Summary
Her præsenterer vi en protokol for at differentiere retinale pigment epitel (ÅV) celler fra humane pluripotente stamceller forsynet med patienten-afledte mutationer. De mutante cellelinjer kan anvendes til funktionelle analyser herunder immunoblotting, immunofluorescens og patch klemme. Denne sygdom i parabol fremgangsmåde omgår vanskeligheden ved at opnå indfødte ÅV menneskeceller.
Abstract
Selv om over 200 genetiske mutationer i det menneskelige gen, BEST1 er blevet identificeret og knyttet til retinal degenerative sygdomme, fortsat de patologiske mekanismer undvigende hovedsagelig på grund af manglen på en god i vivo model til at studere BEST1 og dens mutationer fysiologiske betingelser. BEST1 koder en ion-kanal, nemlig BESTROPHIN1 (BEST1), som fungerer i retinale pigment epitel (ÅV); imidlertid udgør meget begrænset adgang til native ÅV menneskeceller en stor udfordring for videnskabelig forskning. Denne protokol beskriver hvordan man kan generere menneskelige RPEs forsynet med BEST1 sygdomsforårsagende mutationer af inducerede differentiering fra humane pluripotente stamceller (hPSCs). Som hPSCs er selvstændige vedvarende, denne fremgangsmåde gør det muligt for forskere at have en konstant kilde til hPSC-RPEs for forskellige eksperimentelle analyser, såsom immunoblotting, immunofluorescens og patch clamp, og dermed giver en meget kraftfuld sygdom i skål model for BEST1-forbundet retinal betingelser. Denne strategi kan især anvendes til at studere ÅV (patho) fysiologi og andre gener af interesse indbygget udtrykt i ÅV.
Introduction
Det er blevet dokumenteret at mindst fem retinal degenerative sygdomme er forårsaget af genetiske mutationer i BEST1 genet1,2,3,4,5,6 , 7 , 8, med antallet af rapporterede mutationer allerede over 200 og stadig stigende. Disse BEST1-associerede sygdomme, også kendt som bestrophinopathies, forårsage progressiv synstab og endda blindhed, og der er i øjeblikket ingen effektive behandlinger. Protein produkt af BEST1, nemlig BESTROPHIN1 (BEST1), er en Ca2 +-aktiverede Cl- kanal (CaCC) specifikt kommer til udtryk i den retinale pigment epitel (ÅV) øjne5,6, 8,9. Vigtigere er, en klinisk Fænotypen af BEST1-associerede sygdomme er den reducerede visuelle reaktion på lys stimuli, kaldet light peak (LP) målt i electrooculogram10,11; LP menes at være medieret af en CaCC ÅV12,13,14. For at bedre forstå de patologiske mekanismer af BEST1 mutationer og arbejde hen imod potentielle terapier er det vigtigt at studere mutant BEST1 kanaler endogent udtrykt i ÅV menneskeceller.
Men, at opnå ÅV celler direkte fra live patienter er meget upraktisk. Selvom indfødte ÅV celler kan høstes fra biopsier af menneskelige kadavere og fostre, begrænser vanskelig adgang til disse kilder væsentligt videnskabelig forskning. Derfor er det afgørende at have alternative ÅV kilder end menneskers øjne. Dette opkald er blevet besvaret af de seneste fremskridt i stamceller teknikker, som funktionelle ÅV celler kan nu differentieres fra humane pluripotente stamceller (hPSCs), herunder embryonale stamceller (hESCs) og induceret pluripotente stamceller (hiPSCs), sidstnævnte der genereres af omprogrammering primære hud fibroblaster fra donorer16,17,18. Vigtigere, sikrer selvfornyelse og pluripotency af hPSCs en pålidelig kilde for at generere RPEs, mens patienten-specificiteten af hiPSCs og genomisk ændring potentiale af hESCs (f.eks.af CRISPR) tilbyder en alsidig sygdom i skål model for ønskede BEST1 mutationer.
hPSC-RPE har flere fordele sammenlignet med mus ÅV modeller: 1) BEST1 knockout mus ikke vise nogen retinal abnormitet19, at øge muligheden for forskellige genetiske kravet om BEST1 i ÅV mellem mus og mennesker; 2) kun 3% af ÅV menneskeceller er binucleate, i modsætning til 35% i mus20; 3) hiPSC-RPE potentiates autolog transplantation i klinisk behandling af retinal lidelser21. Ikke desto mindre dyremodeller er stadig nødvendig for at studere ÅV fysiologi og patologi i et levende system, og det muterede potentiale i hiPSC ikke blive overset.
