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Chemistry

स्थानीय कैल्शियम आयन ढाल के जवाब में विशाल बुलबुले की झिल्ली remodeling

Published: July 16, 2018 doi: 10.3791/57789
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry and Chemical Engineering, Chalmers University of Technology

Summary

हम बुलबुले के संपर्क में micromanipulation के लिए एक तकनीक वर्तमान स्थानीयकृत कैल्शियम आयन ढाल का उपयोग कर । एक कैल्शियम आयन समाधान के Microinjection, एक विशाल लिपिड पुटिका के आसपास में, लिपिड झिल्ली remodel करने के लिए उपयोग किया जाता है, झिल्ली ट्यूबलर घुसपैठ के उत्पादन में जिसके परिणामस्वरूप.

Abstract

ऐसी झिल्ली की तस्करी और apoptosis के रूप में मौलिक कोशिका प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता में, कोशिका झिल्ली आकार संक्रमण कैल्शियम आयन एकाग्रता में स्थानीय विविधताओं के साथ समवर्ती हो । इन प्रक्रियाओं में शामिल मुख्य आणविक घटकों की पहचान की गई है; हालांकि, कैल्शियम आयन ढाल और कोशिका झिल्ली के भीतर लिपिड के बीच विशिष्ट पुनरावृत्ति अब तक कम जाना जाता है, मुख्य रूप से जैविक कोशिकाओं की जटिल प्रकृति और अवलोकन योजनाओं की मुश्किल के कारण. इस अंतर को पाटने के लिए, एक सिंथेटिक दृष्टिकोण सफलतापूर्वक कोशिका झिल्ली की नकल पर कैल्शियम आयनों का स्थानीयकृत प्रभाव प्रकट करने के लिए लागू किया गया है । एक सेल के भीतर शर्तों के समान करने के लिए एक नकल की स्थापना एक severalfold समस्या है । सबसे पहले, उचित आयामों और झिल्ली संरचना के साथ एक पर्याप्त biomimetic मॉडल कोशिकाओं के भौतिक गुणों पर कब्जा करने के लिए आवश्यक है । दूसरा, एक micromanipulation सेटअप एक विशेष झिल्ली स्थान पर कैल्शियम आयनों की एक छोटी राशि देने के लिए की जरूरत है । अंत में, एक अवलोकन योजना का पता लगाने और बाहरी उत्तेजना के लिए लिपिड झिल्ली की प्रतिक्रिया रिकॉर्ड करने के लिए आवश्यक है । यह लेख कैल्शियम आयन झिल्ली बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत biomimetic दृष्टिकोण प्रदान करता है, जहां एक लिपिड पुटिका प्रणाली, एक विशाल unilamellar पुटिका से मिलकर (गुव) एक multilamellar पुटिका (MLV) से जुड़े, एक स्थानीयकृत कैल्शियम के संपर्क में है एक microinjection प्रणाली का उपयोग ढाल का गठन किया । झिल्ली पर ईओण का प्रभाव की गतिशीलता प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मनाया और वीडियो फ्रेम दरों पर दर्ज किया गया । झिल्ली उत्तेजना का एक परिणाम के रूप में, गुव के अंदर उच्च घुमावदार झिल्ली ट्यूबलर दखलंदाजी (MTPs) का गठन, झिल्ली से दूर उंमुख । वर्णित दृष्टिकोण एक पूरी तरह से संपर्क और नियंत्रित तरीके से लिपिड झिल्ली और एमटीपी उत्पादन के remodeling लाती है । इस दृष्टिकोण का परिचय कैल्शियम आयन झिल्ली बातचीत के विवरण का पता करने के लिए, नए रास्ते प्रदान करने के लिए कोशिका झिल्ली के तंत्र का अध्ययन कर रही है ।

Introduction

जैविक प्रक्रियाओं के भीतर कैल्शियम आयनों की भूमिका, विशेष रूप से संकेतन में उनकी भागीदारी, कोशिका विभाजन, और झिल्ली संलयन, कई यंत्रवत अध्ययन का ध्यान है1. intracellular cytoplasmic कैल्शियम आयन एकाग्रता १०० एनएम के आदेश पर है, जबकि organelles में कैल्शियम, जैसे कि endoplasmic जालिका, स्रावी बुलबुले, और mitochondria, तक पहुंचने के स्तर को एकाग्रता में millimolars के दसियों । यह खड़ी कैल्शियम आयन एकाग्रता intracellular झिल्ली2,3,4,5,6,7,8 भर में परिमाण के ढाल आदेश बनाता है ,9. extracellular कैल्शियम आयन स्तर के आसपास है 2 मिमी और इसलिए, कैल्शियम आयन एकाग्रता के रूपांतरों दोनों extracellular और intracellular के स्तर पर होते हैं. इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से सबूत है कि intracellular कैल्शियम आयन घटनाओं और न्यूरॉन गतिविधि संकेतन extracellular कैल्शियम आयन सांद्रता के स्थानीय उतार चढ़ाव की शर्तों के तहत हो सकता है प्रदान करते हैं, सिंक्रनाइज़ के महत्व का संकेत इंट्रा और extracellular कैल्शियम आयन रूपांतरों10.

कैल्शियम आयनों और जैविक झिल्ली, जिसमें देशी कोशिका झिल्ली लिपिड bilayer बुलबुले के साथ प्रतिस्थापित कर रहे हैं सफलतापूर्वक लागू किया गया है एक सिंथेटिक दृष्टिकोण के बीच एक साथ खेलना समझने के लिए लक्ष्य । कैल्शियम आयन समाधान करने के लिए बुलबुले को उजागर लिपिड सिर समूहों और हाइड्रोकार्बन चेन पैकिंग में परिवर्तन करने के लिए सुराग, वृद्धि की झिल्ली तनाव, और पुटिका एकत्रीकरण, साथ ही लिपिड और झिल्ली चरण संक्रमण11,12 के पृथक्करण ,13,14,15,16। कैल्शियम आयनों के लिए जोखिम पर लिपिड झिल्ली के गुण एक्स के रूप में ऐसी प्रयोगात्मक तकनीक का उपयोग कर जांच की गई है-रे, 1ज-एनएमआर, और स्पेक्ट्रोस्कोपी या ऊष्मा अध्ययन11,16, 17 , 18. इन अध्ययनों में, झिल्ली संरचना अक्सर देशी कोशिका झिल्ली के समान है और phosphatidylcholine (पीसी), phosphatidylethanolamine (पीई), और phosphatidylserine (पी एस) के रूप में ऐसे शारीरिक लिपिड शामिल है देखते हैं । पुनश्च कृत्रिम पुटिका तैयारी में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि यह intracellular झिल्ली की तस्करी, exocytosis, और apoptosis19,20सहित कई सेलुलर प्रक्रियाओं में एक आवश्यक घटक है ।

