Summary
여기 선물이 베어링 환자 파생 된 돌연변이 인간 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 (RPE) 세포를 분화 하는 프로토콜. 돌연변이 세포 라인 immunoblotting, 면역 형광 검사, 패치 클램프 등 기능 분석에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 질병에서 요리 방법 circumvents 네이티브 인간의 RPE 세포를 얻기의 어려움.
Abstract
병 적인 메커니즘 BEST1 공부에 대 한 좋은 vivo에서 모델의 부족 때문에 주로 애매 남아 있지만 인간의 BEST1 유전자에 200 개 이상의 유전자 변이 발견 되었고 망막 퇴행 성 질환에 연결, 그리고 생리 적인 조건 하에서 그것의 돌연변이입니다. BEST1 인코딩하는 이온 채널, 즉 BESTROPHIN1는 기능 (BEST1), 망막 안료 상피 (RPE); 그러나, 네이티브 인간의 RPE 세포에 매우 제한 된 접근성 과학 연구에 대 한 큰 도전을 나타냅니다. 이 프로토콜 BEST1 질병 유발 돌연변이 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)에서 유도 분화에 의해 베어링 인간의 RPEs를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이 이렇게 연구자 immunoblotting, 면역 형광 검사, 패치 클램프 등 다양 한 실험 분석에 대 한 hPSC RPEs의 지속적인 소스를 있으며 따라서에 대 한 매우 강력한 접시에 질병 모델을 제공 합니다 hPSCs 자동 재생으로 BEST1-망막 조건 관련. 특히,이 전략은 RPE (patho) 생리학과 RPE에 기본적으로 표현 하는 관심의 다른 유전자 연구에 적용할 수 있습니다.
Introduction
그것은 적어도 5 망막 퇴행 성 질환 BEST1 유전자1,2,3,4,,56 유전자 변이 의해 발생 하는 문서화 되었습니다. , 7 , 8, 200, 여전히 증가에 이미 보고 된 돌연변이의 숫자와 함께. 이러한 BEST1-관련된 질병, 일컬어 bestrophinopathies, 진보적인 시력 손실과 심지어 실명, 원인과 현재 효과적인 치료법 없습니다. BEST1, 즉 BESTROPHIN1의 단백질 제품 (BEST1)는 캘리포니아2 +-활성화 된 Cl- 채널 (CaCC) 눈5,6, 망막 안료 상피 (RPE)에서 구체적으로 표현 8,9. BEST1의 중요 한 것은, 임상 표현 형-관련된 질병은 빛 자극, 라이트 피크 (LP) electrooculogram10,11; 측정 이라고 감소 시각적 반응입니다 LP는 RPE12,,1314CaCC에 의해 중재 될 여겨진다. 더 나은 BEST1 돌연변이의 병 적인 메커니즘을 이해 하 고 잠재적인 치료 쪽으로 작동, 돌연변이 BEST1 채널 endogenously 인간의 RPE 세포에 표현 공부를 필수적입니다.
그러나, RPE 취득 라이브 환자에서 직접 셀 아니다 매우 실용적인. 네이티브 RPE 세포 인간의 시신과 태아의 생 검에서 수확 수 있습니다, 비록 어려운 접근성이이 소스에는 크게 과학 연구를 제한 합니다. 따라서, 그것은 대체 RPE 자사 인간의 눈을 중요입니다. 이 전화 기능 RPE 세포 이제 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs), 배아 줄기 세포 (hESCs)를 포함 하 여에서 분화 될 수 있다 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs), 후자로 줄기 세포 기술에 있는 최근 전진에 의해 응답 되어 기본 피부 섬유 아 세포 기증자16,,1718에서 프로그래밍에 의해 생성 되 고. 자체-갱신 및 hPSCs의 pluripotency hiPSCs의 환자의 특이성 및 게놈 수정 잠재력 (예를들면, CRISPR에 의해) hESCs의 다양 한 요리에 질병 모델을 제공 하는 동안 RPEs, 생성 하는 신뢰할 수 있는 소스를 확인 하는 중요 한 것은, 원하는 BEST1 돌연변이.
