Summary
نقدم هنا بروتوكولا للتفريق بين خلايا ظهارة (RPE) صباغ الشبكية من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية إذ تضع الطفرات المستمدة من المريض. يمكن استخدام خطوط الخلية متحولة للتحليلات الفنية بما في ذلك إيمونوبلوتينج، الفلورة والمشبك التصحيح. هذا المرض في طبق النهج تلتف إلى صعوبة الحصول على خلايا RPE الإنسان الأصلي.
Abstract
على الرغم من أن ما يزيد على 200 الطفرات الوراثية في الجينات البشرية BEST1 التي تم تحديدها والمرتبطة بالأمراض التنكسية الشبكية، الآليات المرضية التي لا تزال بعيدة المنال يرجع ذلك أساسا إلى عدم وجود نموذج جيد في فيفو لدراسة BEST1 والطفرات في ظل الظروف الفسيولوجية. BEST1 ترميز قناة أيون، هما BESTROPHIN1 (BEST1)، الذي يعمل في ظهارة صباغ الشبكية (RPE)؛ ومع ذلك، إمكانية وصول محدودة للغاية للخلايا RPE البشرية الأصلية يمثل تحديا رئيسيا للبحوث العلمية. ويصف هذا البروتوكول كيفية توليد الرؤى البشرية تحمل BEST1 الطفرات المسببة للمرض بالتمايز المتعمد من الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس). كما هبسكس قابلة للتجديد الذاتي، هذا النهج يسمح للباحثين أن يكون مصدر ثابت للرؤى هبسك للتحليلات التجريبية المختلفة، مثل إيمونوبلوتينج، الفلورة والمشبك التصحيح، ومن ثم يوفر نموذج المرض في صحن قوية جداً BEST1-ترتبط شروط الشبكية. جدير بالذكر أن هذه الاستراتيجية يمكن تطبيقها على دراسة فسيولوجيا RPE (مرضية) وجينات أخرى تهم أصلاً المعرب عنها في RPE.
Introduction
وقد تم توثيق خمسة على الأقل من الأمراض التنكسية الشبكية الناتجة عن الطفرات الوراثية في BEST1 الجينات1،2،3،4،،من56 , 7 , 8، مع عدد الطفرات المبلغ عنها مسبقاً على 200 وآخذة في الازدياد. هذه BEST1-الأمراض المرتبطة بها، ويعرف أيضا باسم بيستروفينوباثيس، تسبب فقدان البصر التدريجي وحتى العمى، ولا يوجد حاليا لا علاجات فعالة. البروتين المنتج من BEST1، هما BESTROPHIN1 (BEST1)، هو Ca2 +-تنشيط Cl– قناة (كاكك) على وجه التحديد المعرب عنها في ظهارة صباغ الشبكية (RPE) لعيون5،6، 8،9. الأهم من ذلك النمط الظاهري سريرية من BEST1-الأمراض المرتبطة بها هي انخفاض الاستجابة البصرية للمنبهات الخفيفة، تسمى ذروة الخفيفة (ليرة لبنانية) تقاس في10،اليكتروكولوجرام11؛ ويعتقد أن يكون توسط كاكك في RPE12،،من1314ليرة لبنانية. من أجل فهم أفضل الآليات المرضية للطفرات BEST1 والعمل من أجل العلاج المحتملة، من الضروري دراسة قنوات BEST1 متحولة وأعربت عن اندوجينوسلي في الخلايا البشرية RPE.
