muligheter for å studere mekanismer cellemembranen omforming.

Introduction

Rollen av kalsiumioner i biologiske prosesser, spesielt deres engasjement i signalering, celledeling og membran fusion, er fokus for mange mekanistisk studier1. Intracellulær cytoplasmatiske kalsium ion konsentrasjonen er på 100 nM, mens kalsium i organeller, som endoplasmatiske retikulum, sekretoriske blemmer og mitokondrier, nå nivåer i titalls millimolars i konsentrasjon. Dette skaper bratt kalsium ion konsentrasjon gradient størrelsesordener over intracellulær membraner2,3,4,5,6,7,8 ,9. Derfor variasjonene av kalsium konsentrasjon forekommer på både de ekstracellulære og intracellulær ekstracellulære kalsium ion nivået er rundt 2 mM. Videre synkronisert nyere studier beviser at intracellulær kalsium ion signalisering hendelser og neuronal aktivitet kan inntreffe under vilkår av lokale svingninger av ekstracellulære kalsium ion konsentrasjoner, indikerer viktigheten av intra- og ekstracellulære kalsium ion variasjoner10.

Å forstå samspillet mellom kalsiumioner og biologiske membraner, en syntetisk tilnærming som innfødt cellemembraner erstattes med lipid bilayer blemmer har blitt implementert. Utsette blemmer kalsium ion løsninger fører til endringer i lipid hodet grupper og hydrokarbon kjeden pakking, økt membran spenning, og vesicle aggregering, samt segregering av lipider og membran fase overgang11,12 ,13,14,15,16. Egenskapene for lipid membraner ved eksponering til kalsiumioner har blitt undersøkt med eksperimentelle teknikker som X-ray og 1H-NMR spektroskopiske eller termodynamisk studier11,16, 17 , 18. i disse studiene, membran sammensetningen er ofte innstilt slik innfødt cellemembraner og inneholder slike fysiologiske lipider phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE) og fosfatidylserin (PS). PS er spesielt viktig i kunstig vesicle forberedelse fordi det er en vesentlig komponent i mange mobilnettet prosesser inkludert intracellulær membran smugling, exocytosis og apoptose19,20.

Størrelsen på syntetiserte lipid blemmer ofte varierer fra nanometer til flere mikrometer. Blant annet vesicle preparater, gigantiske unilamellar blemmer (GUVs), som er flere titalls mikrometer i diameter, er spesielt viktig på grunn av deres relativt store størrelsen, ligner dimensjonene av enkelte celler21 , 22 , 23. tilgjengelig areal på GUVs gjør effekten av lokale kjemiske graderinger på membran Biofysiske egenskaper studier. Ved å utsette bare en del av membran overflaten til eksterne stimuli, kan membran dynamikken bli mer nøye undersøkt. For eksempel har det vært vist at lokaliserte anvendelse av kjemiske eller pH graderinger på overflaten av GUVs fører til dannelse av rørformede utstikkende deler som ikke ble det observert bulk eksponering24,25. Observerte forskjeller i membranen atferd ringe for metoden videreutvikling av enkelt-vesicle avhør ordninger for å få noen innsikt i mekanismer av cellemembranen remodeling.

Bygge på metoder for microinjection og micromanipulation fra det tidlige 1900-tallet26,27, i forbindelse med nyere fremskritt av enkelt-vesicle manipulasjon ordninger fra 2000-tallet23,28 , denne artikkelen presenterer en tilnærming i som membran remodeling og dannelsen av membran rørformede utstikkende deler (MTPs) i GUV membranen genereres svar på lokal anvendelse av kalsiumioner.

Vår tilnærming benytter en vesicle består av en GUV koblet til en multilamellar vesicle (MLV) som biomimetic membran modellsystem (figur 1A). MLV kreves som et lipid reservoar for komplisert å levere lipid materiale til GUV ved eksponering for kalsium ion gradering. Denne tilkoblingen kan komplisert å kompensere for økningen i membranen spenningen under indusert remodeling og forme overgangen av GUV membranen og gi lipider for MTP. Videre MLV forenkler overflaten immobilisering fordi den er større sammenlignet med GUV. GUV-MLV komplekser, når immobilisert på en solid underlaget, har tidligere blitt brukt for produsere nanotube-vesicle nettverk, studere polymer-membran samhandling og etterligne på slutten stadier av exocytosis29,30, 31,32,33.

Tidligere protokoller brukes soyabønner polar lipid ekstrakt (SPE) å forberede GUV-MLV komplekser28. SPE består av en blanding av fosfolipider som inkluderer PC (45,7%), PE (22.1%), phosphatidylinositol (PI, 18.4%), phosphatidic syre (PA, 6,9%) og en blanding av andre lipider (6,9%). I vår protokollen heri, SPE blandingen er dopet med 20% av 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (natrium salt) (DOPS) å etterligne indre heftet av plasma cellemembranen. En ytterligere 1% av ATTO 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-DOPE) brukes stain lipid-bilayer for å aktivere overvåking av membran remodeling bruker fluorescens mikroskopi. GUVs har symmetrisk lipid sammensetning over bilayer og utsettes lokalt for 5 mM konsentrasjoner av veisalt (CaCl2). Slike eksperimentelle forhold, med en forhøyet kalsium konsentrasjon, etterligne også ytre membran heftet av apoptotisk celler, hvor PS molekylene er uttrykt34. Dannelsen av GUV-MLV komplekser krever bruk av en modifisert rehydrering-dehydrering metode opprinnelig utviklet av Criado og Keller35. Vesicle forberedelse protokollen inneholder dannelsen av en tørr lipid lag, som deretter brukes til små blemmer i løsningen. Denne løsningen er så dehydrert og utvannet for å danne siste GUV-MLV komplekser. Figur 2A -D illustrerer de viktigste trinnene for utarbeidelse av en typisk GUV-MLV kompleks.

