Summary
Aquí presentamos un protocolo para diferenciar células del pigmento retiniano epitelio (RPE) de las células de vástago pluripotent humana teniendo mutaciones derivados del paciente. Las líneas celulares mutantes pueden utilizarse para el análisis funcionales como immunoblotting, inmunofluorescencia, abrazadera del remiendo. Este enfoque de la enfermedad en plato evita la dificultad de obtención de células de EPR humanas nativas.
Abstract
Aunque más de 200 mutaciones genéticas en el gene humano de BEST1 han identificado y ligado a enfermedades degenerativas de la retina, los mecanismos patológicos siendo esquivos debido principalmente a la falta de un modelo de buen en vivo para el estudio de BEST1 y sus mutaciones en condiciones fisiológicas. BEST1 codifica un canal iónico, es decir, BESTROPHIN1 (BEST1), que funciona en epitelio retiniano del pigmento (RPE); sin embargo, la accesibilidad muy limitada a las células RPE humanas nativas representa un reto para la investigación científica. Este protocolo describe cómo generar humanos RPEs BEST1 mutaciones enfermedad-que causan del cojinete por la diferenciación inducida de células de vástago pluripotent humanas (hPSCs). Como hPSCs es auto renovables, este enfoque permite a los investigadores a tener una fuente constante de hPSC-RPEs para distintos análisis experimentales, como el immunoblotting, inmunofluorescencia y abrazadera del remiendo y así proporciona un modelo de enfermedad en un plato muy de gran alcance para BEST1-condiciones retinales asociadas. En particular, esta estrategia puede aplicarse para estudiar la fisiología de la RPE (patho) y otros genes de interés nativamente en RPE.
Introduction
Se ha documentado que al menos cinco enfermedades degenerativas retinianas son causadas por mutaciones genéticas en el BEST1 gene1,2,3,4,5,6 , 7 , 8, con el número de mutaciones divulgadas ya sobre 200 y aún creciente. Estos BEST1-enfermedades asociadas, también conocido como bestrophinopathies, causan la pérdida progresiva de la visión e incluso ceguera, y actualmente no existen efectivos tratamientos. El producto de la proteína de BEST1, a saber, BESTROPHIN1 (BEST1), es un Ca2 +-activado canal de Cl– (CaCC) específicamente expresado en el epitelio retiniano del pigmento (RPE) de los ojos5,6, 8,9. Lo importante es un fenotipo clínico de BEST1-enfermedades asociadas es la disminución en la respuesta visual a los estímulos de luz, llamado light peak (LP) medido en el electrooculograma10,11; LP se cree para ser mediado por un CaCC en RPE12,13,14. Para comprender mejor los mecanismos patológicos de las mutaciones BEST1 y procurar terapias potenciales, resulta esencial para estudiar los canales del mutante BEST1 endógeno expresados en células humanas de la RPE.
Sin embargo, obteniendo RPE células directamente de pacientes vivo es altamente impráctico. Aunque nativas células RPE pueden ser cosechadas de las biopsias de cadáveres humanos y de fetos, la difícil accesibilidad a estas fuentes limita significativamente la investigación científica. Por lo tanto, es crítico contar con fuentes alternativas de RPE que no sean los ojos humanos. Esta llamada ha sido contestada por los avances recientes en técnicas de células madre, células RPE funcionales ahora pueden ser distinguidas de células de vástago de pluripotent humanas (hPSCs), incluyendo las células madre embrionarias (hESCs) e inducida de pluripotent células (hiPSCs), este último ser generadas por la reprogramación de fibroblastos de piel primaria de donantes16,17,18. Lo importante es la auto renovación y pluripotencia de hPSCs aseguran una fuente confiable para generar RPEs, mientras que la especificidad de paciente de hiPSCs y potencial modificación genómica de hESCs (p. ej., por CRISPR) ofrecen un modelo de enfermedad en plato versátil para mutaciones de BEST1 deseadas.
hPSC-RPE tiene varias ventajas sobre los ratones modelos RPE: 1) ratones knockout de BEST1 no muestran ninguna anormalidad retiniana19, levantando la posibilidad de diverso requisito genético de BEST1 en RPE entre ratones y humanos; 2) sólo el 3% de células humanas de RPE son binucleado, en contraste con 35% en ratones20; 3) hiPSC-RPE potencializa el trasplante autólogo en clínica tratamiento de retina trastornos21. Sin embargo, los modelos animales están siendo indispensables para el estudio de patología y fisiología RPE en un sistema vivo y no puede ser pasado por alto el potencial oncogénico de hiPSC.