ومع ذلك، الحصول على RPE الخلايا مباشرة من المرضى يعيش عملي جداً. على الرغم من أن يمكن حصادها الأصلية RPE الخلايا من خزعات من الجثث البشرية والأجنة، يحد صعوبة إمكانية الوصول إلى هذه المصادر بشكل كبير البحث العلمي. ولذلك من المهم أن يكون البديل RPE مصادر أخرى بخلاف العين البشرية. تمت الإجابة هذه الدعوة بالتطورات الأخيرة في تقنيات الخلايا الجذعية، كما الوظيفية RPE الخلايا الآن يمكن أن تكون متباينة من الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس)، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية (هيسكس) والتي يتسبب فيها الخلايا الجذعية pluripotent (هيبسكس)، هذا الأخير يتم إنشاؤها بواسطة إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلد الأولية من المانحين16،،من1718. الأهم من ذلك، ضمان التجديد الذاتي وبلوريبوتينسي من هبسكس مصدر موثوق لتوليد الرؤى، بينما المريض-خصوصية هيبسكس وإمكانية تعديل الجينوم هيسكس (مثلاً، قبل كريسبر) تقدم نموذجا للمرض في صحن تنوعاً المطلوب BEST1 الطفرات.
هبسك-RPE مزايا عديدة على الفئران نماذج RPE: 1) لا تعرض الفئران خروج المغلوب BEST1 أي شذوذ الشبكية19، زيادة إمكانية اشتراط BEST1 في RPE الوراثية المختلفة بين الفئران والبشر؛ 2) سوى 3 في المائة خلايا RPE البشرية بينوكليتي، مقابل 35 في المائة في20من الفئران؛ 3) هيبسك-RPE يقوي التي تعالج الزرع الذاتي في السريرية المعالجة الشبكية واضطرابات21. ومع ذلك، نماذج حيوانية لا يزال أمرا لا غنى عنه لدراسة RPE علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض في نظام العيش، ولا يمكن إغفال احتمال النمطان من هيبسك.
يصف الإجراء هنا هبسك مفيدة وبسيطة معتدلة RPE التمايز البروتوكول التي يمكن استخدامها لأغراض السريرية والبحوث. هذا البروتوكول يستخدم نيكوتيناميد (فيتامين B3) لزيادة تمايز هبسكس للأنسجة العصبية، وكذلك فعل التفريق في RPE بالمعاملة مع أضافت-ألف. العلاج نيكوتيناميد قد ثبت لزيادة عدد الخلايا المصطبغة (علامة التمايز في RPE)، ربما بتخفيف النشاط apoptotic للتفريق بين الخلايا22. تعرض الخلايا RPE هبسك الناتجة نفس علامات رئيسية ومورفولوجيا حصاة كبيرة ووظيفة الخلوية ك خلايا RPE البشرية الأصلية22. وهكذا، في إعداد بحوث، RPE هبسك الخلايا الناتجة مناسبة للتحليلات الفنية المتلقين للمعلومات بما في ذلك إيمونوبلوتينج، إيمونوستينينج، والمشبك تصحيح كامل الخلية، التي تتوفر أيضا إجراءات تجريبية مفصلة. سريرياً، RPE الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية أظهرت إمكانات كبيرة لزرع الأعضاء معاملة البقعي في دراسات أجريت على الحيوانات والتجارب البشرية23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-التفريق بين هبسك إلى RPE
- الحفاظ على وهبسكس المرور كما تم وصفه سابقا18.
ملاحظة: جميع الخلايا (بما في ذلك هبسكس والرؤى هبسك) تزرع في 37 درجة مئوية في 5% CO2 طوال فترة نمو وتمايز البروتوكولات. -
قبل التمايز، تقسيم هبسكس المتلاقية المغلفة مسبقاً جيدا 6 لوحات.
- معطف لوحات، وذوبان الغشاء مصفوفة على الجليد لحوالي 1 ح، وتعليق مصفوفة ليكويديزيد في المتوسط دميم 4 درجات مئوية في 01:50 إضعاف، إضافة خليط طلاء ميليلتر 800 لكل بئر، واحتضان لعلى الأقل 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- عند الانتهاء من طلاء، نضح الخليط وإضافة فورا متوسطة 1.5 – 2 مل إلى الآبار.
- رفع هبسكس من لوحات الثقافة القديمة، احتضان الخلايا مع يدتا برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 0.5 مم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ونضح الحل وريسوسبيند الخلايا في كتل صغيرة مع الثقافة المتوسطة.