hPSC-RPE 쥐 RPE 모델에 몇몇 이점이 있다: 1) BEST1 녹아웃 마우스 어떤 망막 이상19, 생쥐와 인간; 사이 BEST1 RPE에의 다른 유전 요구의 가능성을 높이 나타나지 않습니다 2)의 3% 인간 RPE 세포는 쥐20; 35% 달리 binucleate 3) hiPSC-RPE potentiates 임상 헌 이식 망막의 치료 장애21. 그럼에도 불구 하 고, 동물 모델은 여전히 라이브 시스템에 RPE 생리학과 병리학 공부를 위한 불가결 하 고 hiPSC의 종양 가능성을 간과할 수 없습니다.
여기 절차 RPE 차별화 프로토콜 연구 및 임상 목적을 위해 사용 될 수 있는 유용 하 고 비교적 간단한 hPSC을 설명 합니다. 이 프로토콜 니코틴 (비타민 B3)를 사용 하 여 더 치료 activin-a에 의해 RPE로 분화를 유도 신경 조직에 hPSCs의 증가 니코틴 치료가 보여왔다 색소 세포 (RPE로 차별화의 기호)를 증가 시킬 가능성이 셀22차별화의 apoptotic 활동을 약하게 하 여. 결과 hPSC RPE 세포 네이티브 인간의 RPE 세포22로 동일한 키 마커, 조약돌 형태학 및 세포 기능을 표시합니다. 따라서, 연구 설정에서 결과 hPSC RPE 세포는 immunoblotting, immunostaining, 및 자세한 실험 절차는 또한 제공 하는 전체 셀 패치 클램프를 포함 한 다운스트림 기능 분석에 적합 합니다. 임상, RPE 세포 줄기 세포에서 파생 된 동물 연구와 인체 실험23황 반 변성의 이식 치료를 위한 큰 잠재력을 보여왔다.
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Protocol
1입니다. RPE에 hPSC의 차별화
- 유지 하 고 이전18을 설명 하는 통행 hPSCs.
참고: 모든 셀 (를 포함 하 여 hPSCs와 hPSC-RPEs) 성장과 분화 프로토콜의 기간 내내 5% CO2 에서 37 ° C에서 성장 된다. -
차별화, 전에 미리 코팅된 6-잘 접시에 confluent hPSCs 분할.
- 플레이트 코트, 지하실 멤브레인 매트릭스 1 시간 약에 대 한 얼음에 녹여, 1시 50분에 4 ° C DMEM 매체에서 liquidized 매트릭스를 일시 중단 하려면 희석, 각 음을 800 µ L 코팅 혼합물을 추가 하 고 37 ° c.에 적어도 1 시간에 대 한 품 어
- 코팅 작업이 완료 되 면 혼합물을 발음 하 고 즉시 우물에 1.5-2 mL 매체를 추가 합니다.
- 오래 된 문화 판에서 hPSCs 해제, 실 온에서 5 분에 대 한 PBS 플러스 0.5 m m EDTA와 셀을 품 어 하 고 솔루션, 발음 문화 매체와 작은 수 풀에서 셀 resuspend.
- 새로운 접시에 ~ 20 %confluency 종자 세포.
참고:-20 ° C에서 100 µ L aliquots에 지하실 멤브레인 매트릭스를 저장 하 고 한 약 수를 사용 하 여 6 잘 플레이트 코트. 코팅에 대 한 시간 또는 하룻밤 실 온에서 37 ° C에서 4 h까지 확장할 수 있다. 일시 중단 하 고 3-5 셀 보다는 단일 세포의 작은 수 풀으로 hPSCs 씨앗에 중요 하다.
- 세포는 성장 전체 confluency 때 차별화 매체 (4 mL/음)와 문화 매체를 대체 (표 1, activin-A). 문화, 14 일에 대 한 변화 하는 매체 (4 mL/잘) 3 배 / 주.