Proceduren her beskriver en nyttig og moderat enkle hPSC til ÅV differentiering protokol, der kan bruges til forskning og kliniske formål. Denne protokol bruger nicotinamid (vitamin B3) til at forøge differentiering af hPSCs til neurale væv, som yderligere er foranlediget til at differentiere i ÅV ved behandling med activin-A. Nicotinamid behandling har vist sig at øge antallet af pigmenterede celler (et tegn på differentiering af ÅV), muligvis af formildende apoptotiske aktivitet at skelne celler22. De resulterende hPSC-RPE celler vise samme nøgle markører, brostensbelagte morfologi og cellulære funktioner som indfødte menneskelige ÅV celler22. Således i forskning omgivelser er de resulterende hPSC-RPE celler egnet til downstream funktionelle analyser herunder immunoblotting, immunfarvning og hele-celle patch clamp, som detaljeret eksperimentelle procedurer er også til rådighed. Klinisk, har ÅV celler fremstillet af stamceller vist stort potentiale for transplantation behandling af makuladegeneration i både dyreforsøg og human forsøg23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. differentiering af hPSC til ÅV
- Vedligeholde og passage hPSCs som tidligere beskrevet18.
Bemærk: Alle celler (herunder hPSCs og hPSC-RPEs) er vokset i 37 ° C i 5% CO2 i hele varigheden af protokollerne vækst og differentiering. -
Forud for differentiering, opdele sammenflydende hPSCs til præ-coatede 6-godt plader.
- Coat plader, tø basalmembranen matrix på isen for ca 1 h, suspendere liquidized matrix i 4 ° C DMEM medium på en 1:50 fortynding, tilføje 800 µL belægning blanding til hver brønd og Inkuber i mindst 1 time ved 37 ° C.
- Når belægningen er komplet, Aspirér blandingen og straks tilføje 1,5-2 mL medium i brøndene.
- For at hæve hPSCs fra de gamle kultur plader, inkuberes celler med PBS plus 0,5 mM EDTA i 5 min ved stuetemperatur, Opsug løsningen og resuspend celler i små klumper med næringssubstratet.
- Frø celler på ~ 20% confluency i de nye plader.
Bemærk: Opbevar basalmembranen matrix i 100 µL alikvoter ved-20 ° C og bruge en alikvot for at belægge en 6-godt plade. Tid til belægning kan udvides op til 4 timer ved 37 ° C, eller natten over ved stuetemperatur. Det er vigtigt at suspendere og frø hPSCs som små klumper af 3 – 5 celler i stedet for enkelte celler.
- Når celler er vokset til fuld confluency, erstatte næringssubstratet med differentiering medium (4 mL/hul) (tabel 1, uden activin-A). Kultur for 14 dage, skiftende medium (4 mL/hul) 3 x / uge.
Bemærk: HPSC plade tæthed fordobler ca hver 24 h. betydelig celledød forventes efter indledningen af proceduren differentiering. Aggregater af døde celler og snavs i brøndene kan ses med det blotte øje under medium ændringer. - Fra dag 15 til dag 28, supplere differentiering medium med 100 ng/mL menneskelige activin-A (tabel 1, med menneskelige activin-A). Ændre medium (4 mL/hul) 3 x / uge.
- Stop activin-A tilskud starter på dag 29 (tabel 1, uden menneskelige activin-A). Fortsætte, celle dyrkning i differentiering medium for 8-10 uger indtil pigmenteret hPSC-RPE klynger vises (figur 1A-B).
Bemærk: Klynger af pigmenterede celler kan ses som små mørke prikker på en celle kultur plade med det blotte øje (figur 1A-B, top). Enkelte pigmenteret celler med signatur brostensbelagte form kan ses under en 20 X mikroskop (figur 1A-B, nederst).
2. isolering og kultur af differentierede ÅV celler
- Fjerne differentiering medium, vaske en gang med PBS, tilsættes 1 mL 0,05% trypsin plus 1 U/µL af collagenase i hver brønd, og der inkuberes ved 37 ° C i 20-30 min. Fjern trypsin/collagenase og forsigtigt tilsættes 2 mL pre varmede ÅV medium til hver brønd af 6-godt plade (< C0 > tabel 2).