Etter vesicle forberedelsen er fullført og danner komplekse er immobilized på glass underlaget, brukes microinjection teknikken til å levere små mengder kalsiumioner til ytre heftet av GUV gjennom et åpent tips glass brønnene. Flyten av kalsium løsning av spissen genererer en lokalisert kalsium ion gradient på GUV membran overflaten, fører til membran remodeling og generering av MTPs. MTPs er orientert fra kalsium ion kilden og vokser inne GUV. Denne MTP-formasjonen kan overvåkes direkte bruke fluorescens mikroskopi og registrert bruker et digitalt kamera. Figur 3 viser eksperimentelle oppsettet brukes til å produsere membran remodeling. Dannelsen av MTPs (figur 2E og Figur 4) i denne protokollen demonstrerer et kontrasterende resultat til kalsium ion eksponering eksperimenter utført i bulk volumer. Under bulk forhold, GUVs brudd og danne membran oppdateringer som kan observeres for å overholde glass overflaten25.

Mer informasjon om dannelsen av GUV-MLV komplekser, samt prosedyren for å utføre microinjection av kalsiumioner, er beskrevet i denne artikkelen. Protokollene er hovedsakelig fokusert på kalsium ion microinjection; men kan denne tilnærmingen enkelt endres for bruk i å studere membran svarene på grunn av lokale eksponering til andre ioner eller proteiner. I tillegg stilles sammensetningen av blemmer for å isolere lipid komponent rollene under membranen remodeling. Presentert protokollen krever ikke noe avansert utstyr å produsere GUV-MLV komplekser og er preget av en høy grad av reproduserbarhet.

Protocol

1. utarbeidelse av små Lipid blemmer

  1. Forberede en løsning av lipider SPE/DOPS/ATTO488-DOPE i kloroform med en masse blande forholdet mellom 79/20/1.The siste konsentrasjon av lipider i kloroform er 1 mg/mL, og siste massen er 0.6 mg (vanligvis mindre enn 1 mg). Bruk disponibel rundt bunnen hetteglass (rund bunn glass rør, 10 x 75 mm) når forberede lipid løsning uten en pre rengjøringstrinnet.
    1. Fyll og skyll glass sprøyter (25 µL) med kloroform minst 5 ganger før bruk. Fylle og skyll glass sprøyten minst 5 ganger, 3-4 mL kloroform er tilstrekkelig.
      FORSIKTIG: Når håndtere kloroform, bruker glass sprøyter og utfører alle prosedyrer i avtrekksvifte med riktige hansker og vernebriller hele tiden. Ikke bruke plast flasker, sprøyter eller Pipetter ved håndtering kloroform.
  2. Pakk hetteglass med lipid blandingen med metallfolie beskytte innholdet fra lyset og fordampe løsemiddelet i en roterende fordamperen for 3t fjerne kloroform, med trykket nå 7 kPa vakuum 80 RPM. En tørr lipid film dannes nederst i hetteglass etter fordampning (figur 2A).
    Merk: Skalere opp flere ganger og bruker større mengder lipider krever lengre roterende fordampning tid å sikre fullstendig fjerning av kloroform.
  3. Sakte legge til 600 µL av fosfat bufret (PBS) buffer saltvannsoppløsning (pH 7,8, uten fortynning) på tørket lipid filmen. Lagt til bufferen, forsiktig legge 6 µL glyserol å beskytte prøven fra komplett dehydrering under GUV-MLV formasjon trinn (oppnå en siste konsentrasjon av glyserol 1 wt %)36. Forsegle hetteglass ved parafilm og dekke med metallfolie for å beskytte mot lyset. Oppbevares i kjøleskap på 4 ° C over natten.
    Merk: PBS buffer løsning består av 0.151 g Trizma base, 1.592 g K3PO4, 1.021 g KH2PO4, 0.062 g av MgSO4 ·7H2O og 0.0465 g av EDTA i 250 mL av renset vann. Lagre løsningen på 4 ° C, og varm til romtemperatur før bruk. Tilsvarende beløp for 10 mM HEPES buffer kan brukes i stedet for PBS løsning. HEPES buffer løsning er utarbeidet av fortynne en 1 M HEPES lager løsning med renset vann.
  4. Dagen sonicate hetteglass som inneholder løsningen for 1 min bruker et ultrasonication bad ved romtemperatur. Fjerne parafilm og Pipetter til en visuelt enhetlig løsning av små lipid blemmer er dannet (figur 2B). Aliquot 30 µL av fått liten lipid vesicle løsningen i individuelle 0,5 mL plast rør. Hold disse lager dele på-18 ° C for et maksimum av 6 måneder.
    Merk: Hvis små lipid vesicle løsningen ikke visuelt uniform, vortex løsningen 4 ganger for 1-2 s med en vortex mikser med maksimal hastighet.