संश्लेषित लिपिड बुलबुले के आकार अक्सर nanometers से कई micrometers के लिए पर्वतमाला । विभिंन पुटिका तैयारी के अलावा, विशाल unilamellar बुलबुले (GUVs), जो व्यास में micrometers के दसियों के लिए कई हैं, विशेष रूप से उनके अपेक्षाकृत बड़े आकार के कारण महत्व के हैं, बारीकी से व्यक्तिगत कोशिकाओं21 के आयामों जैसी , 22 , 23. GUVs की उपलब्ध सतह क्षेत्र का अध्ययन किया जा करने के लिए झिल्ली जैव भौतिक संपत्तियों पर स्थानीय रासायनिक ढाल के प्रभाव को सक्षम बनाता है । बाहरी उत्तेजनाओं के लिए झिल्ली की सतह का केवल एक भाग को उजागर करके, झिल्ली गतिशीलता और अधिक बारीकी से जांच की जा सकती है । उदाहरण के लिए, यह दिखाया गया है कि GUVs की सतह के लिए रासायनिक या पीएच ढाल के स्थानीयकृत आवेदन को ट्यूबलर दखलंदाजी के गठन की ओर ले जाता है, जो थोक जोखिम24,25पर नहीं मनाया गया । एकल पुटिका पूछताछ योजनाओं के आगे विधि विकास के लिए झिल्ली व्यवहार कॉल में मनाया मतभेद सेल झिल्ली remodeling के तंत्र में कुछ अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए ।

प्रारंभिक 1900s26,27, से microinjection और micromanipulation के तरीकों पर निर्माण-200023,28 से एकल पुटिका हेरफेर योजनाओं का अधिक हाल ही में प्रगति के संबंध में , इस लेख में एक दृष्टिकोण है जो झिल्ली remodeling और झिल्ली ट्यूबलर दखलंदाजी (MTPs) के गठन गुव झिल्ली में कैल्शियम आयनों के स्थानीय अनुप्रयोग के जवाब में उत्पन्न कर रहे हैं प्रस्तुत करता है ।

हमारे दृष्टिकोण एक पुटिका एक MLV झिल्ली मॉडल प्रणाली (आंकड़ा 1a) के रूप में एक multilamellar पुटिका (biomimetic) से जुड़े गुव से मिलकर जटिल का इस्तेमाल करता है । MLV परिसर के लिए एक लिपिड जलाशय के रूप में एक कैल्शियम आयन ढाल के लिए जोखिम के दौरान गुव को लिपिड सामग्री की आपूर्ति के लिए आवश्यक है । इस संबंध में जटिल के दौरान झिल्ली तनाव में वृद्धि के लिए क्षतिपूर्ति करने की अनुमति देता है और गुव झिल्ली के आकार में संक्रमण के लिए प्रेरित और एमटीपी वृद्धि के लिए लिपिड प्रदान करते हैं । इसके अलावा, MLV सतह स्थिरीकरण की सुविधा है क्योंकि इसके द्रव्यमान गुव की तुलना में बड़ा है । गुव-MLV परिसरों, जब एक ठोस सब्सट्रेट पर मैटीरियल, पहले नैनोट्यूब-पुटिका नेटवर्क के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया है, बहुलक-झिल्ली बातचीत का अध्ययन, और exocytosis29,30की देर चरणों नकल उतारा, 31,३२,३३.

पिछले प्रोटोकॉल का उपयोग सोयाबीन ध्रुवीय लिपिड निकालने (एसपीई) गुव-MLV परिसरों को तैयार करने के लिए28. एसपीई फॉस्फोलिपिड का एक मिश्रण है कि शामिल पीसी (४५.७%), पीई (२२.१%), phosphatidylinositol (PI, १८.४%), phosphatidic एसिड (फिलीस्तीनी अथॉरिटी, ६.९%), और अंय लिपिड का मिश्रण (६.९%) । हमारे प्रोटोकॉल में, एसपीई मिश्रण 1, 2 के 20% के साथ मैगनीज-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-एल serine (सोडियम नमक) (DOPS) के लिए सेल प्लाज्मा झिल्ली की भीतरी पत्रक नकल है । एक अतिरिक्त 1% एटो 488-1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-डोप) के लिपिड bilayer दाग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर झिल्ली की निगरानी सक्षम करने के लिए प्रयोग किया जाता है । GUVs bilayer भर सममित लिपिड संरचना है और स्थानीय रूप से 5 कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2) के मिमी सांद्रता को उजागर कर रहे हैं । इस तरह के प्रयोगात्मक शर्तों, एक ऊंचा कैल्शियम आयन एकाग्रता के साथ, भी अपोप्तोटिक कोशिकाओं की बाहरी झिल्ली पत्रक की नकल, जहां पुनश्च अणुओं३४व्यक्त कर रहे हैं । गुव-MLV परिसरों के गठन एक संशोधित निर्जलीकरण-निर्जलीकरण विधि शुरू में Criado और केलर३५द्वारा विकसित के उपयोग की आवश्यकता है । पुटिका तैयारी प्रोटोकॉल एक सूखी लिपिड परत है, जो तो समाधान में छोटे बुलबुले के रूप में इस्तेमाल किया जाता है के गठन भी शामिल है । यह समाधान तो निर्जलित और अंतिम गुव-MLV परिसरों के रूप में हाइड्रेटेड है । चित्र 2a -D एक ठेठ गुव-MLV परिसर की तैयारी के लिए मुख्य कदम दिखाता है ।

पुटिका तैयारी पूरा हो गया है और पुटिका परिसर कांच सब्सट्रेट पर मैटीरियल है के बाद, microinjection तकनीक एक खुली टिप ग्लास micropipette के माध्यम से गुव के बाहरी पत्रक के लिए कैल्शियम आयनों की छोटी मात्रा में वितरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । कैल्शियम टिप से बाहर समाधान के प्रवाह गुव झिल्ली की सतह पर एक स्थानीयकृत कैल्शियम आयन ढाल उत्पन्न करता है, झिल्ली remodeling और MTPs की पीढ़ी के लिए अग्रणी. MTPs कैल्शियम आयन स्रोत से दूर उंमुख और गुव के अंदर हो जाना कर रहे हैं । इस एमटीपी गठन सीधे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर निगरानी की जा सकती है और एक डिजिटल कैमरे का उपयोग कर दर्ज की गई । चित्रा 3 प्रयोगात्मक झिल्ली reproducing के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया सेटअप से पता चलता है । MTPs के गठन (चित्रा 2E और चित्रा 4) इस प्रोटोकॉल में कैल्शियम आयन जोखिम थोक मात्रा की स्थिति में प्रदर्शन किया प्रयोगों के लिए एक विषम परिणाम दर्शाता है. थोक शर्तों के तहत, GUVs टूटना और फार्म झिल्ली पैच है कि कांच की सतह25का पालन करने के लिए मनाया जा सकता है ।