참고: hPSC 플레이트 밀도 복식 약 마다 24 h. 중요 한 세포 죽음 차별화 절차의 시작으로 예상 된다. 죽은 세포와 우물에서 파편의 집계는 중간 변경 시 맨 눈으로 볼 수 있습니다. - 하루 28 일 15에서에서 100 ng/mL 인 activin-A (표 1, 인간 activin-A)와 차별화 매체를 보충. 매체 (4 mL/잘) 변경 3 x / 주.
- Activin-A 보충 주 29 (표 1, 인간 activin-A)에 시작을 중지 합니다. 안료 hPSC-RPE 클러스터 (그림 1A-B)이 나타날 때까지 8-10 주에 대 한 차별화 매체에 경작 하는 셀을 계속.
참고: 클러스터 색소 세포의 볼 수 있습니다 셀 문화 접시에 작은 어두운 점으로 (그림 1A-B, 톱) 육안에 의해. 서명 조약돌 모양으로 개별 안료 세포는 현미경 20 X (그림 1A-B, 아래) 볼 수 있습니다.
2. 격리와 차별화 된 RPE 세포의 문화
- 차별 매체를 제거, PBS로 한 번 씻어, 0.05 %trypsin 플러스 각 음에 콜라의 1 U / µ L의 1 mL를 추가 20-30 분 제거 트립 신/콜라에 대 한 37 ° C에서 품 어 고 부드럽게 6 잘 플레이트의 각 음에 미리 따뜻하게 RPE 매체의 2 개 mL를 추가 (< c0 > 표 2).
참고: 다각형 트립 신/콜라 치료 하기 전에, hPSC-RPE 세포의 형태를 모니터링 하는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 충분 한 소화 후 라운드 되 고. -
당겨 유리 펫 파스퇴르 분 젠 버너를 사용 합니다.
- 두 손으로 잡고 오래 (9 인치) 파스퇴르 피 펫 수평, 그래서 양쪽 끝에 분 젠 버너 위에 피 펫의 얇은 부분의 길이를 약 2/3.
- 일단 유리는 불꽃에서 부드러운 되 고, 신속 하 게 당겨 두 끝 떨어져, 마이크로 스 크레이 퍼 같은 팁은 피 펫 (그림 2)의 새로운 끝에 형성 되도록 합니다.
- 여러 "셀 기구"를 만드는 데 여러 번 반복 합니다. 가져온된 펫 살 균에 대 한 70% 에탄올 스프레이 하 고 셀 문화 후드에 그들을 건조.
-
현미경, 마이크로 "셀 스 크레이 퍼"를 사용 하 여 부드럽게 분리 접시에서 안료 hPSC-RPE 클러스터를.
- 부드럽게 탭 (긁어 하지 않습니다) 직접 색소 세포에는 플 로트 것입니다 최대 문화 매체에 일단 그들이 우물의 바닥에서 해리.
- 즉시 사용 하 여 20 µ L micropipette 부드럽게 해리 hPSC-RPE 세포를 흡입 하 고 RPE 중간24미리 코팅된 6 잘 플레이트에 그들을 전송.
- 미리 코팅 12-잘 접시의 단계 2.3.1–2.3.2 필요에 따라 여러 번 반복 하 여 각 5 ~ 103 셀 (~ 10% confluency 20 X 현미경 관찰) 배를 수집 합니다. 2 mL에 매체의 최종 볼륨을 가져와.
참고: 해리 hPSC-RPE를 방지 하기 위해 부동에서 셀, 하지 마십시오 플레이트의 움직임을 분리 과정에서 천연된 셀 매체에 떠 있지만 여전히 로컬 집중 유지 되도록.
- RPE 매체 안료 단층 (그림 1C)을 형성 있도록 또 다른 6-8 주 동안에 12-잘 접시에 문화 새로 격리 hPSC-RPE 세포 (P0)
- 3 매체 변경 x / 주. 매체를 변경할 때 기존 매체의 약 1/3 볼륨에 각 잘 두고 신선한, 미리 데워 진 RPE 매체의 2/3 볼륨 추가. 이 단계에서 12-잘 접시에 각 잘 RPE 매체의 2 mL을 사용 (따라서, 중간의 1.3 mL 때마다를 교환).