Bemærk: Brug en inverteret mikroskop til at overvåge morfologi af hPSC-RPE celler, som er polygonal før trypsin/collagenase behandling, og blive runde efter tilstrækkelig fordøjelsen. -
Bruge en bunsenbrænder til pull glas Pasteur pipetter.
- Med begge hænder, hold en lang (9 tommer) Pasteur pipette i begge ender, så det er vandret, og ovenfor bunsenbrænder omkring 2/3 ned på længden af den tynde del af en pipette.
- Når glasset bliver bløde fra flammen, hurtigt trække de to ender fra hinanden, sådan at en mikro skraber-lignende spids er dannet nye ultimo pipette (figur 2).
- Gentag flere gange til at oprette flere "cell skrabere". Spray det trak pipetter med 70% ethanol til sterilisation og lufttørre dem i celle kultur hætte.
-
Under et mikroskop, bruge en mikro "celle skraber" at forsigtigt adskille pigmenteret hPSC-RPE klynger fra pladen.
- Forsigtigt trykke (ikke skrabe) direkte på de pigmenterede celler, der vil flyde op i dyrkningsmediet når de tage afstand fra bunden af brønden.
- Umiddelbart bruge en 20 µL mikropipette til forsigtigt suge de dissocierede hPSC-RPE celler og overføre dem til en præ-coatede 6-godt plade med ÅV medium24.
- Indsamle ~ 5 x 103 celler (~ 10% confluency som observeret under 20 X mikroskop) i hver overfladebelagt godt af en 12-godt pladen ved at gentage trin 2.3.1–2.3.2 flere gange, efter behov. Bringe den endelige mængden af medium til 2 mL.
Bemærk: For at forhindre dissocierede hPSC-RPE celler fra flydende væk, undgå bevægelser af pladerne under dissociation processen sådan, at de dissocierede celler er flydende i medium men stadig forblive lokalt koncentrerede.
- Kultur de nyligt isolerede hPSC-RPE celler (P0) på 12-godt plader i ÅV medium for en anden 6-8 uger at tillade dem at danne en pigmenteret éncellelag (figur 1 c).
- Ændre medium 3 x / uge. Når du ændrer mediet, forlader ca 1/3 volumen af den gamle medium i hver brønd, og tilføje 2/3 volumen af friske, pre varmede ÅV medium. På dette stadium, bruge 2 mL af ÅV medium til hver brønd i en 12-godt plade (således udveksle 1,3 mL medium hver gang).
Bemærk: Éncellelag P0 hPSC-RPE celler kan danne kupler, tyder på, at cellerne aktivt transport af væsker, og er forankret ved stramme kryds25. Dome dannelse er derfor en indikator for modne ÅV status.
3. ÅV skæbne validering af Immunoblotting
- Gøre cellen hPSC-RPE lysate ved hjælp af protein af pattedyr ekstraktionsbuffer suppleret med proteinase hæmmer cocktail. Der inkuberes i isbad i 30 min inden centrifugering ved 13.000 x g i 15 min. ved 4 ° C kassere uopløst celle debris cellen lysate. Måle den samlede proteinkoncentration af lysate.
- Denaturere 40 µg af total protein i Laemmli SDS prøvebuffer ved 75 ° C til 10 min. adskille protein prøver på en 10% Tris-glycin SDS-PAGE gel ved en konstant spænding på 90 V for 15 min og derefter 150 V indtil den hårfarve forreste når bunden af gelen.
- Overføre proteiner på en nitrocellulose membran i pre afkølede Tris-glycin buffer suppleret med 10% methanol på 100 V til 1 h.
- Blokere membran i Tris bufferet saltvand med 0,1% nonionisk detergent (TBST) og 5% fedtfrit tørt mælk i 1 time ved stuetemperatur.
- Inkuber membranen med primære antistoffer fortyndet i den blokerende buffer ved 4 ° C natten over. Fortynd antistoffer rettet mod ÅV specifikke markør proteiner som følger: RPE65, 1:1, 000; CRALBP, 1:1, 000; BEST1, 1:1, 000. Fortynd antistof mod β-actin på 1:10,000 at opdage β-actin som lastning kontrol.
- Vask membran med TBST 3 gange, med 5 min til hver vask.
- Inkuber membran med fluorophore konjugeret gede anti-mus IgG sekundær antistof fortyndet 1:10,000 i blokerende buffer i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask membran med TBST 4 gange, med 10 min for hver vask.