गुव-MLV परिसरों के गठन पर और अधिक जानकारी, साथ ही साथ कैल्शियम आयनों के microinjection करने के लिए प्रक्रिया, इस लेख में समझाया जाता है । प्रोटोकॉल मोटे तौर पर कैल्शियम आयन microinjection पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं; हालांकि, इस दृष्टिकोण आसानी से अंय आयनों या प्रोटीन के लिए स्थानीय जोखिम के कारण झिल्ली प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने में उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, बुलबुले की संरचना को अलग करने के लिए देखते किया जा सकता है की प्रक्रिया में लिपिड घटक भूमिकाओं remodeling । प्रस्तुत प्रोटोकॉल गुव-MLV परिसरों का उत्पादन करने के लिए किसी भी अत्याधुनिक उपकरणों की आवश्यकता नहीं है और reproducibility के एक उच्च डिग्री की विशेषता है ।

Protocol

1. छोटे लिपिड बुलबुले की तैयारी

  1. लिपिड एसपीई/DOPS/ATTO488-डोप का समाधान तैयार करें क्लोरोफॉर्म में बड़े पैमाने पर मिश्रण के अनुपात के साथ 79/1. क्लोरोफॉर्म में लिपिड के अंतिम एकाग्रता है 1 मिलीग्राम/एमएल, और अंतिम मास है ०.६ मिलीग्राम (आमतौर पर कम से 1 मिलीग्राम). उपयोग डिस्पोजेबल गोल नीचे कांच शीशियों (गोल नीचे ग्लास ट्यूबों, 10 x ७५ mm) जब एक पूर्व सफाई कदम के बिना लिपिड समाधान की तैयारी ।
    1. क्लोरोफॉर्म के साथ कांच सीरिंज (25 µ l) को भरें और कुल्ला करें कांच सिरिंज को भरने और कुल्ला करने के लिए, क्लोरोफॉर्म की 3-4 मिलीलीटर पर्याप्त है ।
      चेतावनी: जब हैंडलिंग क्लोरोफॉर्म, उपयोग कांच सीरिंज और एक धुएं हुड में सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन करते हुए हर समय उचित दस्ताने और सुरक्षात्मक eyewear पहने हुए । क्लोरोफॉर्म हैंडलिंग करते समय किसी भी प्लास्टिक की कुप्पी, सीरिंज, या पिपेट का उपयोग न करें ।
  2. कांच की शीशी के साथ लिपिड मिश्रण युक्त लपेटें को परिवेश प्रकाश से सामग्री की रक्षा और 3 ज के लिए एक रोटरी वाष्पन में विलायक लुप्त हो जाना क्लोरोफॉर्म हटाने के लिए, दबाव के साथ 7 केपीए वैक्यूम ८० rpm पर पहुंच रहा है । एक सूखी लिपिड फिल्म वाष्पीकरण (चित्रा 2a) के बाद कांच की शीशी के नीचे बनाई गई है ।
    नोट: कई बार स्केलिंग और लिपिड की बड़ी मात्रा का उपयोग कर क्लोरोफॉर्म की पूर्ण हटाने सुनिश्चित करने के लिए अब रोटरी वाष्पीकरण समय की आवश्यकता हो सकती है ।
  3. धीरे सूखे लिपिड फिल्म के शीर्ष पर फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) बफर समाधान (पीएच ७.८, बिना कमजोर पड़ने) के ६०० µ एल जोड़ें । बफर के अलावा, धीरे ग्लिसरॉल के 6 µ एल जोड़ने के लिए गुव के दौरान पूरी तरह से निर्जलीकरण से नमूने की रक्षा-MLV गठन कदम (1 ग्लिसरॉल के wt के एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने%)३६। parafilm का उपयोग कर कांच की शीशी सील और परिवेश प्रकाश से बचाने के लिए धातु पंनी के साथ कवर । रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में स्टोर ।
    नोट: पंजाबियों बफर समाधान Trizma आधार के ०.१५१ ग्राम के होते हैं, कश्मीर के3पीओ4, १.०२१ ग्राम के KH2पीओ4, MgSO4 · 7H2ओ के ०.०६२ ग्राम, और शुद्ध पानी के ०.०४६५ मिलीलीटर में EDTA के २५० ग्राम । 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान, और उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान को गर्म । 10 मिमी HEPES बफर के बराबर राशि का इस्तेमाल किया जा सकता है के बजाय पंजाब के समाधान । HEPES बफर समाधान कमजोर द्वारा तैयार किया जाता है एक 1 मीटर शुद्ध पानी के साथ HEPES स्टॉक समाधान ।
  4. अगले दिन, कांच की शीशी 1 मिनट के लिए समाधान युक्त sonicate कमरे के तापमान पर एक अल्ट्रासोनिक स्नान का उपयोग कर । parafilm और पिपेट निकालें छोटे लिपिड बुलबुले की एक नेत्रहीन वर्दी समाधान जब तक (चित्रा बी) का गठन किया है । Aliquot 30 µ एल प्राप्त छोटे लिपिड पुटिका समाधान में व्यक्तिगत ०.५ मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों । इन शेयर aliquots को अधिकतम 6 महीने के लिए-18 डिग्री सेल्सियस पर रखें ।
    नोट: छोटे लिपिड पुटिका समाधान नेत्रहीन वर्दी नहीं है, तो समाधान भंवर 4 बार 1-2 एस के लिए अधिकतम गति पर एक भंवर मिक्सर का उपयोग कर ।

2. गुव-MLV परिसरों की तैयारी

  1. गल कमरे के तापमान को एक प्लास्टिक ट्यूब छोटे लिपिड बुलबुले के जमे हुए निलंबन के एक aliquot युक्त । भंवर ट्यूब 1-2 एस के लिए 4 बार अधिकतम गति पर एक भंवर मिक्सर का उपयोग कर ।
  2. एक छोटे से गोल छोटी बूंद बनाने के लिए एक गिलास कवर स्लिप (24 x ६० मिमी) की सतह पर छोटे लिपिड पुटिका निलंबन के 5 µ एल प्लेस । किसी भी पूर्व सफाई कदम के बिना एक ग्लास कवर पर्ची का प्रयोग करें ।
  3. ग्लास कवर स्लिप को एक वैक्यूम desiccator (< 100 केपीए वैक्यूम) में 20 मिनट के लिए रखें ।
  4. 4 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सूख लिपिड फिल्म की दुकान, फिर धीरे पिपेट ५० निर्जलीकरण के लिए शुष्क लिपिड फिल्म के शीर्ष पर 10 मिमी HEPES बफर के µ एल । गुव-MLV परिसरों (चित्रा 2c) के पूर्व फार्म करने के लिए 5 मिनट रुको ।
  5. केंद्र खुर्दबीन स्टेज पर एक गिलास कवर पर्ची, तो पिपेट ३०० µ एल पर HEPES बफर की और इस उद्देश्य (चित्र बी) ऊपर छोटी बूंद के केंद्र की स्थिति ।
  6. HEPES समाधान (३०० µ l) में पूर्व-गठित गुव-MLV समाधान के ५० µ l का अंतरण । गुव-MLV परिसरों को मजबूती से कांच कवर स्लिप (चित्रा 2d) की सतह का पालन करने की अनुमति देने के लिए 25 मिनट रुको ।
    नोट: कभी-कभार, गुव-MLV परिसरों कांच कवर पर्ची पर फार्म नहीं है और इसके बजाय लिपिड पैच या केवल MLVs मनाया जाता है । यह २.४ या २.६, या कई फ्रीज-गल चक्र छोटे पुटिका निलंबन के दौरान नमूने के आकस्मिक झटकों से समझाया जा सकता है । दोहराएं चरण 2.1-2.6 या गुव-MLV परिसरों को प्राप्त करने के लिए हौसले से तैयार लिपिड स्टॉक समाधान (चरण १.१) का उपयोग करें ।