참고: P0 hPSC-RPE 세포의 단층 지붕, 셀 적극적으로 체액을 운반 하 고 단단한 접속점25에 의해 정박 제안 양식 수 있습니다. 따라서, 돔 형성 RPE 상태 성숙의 지표 이다.
3. RPE Immunoblotting 운명 유효성 검사
- 확인 hPSC-RPE 세포 lysate 가수분해 억제 물 보충 포유류 단백질 추출 버퍼를 사용 하 여 칵테일. 소화 세포 파편을 삭제 하도록 4 ° C에서 15 분 13000 x g 에서 원심 분리 하기 전에 30 분 동안 얼음에 세포 lysate를 품 어. Lysate의 총 단백질 농도 측정 합니다.
- 변성 40 75 ° C에서 Laemmli SDS 샘플 버퍼에 총 단백질의 µ g 단백질을 분리 하는 10 분에 대 한 샘플에 15 분 및 염료 앞에 도달 될 때까지 다음 150 V 90 V의 정 전압에서 10% 트리 스-글리신 SDS 페이지 젤 젤의 하단.
- 100 V 1 h 10% 메탄올 보충 사전 냉각된 트리 스-글리신 버퍼에 니트로 막에 단백질을 전송 합니다.
- 0.1% 비 이온 세제 (TBST)와 실 온에서 1 h 5% 비 지방 건조 우유 염 분 Tris 버퍼에 막을 차단 합니다.
- 4 ° C에서 블로킹 버퍼에 하룻밤 희석 주 항 체를 막 품 어. 다음과 같이 RPE 특정 마커 단백질을 대상으로 하는 항 체 희석: RPE65, 1:1, 000; CRALBP, 1:1, 000; BEST1의 1:1, 000 Β-말라 로드 컨트롤을 검색 하는 1:10,000에서 β-걸에 대 한 항 체 희석.
- 각 세척에 대 일 분으로 TBST 3 시간 막 씻으십시오.
- 마우스로 fluorophore 활용된 염소 항 실 온에서 1 h에 대 한 블로킹 버퍼에 IgG 이차 항 체 희석 1:10,000 막 품 어.
- 각 세척에 대 일 분으로 TBST 4 시간 막 씻으십시오.
- 이미징 시스템 (그림 3)는 적외선을 사용 하 여 단백질을 감지 합니다.
4. 검사 Immunostaining에 의해 BEST1 Subcellular 지 방화
- 2 mL PBS의 hPSC-RPE 세포를 한 번 세척 하 고 실 온에서 45 분 동안 4% paraformaldehyde 2 mL에 수정.
- 두 번, 2 mL의 PBS로 세척 하 고 2 mL PBS의 0.1% 비 이온 계면 활성 제 및 2% 당나귀 세럼 45 분 비 특정 바인딩 사이트 차단와 함께 셀을 품 어.
- BEST1 항 체 (1: 200 희석) 실 온에서 2 h에 대 한 셀을 품 어.
- 셀 2 mL PBS 3 번을 씻는 다. 함께 품 어 fluorophore 활용 보조 IgG (1:1, 000) 실 온에서 1 h.
- 씻어 2 mL PBS 3 번 언바운드 이차 항 체를 제거 하.
- Confocal 현미경 검사 법 (그림 4)에 의해 스테인드 세포를 관찰 합니다.
5. 녹음 캘리포니아2 +-hPSC-RPE 전체 셀 패치 클램프에 의해에 종속 Cl- 전류
- 패치 클램프 전에 24-72 h (조약돌 모양의 안료)는 완전히 confluent 잘 (12-잘 접시)에 성숙한 P0 hPSC-RPE 세포의 분할. PBS와 중간, 세척 한 번 발음 하 고 우물에 0.05 %trypsin 플러스 1 U / µ L 콜라의 1 mL를 추가 합니다.
참고: 사전 사용 하기 바로 전에 37 ° C에 트립 신/콜라 따뜻한. - 8 분 동안 37 ° C에서 품 어.