- Opdage proteiner ved hjælp af en infrarød imaging system (figur 3).
4. kontrol BEST1 subcellulært lokalisering af immunfarvning
- Vask hPSC-RPE celler med 2 mL PBS én gang og lave i 2 mL 4% PARAFORMALDEHYD for 45 min ved stuetemperatur.
- Vask med 2 mL PBS to gange, og Inkuber celler i 2 mL PBS med 0,1% nonioniske overfladeaktive stoffer og 2% æsel serum for 45 min til at blokere de uspecifikke bindingssteder.
- Inkuber celler med BEST1 antistof (1:200 fortynding) i 2 timer ved stuetemperatur.
- Cellerne vaskes med 2 mL PBS 3 gange. Der inkuberes med fluorophore konjugeret sekundære IgG (1:1, 000) i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask med 2 mL PBS 3 gange for at fjerne ubundne sekundær antistof.
- Observere farvede celler af Konfokal mikroskopi (figur 4).
5. optagelse Ca2 +-afhængige Cl- løbende i hPSC-RPE af hele-celle Patch klemme
- 24-72 timer før patch klemmen, split en fuldt sammenflydende godt (på et 12-godt plade) af modne P0 hPSC-RPE celler (brostensbelagte-formet og pigmenteret). Opsug den medium, vask en gang med PBS, og der tilsættes 1 mL 0,05% trypsin plus 1 U/µL collagenase i brønden.
Bemærk: Varm pre trypsin/collagenase til 37 ° C lige før brug. - Der inkuberes ved 37 ° C i 8 min.
Bemærk: Efter dette trin, hPSC-RPE celler er stadig tilhænger og tilsluttet. - Bruge en 1 mL mikropipette forsigtigt vaske cellerne fra pladen, og Overfør celler i fordøjelsen blandingen til en 15 mL konisk slange. Vaske godt med 1 mL af pre varmede trypsin/collagenase at indsamle de resterende celler og kombinere dem til 15 mL konisk tube.
Bemærk: HPSC-RPE celler er stadig i store klumper på dette punkt. Forsøg ikke at bryde celle klumper af energisk pipettering. Nogle klumper kan holde sig til den indre væg af 1 mL tip. - Inkuber den koniske rør i et 37 ° C tør bad for 8 min.
- Bruge en 1 mL mikropipette til forsigtigt pipette up-and-down 10 – 15 gange fordøjelsen mix.
Bemærk: Celle klumper bliver langt mindre men stadig synlige. Undgå kraftig pipettering. - Gentag de forrige to trin.
Bemærk: De fleste af cellerne skal være i én celle suspension efter pipettering. Der kan stadig være nogle bittesmå celle klumper, der er acceptable. Valgfrit: Ruger den koniske rør ved 37 ° C i en yderligere 5 min. efterfulgt af blid pipettering. Den samlede tid i trypsin/collagenase ved 37 ° C må ikke overstige 30 min (8 + 8 + 8 + 5 = 29). - Tilsættes 5 mL af pre varmede ÅV medium til 15 mL konisk røret med de nedbrudte celler. Spin på 200 x g i 5 min. til at indsamle cellerne. Genopslæmmes og frø celler på forhånd belagte 35 mm retter på 10 – 20% confluency (fx, en 100% sammenflydende godt på en 12-godt plade til fem 35 mm retter for 10% confluency).
Bemærk: På alle tidspunkter, undgå kraftig pipettering, som kan forårsage betydelig celledød, som repræsenteres af tilsyneladende mørke celle debris i supernatanten efter centrifugering. Vel adskilte encellede såning er afgørende for patch klemme optagelse. - Udføre hele-cell-patch klemme som tidligere beskrevet18,26,27,28,29,30,31. Erhverve aktuelle spor fra en familie af trin potentialer (-100 til + 100 mV fra en bedrift potentiale af 0 mV) (figur 5).
Bemærk: Opskrifter på interne og eksterne løsninger er beskrevet i tabel 3 og tabel 4, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den teknisk mest udfordrende skridt er den manuelle isolation, som sigter mod at opnå en høj renhed af en differentieret P0 hPSC-RPE befolkning. Efter en vellykket isolation, > 90% celler i P0 befolkning vil vokse og modnes til at vise signatur ÅV morfologier (figur 1 c). Eksistensen af en mindre del af ikke-ÅV eller umodne ÅV celler i P0 befolkning er næsten uundgåeligt, men vil ikke forstyrre de downstream eksperimenter, så længe antallet af pigmenterede og brosten-formet hPSC-RPE celler er den overvældende flertal.