3. Micropipette वडा और Microinjection

  1. borosilicate कांच केशिकाओं के किनारों को धीरे से केशिका रखकर एक मोमबत्ती की लौ में समाप्त होता है micropipette को रोकने के लिए टूट रहा है जबकि micropipette धारक को संलग्न ।
  2. एक स्वत: लेजर खींचने का उपयोग कर कार्यक्रम के सेट का उपयोग कर कम से कम 3 ग्लास केशिकाओं खींचो, गर्मी = ४००, Fil = 4, Vel = ५०, Del = २२५, Pul =; हीट = ४००, Fil = 4, Vel = ६०, Del = १५०, Pul = १२०. प्रोग्राम सेट Pul के पहले मान के साथ दर्ज किया जाना चाहिए रिक्त छोड़ दिया है । भीतरी व्यास (आईडी) १.०० मिमी और बाहरी व्यास (ओडी) ०.७८ मिमी व्यास में लगभग ०.३ µm के एक टिप खोलने के साथ एक micropipette में borosilicate ग्लास केशिकाओं का उपयोग करना ।
  3. वापस-एक microloader का उपयोग HEPES बफर (10 मिमी) में 5 मिमी CaCl2 समाधान के 8 µ एल के साथ प्रत्येक micropipette भरें । पिपेट टिप के कॉलेस्ट्रॉल से बचने के लिए उपयोग करने से पहले एक 0.2-0.5 µm सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर CaCl2 समाधान फ़िल्टर ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि CaCl2 पूरी तरह से HEPES बफर समाधान है, जो भी कदम 2.4-2.6 के लिए प्रयोग किया जाता है में भंग कर दिया है ।
  4. किसी micropipette धारक को micromanipulator से कनेक्ट करें । micropipette micropipette धारक में कसकर माउंट । इंजेक्शन पंप और केशिका धारक आपूर्ति ट्यूब का उपयोग कर कनेक्ट करें ।
  5. इंजेक्शन पंप शुरू करो । इंजेक्शन पंप पर सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए 20 hPa (इंजेक्शन दबाव) और सेट एक 5 hPa मुआवजा दबाव, पर स्वचालित मोड. micropipette microinjection के लिए तैयार है जब तक इंजेक्शन पंप रोकें ।
  6. माइक्रोस्कोप को brightfield मोड पर सेट करें । यह अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (उद्योग) के लिए कॉंफ़िगर करें । इष्टतम झिल्ली किनारे समाधान प्राप्त करने के लिए 63X या 100X उच्च एनए (१.३) उद्देश्यों का उपयोग करें ।
  7. मोटे micromanipulator का उपयोग करने के लिए गुव-MLV परिसरों युक्त छोटी बूंद के ऊपर micropipette स्थिति । उद्देश्य के ऊपर micropipette के टिप का पता लगाएँ ।
  8. गुव-MLV कॉम्प्लेक्स के मध्यबिंदु पर माइक्रोस्कोप को फोकस करें और फिर गुव के ऊपर लगभग ५० µm को फिर से फोकस करे । micromanipulator के मोटे मोड का उपयोग करने के लिए धीरे ध्यान में micropipette लाने के लिए ।
  9. micromanipulator को ठीक मोड में स्विच करें । धीरे गुव सतह को फिर से ध्यान केंद्रित जबकि micropipette टिप नीचे अनुवाद और ध्यान में टिप रखते हुए । micropipette टिप गुव सतह से लगभग 20 µm की स्थिति । यदि micropipette टिप कांच कवर पर्ची के साथ आकस्मिक संपर्क के कारण टूट गया है ( चित्रा 5Bमें उदाहरण), यह तुरंत बदलें नमूना थोक समाधान में अनावश्यक कैल्शियम आयन रिहाई से बचने के लिए ।

4. कैल्शियम आयन स्रोत का उपयोग कर MTPs का गठन और अनुवाद

  1. माइक्रोस्कोप को प्रतिदीप्ति मोड में सेट करें । सेट dichroics ४८८ एनएम पर उत्तेजित और उत्सर्जन का पता लगाने के लिए 505-550 एनएम ।
  2. इंजेक्शन पंप पर स्विच और कैल्शियम आयन इंजेक्शन शुरू करते हैं । micromanipulator के ठीक मोड का प्रयोग करें, और धीरे micropipette टिप के साथ गुव दृष्टिकोण । झिल्ली की सतह से 3 µm की दूरी पर micropipette टिप स्थिति जबकि micropipette से CaCl2 समाधान इंजेक्शन के लिए MTPs (चित्रा 4) के रूप में अनुमति देते हैं ।
  3. गुव सतह के साथ MTPs अनुवाद, धीरे पिपेट टिप (0.1-0.3 µm के वेग के साथ) गुव सतह के आसपास ठीक micromanipulator (6 चित्रा) का उपयोग कर चाल । कैल्शियम आयन इंजेक्शन जारी रखते हुए गुव सतह और micropipette टिप के बीच लगभग एक ही दूरी (3 µm) बनाए रखें ।
    नोट: उच्च अनुवाद दर पर micropipette टिप (०.७ µm/s) के ऊपर, MTPs सिंक में micropipette के साथ माइग्रेट नहीं होगा । इसके बजाय, वे तितर बितर और छोटा होगा, जबकि नई MTPs micropipette टिप (चित्रा 7) के नए स्थान पर गठित किया जाएगा ।
  4. microinjection को बंद करने के लिए इंजेक्शन पम्प को बंद कर दें और micropipette को गुव सतह से दूर ले जाएं ।

Representative Results

इस काम में, हम गुव-MLV परिसरों के निर्माण का प्रदर्शन और कैसे वे कोशिका झिल्ली गतिशीलता पर कैल्शियम आयन ढाल के प्रभाव स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । microinjection के माध्यम से एक आयन ढाल की स्थापना करते हुए एक निश्चित सेल आकार की नकल के लिए अनुमति देने के लिए इन प्रयोगों के लिए सतह से जुड़ी गुव-MLV परिसरों की आवश्यकता होती है । गुव झिल्ली MTPs के गठन के माध्यम से कैल्शियम एकाग्रता स्थानीयकृत का जवाब कैल्शियम आयन स्रोत से दूर निर्देशित । इसके अलावा, MTPs झिल्ली सतह के आसपास micropipette टिप ले जाकर एक संपर्क तरीके से गुव के आसपास अनुवाद किया जा सकता है ।