El procedimiento aquí describe un hPSC moderado simple y útil en el protocolo de diferenciación de RPE que puede utilizarse para fines de investigación y clínicos. Este protocolo utiliza nicotinamida (vitamina B3) para aumentar la diferenciación de hPSCs al tejido neural, que además se induce a diferenciarse en RPE por tratamiento con activina-A. Tratamiento de nicotinamida ha demostrado aumentar el número de células pigmentadas (un signo de diferenciación en RPE), posiblemente por atenuar la actividad apoptótica de diferenciar células22. Las células de RPE hPSC resultante muestran los mismos marcadores claves, guijarro morfología y funcionalidad celular como nativo humano RPE células22. Así, en un entorno de investigación, las células de RPE hPSC resultantes son adecuadas para posteriores análisis funcionales incluyendo immunoblotting, inmunotinción y abrazadera del remiendo de celulares, para que también se proporcionan procedimientos experimentales detallados. Clínicamente, las células RPE derivadas de células madre han demostrado gran potencial para el tratamiento de trasplante de la degeneración macular en estudios en animales y ensayos humanos23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. diferenciación de hPSC para RPE
- Mantener y paso hPSCs como describió anteriormente18.
Nota: Todas las células (incluyendo hPSCs y hPSC RPEs) se cultivan en 37 ° C en 5% CO2 a lo largo de la duración de los protocolos de crecimiento y diferenciación. -
Antes de la diferenciación, split hPSCs confluentes en placas de 6 pocillos prelacadas.
- Capa de placas, matriz de la membrana del sótano en hielo durante aproximadamente 1 hora de descongelar, suspender liquidized matriz en medio DMEM de 4 ° C en un 1:50 dilución, agregue la mezcla de capa de 800 μl a cada pozo e incubar durante al menos 1 h a 37 ° C.
- Cuando la capa está completa, aspirar la mezcla y añadir medio de 1,5 – 2 mL en los pocillos.
- Para levantar el hPSCs de las placas de cultivo antiguo, incubar las células con PBS más 0,5 mM EDTA durante 5 minutos a temperatura ambiente, aspirar la solución y resuspender las células en pequeños grupos con medio de cultivo.
- Células de semilla en confluencia de ~ 20% en las nuevas placas.
Nota: Tienda matriz de la membrana del sótano en alícuotas de μl 100 a-20 ° C y utilizar una alícuota para recubrir una placa de 6 pozos. El tiempo de recubrimiento puede prolongarse hasta 4 h a 37 ° C, o durante la noche a temperatura ambiente. Es importante suspender y semillas hPSCs como pequeños grupos de 3 a 5 células en lugar de las células.
- Cuando las células se cultivan en plena confluencia, sustituir el medio de cultivo con medio de diferenciación (4 mL/pocillo) (tabla 1, sin activina-A). La cultura durante 14 días, cambiando el medio (4 mL/pocillo) 3 x / semana.
Nota: Se espera que las hPSC placa densidad dobles aproximadamente cada 24 h. muerte celular importante después del inicio del procedimiento de diferenciación. Agregados de células muertas y los desechos de los pozos se pueden ver a simple vista durante los cambios de medio. - Del día 15 al día 28, suplemento medio de diferenciación con 100 ng/mL humanos activina-A (tabla 1, con humanos activina-A). Cambiar el medio (4 mL/pocillo) 3 x / semana.
- Deje de activina-A la suplementación a partir del día 29 (tabla 1, sin humanos activina-A). Continuar el cultivo celular en medio de la diferenciación para 8 – 10 semanas hasta que racimos hPSC-RPE pigmentadas (figura 1A-B).
Nota: Grupos de células pigmentadas pueden verse como pequeños puntos oscuros en una placa de cultivo celular a simple vista (figura 1A-B, arriba). Células pigmentadas individuales con forma de guijarro de firma pueden verse al microscopio 20 X (figura 1A-B, parte inferior).
2. aislamiento y cultivo de células RPE diferenciados
- Retire el medio de diferenciación, lavar una vez con PBS, añadir 1 mL de tripsina 0,05% y 1 U/μl de colagenasa en cada pozo, incubar a 37 ° C durante 20-30 min Quite la tripsina/colagenasa y suavemente agregar 2 mL de medio RPE precalentado en cada pocillo de la placa de la pozo 6 (< C0 > tabla 2).