Med hPSC-RPE baseret sygdom i parabol holdning, kan hver patient-specifikke BEST1 mutation være grundigt karakteriseret i vivo for sit protein udtryk (immunoblotting, figur 3), menneskehandel () membran immunfarvning, figur 4), og ion-kanal funktion (hele-celle patch clamp, figur 5). Disse resultater vil give vigtige oplysninger for belyse de patologiske mekanismer af kanal mutationer, og udvikle personlig medicin.
Som BEST1 er overvejende udtrykt i ÅV celler, kan det bruges som en cellulær markør for validering af en moden ÅV status. Det skal bemærkes, at nogle BEST1 mutationer kan påvirke sit protein udtryk, så andre veletablerede ÅV markører som RPE65 og CRALBP stadig behov for at blive evalueret (figur 3).
Modnet P0 hPSC-RPE celler kan opretholdes i 2-3 måneder før opdeling (til P1) for hele-celle patch klemme. P0 celler ældre end 3 måneder anbefales ikke til patch klemme men kan stadig bruges til immunoblotting og immunfarvning eksperimenter.
Figur 1: differentierede hPSC-RPE celler på forskellige stadier. Repræsentative billeder af pigmenteret hPSC-RPE klynger i kultur plader på første optræden (A), før isolation (B), og efter en stigning til udløb post isolation (C). Eye-view og 20 X fase kontrast billeder er vist i prima og nederst bedømmelseskomite, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentativt billede af mikro celle skraber trukket fra Pasteur pipette. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: validering af modne ÅV status for differentierede hPSC-RPE celler ved immunoblotting. Blotting viser udtryk af ÅV-specifikke protein markører BEST1, RPE65 og CRALBP i WT hPSC og hPSC-RPE celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: immunfarvning af BEST1 i WT hPSC-RPEs. (A) repræsentative immunfluorescent billeder viser membran lokaliseringen af WT BEST1 i brosten-formet hPSC-RPE celler. (B) immunfarvning negativ kontrol udelade BEST1 primære antistof.
Figur 5: hele-celle patch klemme optagelser af hPSC-RPEs. (A) A single hPSC-RPE celle for hele-celle patch klemme. (B) repræsentative aktuelle spor optaget fra en BEST1 WT hPSC-RPE og en BEST1 muteret hPSC-RPE på peak Ca2 +. Spænding protokollen bruges til at fremkalde strømme er vist i indsatsen. Skalalinjen = 1 nA, 150 ms. Se tabel 3 og tabel 4 for patch klemme forberedelse detaljer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagens | Beløb |
| Knock-Out (KO) DMEM | 500 mL |
| KO serum udskiftning | 15% (75 mL) |
| Uvæsentlige aminosyrer | 1% (5 mL) |
| Glutamin | 1% (5 mL) |
| Penicillin-streptomycin | 1% (5 mL) |
| Nicotinamid | 10 mM |
| Menneskelige activin-A * | 100 ng/mL |
| * Human activin-A er suppleret under dage 15-28 af differentiering protokol. | |
Tabel 1: ÅV differentiering Medium.
| Reagens | Beløb |
| MEM (α ændring) | 500 mL |
| Føtal bovint Serum | 5% (25 mL) |
| N1 supplement | 1% (5 mL) |
| Glutamin-penicillin-streptomycin | 1% (5 mL) |
| Uvæsentlige aminosyrer | 1% (5 mL) |
| Taurin | 125 mg |
| Hydrocortison | 10 µg |
| Triiodo-thyronin | 0.0065 µg |
Tabel 2: ÅV næringssubstratet.
| Reagens | Koncentration |
| CsCl | 130 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| EGTA | 10 mM |
| Magnesium ATP | 2 mM |
| HEPES (pH 7,4) | 10 mM |
| CaCl2* | Varierer |
| Glukose ** | ~ 5 mM |
| * Tilføje CaCl2 for at opnå ønskede Ca2 + koncentration | |
| ** Brug glukose til at justere osmolaritet til 290-295 mOsm/L | |
Tabel 3: Patch klemme intern løsning.