गुव-MLV तैयारी प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध चित्रण चित्रा 2में दिखाया गया है । हालांकि प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, गुव-MLV कॉम्प्लेक्स पहले से ही चरण २.४ (चित्र 2c) के दौरान पूर्व में बनते हैं, पुटिका समाधान को स्थानांतरित करने के लिए एक और ३०० µ l छोटी बूंद की बफ़र (प्रोटोकॉल के चरण २.६) की अनुमति देता है विरल का गठन गुव-MLV परिसरों के लिए पर्याप्त कांच सब्सट्रेट करने के लिए पालन करें । इस तरह, micromanipulation और microinjection के लिए एक उपयुक्त परिसर (चित्रा 2d) की स्थापना की है । कभी-कभार, GUVs में एक या कई फंस लिपिड बुलबुले होते हैं, जो एमटीपी गठन को प्रभावित नहीं करते हैं, जैसा कि चित्र 4aमें दिखाया गया है । ये GUVs उत्पादन MTPs; फंस बुलबुले बड़े होते हैं, तो हालांकि, इमेजिंग बाधित हो सकता है । तैयार GUVs के बहुमत (अप करने के लिए ७५%) अर्धगोल दिखाई देते हैं और MLVs से जुड़े होते हैं, जैसा कि चित्र 1aमें दिखाया गया है । इन बुलबुले इस प्रोटोकॉल का मुख्य फोकस कर रहे है और microinjection प्रक्रिया के लिए उपयुक्त हैं । शेष GUVs के बारे में 25% लहरदार (आंकड़ा 1b), जो एक कम झिल्ली तनाव शासन का संकेत है दिखाई देते हैं । ये लहरदार बुलबुले भी ट्यूबलर दखलंदाजी के गठन के लिए अनुमति देते हैं; हालांकि, वे विभिंन कैनेटीक्स और गठित MTPs, जो इस प्रोटोकॉल25के दायरे से बाहर है की एक अलग आकृति विज्ञान प्रदर्शन । तैयार बुलबुले के ठेठ व्यास MLVs के लिए 2 से 15 µm के बीच, और GUVs के लिए 2 से ४० µm के बीच बदलता है । कैल्शियम आयनों के लिए जोखिम के लिए इष्टतम गुव आकार 5 µm या बड़ा है ।

Micropipettes के रूप में अच्छी तरह से कई दशकों३७,३८के लिए सिंथेटिक GUVs के हेरफेर की आवश्यकता प्रक्रियाओं में गाते-सेल पूछताछ योजनाओं में इस्तेमाल किया गया है । इन आवेदनों के बहुमत micropipette और कोशिकाओं या बुलबुले की सतह के बीच सीधे शारीरिक संपर्क शामिल थे । उदाहरण पैच-दबाना तकनीक या गुव झिल्ली से खींच झिल्ली tethers, नैनोट्यूब निर्माण के अलावा-पुटिका नेटवर्क23,28,३९शामिल हैं । हाल ही में, micropipettes भी आयनों और GUVs के आसपास अणुओं के स्थानीयकृत ढाल उत्पंन करने के लिए उपयोग किया गया है विषम कोशिका microenvironments24,25पुनर्निर्माण । प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, एक ठीक से कार्य micropipette (चित्रा धारा 5) के भीतर समाहित समाधान जारी करके गुव सतह पर एक कैल्शियम आयन ढाल की स्थापना के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है । गुव सतह पर micropipette की उचित स्थिति और लिपिड झिल्ली के साथ संपर्क से बचने के सफल microinjection के लिए आवश्यक हैं । micropipette टिप गुव सतह से लगभग 3 µm की दूरी पर आयोजित किया जाता है, जो एक इष्टतम दूरी MTPs उत्पन्न करने के लिए है, जबकि कोशिका झिल्ली के पास कैल्शियम की विविधताओं की नकल उतारा. यदि micropipette टिप गलती से टूट गया है (चित्रा 5B), एक प्रतिस्थापन की आवश्यकता है । micropipette के अंदर CaCl2 के पहले परीक्षण एकाग्रता रेंज, जो एमटीपी गठन के लिए अनुमति देता है, 2 और 5 मिमी25के बीच है, जो extracellular कैल्शियम सांद्रता के अनुरूप है । कम CaCl2 सांद्रता, यानी, 1 मिमी, कोई MTPs मनाया जाता है ।

कैल्शियम microinjection पर MTPs के गठन के छोटे झिल्ली invaginations, जो MTPs में एक्सपोजर (चित्रा 4B) के स्थल पर बढ़ने के गठन के साथ शुरू होता है । MTPs गुव झिल्ली कैल्शियम आयनों के संपर्क में रहता है के रूप में लंबे समय के रूप में विकसित करने के लिए जारी है । वे उतार चढ़ाव और कैल्शियम आयन स्रोत से दूर बिंदु (चित्रा 4c, अनुपूरक फिल्म 1). जब कैल्शियम आयन की आपूर्ति समाप्त हो गया है, गुव सतह पर MTPs तितर बितर, यह मुश्किल निष्कर्ष निकालना है कि क्या MTPs रहने या अंततः गायब हो रही है ।

MTPs के गठन स्थानीयकृत कैल्शियम गुव झिल्ली के उजागर बाहरी पत्रक के लिए बाध्यकारी आयन द्वारा समझाया जा सकता है और सहज वक्रता ट्रिगर (एम), जो सीधे सहज तनाव के गठन के साथ जुड़ा हुआ है σ = 2κm2 (κ झुकने कठोरता है), कि झिल्ली के झुकने के लिए प्रेरित और आवक MTPs बनाने । पिछले रिपोर्टों का प्रदर्शन किया है कि झिल्ली के विकृति और/या नकारात्मक आरोप लिपिड की झिल्ली को कैल्शियम आयनों के बंधन पर, नकारात्मक सहज वक्रता४०में जिसके परिणामस्वरूप के द्वारा समझाया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, 2 Ca के मजबूत बाध्यकारी+ नकारात्मक आरोप लगाया bilayer की सतह को उजागर लिपिड bilayer पुस्तिका के सतह प्रभारी घनत्व बेअसर । यह bilayer भर में चार्ज घनत्व अंतर होता है, शून्य सहज वक्रता में जिसके परिणामस्वरूप,25झिल्ली मोड़ करने के लिए पर्याप्त.

MTPs के मनाया गठन कैल्शियम आयनों के लिए लिपिड झिल्ली की संवेदनशीलता को दर्शाता है और झिल्ली ट्यूबलर संरचनाओं के उत्पादन के लिए एक उपंयास संपर्क दृष्टिकोण प्रदान करता है । Elucidating इस झिल्ली tubulation की उत्पत्ति विभिंन कोशिका कार्यों और कोशिका को आकार देने के दौरान झिल्ली संक्रमण की गतिशीलता को समझने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है और सेल के भीतर लिपिड संगठन में अंतर्दृष्टि पाने के लिए सहायक हो सकता है झिल्ली.