- خلايا البذور في كونفلوينسي ~ 20 ٪ في لوحات جديدة.
ملاحظة: تخزين مصفوفة الغشاء في 100 ميليلتر مختبرين في-20 درجة مئوية، واستخدام قاسمة واحد لمعطف لوحة 6-جيدا. ويمكن تمديد الوقت لطلاء ما يصل إلى 4 س على 37 درجة مئوية، أو بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. من المهم أن تعليق والبذور هبسكس ككتل صغيرة من الخلايا 3-5 بدلاً من خلايا مفردة.
- عندما تكون الخلايا نمت بالكامل كونفلوينسي، استبدال المتوسطة الثقافة مع التمايز المتوسطة (4 مل في البئر) (الجدول 1، دون أضافت-A). الثقافة لمدة 14 يوما، تغيير المتوسطة (4 مل في البئر) 3 x/الأسبوع.
ملاحظة: من المتوقع الزوجي كثافة لوحة هبسك تقريبا كل 24 h. موت الخلية كبيرة بعد بدء إجراءات المفاضلة. يمكن رؤية مجاميع من الخلايا الميتة والحطام في الآبار بالعين المجردة خلال التغييرات متوسطة. - من يوم 15 إلى يوم 28، الملحق متوسطة التمايز مع 100 نانوغرام/مليلتر الإنسان أضافت-أ (الجدول 1، مع الإنسان أضافت-أ). تغيير المتوسطة (4 مل في البئر) 3 x/الأسبوع.
- إيقاف التزويد بالفيتامين A-أضافت ابتداء من يوم 29 (الجدول 1، دون الإنسان أضافت-أ). مواصلة استزراع الخلايا في متوسطة التمايز 8 – 10 أسابيع حتى تظهر مجموعات RPE هبسك المصطبغة (الشكل 1 أ-ب).
ملاحظة: مجموعات من الخلايا المصطبغة يمكن اعتبار النقاط الداكنة الصغيرة على لوحة ثقافة خلية بالعين المجردة (الشكل 1A-ب، أعلى). يمكن رؤية الخلايا المصطبغة الفردية مع الشكل حصاة كبيرة التوقيع تحت مجهر X 20 (الشكل 1A-ب، أسفل).
2-العزلة والثقافة من الخلايا المتمايزة RPE
- إزالة متوسطة التمايز ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، وإضافة 1 مل من التربسين 0.05% زائد 1 يو/ميليلتر من كولاجيناز في كل بئر، واحتضان في 37 درجة مئوية لإزالة التربسين/كولاجيناز كحد أدنى 20 – 30 وإضافة 2 مل من قبل حرارة RPE المتوسطة في كل من لوحة 6-جيدا جيدا بلطف (< c0 > الجدول 2).
ملاحظة: استخدم مجهر مقلوب لرصد مورفولوجيا الخلايا هبسك-RPE، ومضلعة قبل العلاج التربسين/كولاجيناز، وتصبح جولة بعد الهضم كافية. -
استخدام موقد بنسن لسحب الزجاج الماصات باستور.
- بكلتا يديه، عقد طويل (9 بوصة) ماصة باستور في كلا طرفي ذلك أفقي، وفوق موقد بنسن حوالي 2/3 من أسفل طول الجزء رقيقة من الماصة.
- حالما يصبح الزجاج الناعمة من اللهب، بسرعة سحب طرفي عن بعضها البعض، مثل أن تلميح الشبيهة مكشطة الصغرى تتشكل في نهاية جديدة الماصة (الشكل 2).
- كرر عدة مرات لإنشاء عدة "كاشطات الخلية". رش الماصات سحبت مع الإيثانول 70% للتعقيم وأيردري لهم في هود ثقافة الخلية.
-
تحت مجهر، استخدم الجزئي "خلية مكشطة" أن تنأى بلطف مجموعات RPE هبسك المصطبغة من اللوحة.