| Reagens | Koncentration |
| NaCl | 140 mM |
| KCl | 5 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| CaCl2 | 2 mM |
| HEPES (pH 7,4) | 10 mM |
| Glukose * | ~ 5 mM |
| * Bruge glukose til at justere osmolaritet til 300-305 mOsm/L. | |
Tabel 4: Patch klemme eksterne løsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den vigtigste procedure til sygdom i parabol tilgang er at skelne hPSCs med en sygdomsfremkaldende mutation til den korrekte celle afstamning, som er ÅV for BEST1. Således, efter hver differentiering eksperiment, de deraf følgende hPSC-RPE celler skal omhyggeligt valideres for deres modne status af ÅV-specifikke morfologier og protein markører16,17,18. For at minimere klonede artefakt, bør flere hiPSC kloner fra den samme patient eller flere menneskelige stamceller kloner med den samme mutation anvendes når det er muligt.
Både hiPSC og menneskelige stamceller kan differentieres til ÅV med samme protokol. hiPSCs med eller uden en mutation i BEST1 -genet kan omprogrammeres fra huden fibroblaster af BEST1 patienter eller raske donorer, henholdsvis. hESCs forsynet med en mutation i BEST1 kan være genetisk manipuleret fra linjen forældrenes menneskelige stamceller, som har wild-type (WT) BEST1. HiPSC-RPE og menneskelige stamceller-ÅV ruterne har deres egne fordele og ulemper. Førstnævnte er mere patient-specifikke og klinisk relevant, især for personlig medicin. Det er dog værd at bemærke, at der er flere begrænsninger for hiPSC-RPE tilgang: 1) det er logistisk vanskeligt at få adgang til et fuldt spektrum af BEST1 patient prøver, donationer fra patienter ikke altid kan opfyldes, og nogle mutationer er meget sjælden i første omgang; 2) ikke-specifikke fænotyper kan skyldes forskellige genetiske baggrunde og fysiske forhold af donorer; 3) hiPSC til ÅV differentiering effektivitet varierer for forskellige donorer, således at nogle sager kan være en teknisk udfordring for at opnå hiPSC-RPEs. På den anden side den menneskelige stamceller-ÅV rute, selv om mere kunstig, tilbyder en alsidig platform for at generere isogene menneskelige stamceller-RPEs med ønskede mutationer på efterspørgsel efter ikke-partisk funktionelle undersøgelser.
Modne ÅV celler er pigmenteret, polygonale og forbundet med stramme vejkryds i en éncellelag. Efter opdeling i en enkelt celle population for patch clamp, vil frisk tilsås hPSC-RPE celler miste den polygonal form, men stadig bevare pigmentering i flere dage (figur 5A). Patch klemme er udført 24-72 h efter celle opdeling, i hvilket tidsrum pigmentering kan stadig bruges som en synlig markør til at markere celler med god ÅV status. En blid celle opdelt, hvilket resulterer i et flertal af godt adskilt enkelt celler uden betydelig celledød er nøglen til succes for patch klemmen.
Flere andre differentiering protokoller ved hjælp af forskellige celle dyrkningsmedier og vækstfaktorer er blevet dokumenteret i litteraturen21,32. Den nødvendige tid til differentiering af hPSC til ÅV er ens i alle disse protokoller, herunder vores, mens det er svært at fortælle, hvis der er nogen signifikant forskel i differentiering effektivitet uden en side-by-side sammenligning. Det skal bemærkes, at i den nuværende protokol, hPSC-RPE celler dyrkes i regelmæssig flad bundplade, men ikke på plader med membran skær, så hPSC-RPE genereret af denne procedure ikke kan bedst sammenfatte polariteten af ÅV celler i vivo. Derfor, de teknikker, der er beskrevet ovenfor er for det meste egnet i en forskning indstilling33, selvom de genererede hPSC-RPE celler kan også dyrkes i Transwell plader til form éncellelag ÅV plader til kliniske formål17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette projekt blev finansieret af NIH tilskud EY025290, GM127652 og University of Rochester start-up finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
References
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease). Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Boon, C. J., et al. The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).
- Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. Functional roles of bestrophins in ocular epithelia. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).
- Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium. Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane. J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines. Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).
- Milenkovic, A., et al. Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).
- Moshfegh, Y., et al. BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE. Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. Elife. 6, (2017).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).
- Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), e0125631 (2015).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Idelson, M., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maruotti, J., et al. A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nat Commun. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Gong, J., et al. Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate. PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).
- Zhang, Y., et al. ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction. Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).