참고:이 단계 후 hPSC-RPE 세포는 여전히 부착 연결. - 1 mL micropipette 부드럽게 세척 접시, 떨어져 세포를 사용 하 여 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 소화 혼합물에 셀을 전송. 잔여 세포를 수집 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 그들을 결합을 미리 데워 트립 신/콜라의 1 mL와 잘을 씻는 다.
참고: hPSC RPE 세포는이 시점에서 여전히 큰 덩어리에서. 활기찬 pipetting으로 셀 덩어리를 휴식 하지 마십시오. 일부 덩어리 1 mL 팁의 내부 벽에 충실 수 있습니다. - 8 분 동안 37 ° C 건조 욕조에 원뿔 튜브를 품 어.
- 10-15 회 소화 믹스 1 mL micropipette 위아래 부드럽게 피 펫을 사용 합니다.
참고: 셀 덩어리 훨씬 작은 하지만 여전히 표시 된다. 활기찬 pipetting 하지 마십시오. - 위의 두 단계를 반복 합니다.
참고: 셀의 대부분 pipetting 후 단일 셀에 있어야 한다. 여전히 사용할 수 있습니다 몇 가지 작은 세포 덩어리 수 있습니다. 선택 사항: 추가 5 분 뒤에 부드러운 pipetting 37 ° C에서 원뿔 튜브 품 어. 37 ° C에서 트립 신/콜라에 총 시간 30 분 (8 + 8 + 8 + 5 = 29)을 넘지 말아야 한다. - 소화 셀을 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브를 미리 데워 RPE 매체의 5 mL를 추가 합니다. 셀 수집을 5 분 동안 200 x g 에서 회전 합니다. 10-20 %confluency 미리 코팅된 35mm 요리에 다시 일시 중단 하 고 씨 셀 (예를 들어, 100% 10 %confluency 대 한 5 개의 35mm 요리 12-잘 접시에 confluent).
참고: 항상 피할 활기찬 pipetting 원심 분리 후에 상쾌한에 명백한 어두운 세포 파편에 의해 표현 되는 중요 한 세포 죽음을 발생할 수 있습니다. 잘 분리 된 단일 셀 시드 패치 클램프 기록에 대 한 필수적입니다. - 수행 하는 전체 셀 패치 클램프18,26,,2728,29,30,31위에서 설명한 대로. 취득 단계 잠재력의 가정에서 현재 추적 (-100 + 100 0의 지주 잠재력에서 뮤직 비디오 mV) (그림 5).
참고: 내부 및 외부 솔루션의 조리법에 대해서는 표 3 과 표 4, 각각.
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Representative Results
가장 기술적으로 도전적인 단계는 차별화 된 P0 hPSC-RPE 인구의 높은 순도 달성 하는 것을 목표로 수동 격리 합니다. 성공적인 격리 후 > 90% 셀 P0 인구에서 성장 하 고 서명 RPE 형태학 (그림 1C) 표시를 성숙. 비 RPE 또는 P0 인구에 미숙한 RPE 세포의 작은 부분의 존재 거의 불가피 하지만 간섭 하지 않습니다 다운스트림 실험으로 안료와 조약돌 모양의 hPSC-RPE 세포의 수는 압도 대다수입니다.
HPSC-RPE 기반으로 질병에서 요리 방식으로 각 환자 별 BEST1 돌연변이 종합적 특징이 vivo에서 그것의 단백질 식 (immunoblotting, 그림 3), 막 밀매 (대 한 수 있습니다. immunostaining, 그림 4), 그리고 이온 채널 기능 (전체 셀 패치 클램프, 그림 5). 이러한 결과 맞춤된 약 개발을 위한 elucidating 채널 돌연변이의 병 적인 메커니즘에 대 한 중요 한 정보를 제공할 것입니다.
BEST1는 RPE 세포에 주로 표현 된다, 성숙한 RPE 상태의 유효성 검사에 대 한 셀룰러 표식으로 사용할 수 있습니다. 그것은 일부 BEST1 돌연변이 단백질 표현, RPE65 및 CRALBP 아직도 필요가 같은 다른 잘 설립 RPE 마커 평가 (그림 3) 그래서 미칠 주목 한다.