- اضغط برفق (لا تتخلص) مباشرة على الخلايا المصطبغة، الذي سوف تطفو تصل في المتوسط الثقافة بمجرد أنها تنأى من أسفل البئر.
- فورا استخدام ميكروبيبيتي 20 ميليلتر لشفط الخلايا RPE هبسك منفصلان بلطف ونقلها إلى صفيحة 6-جيدا قبل مغلفة مع RPE متوسطة24.
- جمع ~ 5 × 103 خلايا (~ 10% كونفلوينسي كما لاحظ تحت مجهر X 20) في كل المغلفة مسبقاً جيدا من صفيحة 12-جيدا بتكرار الخطوات 2.3.1–2.3.2 عدة مرات، حسب الحاجة. إعادة التخزين النهائي من المتوسطة إلى 2 مل.
ملاحظة: لمنع RPE هبسك منفصلان الخلايا من العائمة بعيداً، تجنب حركة الصفائح أثناء عملية تفكك الخلايا معزولة تطفو في المتوسط ولكن لا تزال تتركز محلياً.
- خلايا الثقافة المعزولة حديثا هبسك-RPE (ف0) على لوحات 12-جيدا في المتوسط RPE لمدة 6-8 أسابيع للسماح لهم بشكل أحادي مصطبغة الطبقة (الشكل 1).
- تغيير متوسط 3 x/الأسبوع. عند تغيير المتوسطة، ترك حوالي 1/3 حجم متوسط العمر في كل بئر، وإضافة 2/3 حجم المتوسطة RPE طازجة والمعالجون مسبقاً. في هذه المرحلة، استخدم 2 مل RPE متوسطة لكل بئر في صفيحة 12-جيدا (وهكذا تبادل 1.3 مل متوسطة في كل مرة).
ملاحظة: قد تشكل أحادي الطبقة ف0 RPE هبسك الخلايا القباب، مما يوحي بأن الخلايا هي نشاط نقل السوائل، وترسو بتقاطعات ضيق25. ولذلك، تشكيل قبة مؤشرا من مؤشرات النضج RPE حالة.
3-RPE مصير التحقق من إيمونوبلوتينج
- جعل الخلية RPE هبسك استخدام المخزن المؤقت لاستخراج البروتين الثدييات تستكمل مع مثبط بروتيناز كوكتيل. احتضان الخلية ليساتي على الجليد لمدة 30 دقيقة قبل الطرد المركزي في س 13,000 ز لمدة 15 دقيقة عند 4 درجة مئوية للتخلص من الحطام خلية أونديسولفيد. قياس تركيز البروتين الكلي ليستي.
- تؤذي 40 ميكروغرام بروتين الكلي في "الحزب الديمقراطي الصربي لايملي" عينة العازلة عند 75 درجة مئوية للحد الأدنى 10 فصل البروتين عينات في جل تريس-جليكاين الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 10 ٪ في جهد مستمر من 90 الخامس لمدة 15 دقيقة وثم 150 الخامس حتى وصول الجبهة صبغ الجزء السفلي من الجل.
- نقل البروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز في المخزن تريس-جليكاين يبرد قبل استكمالها مع الميثانول 10% في 100 الخامس ح 1.
- كتلة الغشاء في تريس مخزنة المالحة مع المنظفات غير الأيونية 0.1% (تبسة) و 5% غير الدسم الحليب الجاف ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأساسي المخفف في المخزن المؤقت حظر عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تخفف من الأجسام المضادة التي تستهدف بروتينات RPE علامة محددة على النحو التالي: RPE65، 1:1، 000؛ كرالبب، 1:1، 000؛ BEST1، 1:1، 000. تضعف الجسم ضد β-أكتين في المضيفين للكشف عن β-أكتين كعنصر تحكم تحميل.
- يغسل الغشاء مع تبست 3 مرات، مع 5 دقائق لكل غسل.
- احتضان الغشاء مع fluorophore الماعز مترافق مكافحة الماوس مفتش الثانوي جسم المخفف المضيفين في المخزن المؤقت حظر لح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- يغسل الغشاء مع تبسة 4 مرات، مع 10 دقيقة لكل غسل.