2. forberedelse av GUV-MLV komplekser

  1. Tine til romtemperatur et plastrør som inneholder en aliquot av frosne suspensjon av små lipid blemmer. Vortex tube 4 ganger for 1-2 s med en vortex mikser med maksimal hastighet.
  2. Sted 5 µL av små lipid vesicle suspensjon på overflaten av et glass cover slip (24 x 60 mm) til å danne en liten runde slippverktøy. Bruk en glass cover slip uten pre rengjøring trinn.
  3. Plasser glass cover slip i et vakuum desiccator (< 100 kPa vakuum) for 20 min.
  4. Lagre tørket lipid filmen ved romtemperatur for 4 min, og deretter sakte Pipetter 50 µL av 10 mM HEPES buffer på tørr lipid filmen for utvanning. Vent 5 min pre danner GUV-MLV komplekser (figur 2C).
  5. Midtstille et glass cover slip på mikroskopet scenen, og Pipetter 300 µL av HEPES buffer på den og plasser midten av slippverktøyet over målsettingen (figur 3B).
  6. Overfør den 50 µL av pre-formet GUV-MLV løsningen til HEPES løsningen (300 µL). Vente 25 min å la tynt dannet GUV-MLV komplekser fast følge overflaten av glass cover slip (figur 2D).
    Merk: Noen ganger GUV-MLV komplekser form ikke på glass cover slip og i stedet lipid flekker eller bare MLVs er observert. Dette kan forklares ved utilsiktet risting av utvalget i trinnene 2,4 eller 2.6 eller mange fryse-Tin sykluser av små vesicle suspensjon. Gjenta trinn 2.1-2.6 eller bruke nylagde lipid lagerløsning (trinn 1.1) for å få GUV-MLV komplekser.

3. brønnene forberedelse og Microinjection

  1. Rundt kantene av Borosilikatglass kapillærene ved forsiktig å plassere av kapillær ender i flammen å hindre brønnene blir brutt mens feste det til innehaveren av brønnene.
  2. Dra minst 3 glass kapillærene bruker en automatisk laser avtrekker med programmet sett: varme = 400, Fil = 4, Vel = 50, Del = 225, Pul =; Varme = 400, Fil = 4, Vel = 60, Del = 150, Pul = 120. Hvilke program må angis med den første verdien av Pul tomt. Bruke Borosilikatglass kapillærene av indre diameter (ID) 1.00 mm og ytre diameter (OD) 0.78 mm resultater i brønnene med en tips åpning på ca 0,3 µm i diameter.
  3. Tilbake-Fyll hver brønnene med 8 µL av 5 mM CaCl2 løsning HEPES buffer (10 mM) bruker en microloader. Filtrere CaCl2 løsningen bruker en 0,2 til 0.5 µm sprøyte filteret før bruk å unngå tilstopping pipette tips.
    Merk: Kontroller at CaCl2 er fullstendig oppløst i HEPES buffer løsning, som også brukes for trinn 2.4-2.6.
  4. Koble en brønnene holder til en micromanipulator. Montere brønnene i brønnene abonnenten tett. Koble innsprøytingspumpe og kapillær holderen bruker levering røret.
  5. Starte injeksjon pumpen. Justere innstillingene i innsprøytingspumpe til 20 hPa (injeksjon press) og en 5 hPa kompensasjon press på automatisk modus. Stoppe injeksjon pumpen til brønnene er klar for microinjection.
  6. Satt mikroskop brightfield modus. Konfigurere den differensial forstyrrelser kontrast (DIC). Bruk 63 X eller 100 X høy NA (1.3) mål for å oppnå optimal membran kanten oppløsningen.
  7. Bruk den grove micromanipulator for å plassere brønnene ovenfor dropleten inneholder GUV-MLV komplekser. Finn spissen av brønnene over målsettingen.
  8. Fokusere mikroskopet på midtpunktet av GUV-MLV komplekset og deretter refokusere ca 50 µm over GUV. Brukes av grov i micromanipulator til forsiktig bringe brønnene i fokus.
  9. Bytte av micromanipulator til den fine modusen. Sakte refokusere til GUV overflaten mens oversette brønnene spissen ned og holde spissen i fokus. Plasser brønnene tips ca 20 µm fra GUV overflaten. Hvis brønnene spissen er brutt på grunn av tilfeldig kontakt med glass cover slip (eksemplet i figur 5B), Erstatt den umiddelbart for å unngå unødvendige kalsium ion utgivelse eksempel bulk løsning.

4. dannelse og oversettelse av MTPs bruke kalsium Ion kilden

  1. Satt mikroskop til fluorescens modus. Angi dichroics å opphisse på 488 nm og oppdage utslipp på 505-550 nm.
  2. Slå på injeksjon pumpen og starte kalsium ion injeksjon. Bruk av de fine micromanipulator, og sakte nærmer GUV brønnene spissen. Plasser brønnene spissen i en avstand på 3 µm fra membranen overflaten mens injisering CaCl2 løsningen fra brønnene skal kunne MTPs form (Figur 4).
  3. For å oversette MTPs langs GUV overflaten, sakte flytte pipette spissen (med en hastighet av 0.1-0.3 µm/s) rundt GUV overflaten med den fine micromanipulator (figur 6). Opprettholde omtrent samme avstand (3 µm) mellom GUV overflaten og brønnene spissen mens du fortsetter kalsium ion injeksjon.
    Merk: På høy oversettelse priser brønnene tips (over 0,7 µm/s), MTPs vil ikke migrere synkronisert med brønnene. I stedet vil de spre og forkorte, mens nye MTPs blir dannet på den nye plasseringen av brønnene tuppen (figur 7).
  4. Slutte microinjection, slås av ved injeksjon og flytte brønnene fra GUV overflaten.

Representative Results

I dette arbeidet viser vi skape GUV-MLV komplekser og hvordan de kan brukes til å belyse effekten av kalsium ion graderinger på cellemembranen dynamics. Overflate-vedlagt GUV-MLV komplekser kreves for disse eksperimentene å tillate en bestemt celle størrelse etterligne ved opprettelse av en ion gradering gjennom microinjection. GUV membranen svarer på lokaliserte kalsium konsentrasjon gjennom dannelsen av MTPs rettet fra kalsium ion kilden. Videre kan til MTPs oversettes rundt GUV på en kontaktløse måte ved å flytte brønnene spissen rundt membran overflaten.