Nota: Utilice un microscopio invertido para controlar la morfología de las células de RPE hPSC, que son poligonales antes del tratamiento de tripsina/colagenasa, y se convierten en la redondo después de la digestión suficiente. -
Use un mechero de Bunsen al tirar vidrio Pipetas Pasteur.
- Con ambas manos, sujete una larga pipeta Pasteur (9 pulgadas) en ambos extremos por lo que es horizontal y sobre la hornilla de Bunsen 2/3 la longitud de la parte fina de la pipeta.
- Una vez que el vidrio se convierte en suave de la llama, rápidamente separe los dos extremos, tal que un micro punta de raspador-como se forma en el nuevo extremo de la pipeta (figura 2).
- Repita varias veces para crear múltiples "raspadores de la célula". Rocíe las pipetas tiradas con etanol al 70% para la esterilización y secar en la campana de la cultura de célula.
-
Bajo un microscopio, utiliza una micro "raspador de célula" suavemente disociar grupos pigmentadas hPSC-RPE de la placa.
- Golpee ligeramente (no rascar) directamente en las células pigmentadas, que flotan para arriba en el medio de cultivo una vez que disocian de la parte inferior del pozo.
- Inmediatamente utilice una micropipeta de 20 μl suavemente las células disociadas hPSC-RPE de succión y transferirlas a una placa de 6 pozos prelacada con RPE media24.
- Recoger ~ 5 x 103 células (confluencia de ~ 10% como se observa al microscopio 20 X) en cada uno previamente revestido de una placa de 12 pozos, repitiendo los pasos 2.3.1–2.3.2 varias veces, según sea necesario. Llevar el volumen final de medio a 2 mL.
Nota: Para evitar disociado hPSC-RPE células de flotación, no movimiento de las placas durante el proceso de disociación que las células disociadas están flotando en el medio pero siguen siendo localmente concentradas.
- Células en cultivo recién aislado hPSC-RPE (P0) en las placas de 12 pozos en medio de la RPE durante otras 6-8 semanas para que puedan formar una monocapa pigmentada (figura 1).
- Cambiar el medio 3 x / semana. Cuando se cambia el medio, deja aproximadamente 1/3 volumen del medio vieja en cada pozo y añadir 2/3 volumen de medio fresco, precalentado de RPE. En esta fase, usar 2 mL de medio RPE para cada pocillo de una placa de 12 pozos (por lo tanto, intercambio de 1,3 mL de medio cada vez).
Nota: La monocapa de células de P0 hPSC-RPE puede formar cúpulas, sugiriendo que las células activamente son transporte de fluidos y son ancladas por uniones estrechas25. Por lo tanto, formación del domo es un indicador de estado maduro de RPE.
3. RPE destino validación por Immunoblotting
- Hacer la célula hPSC-RPE lisado con tampón de extracción de la proteína mamífera con inhibidor de la proteinasa cóctel. Incubar el lisado celular en hielo durante 30 minutos antes de la centrifugación a 13.000 x g durante 15 min a 4 ° C para eliminar restos celulares sin disolver. Medir la concentración de proteína total de lisado.
- Desnaturalizar 40 μg de proteína total en Tampón Laemmli SDS a 75 ° C por 10 minutos separan la proteína muestras en gel de SDS-PAGE de Tris glicina 10% a una tensión constante de 90 V por 15 min y luego 150 V hasta que la frente llegue a tinte la parte inferior del gel.
- La transferencia de las proteínas en una membrana de nitrocelulosa en solución tampón de Tris glicina previamente enfriado suplementado con 10% de metanol a 100 V durante 1 hora.
- Bloquear la membrana en solución salina tamponada con Tris con 0,1% detergente no iónico (TBST) y leche en polvo sin grasa 5% durante 1 h a temperatura ambiente.
- Incubar la membrana con anticuerpos primarios diluidos en la solución amortiguadora de bloqueo a 4 ° C durante la noche. Diluir los anticuerpos dirigidos a proteínas del marcador específico de RPE como sigue: RPE65, 1:1, 000; CRALBP, 1:1, 000; BEST1, 1:1, 000. Diluir el anticuerpo contra β-actina en 1: 10,000 para detectar β-actina como control de carga.
- Lavar la membrana con TBST 3 veces, con 5 minutos para cada lavado.