मनाया MTPs हमेशा कैल्शियम आयन जोखिम के दौर से गुजर झिल्ली पर साइट पर उत्पंन कर रहे हैं । इस प्रकार, micropipette टिप के स्थान का चयन करके, यह संभव है कि गुव की सतह के क्षेत्र में दखलंदाजी वृद्धि के लिए परिभाषित । अगले, अगर micropipette धीरे (0.1-0.3 µm/गुव सतह के चारों ओर ले जाया गया है, जबकि झिल्ली से जुदाई दूरी बनाए रखने, MTPs micropipette के साथ मिलकर में अनुवाद कर रहे हैं । चित्रा 6 और इसी पूरक फिल्म 2 गुव सतह के आसपास MTPs के ऐसे प्रवास का प्रदर्शन । इस प्रक्रिया के लिए सतत कैल्शियम आयन इंजेक्शन25पर नए MTPs के गठन के साथ होने की संभावना है । उच्च अनुवाद दरों पर (०.७ µm/एस ऊपर), MTPs micropipette टिप का पालन नहीं कर पा रहे हैं । इसके बजाय, नई दखलंदाजी micropipette टिप (चित्रा 7) के नए स्थान पर गठित कर रहे हैं ।

मनाया संपर्क कैल्शियम आयन-गुव सतह के आसपास MTPs का मार्गदर्शन अनुवाद आगे कोशिकाओं के अंदर झिल्ली ट्यूबलर संरचनाओं की गतिशीलता के पीछे ड्राइविंग बलों की हमारी समझ सकते हैं । इसके अलावा, इस दृष्टिकोण रासायनिक ढाल का उपयोग करके नरम बात प्रणालियों में सामग्री के परिवहन को नियंत्रित करने के लिए एक उपंयास संपर्क मोड प्रदान करता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : गुव के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों-MLV परिसरों एक गिलास कवर पर्ची की सतह पर मैटीरियल । (क). एक गोलाकार गुव का उदाहरण । गुव MLV से जुड़ी एक गोलार्द्ध के रूप में प्रकट होता है । (ख) एक लहरदार गुव का उदाहरण । काले तीर झिल्ली के विकृत क्षेत्रों से संकेत मिलता है । छवियों को बढ़ा रहे हैं और फ्लोरोसेंट लेबल गुव झिल्ली के दृश्य में सुधार औंधा. स्केल बार 5 µm का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : गुव-MLV तैयारी और microinjection योजनाओं के योजनाबद्ध रेखांकन. (क). एक सूखी लिपिड परत क्लोरोफॉर्म के लिपिड समाधान से रोटरी वाष्पीकरण का एक परिणाम के रूप में कांच की शीशी के तल पर बना है । (ख). rehydratेड लिपिड परत sonicated है, और छोटे लिपिड बुलबुले का गठन कर रहे हैं । (ग). पुटिका समाधान (5 µ एल) की एक छोटी सी छोटी बूंद एक गिलास कवर पर्ची की सतह पर रखा गया है और 20 मिनट के लिए लिपिड समाधान निर्जलीकरण और एक सूखी लिपिड फिल्म फार्म (इस कदम नहीं दिखाया गया है) के लिए एक desiccator में स्थानांतरित कर दिया । ५० µ एल के साथ शुष्क लिपिड फिल्म rehydrat बफर समाधान के पूर्व गुव-MLV परिसरों का गठन पैदा करता है । (घ). पूर्व-गठित परिसरों के स्थानांतरण से काँच के आवरण स्लिप की सतह से जुड़ी विरल पृथक गुव-MLVs के गठन में बफर परिणामों की एक बड़ी मात्रा का पता चलता है. (ङ). स्थिति गुव की सतह के पास micropipette और कैल्शियम आयनों जारी MTPs के गठन से चलाता है । रेखांकन स्केल करने के लिए आरेखित नहीं हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : कैल्शियम आयनों के microinjection के लिए प्रायोगिक सेटअप । (A). GUVs में MTPs जनरेट करने के लिए आवश्यक प्रयोगात्मक सेटअप के घटक । (ख) microinjection सेटअप का विवरण । ग् coverslip माइक्रोस्कोपी स्टेज पर रखे गुव-MLV परिसरों के समाधान के साथ । micropipette और कांच के कवर स्लिप की सतह के बीच का कोण 30 ° (सफेद में चिह्नित) है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : गुव की सतह पर कैल्शियम आयनों के microinjection पर MTPs का गठन । (क). गुव-MLV जटिल एक कैल्शियम आयन ढाल के लिए जोखिम से पहले । तीर गुव के अंदर एक लिपिड पुटिका फंस को इंगित करता है, और जो MTPs का अवलोकन बाधा नहीं करता. (ख). छोटे MTPs कैल्शियम आयनों (micropipette में CaCl2 के 5 मिमी एकाग्रता) के microinjection पर गठित कर रहे हैं । (ग) कैल्शियम आयनों के लिए निरंतर जोखिम पर MTPs की वृद्धि. प्रतिदीप्ति छवियों को बढ़ाया और दृश्य प्रयोजनों के लिए औंधा कर रहे हैं । स्केल बार 5 µm का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : ग् micropipettes कैल्शियम आयन microinjection के लिए प्रयोग किया जाता है । (a). एक ठीक से कार्य micropipette का एक उदाहरण । (ख). एक टूटी हुई टिप (क्षतिग्रस्त क्षेत्र एक काले तीर के साथ संकेत दिया है) है कि एक micropipette का एक उदाहरण है । दोनों छवियों को बढ़ाया और बेहतर दृश्य के लिए औंधा कर रहे हैं । स्केल बार 5 µm का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : कैल्शियम आयन-गुव की सतह के आसपास MTPs के मार्गदर्शन अनुवाद । (क). MTPs 5 मिमी CaCl2 समाधान के microinjection पर गुव सतह पर गठित कर रहे हैं । (बी-सी). micropipette टिप (0.2-0.3 माइक्रोन/झिल्ली की सतह के आसपास) के अनुवाद कैल्शियम आयन स्रोत की दिशा में MTPs के आंदोलन से चलाता है । काले तीर micropipette आंदोलन की दिशा पर प्रकाश डाला । छवियों को बढ़ाया और झिल्ली दृश्य में सुधार औंधा कर रहे हैं । स्केल बार 5 µm का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : micropipette टिप के उच्च अनुवाद दर पर MTPs । (क). MTPs 5 मिमी CaCl2 समाधान (व्हाइट लाइन) के microinjection पर गुव सतह पर गठित कर रहे हैं । (बी-सी). गुव सतह के चारों ओर micropipette की उच्च अनुवाद दर (1 माइक्रोन/micropipette टिप (रानी रेखा) के नए स्थान पर नए MTPs के गठन में परिणाम, साथ ही पहले से गठित MTPs (व्हाइट लाइन) के कैटरिंग । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Movie 1
अनुपूरक मूवी 1: Ca के लिए स्थानीयकृत प्रदर्शन पर गुव में MTPs का गठन 2 + ग्रैडिएंट । कृपया यहां क्लिक करें इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए । 

Movie 2
अनुपूरक मूवी 2: गुव सतह के आसपास कैल्शियम आयन निर्देशित एमटीपी माइग्रेशन ।   कृपया यहां क्लिक करें इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए । 

Discussion

Biomimetic सेल सिस्टम आयनों, प्रोटीन, या नैनोकणों के रूप में बाहरी उत्तेजनाओं के लिए जोखिम पर झिल्ली व्यवहार के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं । GUVs, इस तरह के एक मॉडल जा रहा है, उनके आकार, जो अक्सर ट्यूबलर संरचनाओं और invaginations24,४१,४२,४३ के गठन शामिल है का समायोजन करके रासायनिक वातावरण में परिवर्तन का जवाब कर सकते है .