En skjematisk illustrasjon av GUV-MLV forberedelse prosedyren er vist i figur 2. Selv om i presentert protokollen, GUV-MLV komplekser er allerede før dannet under trinn 2.4 (figur 2C), lar overføre vesicle løsningen til en annen 300 µL dråpe buffer (trinn 2.6 protokollen) tynt dannet GUV-MLV komplekser til tilstrekkelig overholde glass underlaget. På denne måten, opprettes et egnet kompleks for micromanipulation og microinjection (figur 2D). Noen ganger, inneholder GUVs én eller flere fanget lipid blemmer, som ikke påvirker MTP-formasjonen, som vist i figur 4A. Disse GUVs produserer MTPs; avbilding kan imidlertid bli hindret hvis fanget blemmer er store. Fleste av de forberedt GUVs (opptil 75%) vises hemisfæriske og er knyttet til MLVs, som vist i figur 1A. Disse vesikler er hovedfokus for denne protokollen og er egnet for microinjection prosedyren. Omtrent 25% av de gjenværende GUVs vises bølgende (figur 1B), som er veiledende et lavere membran spenning regime. Disse bølgende vesikler også tillate for dannelsen av de rørformede utstikkende deler; men viser de ulike kinetics og en annen morfologi av de dannet MTPs, som er utenfor omfanget av denne protokollen25. Typisk diameteren av forberedt blemmer varierer mellom 2 til 15 µm for MLVs, og mellom 2 til 40 µm for GUVs. Optimal GUV størrelse for eksponering kalsiumioner er 5 µm eller større.

Mikropipetter har blitt brukt i svi celle avhør ordninger samt som prosedyrer krever manipulasjon av syntetisk GUVs for flere tiår37,38. Fleste av disse programmene involvert direkte fysisk kontakt mellom brønnene og overflaten av celler eller blemmer. Eksempler patch-klemme teknikken eller trekke membran festeseler fra GUV membranen, i tillegg til bygge nanotube-vesicle nettverk23,28,39. Nylig har Mikropipetter også blitt brukt til å generere lokaliserte graderinger av ioner og molekyler rundt GUVs å rekonstruere heterogene celle microenvironments24,25. I presentert protokollen er fungerende brønnene (figur 5A) en avgjørende faktor for å etablere en kalsium ion gradient på GUV overflaten av frigir løsningen i. Riktig plassering av brønnene på GUV overflaten og unngå kontakt med lipid membran er avgjørende for vellykket microinjection. Brønnene spissen er holdt i en avstand på ca 3 µm fra GUV overflaten, som er en riktig avstand å generere MTPs mens mimicking varianter av kalsium i cellemembranen. Hvis brønnene spissen er uhell brutt (figur 5B), kreves en erstatning. Den tidligere testet konsentrasjon utvalg av CaCl2 i brønnene, som tillater MTP dannelse, er mellom 2 og 5 mM25, som tilsvarer ekstracellulære kalsium konsentrasjoner. Lavere CaCl2 konsentrasjoner, dvs, 1 mM, er ingen MTPs observert.

Dannelsen av MTPs på kalsium microinjection begynner med dannelse av små membran invaginations, som vokser i MTPs på stedet av eksponering (figur 4B). MTPs fortsetter å vokse så lenge GUV membran restene utsatt for kalsiumioner. De svinger og peker fra Kalsiumionekilder (figur 4C, utfyllende film 1). Når kalsium ion tilbudet er avsluttet, MTPs scatter over GUV overflaten, noe som gjør det vanskelig å konkludere med om MTPs forblir eller til slutt forsvinne.

Dannelsen av MTPs kan forklares med lokaliserte kalsium ion binding til utsatte ytre heftet av GUV membranen og utløser spontan kurvatur (m), som er direkte forbundet med dannelsen av spontane spenning σ = 2κm2 (Κ er bøyd stivhet), som induserer bøying av membranen og danner indre MTPs. Tidligere rapporter har vist at deformasjon av membranen kan forklart av kondens og/eller klynger av de negativt ladde lipider ved binding av kalsiumioner til membranen, som resulterer i negativ spontan kurvatur40. Alternativt, sterk binding av Ca2 + på overflaten av den negativt ladde bilayer nøytraliserer overflaten kostnad tettheten av eksponert lipid bilayer brosjyre. Dette fører til kostnad tetthet forskjellen over bilayer, som resulterer i annen spontan kurvatur, tilstrekkelig til å bøye membran25.

Observerte dannelsen av MTPs demonstrerer en følsomhet av lipid membraner til kalsiumioner og tilbyr en ny kontaktløse tilnærming for å produsere membran stålrør strukturer. Klargjørende opprinnelsen av denne membranen tubulation kan være viktig for å forstå dynamikken i membranen figur overgang under ulike celle funksjoner og celle omforme og kan være nyttig for å få innsikt i lipid organisasjon i celle membraner.

De observerte MTPs genereres alltid på området på membranen gjennomgår kalsium ion eksponering. Dermed, ved å velge plasseringen av brønnene spissen, er det mulig å definere området GUV overflaten for protrusion vekst. Neste, hvis brønnene er sakte (0.1-0.3 µm/s) flyttet rundt GUV overflaten, mens avstanden fra membranen, MTPs oversettes i tandem med brønnene. Figur 6 og tilsvarende utfyllende Movie 2 viser slike migrering av MTPs rundt GUV overflaten. Denne prosessen er sannsynlig å være sammen med dannelsen av nye MTPs på kontinuerlig kalsium ion injeksjon25. Til høy oversettelse priser (over 0,7 µm/s) er MTPs ikke følge brønnene spissen. Nye utstikkende deler dannes i stedet på den nye plasseringen av brønnene tuppen (figur 7).

