Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att skilja retinal pigment epitel (RPE) celler från mänskliga pluripotenta stamceller bär patientderiverade mutationer. De muterade cellinjer kan användas för funktionella analyser inklusive immunoblotting, immunofluorescens och patch clamp. Denna sjukdom-i-ett-skålen strategi kringgår svårigheten att få infödda mänskliga RPE-celler.
Abstract
Även om över 200 genetiska mutationer i mänskliga BEST1 -genen har identifierats och kopplade till retinala degenerativa sjukdomar, vara de patologiska mekanismerna svårfångade främst på grund av avsaknaden av en bra in-vivo -modell för att studera BEST1 och dess mutationer under fysiologiska betingelser. BEST1 kodar en jonkanal, nämligen BESTROPHIN1 (BEST1), som fungerar i pigmentepitelet (RPE); dock är ytterst begränsad tillgänglighet till infödda mänskliga RPE-celler en stor utmaning för vetenskaplig forskning. Det här protokollet beskriver hur man skapar mänskliga RPEs bär BEST1 sjukdomsframkallande mutationer av inducerad differentiering från mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs). Som hPSCs är själv förnybara, detta tillvägagångssätt tillåter forskare att ha en stadig källa till hPSC-RPEs för olika experimentella analyser, såsom immunoblotting, immunofluorescens och patch clamp, och ger därmed en mycket kraftfull sjukdom-i-ett-skålen modell för BEST1-associerade retinal villkor. Bland annat kan denna strategi användas för att studera RPE (patolo) fysiologi och andra gener av intresse inföding uttryckt i RPE.
Introduction
Det har dokumenterats som minst fem retinala degenerativa sjukdomar orsakas av genetiska mutationer BEST1 -genen1,2,3,4,5,6 , 7 , 8, med antalet rapporterade mutationer redan över 200 och fortfarande ökande. Dessa BEST1-associerade sjukdomar, även känd som bestrophinopathies, orsaka progressiv synförlust och med blindhet, och för närvarande finns det inga effektiva behandlingar. Proteinprodukter av BEST1, nämligen BESTROPHIN1 (BEST1), är en Ca2 +-aktiverade Cl– kanal (CaCC) specifikt uttryckt i pigmentepitelet (RPE) av ögonen5,6, 8,9. Ännu viktigare, en klinisk fenotyp av BEST1-associerade sjukdomar är minskad visuella svar på ljus stimuli, kallas light peak (LP) mätt i electrooculogram10,11; LP är trodde till vara medierade av en CaCC RPE12,13,14. För att bättre förstå de patologiska mekanismerna av BEST1 mutationer och att arbeta mot potentiella behandlingar, är det viktigt att studera mutant BEST1 kanaler endogenously uttryckt i mänskliga RPE-celler.
Dock att erhålla RPE-celler direkt från levande patienter är mycket opraktiskt. Även om infödda RPE-celler kan skördas från biopsier av mänskliga kadaver och foster, begränsar svårt tillgängligheten till dessa källor avsevärt vetenskaplig forskning. Därför är det avgörande att ha alternativa RPE källor än mänskliga ögon. Detta samtalet har besvarats av senaste framsteg i stamceller tekniker, som funktionell RPE-celler kan nu göras åtskillnad mellan från mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs), inklusive embryonala stamceller (hESCs) och inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), den senare som genereras av omprogrammering primära hud fibroblaster från givare16,17,18. Ännu viktigare, säkerställer den självförnyelse och pluripotency av hPSCs en tillförlitlig källa för att generera RPEs, medan patienten-specificitet hiPSCs och genomisk modifiering potential hESCs (t.ex., av CRISPR) erbjuder en mångsidig sjukdom-i-ett-skålen modell för önskad BEST1 mutationer.
hPSC-RPE har flera fördelar jämfört med möss RPE-modeller: 1) BEST1 knockoutmöss visar inte någon retinal abnormitet19, öka möjligheten av olika genetiska kravet av BEST1 i RPE mellan möss och människor; (2) endast 3% av mänskliga RPE-celler är binucleate, i motsats till 35% i möss20; (3) hiPSC-RPE potentierar autolog transplantation i klinisk behandling av retinala sjukdomar21. Dock djurmodeller fortfarande oumbärlig för att studera RPE fysiologi och patologi i ett levande system, och hiPSC onkogen potential kan inte förbises.