- الكشف عن البروتينات استخدام الأشعة تحت حمراء التصوير النظام (الشكل 3).
4-التحقق من الترجمة BEST1 سوبسيلولار من إيمونوستينينج
- يغسل خلايا RPE هبسك مع 2 مل من برنامج تلفزيوني مرة واحدة وإصلاحها في 2 مل بارافورمالدهيد 4% لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تغسل مرتين مع 2 مل من برنامج تلفزيوني، واحتضان الخلايا في 2 مل من برنامج تلفزيوني مع 0.1% غير الأيونية السطح و 2% حمار المصل لمدة 45 دقيقة لمنع مواقع الربط غير محددة.
- احتضان الخلايا بجسم BEST1 (تخفيف 1: 200) ح 2 في درجة حرارة الغرفة.
- تغسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 3 مرات. احتضان مع fluorophore مترافق مفتش الثانوي (1:1، 000) ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- يغسل مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 3 مرات لإزالة الأجسام المضادة الثانوية غير منضم.
- مراقبة الخلايا ملطخة بالفحص المجهري [كنفوكل] (الشكل 4).
5-تسجيل Ca2 +-تعتمد الحالي Cl– في RPE هبسك بكامل الخلية "التصحيح المشبك"
- 24 – 72 ح قبل المشبك التصحيح، تقسيم الكامل المتلاقية جيدا (على لوحة 12-جيدا) ناضجة ف0 RPE هبسك الخلايا (على شكل حصاة كبيرة والمصطبغة). نضح مرة واحدة متوسطة الحجم، واغسل مع برنامج تلفزيوني، وإضافة 1 مل من التربسين 0.05% زائد 1 يو/ميليلتر كولاجيناز في البئر.
ملاحظة: قبل الحارة التربسين/كولاجيناز إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. - احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 8 دقائق.
ملاحظة: بعد هذه الخطوة، RPE هبسك الخلايا لا تزال ملتصقة ومتصلة. - استخدم ميكروبيبيتي 1 مل لغسل بلطف الخلايا خارج اللوحة، ونقل الخلايا في خليط الهضم إلى أنبوب مخروطي 15 مل. أغسل جيدا مع 1 مل من التربسين/كولاجيناز المعالجون مسبقاً جمع الخلايا المتبقية والجمع بينهما في الأنبوبة المخروطية 15 مل.
ملاحظة: الخلايا RPE هبسك لا تزال في كتل كبيرة في هذه المرحلة. لا تحاول كسر كتل الخلايا من بيبيتينج قوية. بعض كتل قد تتمسك بالجدار الداخلي لتلميح 1 مل. - احتضان الأنبوبة المخروطية في حمام جافة 37 درجة مئوية لمدة 8 دقائق.
- استخدام ميكروبيبيتي 1 مل بلطف ماصة صعودا ونزولاً من 10 – 15 مرة في مزيج الهضم.
ملاحظة: كتل الخلايا تصبح أصغر بكثير ولكن لا تزال مرئية. تجنب بيبيتينج قوية. - كرر الخطوتين السابقتين.
ملاحظة: يجب أن يكون معظم الخلايا في تعليق خلية واحدة بعد بيبيتينج. قد يكون هناك لا يزال بعض كتل خلايا صغيرة، ومقبولة. اختياري: احتضان الأنبوبة المخروطية في 37 درجة مئوية لإضافية 5 دقيقة تليها بيبيتينج لطيف. إجمالي الوقت في التربسين/كولاجيناز عند 37 درجة مئوية وينبغي أن لا تتجاوز 30 دقيقة (8 + 8 + 8 + 5 = 29). - إضافة 5 مل من قبل حرارة RPE المتوسطة إلى أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على خلايا هضمها. تدور في 200 x ز لمدة 5 دقائق لجمع الخلايا. الخلايا إعادة تعليق والبذور على الأطباق قبل المغلفة 35 ملم في 10 – 20% كونفلوينسي (مثلاً، 100 ٪ المتلاقية جيدا على لوحة 12-جيدا لخمسة صحون 35 ملم كونفلوينسي 10%).