Observerte kontaktløse kalsium ion-guidede oversettelsen av MTPs rundt GUV overflaten kan ytterligere vår forståelse av kjøring styrker bak dynamikken i membran stålrør strukturer i cellene. Videre tilbyr denne tilnærmingen en roman kontaktløse modus for å kontrollere transport av materiale i myk saken systemer ved hjelp av kjemiske graderinger.

Figure 1
Figur 1 : Representant fluorescerende mikroskopi bilder av GUV-MLV komplekser immobilisert på overflaten av et glass cover slip. (A). eksempel på en sfærisk GUV. GUV vises i form av en halvkule knyttet til MLV. (B). eksempel på en bølgende GUV. De svarte pilene angir deformert områdene av membranen. Bildene er forbedret og invertert for å bedre visualisering av fluorescently merket GUV membraner. Baren skala representerer 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Skjematisk illustrasjoner av GUV-MLV forberedelse og microinjection ordninger. (A). en tørr lipid lag dannes nederst i hetteglass av den roterende fordamping av kloroform fra lipid løsning. (B). utvannet lipid laget er sonicated og små lipid blemmer dannes. (C). en liten dråpe vesicle løsningen (5 µL) er plassert på overflaten av et glass cover slip og overført til en desiccator for 20 min å tørke lipid løsningen og danner en tørr lipid film (dette trinnet ikke vises). Rehydrating tørr lipid filmen med 50 µL av buffer løsning produserer pre-formet GUV-MLV komplekser. (D). overføring av pre-formet komplekser til et større volum av buffer resulterer i dannelsen av tynt atskilt GUV-MLVs festet til overflaten av glass cover slip. (E). plassering av brønnene nær overflaten av GUV og slippe kalsiumioner utløser dannelsen av MTPs. Illustrasjonene er ikke tegnet til skala. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Eksperimentelle oppsett for microinjection av kalsiumioner. (A). komponentene av eksperimentelle oppsett kreves for å generere MTPs i GUVs. (B). detaljer for microinjection. Glass dekkglassvæske med løsning av GUV-MLV komplekser plassert på mikroskopet scenen. Vinkelen mellom brønnene og overflaten av glass cover slip er 30° (merket i hvitt). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Dannelsen av MTPs ved microinjection av kalsiumioner på overflaten av GUV. (A). The GUV-MLV komplekse før eksponering for kalsium ion gradering. Pilen viser en lipid vesicle fanget inne GUV, og som ikke hindrer observasjon MTPs. (B). Små MTPs er dannet ved microinjection av kalsiumioner (5 mM konsentrasjon av CaCl2 i brønnene). (C). vekst av MTPs ved kontinuerlig eksponering til kalsiumioner. Fluorescens bildene er forbedret og invertert for visualisering formål. Baren skala representerer 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Glass Mikropipetter brukes for kalsium ion microinjection. (A). et eksempel på en fungerende brønnene. (B). et eksempel av brønnene som en brukket tips (den skadede delen angis med en svart pil). Både bilder er forbedret og invertert for bedre visualisering. Baren skala representerer 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Kalsium ion-guidede oversettelse av MTPs rundt på overflaten av GUV. (A). The MTPs er dannet på GUV overflaten på microinjection 5 mm CaCl2 løsning. (ABC). Oversettelse av brønnene spissen (0,2-0,3 μm/s) rundt membranen overflaten utløser bevegelsen av MTPs i retning av kalsium ion kilden. Svarte pilene markere brønnene bevegelsesretning. Bildene er forbedret og invertert for å forbedre membran visualisering. Baren skala representerer 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 : MTPs med høy oversettelse rate av brønnene tuppen. (A). The MTPs er dannet på GUV overflaten på microinjection av 5 mM CaCl2 løsning (hvit linje). (ABC). En høy oversettelse rate av brønnene rundt GUV overflaten (1 μm/s) resulterer i dannelsen av nye MTPs på den nye plasseringen av brønnene tuppen (magenta linje), og spredning av de tidligere dannet MTPs (hvit linje). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Movie 1
Sekvenser komplementære filmen 1: Dannelsen av MTPs i GUV ved lokaliserte eksponering til Ca 2 + gradert. Klikk her for å laste ned filmen. 

Movie 2
Sekvenser komplementære filmen 2: Kalsium ion-guidede MTP migrasjon rundt GUV overflaten.   Klikk her for å laste ned filmen. 

Discussion

BioMimetic celle systemer tillater for studier av membran oppførsel etter eksponering for eksterne stimuli som ioner, proteiner eller nanopartikler. GUVs, blir slik modell, kan svare på endringer i kjemiske miljøet ved å justere formen, som ofte innebærer dannelsen av rørformede strukturer og invaginations24,41,42,43 .

Denne artikkelen inneholder en tilnærming for å generere MTPs på en kontaktløse måte via ombygging av GUV overflaten på lokaliserte injeksjon av kalsiumioner på GUV overflaten. Protokollen beskriver utarbeidelse av GUV-MLV komplekset, som etterligner en celle plasma membran, samt hvordan for å ansette en microinjection teknikk for å generere kalsium ion graderinger nær GUV overflaten skjemaet MTPs. Flertallet av tidligere eksperimentelle studier som adressert kalsium ion-membran interaksjoner utsatt lipid blemmer til bulk kalsium ion konsentrasjon14,17. Avhengig av eksperimentelle forhold, kan slik bulk eksponering resultere i forskjellige membran svar med ingen rørformede utstikkende deler dannet25.