यह लेख गुव सतह पर कैल्शियम आयनों के स्थानीयकृत इंजेक्शन पर गुव सतह के remodeling के माध्यम से एक संपर्क तरीके में MTPs उत्पन्न करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है. प्रोटोकॉल गुव-MLV परिसर, जो एक सेल प्लाज्मा झिल्ली की नकल की तैयारी का वर्णन, साथ ही साथ कैसे एक microinjection तकनीक को रोजगार के लिए कैल्शियम आयन ढाल गुव सतह के करीब उत्पंन करने के लिए MTPs फार्म । पिछले प्रयोगात्मक अध्ययन के बहुमत है कि संबोधित किया कैल्शियम आयन-झिल्ली बातचीत करने के लिए लिपिड बुलबुले उजागर थोक कैल्शियम आयन14,17. प्रयोगात्मक शर्तों के आधार पर, इस तरह के थोक जोखिम कोई ट्यूबलर दखलंदाजी के साथ एक अलग झिल्ली प्रतिक्रिया में परिणाम हो सकता है25का गठन किया ।

गुव-MLV परिसरों के गठन बल्कि सीधा है और केवल मानक प्रयोगशाला उपकरण, जैसे कि एक रोटरी वाष्पीकरण, अल्ट्रासोनिक स्नान, और वैक्यूम desiccator की आवश्यकता है । फिर भी, वहां कई महत्वपूर्ण कदम पुटिका तैयारी के दौरान विचार कर रहे हैं । यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि बुलबुले के निर्जलीकरण (प्रोटोकॉल के २.३ कदम के दौरान) पूरा हो गया है और एक सूखी परिपत्र लिपिड केवल नमक क्रिस्टल की एक छोटी राशि से युक्त फिल्म कांच कवर स्लिप की सतह पर बनाई गई है । प्रयोग के दौरान, पुटिका समाधान के सावधान हैंडलिंग, क्लोरोफॉर्म में ताजा लिपिड स्टॉक समाधान का उपयोग कर के रूप में अच्छी तरह के रूप में ताजा HEPES बफर, गुव-MLV परिसरों की सफल तैयारी के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, गुव-MLV परिसर के कांच कवर पर्ची सतह के सुरक्षित लगाव micromanipulation और microinjection के लिए महत्वपूर्ण है । गुव-MLV परिसर के पर्याप्त आसंजन की पुष्टि करने के लिए, micropipette (इंजेक्शन प्रवाह के बिना) धीरे गुव सतह के खिलाफ धक्का करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक दृढ़ता से पालन पुटिका सीधे शारीरिक संपर्क पर सतह के साथ स्लाइड नहीं होगा । प्रयोगों एक खुले बफर छोटी बूंद में किया जाता है, जो कई घंटे के लिए पूछताछ की जा सकती है, वाष्पीकरण को ध्यान में रखा जाना चाहिए. बफर छोटी बूंद से वाष्पीकरण को प्रभावित और बुलबुले को अस्थिर कर सकता है जो आसमाटिक शर्तों, बदल जाएगा । आसमाटिक शर्तों को पुनर्स्थापित करने के लिए, मूल वॉल्यूम को पुनर्स्थापित करने के लिए नमूने के लिए शुद्ध पानी के आवधिक अतिरिक्त homeostasis करने के लिए सिस्टम देता है ।

जब लिपिड झिल्ली संरचना को संशोधित करने, यह महत्वपूर्ण है कि बुलबुले एक गुव-MLV जटिल के रूप में उत्पादित कर रहे हैं क्योंकि MLV झिल्ली को आकार देने के दौरान गुव के लिए लिपिड सामग्री को स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देता है । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि शुद्ध लिपिड के साथ एसपीई मिश्रण के घटकों की जगह, या कोलेस्ट्रॉल के 5-30% जोड़ने, भी गुव के लिए अनुमति देता है-MLV जटिल गठन28,४४. तैयार GUVs का बहुमत unilamellar४५है ।

इसके अलावा, जब इस तरह के मैग्नीशियम आयनों के रूप में अंय divalent cations, परीक्षण, MTPs के गठन भारी लिपिड मिश्रण में नकारात्मक आरोप लगाया DOPS की उपस्थिति पर निर्भर करता है । DOPS के बिना, MTPs इस प्रोटोकॉल में वर्णित बुलबुले में फार्म नहीं है । इसके अलावा, पोटेशियम और सोडियम के रूप में monovalent cations, MTPs के गठन में परिणाम नहीं है, यहां तक कि DOPS-युक्त बुलबुले25.

तैयारी और GUVs के हेरफेर के संबंध में महत्वपूर्ण कदम के अलावा, वहां कई महत्वपूर्ण कारकों को microinjection प्रक्रिया के दौरान विचार कर रहे हैं । कैल्शियम आयनों के सफल microinjection के प्रयोग के दिन पर तैयार कर रहे हैं, जो ठीक से काम कर कांच micropipettes, पर निर्भर करता है । कई कारकों है कि micropipette खराबी के कारण सकता है । एक आम कारण एक भरा टिप खोलने है । छोटे लिपिड कणों, जो पुटिका तैयारी के शोधकार्य कर रहे हैं, समाधान में फैला रहे हैं और micropipette टिप का पालन करने के लिए करते हैं, जिससे एक कॉलेस्ट्रॉल पैदा. सफाई पिपेट टिप सबसे अच्छा यह पुटिका समाधान से ऊपर उठाने और इसे वापस गुव सतह के करीब रखने के द्वारा किया जाता है । क्योंकि यह भारी समाधान में कैल्शियम आयनों के बड़े पैमाने पर इंजेक्शन में परिणाम microinjection पंप का झटका बाहर समारोह के उपयोग से बचा जाना चाहिए । इसके अलावा, छोटे हवाई बुलबुले micropipette अंदर फंस उचित microinjection को रोकने के लिए, जो मामले में micropipette एक नया एक के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए । टिप टूटना काफी टिप दोलनों को कम करने के लिए एक कंपन-भीगा मेज पर प्रयोगात्मक सेटअप रखने से कम किया जा सकता है ।