ملاحظة: في جميع الأوقات، تجنب بيبيتينج نشطة، مما قد يسبب موت الخلية الكبيرة التي تمثلها الحطام خلية الظلام الواضح في المادة طافية بعد الطرد المركزي. البذر جيدا فصل خلية واحدة أمر ضروري لتسجيل المشبك التصحيح. - إجراء التصحيح كامل الخلية المشبك كما هو موضح سابقا18،26،27،،من2829،،من3031. الحصول على آثار الحالية من عائلة من إمكانات خطوة (-100 إلى + 100 أم من احتمال عقد 0 mV) (الشكل 5).
ملاحظة: وصفات الحلول الداخلية والخارجية ويرد في الجدول 3 و الجدول 4، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذه الخطوة من الناحية التقنية الأكثر تحديا هو عزل اليدوية، التي تهدف إلى تحقيق درجة نقاء عالية متباينة ف0 RPE هبسك السكان. بعد عزلة، ونجاح > الخلايا 90% من السكان0 ف سوف تنمو وتنضج لعرض التوقيع RPE مورفولوجيس (الشكل 1). أن وجود نسبة بسيطة من غير RPE أو خلايا RPE غير ناضجة في السكان0 ف أمر لا مفر منه تقريبا، ولكن سوف لا تتداخل مع تجارب المتلقين للمعلومات طالما هو عدد الخلايا المصطبغة وعلى شكل حصاة كبيرة هبسك-RPE الساحقة الأغلبية.
مع اقتراب المرض في صحن هبسك-RPE على أساس، طفرة BEST1 كل مريض على حدة يمكن أن تكون شاملة تتسم في فيفو للتعبير البروتين (إيمونوبلوتينج، الشكل 3)، الغشاء (الاتجار بالبشر إيمونوستينينج، الرقم 4)، وأيون قناة الدالة (تصحيح كامل الخلية المشبك، الرقم 5). ستوفر هذه النتائج معلومات هامة لتوضيح الآليات المرضية للطفرات القناة، وتطوير الطب شخصية.
كما BEST1 هو الغالب في الخلايا RPE، يمكن استخدامه كعلامة خلوية للتحقق من حالة RPE ناضجة. تجدر الإشارة إلى أن بعض الطفرات BEST1 قد يؤثر على التعبير عن البروتين، حيث علامات RPE راسخة أخرى مثل RPE65 وكرالبب لا يزال يتعين تقييم (الشكل 3).
يمكن الحفاظ على الخلايا RPE هبسك0 ف نضجت لمدة 2-3 أشهر قبل تقسيم (إلى ف1) لتصحيح كامل الخلية المشبك. ف0 الخلايا أقدم من 3 أشهر لا ينصح المشبك التصحيح ولكن لا يزال يمكن أن تستخدم للتجارب إيمونوبلوتينج وإيمونوستينينج.
رقم 1: يميز RPE هبسك الخلايا في مراحل مختلفة- صور الممثل لمجموعات RPE هبسك المصطبغة بلوحات الثقافة في أول ظهور (A)، قبل عزلة (ب)، وبعد النمو إلى مرحلة النضج بعد عزلة (ج). عرض العين والمرحلة X 20 تباين الصور ترد في لوحات أعلى وأسفل، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: صورة تمثيلية مكشطة الخلية الصغرى سحبت من ماصة باستور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: التحقق حالة ناضجة RPE RPE هبسك متمايزة خلايا من إيمونوبلوتينج- يظهر التعبير عن علامات البروتين محددة RPE BEST1 و RPE65 وكرالبب في خلايا هبسك و RPE هبسك WT البقع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: Immunostaining BEST1 في وزن هبسك-الرؤى. (أ) ممثل إيمونوفلوريسسينت الصور التي تبين توطين غشاء WT BEST1 في الخلايا على شكل حصاة كبيرة هبسك-RPE. إيمونوستاينينج (ب) سلبية تحكم إهمال جسم الابتدائي BEST1.