Dannelsen av GUV-MLV komplekser er ganske grei og krever bare standard laboratorieutstyr og som roterende fordamperen, ultralydbad og vakuum desiccator. Likevel er det flere viktige tiltak for å vurdere under vesicle utarbeidelsen. Det er viktig å sikre at dehydrering av blemmer er fullført (under trinn 2.3 protokollen) og en tørr sirkulær lipid film som inneholder bare en liten mengde salt krystaller dannes på overflaten av glass cover slip. Under eksperimentet, forsiktig håndtering av vesicle løsningen, bruke fersk lipid lagerløsning kloroform samt fersk HEPES buffer, er avgjørende for vellykket utarbeidelse av GUV-MLV komplekser. Videre er sikkert feste GUV-MLV komplekset til glass cover slip overflaten avgjørende for micromanipulation og microinjection. For å bekrefte tilstrekkelig vedheft av GUV-MLV komplekse, brønnene (uten injeksjon flow) kan brukes Skyv mot GUV overflaten. En fast adhered vesicle vil ikke Skyv langs overflaten på direkte fysisk kontakt. Fordi eksperimenter utføres i en åpen buffer dråpe, som kan bli avhørt i flere timer, må fordampning tas i betraktning. Fordampning fra bufferen slippverktøyet endres de osmotisk forholdene som kan påvirke og destabilisere blemmer. For å gjenopprette osmotisk forhold, returnerer periodisk tillegg rent vann å prøve å gjenopprette opprinnelige volumet systemet å homeostase.

Når du endrer lipid membran sammensetningen, er det avgjørende at blemmer produseres i form av et GUV-MLV kompleks fordi MLV tillater overføring lipid materialet til GUV under membranen gjenreisningen. Tidligere studier har vist at erstatte komponentene av SPE blandingen med ren lipider eller legge til 5-30% av kolesterol, også tillater GUV-MLV komplekse formasjon28,44. Fleste av de forberedt GUVs er unilamellar45.

Videre når testing andre divalent kasjoner, som magnesium ioner, avhengig dannelsen av MTPs tungt av tilstedeværelsen av negativt ladde DOPS i lipid blandingen. Uten DOPS form MTPs ikke i blemmer beskrevet i denne protokollen. Også resultere monovalent kasjoner, som kalium og natrium, ikke i dannelsen av MTPs, selv i DOPS inneholder blemmer25.

I tillegg til kritiske trinnene forberedelse og manipulering av GUVs er det flere viktige faktorer å vurdere under microinjection prosedyren. Den vellykkede microinjection av kalsiumioner er sterkt avhengig av godt fungerende glass Mikropipetter, som tilberedes på dagen for eksperimentet. Det er flere faktorer som kan forårsake brønnene funksjonsfeil. En felles grunn er en tett tips åpning. Liten lipid partikler, som er biprodukter av vesicle utarbeidelse, spres i løsningen og overholder brønnene spissen, og dermed generere en tilstopping. Rengjøring pipette spissen er best gjøres ved å løfte den fra vesicle løsningen og plassere den tilbake nær GUV overflaten. Bruken av funksjonen blåse ut av microinjection pumpen må unngås fordi det resulterer i enorme injeksjon av kalsiumioner i bulk løsning. Videre, bobler lite luft fanget inne i brønnene hindre riktig microinjection, der tilfelle av brønnene skal erstattes med en ny. Tips brudd kan reduseres betydelig ved å plassere eksperimentelle oppsettet på en vibrasjon harddiskspor tabell å minimere tips svingninger.

Videre må omsorg tas når du velger en observasjon ordningen, minimere photobleaching mens å skaffe de beste tid-løst bildene. Wide-field laser-indusert fluorescens mikroskopi ble benyttet i denne protokollen fordi det gir en relativt høy oppkjøpet hastighet på en objektiv begrenset sonde dybde. Videre gir bruk av invertert mikroskopi samtidig microinjection og observasjon av lipid blemmer og MTPs.

En av de viktigste begrensningene av metoden presentert er behovet av omfattende manuelt arbeid og tilstrekkelig micromanipulation ferdigheter. Fordi komplekser dannes gjennom en spontan hevelse, ikke kan størrelsen på GUVs og MLVs kontrolleres. I tillegg tillater ikke denne protokollen for kontroll av membran spenningen i forberedt GUV-MLV komplekser, som kan være nødvendig å samle ytterligere informasjon med hensyn til membran remodeling. GUVs er koblet til MLVs med sistnevnte leverer lipid materialet for betydelig vekst i MTPs i et omfang som ville være umulig å oppnå utelukkende bruker membranen tilgjengelig fra GUVs. MLVs også bidra til å senke alle lateral overflatespenning varianter i den GUV-MLV komplekse44, som vil komplisere forsøkene på å kontrollere spenningen av vesicle ved hjelp av brønnene aspirasjon. Denne GUV-MLV-baserte modellen gir en lavere spenning som etterligner bedre spenning regimer i mobilnettet membran strukturer koblet til membran reservoarer som membran folder og invaginations46. Samtidig, kan brønnene aspirasjon teknikken kunne brukes for å kontrollere membran spenning i én GUVs. For eksempel gitt arbeidet Graber et al. detaljer av membran rørformede invaginations i ett GUVs ved binding av kalsiumioner til membranen på bulk forhold variert spenning regimer40. Til slutt, sammenligning av membran virkemåten på både lokale og bulk eksponering for kalsium krever forbedret kontroll av membran vedheft til overflaten, som er utenfor omfanget av denne protokollen.