- Incubar la membrana con fluoróforo cabra conjugado anti-ratón IgG anticuerpo secundario diluido 1: 10,000 en solución amortiguadora de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Lavar la membrana con TBST 4 veces, con 10 minutos para cada lavado.
- Detectar las proteínas mediante un sistema (figura 3) la proyección de imagen de infrarrojos.
4. comprobación de localización subcelular BEST1 immunostaining
- Lavar una vez las células RPE hPSC con 2 mL de PBS y se fijan en 2 mL de paraformaldehído al 4% durante 45 min a temperatura ambiente.
- Lavar dos veces con 2 mL de PBS e incubar las células en 2 mL de PBS con 0.1% no iónico surfactant y el 2% burro suero de 45 min bloquear los sitios de Unión inespecífica.
- Incubar las células con el anticuerpo BEST1 (dilución 1: 200) por 2 h a temperatura ambiente.
- Lavar las células con 2 mL de PBS 3 veces. Incubar con fluoróforo conjugada secundaria IgG (1:1, 000) por 1 h a temperatura ambiente.
- Lavar con 2 mL de PBS 3 veces para retirar el anticuerpo secundario independiente.
- Observar células por microscopía confocal (figura 4).
5. grabación Ca2 +-dependiente corriente de Cl– en hPSC-RPE por celulares Patch Clamp
- 24 – 72 h antes de la abrazadera del remiendo, dividir completamente confluente (en una placa de 12 pozos) de células maduras de hPSC-RPE de0 P (en forma de guijarro y pigmentado). Aspire el medio, lave una vez con PBS y agregar 1 mL de tripsina 0,05% plus 1 colagenasa U/μL en el pozo.
Nota: Precaliente la tripsina/colagenasa a 37 ° C antes de usar. - Incubar a 37 ° C durante 8 minutos.
Nota: Después de este paso, las células de RPE hPSC siguen siendo adherente y conectado. - Utilizar una micropipeta de 1 mL para lavar suavemente las células de la placa y transferencia de las células en la mezcla de digestión a un tubo cónico de 15 mL. Lavar el pozo con 1 mL de tripsina/colagenasa precalentado para recoger las células residuales y combinarlos en el tubo cónico de 15 mL.
Nota: Las células de RPE hPSC todavía están en grupos grandes en este punto. No trate de romper los grumos de células mediante pipeteo vigoroso. Algunos grupos pueden adherirse a la pared interna de la punta de 1 mL. - Incubar el tubo cónico en un baño seco de 37 ° C durante 8 minutos.
- Utilice una micropipeta de 1 mL para suavemente la pipeta hacia arriba y abajo 10 a 15 veces la mezcla de digestión.
Nota: Grupos de células se convierten en mucho más pequeños pero aún visible. Evitar pipetear vigoroso. - Repita los dos pasos anteriores.
Nota: La mayoría de las células debe ser unicelular suspensión después de su uso. Todavía puede haber algunos macizos de células pequeñas, que son aceptables. Opcional: Incubar el tubo cónico a 37 ° C por un adicional 5 min seguido mediante pipeteo suave. El tiempo total en la tripsina/colagenasa a 37 ° C no debe exceder 30 min (8 + 8 + 8 + 5 = 29). - Añadir 5 mL de medio RPE precalentado al tubo cónico de 15 mL que contiene las células digeridas. Girar a 200 x g durante 5 minutos recoger las células. Las células Resuspenda y semillas en platos de 35 mm prelacado en confluencia de 10 – 20% (por ejemplo, un 100% confluentes en una placa de 12 pozos a cinco platos de 35 mm para 10% confluencia).
Nota: En todo momento, evitar pipeteo vigoroso, que puede causar la muerte celular importante representada por restos de células oscuras aparente en el sobrenadante tras la centrifugación. Bien separados unicelular siembra es esencial para la grabación de abrazadera del remiendo. - Realizar el parche de células completas de la abrazadera como se describió anteriormente18,26,27,28,29,30,31. Adquirir los rastros actuales de una familia de potenciales de paso (-100 a + 100 mV de un potencial de explotación de 0 mV) (figura 5).
Nota: Las recetas de soluciones internas y externas se describen en la tabla 3 y tabla 4, respectivamente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El paso más difícil es el aislamiento manual, que tiene como objetivo conseguir una elevada pureza de una población de hPSC-RPE diferenciada P0 . Después de un aislamiento exitoso, > células del 90% de la población de0 P va creciendo y madurando para mostrar morfologías RPE de firma (figura 1). La existencia de una porción menor de RPE no o inmaduras células RPE en la población de0 P es casi inevitable, pero no interferirá con los experimentos posteriores como el número de células pigmentadas y con forma de guijarro hPSC-RPE es la abrumadora mayoría.
Con el enfoque de enfermedad en plato base hPSC-RPE, cada mutación de BEST1 específico para cada paciente puede ser comprensivo caracterizado en vivo para su expresión de la proteína (immunoblotting, figura 3), (tráfico de membrana immunostaining, figura 4) y la función de canal de iones (abrazadera del remiendo de celulares, figura 5). Estos resultados proporcionarán información crítica para dilucidar los mecanismos patológicos de las mutaciones del canal y para el desarrollo de la medicina personalizada.
Como BEST1 se expresa predominantemente en las células RPE, puede utilizarse como un marcador celular para la validación de un estado maduro de RPE. Cabe señalar que algunas mutaciones BEST1 afecte su expresión de la proteína, por lo que otros marcadores RPE bien establecidos como RPE65 y CRALBP todavía necesidad de ser evaluaron (figura 3).
Madura las células de RPE hPSC de P0 se pueden mantener durante 2-3 meses antes de partir (a P1) para la abrazadera del remiendo de célula entera. P0 células más de 3 meses no se recomiendan para la abrazadera del remiendo pero todavía pueden ser utilizadas para experimentos immunoblotting y el immunostaining.
Figura 1: células de RPE hPSC diferenciadas en distintas etapas. Imágenes representativas de racimos pigmentadas hPSC-RPE en placas en el primer aspecto (A), antes de aislamiento (B) y luego de un crecimiento a la madurez post aislamiento (C). Visión y 20 imágenes de contraste de fase X se muestran en los paneles superior e inferior, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: imagen representativa de la rasqueta de micro celda tiró de una pipeta Pasteur. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: validación de la condición RPE madura de distinguido hPSC-RPE células immunoblotting. Manchas blancas mostrando la expresión de marcadores de proteínas específicas de la RPE BEST1, RPE65 y CRALBP en WT hPSC y hPSC-RPE células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: inmunotinción de BEST1 en WT hPSC-RPEs. (A) imágenes representativas de inmunofluorescencia mostrando la localización de la membrana de WT BEST1 en células en forma de adoquines hPSC-RPE. (B) Immunostaining negativo control omitiendo el anticuerpo primario BEST1.
Figura 5: grabaciones de abrazadera de parche de células completas de hPSC RPEs. (A) A celular solo hPSC-RPE para abrazadera del remiendo de célula entera. (B) representante actuales huellas grabadas desde un BEST1 WT hPSC-RPE y una BEST1 mutaron hPSC-RPE en pico Ca2 +. El protocolo de voltaje utilizado para generar corrientes se muestra en la estufa. Barra de escala = 1 nA, 150 ms. véase tablas 3 y tabla 4 para parche detalles de preparación de la abrazadera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo de | Cantidad |
| DMEM Knock-Out (KO) | 500 mL |
| Reemplazo de suero KO | 15% (75 mL) |
| Aminoácidos no esenciales | 1% (5 mL) |
| Glutamina | 1% (5 mL) |
| Penicilina-estreptomicina | 1% (5 mL) |
| Nicotinamida | 10 mM |
| Humano activina-A * | 100 ng/mL |
| * Humanos activina-A es suplida durante días 15 – 28 del Protocolo de diferenciación. | |
Tabla 1: Medio de diferenciación de RPE.
| Reactivo de | Cantidad |
| MEM (modificación α) | 500 mL |
| Suero bovino fetal | 5% (25 mL) |
| Suplemento N1 | 1% (5 mL) |
| Glutamina-penicilina-estreptomicina | 1% (5 mL) |
| Aminoácidos no esenciales | 1% (5 mL) |
| Taurina | 125 mg |
| Hidrocortisona | 10 μg |
| Triyodotiroacético-thyronin | 0.0065 μg |
Tabla 2: Medio de cultivo de EPR.
| Reactivo de | Concentración |
| CsCl | 130 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| EGTA | 10 mM |
| Magnesio, ATP | 2 mM |
| HEPES (pH 7.4) | 10 mM |
| CaCl2* | Varía |
| Glucosa ** | ~ 5 m m |
| * Añadir CaCl2 para obtener la concentración deseada de Ca2 + | |
| ** El uso de glucosa para ajustar osmolaridad 290-295 mOsm/l | |
Tabla 3: Parche solución interna de la abrazadera.