الرقم 5: تسجيلات المشبك تصحيح كامل الخلية من الرؤى هبسك. (A) A RPE هبسك وحيدة الخلية لتصحيح كامل الخلية المشبك. (ب) آثار الحالي الممثل مسجل من BEST1 WT هبسك-RPE و BEST1 تحور RPE هبسك في ذروة Ca2 +. ويرد في الإدراج الجهد البروتوكول المستخدم للحصول على التيارات. شريط المقياس = nA 1، 150 السيدة انظر الجدولين 3 و 4 الجدول للتصحيح المشبك إعداد التفاصيل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| كاشف | المبلغ |
| دميم المغلوب (كو) | 500 مل |
| استبدال المصل كو | 15% (75 مل) |
| الأحماض الأمينية غير الأساسية | 1% (5 مل) |
| الجلوتامين | 1% (5 مل) |
| البنسلين-ستربتوميسين | 1% (5 مل) |
| نيكوتيناميد | 10 ملم |
| أضافت البشرية-A * | 100 نانوغرام/مليلتر |
| * البشرية وأضافت-أ تستكمل خلال الأيام 15-28 من البروتوكول التمايز. | |
الجدول 1: متوسط التمايز RPE.
| كاشف | المبلغ |
| MEM (تعديل α) | 500 مل |
| مصل الدم البقري الجنين | 5% (25 مل) |
| الملحق N1 | 1% (5 مل) |
| الجلوتامين-البنسلين-ستربتوميسين | 1% (5 مل) |
| الأحماض الأمينية غير الأساسية | 1% (5 مل) |
| توراين | 125 ملغ |
| الهيدروكورتيزون | 10 ميكروغرام |
| Triiodo-thyronin | ميكروغرام 0.0065 |
الجدول 2: RPE الثقافة المتوسطة.
| كاشف | تركيز |
| CsCl | 130 مم |
| مجكل2 | 1 مم |
| عطا | 10 ملم |
| المغنيسيوم ATP | 2 مم |
| حبيس (درجة الحموضة 7.4) | 10 ملم |
| كاكل2* | ويختلف |
| السكر * * | ~ 5 مم |
| * إضافة كاكل2 للحصول على المطلوب Ca2 + تركيز | |
| * * استخدام الجلوكوز لضبط الاسموليه لموسم 290-295/لتر | |
الجدول 3: التصحيح المشبك حل داخلي.
| كاشف | تركيز |
| كلوريد الصوديوم | 140 ملم |
| بوكل | 5 مم |
| مجكل2 | 1 مم |
| كاكل2 | 2 مم |
| حبيس (درجة الحموضة 7.4) | 10 ملم |
| السكر * | ~ 5 مم |
| * استخدام الجلوكوز لضبط الاسموليه لموسم 300 – 305/ل. | |
الجدول 4: تصحيح الحل الخارجي المشبك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هو الإجراء الأكثر أهمية للمرض في طبق النهج التفريق بين هبسكس مع طفرة المسببة للمرض إلى نسب الخلية الصحيحة، وهو RPE ل BEST1. وهكذا، بعد كل تجربة التمايز، RPE هبسك الخلايا الناتجة ينبغي بعناية المصادقة لوضعهم ناضجة مورفولوجيس RPE على حدة والبروتين علامات16،،من1718. للتقليل من قطعة أثرية الاستنساخ، يجب استخدام استنساخ هيبسك متعددة من المريض نفسه أو استنساخ هيس متعددة مع الطفرة ذاتها كلما كان ذلك ممكناً.