For å oppsummere, muliggjør foreslåtte teknikken kontaktløse membran remodeling og dannelsen av MTPs på lokaliserte stimulering med kalsiumioner. Fremtidige anvendelser av denne metoden center på oversettelsen fra syntetiske vesicle systemer til innfødte biologiske membraner, for eksempel celle blebs. Den foreslåtte metoden kan innlemmet med andre encellede avhør ordninger, som patch-klemme eller microelectrode amperometry, eller kombinert med lokalisert varme strategier31,47,48. Teste effekten av andre ioner og molekyler er grei og innebærer å erstatte de kalsium ionene med molekyler av interesse. Videre kan komplekse syntetiske lipid blemmer produseres gjennom membranen functionalization med transmembrane proteiner, som kan utvide vår forståelse av biofysikk av cellen omforme og cellemembranen dynamikken knyttet sensing av lokale kjemisk graderinger. Sist men ikke minst, kontaktløse stimulering av lipid membran kan også oversettes til polymere myk saken systemer, tilbyr et grunnlag for en roman kontaktløse manipulasjon plattform.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Soy bean polar lipid extract Avanti
Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)		 541602C 100 mg
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS Avanti
Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)		 840035C 1x25 mg
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO-TEC (Germany) AD 488-31 1 mg
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.) Sigma Aldrich (Missouri, USA) 20735 SIGMA-ALDRICH
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10x75 mm, Borosilicate glass 250/pack Corning Incorporated (Corning, NY 14831) 99445-10
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer Sigma Aldrich (Missouri, USA) 650498-1L-D
Rotary evaporator Büchi Rotavapor R-144 Switzerland
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm KEBO lab (Sweden) MA00360500
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO Sharlau Chemie S.A. (Spain) P9333-500G
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0% Sigma Aldrich (Missouri, USA) S7653-1KG
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5% Sigma Aldrich (Missouri, USA) G5516-1L
Glycerol, for molecular biology, minimum 99% Sigma Aldrich (Missouri, USA) T-1503 2050 g
Trizma base Sigma Aldrich (Missouri, USA) P5629-500G
Potassium phosphate tribasic (K3PO4) Sigma Aldrich (Missouri, USA) P5655
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma Aldrich (Missouri, USA) 5886
MgSO4 Merck (USA) 34549-100 g
EDTA Sigma Aldrich (Missouri, USA) H0887 Sigma 
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture Sigma Aldrich (Missouri, USA) Z260282-1PAK 24x60 mm
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm Sigma Aldrich (Missouri, USA) 631-1339 
Menzel Gläzer #1, glass cover slip VWR (USA)
Diaphragm vacuum pump for the desiccator Vacuubrand (Germany)
Ultrasonicate bath Bandelin Sonolex (Germany)
VX-100 Lab vortexer vortex mixer Labnet International (USA)
488 nm laser line  Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden)
Leica Microsystems immersion oil for microscopes Leica (Germany) 12847995 
Inverted fluorescence microscopy system  Leica DM IRB (Wetzlar, Germany)
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision) Technologies GmbH (Thuringia, Germany) 300038
PatchStar Micromanipulator Scientifica (Uckfield, UK) 612-7933
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10,  1.00mm O.D. X 0.78mm I.D.  Harvard Apparatus U.K
Eppendorf microloader (pipette tips) VWR (USA)
P-2000 CO2 laser-puller  Sutter Instruments (Novato, USA)
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet Eppendorf (Germany)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Monteith, G. R., McAndrew, D., Faddy, H. M., Roberts-Thomson, S. J. Calcium and cancer: Targeting Ca2+ transport. Nature Reviews Cancer. 7 (7), 519-530 (2007).
  2. Meldolesi, J., Pozzan, T. The endoplasmic reticulum Ca2+ store: A view from the lumen. Trends in Biochemical Science. 23 (1), 10-14 (1998).
  3. Bygrave, F. L., Benedetti, A. What is the concentration of calcium ions in the endoplasmic reticulum? Cell Calcium. 19 (6), 547-551 (1996).
  4. Mogami, H., Tepikin, A. V., Petersen, O. H. Termination of cytosolic Ca2+ signals: Ca2+ reuptake into intracellular stores is regulated by the free Ca2+ concentration in the store lumen. The EMBO Journal. 17 (2), 435-442 (1998).
  5. SantoDomingo, J., et al. Calcium dynamics in bovine adrenal medulla chromaffin cell secretory granules. European Journal of Neuroscience. 28 (7), 1265-1274 (2008).
  6. Moreno, A., et al. Calcium dynamics in catecholamine-containing secretory vesicles. Cell Calcium. 37 (6), 555-564 (2005).
  7. Bulenda, D., Gratzl, M. Matrix free Ca2+ in isolated chromaffin vesicles. Biochemistry. 24 (26), 7760-7765 (1985).
  8. Montero, M., et al. Chromaffin-cell stimulation triggers fast millimolar mitochondrial Ca2+ transients that modulate secretion. Nature Cell Biology. 2 (2), 57-61 (2000).
  9. Villalobos, C., et al. Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells. The FASEB Journal. 16 (3), 343-353 (2002).
  10. Brown, E. M., Hofer, A. M. Extracellular calcium sensing and signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 530-538 (2003).
  11. Tarafdar, P. K., Chakraborty, H., Dennison, S. M., Lentz, B. R. Phosphatidylserine inhibits and calcium promotes model membrane fusion. Biophysical Journal. 103 (9), 1880-1889 (2012).
  12. Boettcher, J. M., et al. Atomic view of calcium-induced clustering of phosphatidylserine in mixed lipid bilayers. Biochemistry. 50, 2264-2273 (2011).
  13. Binder, H., Zschörnig, O. The effect of metal cations on the phase behavior and hydration characteristics of phospholipid membranes. Chemistry and Physics of Lipids. 115, 39-61 (2002).