इसके अलावा, देखभाल की जरूरत है जब एक अवलोकन योजना का चयन करने के लिए, सबसे अच्छा समय-हल छवियों को प्राप्त करने photobleaching whilst कम करने के लिए लिया जाना चाहिए । वाइड क्षेत्र लेजर प्रेरित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया गया था क्योंकि यह एक उद्देश्य सीमित जांच गहराई में एक अपेक्षाकृत उच्च छवि अधिग्रहण दर के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, उल्टे माइक्रोस्कोपी का उपयोग एक साथ microinjection और लिपिड बुलबुले और MTPs के अवलोकन के लिए अनुमति देता है ।

प्रस्तुत विधि की मुख्य सीमाओं में से एक व्यापक मैनुअल काम और पर्याप्त micromanipulation कौशल की आवश्यकता है । क्योंकि परिसरों में एक सहज सूजन की प्रक्रिया के माध्यम से गठन कर रहे हैं, GUVs और MLVs के आकार को नियंत्रित नहीं किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल को तैयार गुव-MLV परिसरों की झिल्ली तनाव के नियंत्रण के लिए अनुमति नहीं है, जो झिल्ली remodeling के संबंध में अतिरिक्त विवरण इकट्ठा करने के लिए आवश्यक हो सकता है । GUVs MTPs की पर्याप्त वृद्धि के लिए एक हद तक है कि केवल GUVs से उपलब्ध झिल्ली का उपयोग प्राप्त करने के लिए असंभव होगा बाद की आपूर्ति के साथ MLVs से जुड़े रहे हैं । MLVs भी गुव-MLV जटिल४४है, जो micropipette आकांक्षा का उपयोग करके पुटिका के तनाव को नियंत्रित करने का प्रयास जटिल होगा भीतर किसी भी पार्श्व सतह तनाव विविधताओं को कम करने में योगदान । यह गुव-MLV-आधारित मॉडल एक कम तनाव प्रदान करता है जो बेहतर ढंग से झिल्ली के जलाशयों, जैसे झिल्ली परतों और invaginations४६से जुड़ा सेलुलर झिल्ली संरचनाओं में पाया तनाव शासनों की नकल करती है । एक ही समय में, micropipette आकांक्षा तकनीक सफलतापूर्वक एकल GUVs में झिल्ली तनाव को नियंत्रित करने के लिए लागू किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, पकड़ो एट अल द्वारा काम के लिए एक GUVs में झिल्ली ट्यूबलर invaginations के गठन पर विवरण प्रदान की झिल्ली को कैल्शियम आयनों के विभिंन तनाव से भारी स्थितियों में४०सरकारों पर बाध्यकारी । अंत में, दोनों स्थानीय और थोक कैल्शियम के लिए जोखिम पर झिल्ली व्यवहार की तुलना सतह, जो इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है के लिए झिल्ली आसंजन के नियंत्रण में सुधार की आवश्यकता है ।

संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, प्रस्तावित तकनीक के लिए अनुमति देता है संपर्क करने के लिए और कैल्शियम आयनों के साथ स्थानीयकृत उत्तेजना पर MTPs के गठन के लिए । इस विधि के भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए सिंथेटिक पुटिका प्रणालियों से अनुवाद पर केंद्र देशी जैविक झिल्ली, जैसे कोशिका blebs. प्रस्तावित विधि अन्य एकल सेल पूछताछ योजनाओं के साथ शामिल किया जा सकता है, जैसे पैच दबाना या microelectrode amperometry, या स्थानीयकृत हीटिंग रणनीतियों के साथ संयुक्त31,४७,४८. अंय आयनों या अणुओं के प्रभाव का परीक्षण सीधा है और केवल ब्याज के अणुओं के साथ कैल्शियम आयनों की जगह शामिल है । इसके अलावा, जटिल सिंथेटिक लिपिड बुलबुले transmembrane प्रोटीन के साथ झिल्ली functionalization के माध्यम से उत्पादन किया जा सकता है, जो सेल को आकार देने और कोशिका झिल्ली गतिशीलता के संवेदन के साथ जुड़े की हमारी समझ का विस्तार हो सकता है स्थानीय रासायनिक ढाल । पिछले नहीं बल्कि कम, लिपिड झिल्ली के संपर्क में उत्तेजना भी बहुलक नरम बात प्रणालियों के लिए अनुवाद किया जा सकता है, एक उपंयास संपर्क हेरफेर मंच के लिए एक आधार की पेशकश की ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Soy bean polar lipid extract Avanti
Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)		 541602C 100 mg
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS Avanti
Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)		 840035C 1x25 mg
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO-TEC (Germany) AD 488-31 1 mg
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.) Sigma Aldrich (Missouri, USA) 20735 SIGMA-ALDRICH
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10x75 mm, Borosilicate glass 250/pack Corning Incorporated (Corning, NY 14831) 99445-10
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer Sigma Aldrich (Missouri, USA) 650498-1L-D
Rotary evaporator Büchi Rotavapor R-144 Switzerland
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm KEBO lab (Sweden) MA00360500
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO Sharlau Chemie S.A. (Spain) P9333-500G
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0% Sigma Aldrich (Missouri, USA) S7653-1KG
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5% Sigma Aldrich (Missouri, USA) G5516-1L
Glycerol, for molecular biology, minimum 99% Sigma Aldrich (Missouri, USA) T-1503 2050 g
Trizma base Sigma Aldrich (Missouri, USA) P5629-500G
Potassium phosphate tribasic (K3PO4) Sigma Aldrich (Missouri, USA) P5655
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma Aldrich (Missouri, USA) 5886
MgSO4 Merck (USA) 34549-100 g
EDTA Sigma Aldrich (Missouri, USA) H0887 Sigma 
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture Sigma Aldrich (Missouri, USA) Z260282-1PAK 24x60 mm
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm Sigma Aldrich (Missouri, USA) 631-1339 
Menzel Gläzer #1, glass cover slip VWR (USA)
Diaphragm vacuum pump for the desiccator Vacuubrand (Germany)
Ultrasonicate bath Bandelin Sonolex (Germany)
VX-100 Lab vortexer vortex mixer Labnet International (USA)
488 nm laser line  Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden)
Leica Microsystems immersion oil for microscopes Leica (Germany) 12847995 
Inverted fluorescence microscopy system  Leica DM IRB (Wetzlar, Germany)
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision) Technologies GmbH (Thuringia, Germany) 300038
PatchStar Micromanipulator Scientifica (Uckfield, UK) 612-7933
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10,  1.00mm O.D. X 0.78mm I.D.  Harvard Apparatus U.K
Eppendorf microloader (pipette tips) VWR (USA)
P-2000 CO2 laser-puller  Sutter Instruments (Novato, USA)
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet Eppendorf (Germany)

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References

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Ali Doosti, B., Cans, A. S.,… More

Ali Doosti, B., Cans, A. S., Jeffries, G. D. M., Lobovkina, T. Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients. J. Vis. Exp. (137), e57789, doi:10.3791/57789 (2018).

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