يمكن أن تكون متباينة خطوط هيبسك وهيس إلى RPE مع البروتوكول نفسه. يمكن أن تعاد برمجتها هيبسكس مع أو بدون طفرة في الجين BEST1 من الليفية الجلد للمرضى BEST1 أو صحية من الجهات المانحة، على التوالي. يمكن أن يكون هيسكس تحمل طفرة في BEST1 وراثيا من الخط هيس الأبوية، والتي قد BEST1 (WT) البرية من نوع. الطرق هيبسك-RPE و RPE هيس لها مزاياها وعيوبها. السابق أكثر خاصة بالمريض وذات الصلة سريرياً، لا سيما للطب شخصية. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن هناك العديد من القيود للنهج هيبسك-RPE: 1) من الصعب لوجستيا الوصول إلى طائفة كاملة من عينات المرضى BEST1 ، كما يتعذر دائماً منح الهبات المقدمة من المرضى، وبعض الطفرات جداً نادرة في المقام الأول؛ 2) تعمل غير محددة قد يؤدي من مختلف الخلفيات الوراثية والظروف المادية للجهات المانحة؛ 3) هيبسك إلى RPE تمايز الكفاءة يختلف لمختلف الجهات المانحة، حيث أن بعض الحالات يمكن أن يكون تحديا تقنيا للحصول على هيبسك-الرؤى. من ناحية أخرى، توجيه هيس-RPE، على الرغم من أن أكثر اصطناعية، يوفر منبرا متعدد الاستخدامات لتوليد الرؤى هيس اسوي مع الطفرات المرغوبة حسب الطلب للتحقيقات الفنية غير متحيزة.
ناضجة RPE الخلايا المصطبغة والمضلع، ومتصلة بتقاطعات ضيق في أحادي الطبقة. بعد تقسيم عدد سكان خلية مفردة للتصحيح المشبك، الخلايا RPE هبسك ريسيديد طازجة سوف تفقد الشكل المضلع، ولكن ما زالت تحتفظ تصبغ لعدة أيام (الشكل 5A). المشبك التصحيح هو المنجز ح 24 – 72 بعد تقسيم الخلية، هي الفترة التي التصبغ لا يزال استخدامها كعلامة مرئية لتحديد الخلايا التي تحتوي على حالة RPE جيدة. خلية لطيف تقسيم الناتج في معظم الخلايا المفردة المنفصلة جيدا دون موت الخلية كبيرة هو المفتاح لنجاح المشبك التصحيح.
تم توثيق عدة بروتوكولات التمايز الأخرى باستخدام وسائط الثقافة خلية مختلفة وعوامل النمو في21،الأدب32. الوقت اللازم للتفريق بين هبسك إلى RPE مماثلة في كل من هذه البروتوكولات بما فيها وفدنا، في حين أنه من الصعب معرفة ما إذا كان هناك أي اختلاف كبير في كفاءة التفريق دون مقارنة جنبا بجنب. تجدر الإشارة إلى أن في البروتوكول الحالي، RPE هبسك خلايا تزرع في لوحات مسطحة القاع العادية ولكن لا على ألواح مع إدراج الغشاء، حيث لا يجوز الخص هبسك-RPE التي تم إنشاؤها بواسطة هذا الإجراء أفضل الأقطاب RPE خلايا في فيفو. ولذلك، معظمها تناسب التقنيات الموضحة أعلاه في بحث إعداد33، على الرغم من أن يمكن أيضا استزراع الخلايا RPE هبسك الذي تم إنشاؤه في لوحات ترانسويل بشكل أحادي الطبقة RPE أوراق للأغراض السريرية17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذا المشروع من المعاهد الوطنية للصحة منح EY025290، GM127652، وجامعة روتشستر بدء التمويل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
References
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease). Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Boon, C. J., et al. The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).
- Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. Functional roles of bestrophins in ocular epithelia. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).
- Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium. Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane. J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines. Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).
- Milenkovic, A., et al. Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).
- Moshfegh, Y., et al. BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE. Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. Elife. 6, (2017).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).
- Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), e0125631 (2015).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Idelson, M., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maruotti, J., et al. A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nat Commun. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Gong, J., et al. Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate. PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).
- Zhang, Y., et al. ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction. Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).