성숙한 P0 hPSC-RPE 세포 전체 셀 패치 클램프에 대 한 (P1)로 분할 하기 전에 2-3 개월 동안 유지할 수 있습니다. P0 셀 3 개월 보다 더 오래 된 패치 클램프에 대 한 권장 하지 않습니다 하지만 여전히 immunoblotting 및 immunostaining 실험에 사용할 수 있습니다.
그림 1: 여러 단계에서 hPSC-RPE 세포 분화. 첫 등장 (A), 절연 (B), 전후 성장 성숙에 문화 접시에 있는 색소 hPSC-RPE 클러스터의 대표 이미지 게시물 절연 (C). 뷰 및 20 X 단계 대조 이미지 각각 위쪽 및 아래쪽 패널에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 마이크로 셀 스 크레이 퍼의 대표 이미지는 파스퇴르 피 펫에서 뽑아. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 차별화 된 hPSC-RPE의 성숙한 RPE 상태의 유효성 검사 셀 immunoblotting 여. WT hPSC와 hPSC-RPE 세포 RPE 특정 단백질 마커 BEST1, RPE65, 및 CRALBP의 식을 보여주는 말. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: BEST1 WT hPSC-RPEs에의 Immunostaining. (A) 조약돌 모양의 hPSC-RPE 세포에 WT BEST1의 막 지역화를 보여주는 대표적인 immunofluorescent 이미지. (B) Immunostaining 음수 제어 BEST1 1 차적인 항 체를 생략 합니다.
그림 5: hPSC RPEs의 전체 셀 패치 클램프 기록. (A) A 전체 셀 패치 클램프에 대 한 단일 hPSC-RPE 세포. (B) 대표 현재 추적 BEST1 WT hPSC-RPE BEST1 에서 기록 된 최대 캘리포니아2 +hPSC-RPE 돌연변이. 전류를 유도 하는 데 사용 하는 전압 프로토콜 삽입에 표시 됩니다. 눈금 막대 1 nA = 150 양 참조 표 3 및 표 4 패치 클램프 준비 세부 정보. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 시 약 | 금액 |
| DMEM 녹아웃 (KO) | 500 mL |
| 고 혈 청 교체 | 15% (75 mL) |
| 불필요 한 아미노산 | 1% (5 mL) |
| 글루타민 | 1% (5 mL) |
| 페니실린-스 | 1% (5 mL) |
| 니코틴 | 10 m m |
| 인간의 activin-A * | 100 ng/mL |
| * Activin A 인간의 분화 프로토콜의 15-28 일 동안 보충 된다. | |
표 1: RPE 차별화 매체입니다.
| 시 약 | 금액 |
| MEM (α 수정) | 500 mL |
| 소 태아 혈 청 | 5% (25 mL) |
| N1 보충 | 1% (5 mL) |
| 글루타민-페니실린-스 | 1% (5 mL) |
| 불필요 한 아미노산 | 1% (5 mL) |
| 황소자리 | 125 밀리 그램 |
| 날린 | 10 µ g |
| Triiodo-thyronin | 0.0065 µ g |
표 2: RPE 문화 매체입니다.
| 시 약 | 농도 |
| CsCl | 130 m m |
| MgCl2 | 1mm |
| EGTA | 10 m m |
| 마그네슘 ATP | 2 mM |
| HEPES (pH 7.4) | 10 m m |
| CaCl2* | 다릅니다. |
| 포도 당 * * | ~ 5 mM |
| CaCl2 를 원하는 캘리포니아2 + 농도 추가 | |
| * * 포도 당 사용 하 여 290-295 mOsm/l osmolarity | |
표 3: 패치 클램프 내부 솔루션입니다.
| 시 약 | 농도 |
| NaCl | 140 mM |
| KCl | 5 mM |
| MgCl2 | 1mm |
| CaCl2 | 2 mM |
| HEPES (pH 7.4) | 10 m m |
| 포도 당 * | ~ 5 mM |
| * 포도 당 300-305 mOsm/l.에 osmolarity 조정를 사용 하 여 | |
표 4: 패치 클램프 외부 솔루션입니다.
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Discussion
HPSCs는 RPE BEST1에 대 한 올바른 세포 계보에 질병을 일으키는 돌연변이와 차별화 하는 질병--요리에 접근에 대 한 가장 중요 한 절차가입니다. 따라서, 각 분화 실험 후 결과 hPSC RPE 세포 확인 되어야 합니다 신중 하 게 그들의 성숙 상태에 대 한 RPE 특정 형태학 및 단백질 마커16,,1718. 클론 유물을 최소화 하려면 동일한 환자에서 여러 hiPSC 클론 또는 동일한 돌연변이와 여러 hESC 클론 사용 해야 가능.
HiPSC와 hESC 라인을 모두 동일한 프로토콜 RPE에 분화 될 수 있다. hiPSCs 또는 BEST1 유전자에 돌연변이 없이 BEST1 환자 또는 건강 한 기증자의 피부 섬유 아 세포에서 각각 재설정 될 수 있습니다. BEST1 돌연변이 베어링 hESCs 야생-타입 (WT) BEST1는 부모의 hESC 라인에서 유전자 설계 될 수 있다. HiPSC-RPE 및 hESC RPE 노선 그들의 자신의 장점과 단점 있다. 이전은 더 환자 및 맞춤된 의학, 특히 임상으로 관련 된입니다. 그러나, 그것은 hiPSC-RPE 접근에 대 한 몇 가지 제한이 있습니다 협조할: 1) 물류 기부금 환자에서 항상 허용 될 수 없습니다, 그리고 일부 돌연변이 매우 BEST1 환자 샘플의 전체 스펙트럼에 액세스 하기가 드문 처음부터; 2) 특정 고기 다른 유전 배경 및 기증자;의 물리적 조건에서 발생할 수 있습니다. RPE 분화 효율 3) hiPSC는 어떤 경우에는 hiPSC-RPEs를 기술적으로 도전적 일 수 있다 다른 기증자에 대 한 다릅니다. 다른 한편으로, hESC RPE 경로, 비록 더 많은 인공, 비 바이어스 기능 조사에 대 한 수요에 원하는 돌연변이와 isogenic hESC RPEs를 생성 하는 다양 한 플랫폼을 제공 합니다.
성숙한 RPE 세포는 안료, 다각형, 그리고는 단층에 꽉 연결에 의해 연결 된. 패치 클램프에 대 한 단일 셀 인구로 분한 후 갓 다시 시드해야 hPSC-RPE 세포 다각형 모양의 잃을 것 이다 하지만 아직도 몇 일 (그림 5A)에 대 한 착 색을 유지. 패치 클램프 그동안 색소 사용할 수 표시 표식으로 좋은 RPE 상태 셀을 선택 후 셀 분할 수행된 24-72 h입니다. 중요 한 세포 죽음 없이 잘 분리 된 단일 셀의 대부분의 결과로 분할 부드러운 셀 패치 클램프의 성공에 열쇠 이다.
다른 세포 배양과 성장 인자를 사용 하 여 다른 여러 가지 차별화 프로토콜 문학21,32에서 문서화 되었습니다. RPE에 hPSC의 차별화에 필요한 시간 동안 측면-의해-측면 비교 없이 분화 효율에 상당한 차이 인지 알 어렵다 우리를 포함 한 이러한 모든 프로토콜에 비슷합니다. 현재 프로토콜 hPSC RPE 세포는 일반 플랫 바닥 접시에서 재배 하지만 하지 막 삽입과 함께 접시에이 절차에 의해 생성 된 hPSC RPE 최고의 정리 하지 않을 수 있습니다 그래서 RPE의 극성 세포 vivo에주목 한다. 따라서, 생성 된 hPSC-RPE 세포 또한 임상 목적17형태로 단층 RPE 시트 Transwell 접시에 배양 수 있지만 위에서 설명한 기법 연구 설정33, 적응 주로 된다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 NIH 교부 금 EY025290, GM127652, 및 시작 자금 로체스터의 대학에 의해 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
References
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