  14. Sinn, C. G., Antonietti, M., Dimova, R. Binding of calcium to phosphatidylcholine-phosphatidylserine membranes. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 282-283, 410-419 (2006).
  15. Pedersen, U. R., Leidy, C., Westh, P., Peters, G. N. H. The effect of calcium on the properties of charged phospholipid bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. , 573-582 (2006).
  16. Melcrova, A., et al. The complex nature of calcium cation interactions with phospholipid bilayers. Scientific Reports. 6, 38035 (2016).
  17. Roux, M., Bloom, M. Ca2+, Mg2+, Li+, Na+, and K+ distributions in the headgroup region of binary membranes of phosphatidylcholine and phosphatidylserine as seen by deuterium NMR. Biochemistry. 29 (30), 7077-7089 (1990).
  18. Waldbillig, R. C., Robertson, J. D., McIntosh, T. J. Images of divalent cations in unstained symmetric and asymmetric lipid bilayers. Biochimica et Biophysica Act. 448 (1), 1-14 (1976).
  19. Kay, J. G., Koivusalo, M., Ma, X., Wohland, T., Grinstein, S. Phosphatidylserine dynamics in cellular membranes. Molecular Biology of the Cell. 23, 2198-2212 (2012).
  20. Vernier, P. T., et al. Nanopore formation and phosphatidylserine externalization in a phospholipid bilayer at high transmembrane potential. Journal of the American Chemical Society. 128, 6288-6289 (2006).
  21. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid Preparation of Giant Unilamellar Vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  22. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  23. Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies. Journal of Visualized Experiments. (95), e52281 (2015).
  24. Khalifat, N., Puff, N., Bonneau, S., Fournier, J. B., Angelova, M. I. Membrane deformation under local pH gradient: mimicking mitochondrial cristae dynamics. Biophysical Journal. 95, 4924-4933 (2008).
  25. Ali Doosti, B., et al. Membrane Tubulation in Lipid Vesicles Triggered by the Local Application of Calcium Ions. Langmuir. 33 (41), 11010-11017 (2017).
  26. Barber, M. A. A Technic for the Inoculation of Bacteria and Other Substances into Living Cells. The Journal of Infectious Diseases. 8 (3), 348-360 (1911).
  27. Taylor, C. V. An accurately controllable micropipette. Science. 1329, 617-618 (1920).
  28. Jesorka, A., et al. Generation of phospholipid vesicle-nanotube networks and transport of molecules therein. Nature Protocols. 6 (6), 791-805 (2011).
  29. Lobovkina, T., et al. Mechanical tweezer action by self-tightening knots in surfactant nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 7949-7953 (2004).
  30. Karlsson, A., et al. Networks of nanotubes and containers. Nature. 409 (6817), 150 (2001).
  31. Wegrzyn, I., et al. Membrane protrusion coarsening and nanotubulation within giant unilamellar vesicles. Journal of the American Chemical Society. 133, 18046-18049 (2011).
  32. Mellander, L. J., et al. Two modes of exocytosis in an artificial cell. Scientific Reports. 4, (2014).
  33. Cans, A. S., et al. Artificial Cells: Unique Insights into Exocytosis Using Liposomes and Lipid Nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 400-404 (2003).
  34. Hampton, M. B., Vanags, D. M., Isabella Pörn-Ares, M., Orrenius, S. Involvement of extracellular calcium in phosphatidylserine exposure during apoptosis. FEBS Letters. 399 (3), 277-282 (1996).
  35. Criado, M., Keller, B. U. A membrane fusion strategy for single-channel recordings of membranes usually non-accessible to patch-clamp pipette electrodes. FEBS Letters. 224, 172-176 (1987).
  36. Duzgunes, N. Methods in Enzymology. Liposomes Part F. Elsevier Science. , (2009).
  37. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
  38. Orwar, O., et al. Patch-Clamp Detection of Neurotransmitters in Capillary Electrophoresis. Science. 272 (5269), 1779-1782 (1996).
  39. Pevost, C., Tsai, F. C., Bassereau, P., Simunovic, M. Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles. Journal of Visualized Experiments. (130), e56086 (2017).
  40. Graber, Z. T., Shi, Z., Baumgart, T. Cations induce shape remodeling of negatively charged phospholipid membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 19 (23), 15285-15295 (2017).
  41. Pezeshkian, W., et al. Mechanism of Shiga Toxin Clustering on Membranes. ACS Nano. 11 (1), 314-324 (2017).
  42. Angelova, M. I., Tsoneva, I. Interactions of DNA with giant liposomes. Chemistry and Physics of Lipids. 101 (1), 123-137 (1999).
  43. Liu, Y. G., Agudo-Canalejo, J., Grafmuller, A., Dimova, R., Lipowsky, R. Patterns of Flexible Nanotubes Formed by Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Membranes. ACS Nano. 10 (1), 463-474 (2016).
  44. Stepanyants, N., Jeffries, G. D. M., Orwar, O., Jesorka, A. Radial Sizing of Lipid Nanotubes Using Membrane Displacement Analysis. Nano Letters. 12 (3), 1372-1378 (2012).
  45. Billerit, C., et al. Heat-induced formation of single giant unilamellar vesicles. Soft Matter. (20), (2011).
  46. Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (35), 14467-14472 (2011).
  47. Garten, M., et al. Whole-GUV patch-clamping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (2), 328-333 (2017).
  48. Messina, P., et al. Monitoring and Quantifying the Passive Transport of Molecules Through Patch-Clamp Suspended Real and Model Cell Membranes. Angewandte Chemie International Edition. 126 (12), 3256 (2014).

Tags

Kjemi problemet 137 giganten blemmer lipid membran micromanipulation microinjection kalsiumioner kalsium gradering membran rørformede utstikkende deler spontane kurvatur membran remodeling
Membran ombygging av gigantiske blemmer svar på lokaliserte kalsium Ion graderinger
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ali Doosti, B., Cans, A. S.,… More

Ali Doosti, B., Cans, A. S., Jeffries, G. D. M., Lobovkina, T. Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients. J. Vis. Exp. (137), e57789, doi:10.3791/57789 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter