Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para diferenciar as células do epitélio (RPE) pigmento da retina de células-tronco pluripotentes humanas mutações paciente-derivado de rolamento. As linhas de célula mutante podem ser utilizadas para análises funcionais, incluindo immunoblotting, imunofluorescência e braçadeira do remendo. Esta abordagem da doença-em-um-prato contorna a dificuldade de obtenção de células RPE humanas nativas.
Abstract
Apesar de mais de 200 mutações no gene humano BEST1 foram identificadas e ligadas a doenças degenerativas da retina, os mecanismos patológicos permanecem indescritíveis, principalmente devido à falta de um modelo de bom na vivo para o estudo BEST1 e suas mutações sob condições fisiológicas. BEST1 codifica um canal iônico, ou seja, BESTROPHIN1 (BEST1), que funciona no epithelium retinal do pigment (RPE); no entanto, a acessibilidade extremamente limitada para as células RPE humanas nativas representa um grande desafio para a investigação científica. Este protocolo descreve como gerar humanos RPEs rolamento BEST1 doença-causando mutações por induzida por diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Como hPSCs são auto renováveis, esta abordagem permite que os pesquisadores ter uma fonte constante de hPSC-RPEs para várias análises experimentais, como immunoblotting, imunofluorescência e braçadeira do remendo e, portanto, fornece um modelo de doença-em-um-prato muito poderoso para BEST1-associado a condições da retina. Notavelmente, esta estratégia pode ser aplicada para estudar a fisiologia RPE (patho) e outros genes de interesse expressado nativamente no RPE.
Introduction
Tem sido documentado pelo menos cinco doenças degenerativas da retina causadas por mutações genéticas no BEST1 gene1,2,3,4,5,6 , 7 , 8, com o número de mutações relatadas já mais de 200 e ainda crescente. Estes BEST1-doenças associadas, também conhecido como bestrophinopathies, causam perda de visão progressista e até mesmo cegueira, e há atualmente nenhum tratamento eficaz. O produto proteico de BEST1, nomeadamente BESTROPHIN1 (BEST1), é um Ca2 +-canal de Cl– ativado (CaCC) especificamente expressado no epithelium retinal do pigment (RPE) dos olhos5,6, 8,9. Importante, um fenótipo clínico de BEST1-doenças associadas é a reduzida resposta visual aos estímulos de luz, chamado de pico de luz (LP) medido no eletrooculograma10,11; LP é acreditado para ser mediada por um CaCC RPE12,13,14. Para melhor compreender os mecanismos patológicos de mutações BEST1 e trabalhar no sentido de terapias potenciais, é essencial estudar mutante BEST1 canais endogenamente expressados em células humanas de RPE.
No entanto, obter o RPE células diretamente de pacientes ao vivo é altamente impraticável. Embora as células RPE nativas podem ser colhidas de biópsias de cadáveres humanos e fetos, o difícil acesso a essas fontes limita significativamente a investigação científica. Portanto, é essencial dispor de fontes alternativas de RPE diferente de olhos humanos. Esta chamada foi atendida pelos recentes avanços nas técnicas de células-tronco, como as células RPE funcionais agora podem ser diferenciadas de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs), incluindo células-tronco embrionárias (hESCs) e induzida por células estaminais pluripotentes (hiPSCs), este último sendo gerada pela reprogramação de fibroblastos da pele primária de doadores16,17,18. Importante, a auto-renovação e pluripotência de hPSCs certifique-se de uma fonte confiável para gerar RPEs, enquanto a paciente-especificidade de hiPSCs e potencial de modificação do genoma de hESCs (por exemplo, por CRISPR) oferecem um modelo de doença-em-um-prato versátil para mutações de BEST1 desejadas.
hPSC-RPE tem várias vantagens sobre ratos modelos RPE: 1) ratos do KO BEST1 não exibem qualquer anormalidade da retina19, levantando a possibilidade de exigência genética diferente de BEST1 no RPE entre ratos e humanos; 2) apenas 3% de células humanas de RPE são binucleate, em contraste com 35% em ratos20; 3) hiPSC-RPE potencializa transplante autólogo na clínica tratamento de retina distúrbios21. No entanto, modelos animais são ainda indispensáveis para estudar RPE fisiologia e patologia em um sistema ao vivo, e o potencial oncogênica de hiPSC não pode ser esquecido.
O procedimento aqui descreve um hPSC moderadamente simples e útil para o protocolo de diferenciação RPE que pode ser usado para fins clínicos e de pesquisa. Este protocolo utiliza a nicotinamida (vitamina B3) para aumentar a diferenciação de hPSCs tecido neural, que mais é induzida a se diferenciar em RPE pelo tratamento com a União. Tratamento de nicotinamida foi mostrado para aumentar o número de células pigmentadas (sinal de diferenciação em RPE), possivelmente se atenuar a atividade apoptotic de diferenciar células22. As células resultantes do hPSC-RPE exibem a mesmas chaves marcadores, morfologia de paralelepípedos e funcionalidade celular como nativo humano RPE células22. Assim, em um ambiente de pesquisa, as células de RPE-hPSC resultante são adequadas para análises funcionais a jusante, incluindo immunoblotting, imunocoloração e braçadeira do remendo de célula inteira, para que procedimentos experimentais detalhados também são fornecidos. Clinicamente, as células RPE derivadas de células-tronco têm mostrado grande potencial para o tratamento de transplante de degeneração macular em estudos com animais e testes em humanos de23.
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Protocol
1. diferenciação do hPSC de RPE
- Manter e hPSCs de passagem como descrito anteriormente18.
Nota: Todas as células (incluindo hPSCs e hPSC-RPEs) são cultivadas em 37 ° C em 5% CO2 durante toda a duração dos protocolos de crescimento e diferenciação. -
Antes da diferenciação, dividi confluente hPSCs para placas de 6-poços revestidas.
- Para revestir as placas, descongelar matriz da membrana basal no gelo por cerca de 1h, suspender matriz liquefeita em meio DMEM de 4 ° C em um 01:50 diluição, adicione a mistura de revestimento 800 µ l de cada poço e incube pelo menos 1 h a 37 ° C.
- Quando o revestimento é completo, aspirar a mistura e imediatamente adicionar 1,5-2 mL de meio para os poços.
- Para levantar o hPSCs as cultura de placas de idade, incubar as células com PBS mais 0.5 mM EDTA durante 5 min à temperatura ambiente, aspirar a solução e ressuspender as células em pequenos grupos com meio de cultura.
- Células de semente a confluência de ~ 20% nas chapas de novo.
Nota: Armazenar a matriz da membrana basal em 100 alíquotas µ l a-20 ° C e use uma alíquota para revestir uma placa de 6. O tempo para o revestimento pode ser estendido até 4 h a 37 ° C, ou durante a noite em temperatura ambiente. É importante suspender e hPSCs de sementes como pequenos grupos de 3 – 5 células, em vez de células únicas.
- Quando as células são cultivadas para completa confluência, substituir o meio de cultura com o meio de diferenciação (4 mL/poço) (tabela 1, sem União-A). Cultura durante 14 dias, alterando o meio (4 mL/poço) 3x / semana.
Nota: O hPSC placa densidade dobra aproximadamente cada 24 h. morte celular significativo é esperado após o início do processo de diferenciação. Agregados de células mortas e os restos dos poços podem ser vistos a olho nu durante as mudanças de médio. - Do dia 15 ao dia 28, suplemento médio de diferenciação com 100 ng/mL humano União-A (tabela 1, com humanos União-A). Mudar o meio (4 mL/poço) 3x / semana.
- Pare de União-A suplementação, começando no dia 29 (tabela 1, sem humanos União-A). Continue a célula cultivo em meio de diferenciação por 8 – 10 semanas até aglomerados pigmentados hPSC-RPE aparecem (figura 1A-B).
Nota: Aglomerados de células pigmentadas podem ser vistos como pequenos pontos escuros em uma placa de cultura de células, a olho nu (figura 1A-B, superior). Células pigmentadas individuais com a forma de paralelepípedos de assinatura podem ser vistas sob um microscópio de X 20 (figura 1A-B, inferior).
2. isolamento e cultura de células diferenciadas RPE
- Remover o meio de diferenciação, lave uma vez com PBS, adicionar 1 mL de tripsina 0,05%, mais 1 U / µ l de colagenase em cada poço e incubar a 37 ° C por 20 a 30 min.. remover a tripsina/colagenase e delicadamente, adicione 2 mL do meio RPE pré-aquecido em cada poço da placa de 6-poços (< C0 > tabela 2).
Nota: Usar um microscópio invertido para monitorar a morfologia das células hPSC-RPE, que são poligonais antes do tratamento de tripsina/colagenase, e tornar-se rodada após digestão suficiente. -
Use um bico de Bunsen para puxar vidro pipetas Pasteur.
- Com as duas mãos, segure uma longa (9 polegadas) pipeta Pasteur em ambas as extremidades, por isso é horizontal e acima do bico de Bunsen cerca de 2/3 do comprimento da parte fina da pipeta.
- Uma vez que o vidro se torna macio da chama, rapidamente separe as duas extremidades, tal que uma dica de como raspador micro é formada no novo final da pipeta (Figura 2).
- Repeti várias vezes para criar vários raspadores "celular". Pulverizar as pipetas puxadas com etanol a 70% para a esterilização e secar ao ar livre do bairro de cultura de células.
-
Sob um microscópio, usar um micro "raspador de célula" para dissociar suavemente aglomerados pigmentados hPSC-RPE da placa.
- Bata levemente (não raspe) diretamente sobre as células pigmentadas, que flutuará acima no meio de cultura uma vez que eles se dissociam do fundo do poço.
- Imediatamente, use uma micropipeta de 20 µ l suavemente as células de RPE-hPSC dissociada de sucção e transferi-los para uma placa de 6 pré-revestida com RPE médio24.
- Colete ~ 5 x 103 células (~ 10% confluência como observado sob um microscópio X 20) em cada pré-revestido bem de uma placa de 12, repetindo as etapas 2.3.1–2.3.2 várias vezes, conforme necessário. Trazer o volume final do meio de 2 mL.
Nota: Para evitar hPSC-RPE dissociada células de flutuar afastado, não movimento das placas durante o processo de dissociação tal que as células dissociadas estão flutuando no meio, mas ainda permanecem localmente concentradas.
- Células de cultura o hPSC-RPE recentemente isolada (P0) em placas de 12-bem no meio de RPE por 6-8 semanas permitir-lhes formar uma monocamada pigmentada (Figura 1).
- Mudar o meio 3 x / semana. Quando se muda o meio, deixe cerca de 1/3 do volume do meio velho em cada poço e adicione 2/3 volume de meio RPE fresco, previamente aquecido. Nesta fase, usar 2 mL do meio RPE para cada poço em uma placa de 12 (assim, trocar 1,3 mL do meio de cada vez).
Nota: A monocamada de células de hPSC-RPE P0 pode formar cúpulas, sugerindo que as células são ativamente transportar fluidos e são ancoradas por junções apertadas25. Portanto, a formação de cúpula é um indicador de status RPE maduro.
3. RPE destino validação pelo Immunoblotting
- Fazer a célula hPSC-RPE lisado usando buffer de extração de proteínas de mamíferos suplementado com inibidor de proteinase cocktail. Incube o lisado celular no gelo por 30 minutos antes da centrifugação a 13.000 x g durante 15 min a 4 ° C, para descartar os restos da célula não dissolvidos. Medir a concentração de proteínas totais de lisado.
- Desnaturar 40 µ g da proteína total em tampão de amostra SDS Laemmli a 75 ° C por 10 min. separar a proteína amostras em um gel de SDS-PAGE de Tris-glicina 10% com uma tensão constante de 90 V por 15 min e então 150 V até os alcances de tintura da frente da parte inferior do gel.
- Transferência das proteínas para uma membrana de nitrocelulose em pre-cooled tampão Tris-glicina, suplementado com 10% de metanol a 100 V por 1h.
- Bloquear a membrana em solução salina tamponada de Tris com 0.1% de detergente não-iônico (TBST) e 5% sem gordura leite seco por 1h à temperatura ambiente.
- Incube a membrana com anticorpos primários diluídos no buffer de bloqueio a 4 ° C durante a noite. Diluir os anticorpos alvejando proteínas marcador específico de RPE da seguinte forma: RPE65, 1:1, 000; CRALBP, 1:1, 000; BEST1, 1:1, 000. Dilua o anticorpo contra β-actina no 1:10,000 para detectar β-actina como um controle de carregamento.
- Lave a membrana com TBST 3 vezes, com 5 min para cada lavagem.
- Incube a membrana com fluoróforo conjugado de cabra antido mouse IgG 1:10,000 de anticorpo secundário diluído em tampão de bloqueio por 1h à temperatura ambiente.
- Lave a membrana com TBST 4 vezes, com 10 min para cada lavagem.
- Detecta as proteínas usando um infravermelho de imagem de sistema (Figura 3).
4. verificação BEST1 localização Subcellular por imunocoloração
- Lave as células hPSC-RPE com 2 mL de PBS uma vez e corrigir em 2 mL de paraformaldeído 4% por 45 min à temperatura ambiente.
- Lave duas vezes com 2 mL de PBS e incube as celulas em 2 mL de PBS com 0,1% não iónico surfactante e 2% burro soro por 45 min bloquear os sites de ligação não-específica.
- Incube as células com anticorpos BEST1 (diluição de 1: 200) por 2 h à temperatura ambiente.
- Lave as células com 2 mL de PBS 3 vezes. Incube com fluoróforo Conjugado IgG secundário (1:1, 000) por 1h à temperatura ambiente.
- Lavar com 2 mL de PBS 3 vezes para remover o anticorpo secundário não acoplado.
- Observe células coradas pela microscopia confocal (Figura 4).
5. gravação de Ca2 +-dependente Cl– corrente no hPSC-RPE por células inteiras Patch Clamp
- 24-72 h antes da braçadeira do remendo, dividir um totalmente confluente bem (em uma placa de 12) de células maduras de hPSC-RPE de0 P (em forma de paralelepípedos e pigmentada). Aspirar o média, lave uma vez com PBS e adicione 1 mL de tripsina 0,05% mais 1 colagenase U / µ l para o poço.
Nota: Pré-aqueça a tripsina/colagenase a 37 ° C antes do uso. - Incube a 37 ° C durante 8 min.
Nota: Após esta etapa, as células de RPE-hPSC são ainda aderente e conectados. - Use uma micropipeta de 1 mL para lavar delicadamente as células no prato e transferir células na mistura de digestão para um tubo cônico de 15 mL. Lave-o bem com 1 mL de tripsina/colagenase pré-aquecido para coletar as células residuais e combiná-los para o tubo cônico de 15 mL.
Nota: As células de RPE-hPSC ainda estão em grandes aglomerações neste ponto. Não tente quebrar os aglomerados de células pipetando vigorosa. Alguns grupos podem aderir à parede interna da ponta de 1 mL. - Incube o tubo cônico em um banho seco de 37 ° C durante 8 min.
- Use uma micropipeta de 1ml a pipeta suavemente de altos e baixos da mistura de digestão 10-15 vezes.
Nota: Grupos de células tornam-se muito menores, mas ainda visível. Evite pipetagem vigorosa. - Repita as duas etapas anteriores.
Nota: A maioria das células deve ser em suspensão de célula única depois de pipetagem. Ainda pode haver alguns aglomerados de cela minúscula, que são aceitáveis. Opcional: Incube o tubo cônico a 37 ° C por um adicional 5 min, seguido de pipetagem suave. Na tripsina/colagenase a 37 ° C, o tempo total não deve exceder 30 min (8 + 8 + 8 + 5 = 29). - Adicione 5 mL de meio RPE previamente aquecido para o tubo cônico de 15 mL, contendo as células digeridas. Girar a 200 x g por 5 min coletar as células. Células re-suspender e sementes em pratos pré-revestida 35mm na confluência de 10 – 20% (por exemplo, 100% confluentes bem em uma placa de 12 para cinco pratos de 35mm para confluência de 10%).
Nota: Em todos os momentos, evite pipetagem vigoroso, que pode causar morte celular significativo como representado por restos de cela escura aparente no sobrenadante após a centrifugação. Semeadura de célula única bem separados é essencial para a gravação de braçadeira do remendo. - Execute o patch de células inteiras braçadeira conforme descrito anteriormente,18,26,,27,28,29,30,31. Adquirir o atuais vestígios de uma família de potenciais de passo (-100 a + 100 mV de um potencial de exploração de 0 mV) (Figura 5).
Nota: As receitas de soluções internas e externas são descritas na tabela 3 e tabela 4, respectivamente.
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Representative Results
O passo mais tecnicamente desafiador é o isolamento manual, que visa alcançar um grau de pureza elevado de uma população de hPSC-RPE0 P diferenciada. Depois de uma bem sucedida de isolamento, > células de 90% na população de0 P irão crescer e amadurecer para exibir as morfologias RPE de assinatura (Figura 1). A existência de uma pequena proporção de não-RPE ou células imaturas de RPE na população de0 P é quase inevitável, mas não irá interferir com os experimentos a jusante, enquanto o número de células pigmentadas e em forma de paralelepípedos hPSC-RPE é da esmagadora maioria.
Com a abordagem de doença-em-um-prato hPSC-RPE baseado, mutação de BEST1 cada paciente específico pode ser exaustivamente caracterizados na vivo para a expressão da proteína (immunoblotting, Figura 3), membrana de tráfico ( immunostaining, Figura 4) e a função de canais de íon (braçadeira do remendo de células inteiras, Figura 5). Estes resultados fornecerá informações críticas para elucidar os mecanismos patológicos das mutações canal e para o desenvolvimento de medicina personalizada.
Como BEST1 é predominantemente expressa em células RPE, ele pode ser usado como um marcador celular para a validação de um estatuto RPE maduro. Note-se que algumas mutações BEST1 podem afetar sua expressão de proteína, então outros marcadores RPE bem estabelecidos como o RPE65 e CRALBP ainda precisam ser avaliaram (Figura 3).
Células de hPSC-RPE amadurecidas P0 podem ser mantidas por 2-3 meses antes de dividir (a P1) para braçadeira do remendo de células inteiras. P0 células mais de 3 meses não são recomendadas para braçadeira do remendo, mas ainda podem ser usadas para experiências immunoblotting e imunocoloração.
Figura 1: células de hPSC-RPE diferenciadas em diferentes fases. Imagens representativas de clusters hPSC-RPE pigmentadas em placas de cultura com primeira aparição (A), antes de isolamento (B) e após crescimento à maturidade post isolamento (C). Visão e 20 imagens de contraste de fase X são mostradas nos painéis superior e inferior, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: imagem representativa do raspador da célula micro puxou de uma pipeta Pasteur. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: validação do estatuto RPE maduro do hPSC-RPE diferenciada células por immunoblotting. Borrões mostrando a expressão dos marcadores de proteínas específicas RPE BEST1, RPE65 e CRALBP em células de hPSC e hPSC-RPE WT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: imunocoloração de BEST1 em WT hPSC-RPEs. (A) representante imunofluorescência imagens mostrando a localização da membrana do WT BEST1 nas células em forma de paralelepípedos hPSC-RPE. (B) Immunostaining controle omitindo o anticorpo primário BEST1 de negativo.
Figura 5: gravações de braçadeira de remendo de células inteiras de hPSC-RPEs. (A), A célula de único hPSC-RPE para braçadeira do remendo de células inteiras. (B) representante atuais traços gravados a partir de um hPSC BEST1 WT-RPE e um BEST1 mutado hPSC-RPE no pico de Ca2 +. O protocolo de tensão usado para eliciar correntes é mostrado a inserção. Barra de escala = 1 nd, 150 ms. ver quadros 3 e 4 da tabela patch para fixar detalhes de preparação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reagente | Quantidade |
| DMEM nocaute (KO) | 500 mL |
| KO soro substituição | 15% (75 mL) |
| Aminoácidos não essenciais | 1% (5 mL) |
| Glutamina | 1% (5 mL) |
| Penicilina-estreptomicina | 1% (5 mL) |
| Nicotinamida | 10 mM |
| União humana-A * | 100 ng/mL |
| * União-A humana é complementada durante dias 15 – 28 do protocolo de diferenciação. | |
Tabela 1: Médias de diferenciação de RPE.
| Reagente | Quantidade |
| MEM (modificação de α) | 500 mL |
| Soro fetal bovino | 5% (25 mL) |
| Suplemento de N1 | 1% (5 mL) |
| Glutamina-penicilina-estreptomicina | 1% (5 mL) |
| Aminoácidos não essenciais | 1% (5 mL) |
| Taurina | 125 mg |
| Hidrocortisona | 10 µ g |
| Triiodo-thyronin | 0.0065 µ g |
Tabela 2: Meio de cultura RPE.