| Reactivo de | Concentración |
| NaCl | 140 mM |
| KCl | 5 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| CaCl2 | 2 mM |
| HEPES (pH 7.4) | 10 mM |
| Glucosa * | ~ 5 m m |
| * Usar glucosa para ajustar osmolaridad 300-305 mOsm/l. | |
Tabla 4: Parche abrazadera solución externa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El procedimiento más importante para el abordaje de la enfermedad en plato es distinguir hPSCs con una mutación enfermedad-que causan que el linaje de la célula correcta, que es el RPE para BEST1. Así, después de cada experimento de diferenciación, las células RPE hPSC resultante deben ser cuidadosamente validadas para su estado maduro morfologías específicas de RPE y proteínas marcadores16,17,18. Para minimizar el artefacto clonal, múltiples hiPSC clones del mismo paciente o múltiples clones de células con la misma mutación puede usarse siempre que sea posible.
Líneas hiPSC y células pueden diferenciarse a RPE con el mismo protocolo. hiPSCs con o sin una mutación en el gen BEST1 puede ser reprogramado de fibroblastos de la piel de BEST1 pacientes o donantes sanos, respectivamente. hESCs BEST1 teniendo una mutación puede ser genéticamente modificados de la línea de células parentales, que tiene el tipo salvaje (WT) BEST1. Las rutas hiPSC RPE y células RPE tienen sus ventajas y desventajas. El primero es más específico para cada paciente y clínicamente relevantes, particularmente a la medicina personalizada. Sin embargo, cabe señalar que existen varias limitaciones para el abordaje de hiPSC RPE: 1) es logísticamente difícil acceder a un amplio espectro de muestras BEST1 , como siempre no se puede conceder donaciones de pacientes, y algunas mutaciones son muy rara en el primer lugar; 2) inespecífica fenotipos pueden resultar de diferentes orígenes genéticos y las condiciones físicas de los donantes; 3) el hiPSC eficiencia de RPE diferenciación varía para diferentes donantes, tal que algunos casos pueden ser difícil técnicamente obtener hiPSC RPEs. Por otro lado, el células RPE de la ruta, aunque más artificial, ofrece una plataforma versátil para generar células isogénicas-RPEs con mutaciones deseadas sobre la demanda de investigaciones funcionales imparcial.
Las células maduras de RPE son pigmentadas, poligonales y conectadas por uniones estrechas en una monocapa. Después de partir en una población de la célula para la abrazadera del remiendo, las células de RPE de hPSC recién conexión perderá la forma poligonal, pero conservan la pigmentación por varios días (figura 5A). Abrazadera del remiendo es realizado 24 – 72 h después de partir de la celda, tiempo durante el cual la pigmentación puedan utilizarse como un marcador visible al seleccionar celdas con buen estado RPE. Una celda suave split resultando en la mayoría de las células muy separadas sin muerte celular importante es clave para el éxito de la abrazadera del remiendo.
Varios otros protocolos de diferenciación utilizando medios de cultivo celulares diferentes y factores de crecimiento se han documentado en la literatura21,32. El tiempo necesario para la diferenciación de hPSC para RPE es similar en todos estos protocolos, incluido el nuestro, si bien es difícil saber si hay alguna diferencia significativa en la eficiencia de diferenciación sin una comparación lado a lado. Cabe señalar que en el protocolo actual, las células de RPE hPSC se cultivan en placas de fondo plano regular pero no en placas con insertos de membrana, por lo que el RPE hPSC generado por este procedimiento no puede mejor recapitular la polaridad de RPE células en vivo. Por lo tanto, las técnicas descritas son adecuadas sobre todo en un entorno de investigación33, aunque las células generadas hPSC-RPE pueden también cultivarse en placas Transwell en hojas de forma monocapa RPE para propósitos clínicos17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este proyecto fue financiado por subvenciones de NIH EY025290 y GM127652 de la Universidad de Rochester financiación de puesta en marcha.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
References
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease). Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Boon, C. J., et al. The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).
- Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. Functional roles of bestrophins in ocular epithelia. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).
- Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium. Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane. J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines. Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).
- Milenkovic, A., et al. Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).
- Moshfegh, Y., et al. BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE. Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. Elife. 6, (2017).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).
- Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), e0125631 (2015).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Idelson, M., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maruotti, J., et al. A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nat Commun. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Gong, J., et al. Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate. PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).
- Zhang, Y., et al. ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction. Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).