| Reagente | Concentração |
| CsCl | 130 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| EGTA | 10 mM |
| Magnésio ATP | 2 mM |
| HEPES (pH 7,4) | 10 mM |
| CaCl2* | Varia |
| Glicose * * | ~ 5mm |
| * Adicionar CaCl2 para obter a concentração de Ca2 + desejada | |
| * * Use glicose para ajustar a osmolaridade para 290-295 mOsm/L | |
Tabela 3: Patch Clamp solução interna.
| Reagente | Concentração |
| NaCl | 140 mM |
| KCl | 5 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| CaCl2 | 2 mM |
| HEPES (pH 7,4) | 10 mM |
| Glicose * | ~ 5mm |
| * Utilizar glicose para regular a osmolaridade para 305 – 300 mOsm/L. | |
Tabela 4: Patch Clamp solução externa.
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Discussion
O procedimento mais importante para a abordagem da doença-em-um-prato é para diferenciar o hPSCs com uma doença-causando mutação de linhagem celular correto, que é o RPE para BEST1. Assim, após cada experiência de diferenciação, as células de RPE-hPSC resultante devem ser cuidadosamente validadas para seu estado maduro por morfologias RPE específicos e marcadores de proteína a16,17,18. Para minimizar o artefato clonal, vários clones de hiPSC do mesmo paciente ou vários clones de hESC com a mesma mutação devem ser usados sempre que possível.
Ambos hiPSC e hESC linhas podem ser diferenciadas de RPE com o mesmo protocolo. hiPSCs com ou sem uma mutação no gene BEST1 podem ser reprogramadas de fibroblastos da pele de pacientes BEST1 ou doadores saudáveis, respectivamente. hESCs tendo uma mutação em BEST1 pode ser geneticamente da linha parental hESC, que tem o tipo selvagem (WT) BEST1. As rotas hiPSC-RPE e hESC-RPE tem suas próprias vantagens e desvantagens. O primeiro é mais paciente específico e clinicamente relevantes, particularmente para a medicina personalizada. No entanto, é interessante notar que existem várias limitações para a abordagem hiPSC-RPE: 1) é logisticamente difíceis de acessar um espectro completo de BEST1 as amostras dos pacientes, como doações de pacientes sempre não podem ser concedidas, e algumas mutações são muito raro em primeiro lugar; 2) não-específica fenótipos podem resultar de diferentes origens genéticas e condições físicas dos doadores; 3) o hiPSC a eficiência de diferenciação RPE varia para diferentes doadores, tal que alguns casos podem ser tecnicamente desafiador para obter hiPSC-RPEs. Por outro lado, a hESC-RPE rota, embora mais artificial, oferece uma plataforma versátil para gerar isogénicas hESC-RPEs com mutações desejadas sob demanda para investigações funcionais não-tendencioso.
Células maduras RPE são conectadas por junções apertadas em um monolayer pigmentadas e poligonal. Após a divisão em uma população de célula única para braçadeira do remendo, as células recém propagado novamente hPSC-RPE perderá a forma poligonal, mas ainda retêm pigmentação por vários dias (Figura 5A). Braçadeira do remendo é realizada 24-72 h após a divisão celular, durante o qual a pigmentação ainda pode ser usada como um marcador visível para selecionar células com bom estado RPE. Uma célula gentil dividir resultando em a maioria de células únicas bem separadas, sem morte celular significativa é chave para o sucesso da braçadeira do remendo.
Vários outros protocolos de diferenciação usando meios de cultura de células diferentes e fatores de crescimento foram documentados na literatura21,32. O tempo necessário para a diferenciação do hPSC de RPE é semelhante em todos esses protocolos, incluindo a nossa, embora seja difícil dizer se há alguma diferença significativa da eficiência de diferenciação sem uma comparação lado-a-lado. Note que, no actual protocolo, células hPSC-RPE são cultivadas em placas de fundo plano regular mas não em placas com inserções de membrana, então o hPSC-RPE gerado por esse procedimento não pode melhor recapitular a polaridade do RPE células na vivo. Portanto, as técnicas descritas acima são adequadas principalmente em um cenário de pesquisa33, embora as células de RPE-hPSC gerado também podem ser cultivadas em placas de Transwell para folhas RPE formulário monocamada para fins clínicos17.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este projecto foi financiado pelo NIH subsídios EY025290, GM127652 e da Universidade de Rochester financiamento de start-up.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
References
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