Den här proceduren beskriver en användbar och måttligt enkel hPSC till RPE differentiering protokoll som kan användas för forskning och kliniska ändamål. Detta protokoll använder nikotinamid (vitamin B3) att öka differentieringen av hPSCs till nervvävnad, som vidare framkallas differentieras till RPE av behandling med activin-A. Nikotinamid behandling har visat sig öka antalet pigmenterade celler (ett tecken på differentiering in RPE), möjligen av förmildrande aktiviteten apoptotiska skilja celler22. De resulterande hPSC-RPE-cellerna Visa samma viktiga markörer, kullersten morfologi och cellulära funktioner som infödda mänskliga RPE celler22. Således i en forskning är resulterande hPSC-RPE-cellerna lämplig för nedströms funktionella analyser inklusive immunoblotting, immunfärgning och hela-cell patch clamp, som detaljerade experimentella procedurer tillhandahålls också. Kliniskt, har RPE-celler som härrör från stamceller visat stor potential för transplantation behandling av makuladegeneration i både djurstudier och mänskliga försök23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. differentiering av hPSC till RPE
- Underhålla och passage hPSCs beskrivs som tidigare18.
Obs: Alla celler (inklusive hPSCs och hPSC-RPEs) odlas i 37 ° C på 5% CO2 under hela tid av tillväxt och differentiering-protokollen. -
Innan differentiering, split konfluenta hPSCs till före 6-väl plattorna.
- Coat plattor, Tina basalmembranet matris på is för ca 1 h, upphäva liquidized matris i 4 ° C DMEM medium 1:50 utspädning, lägga 800 µL beläggning blandning till varje brunn och inkubera i minst 1 h vid 37 ° C.
- När beläggningen är komplett, sug ut blandningen och omedelbart lägga till 1,5 – 2 mL medium i brunnar.
- För att häva hPSCs från gamla kultur plattorna, inkubera cellerna med PBS plus 0,5 mM EDTA för 5 min i rumstemperatur, aspirera lösningen och resuspendera cellerna i små klumpar med odlingsmedium.
- Utsäde celler på ~ 20% konfluens i nya plattor.
Obs: Lagra basalmembranet matris i 100 µL portioner vid-20 ° C och Använd en alikvot för att belägga en 6-bra platta. Tiden för beläggning kan förlängas upp till 4 h vid 37 ° C eller över natten i rumstemperatur. Det är viktigt att upphäva och utsäde hPSCs som små klumpar av 3 – 5 celler snarare än enstaka celler.
- När cellerna odlas till full konfluens, ersätta odlingssubstratet med differentiering medium (4 mL per brunn) (tabell 1, utan activin-A). Kultur i 14 dagar, ändra mediet (4 mL per brunn) 3 x / vecka.
Obs: De hPSC tallrik täthet dubblar ungefär varje 24 h. betydande celldöd förväntas efter starten av förfarandet för differentiering. Aggregat av döda celler och skräp i brunnarna kan ses med blotta ögat under medellång förändringar. - Från dag 15 till dag 28, komplettera differentiering medium med 100 ng/mL mänskliga activin-A (tabell 1, med mänskliga activin-A). Ändra mediet (4 mL per brunn) 3 x / vecka.
- Stoppa activin-A tillskott start dag 29 (tabell 1, utan mänskliga activin-A). Fortsätt cell odling i differentiering medium för 8 – 10 veckor tills pigmenterad hPSC-RPE kluster visas (figur 1A-B).
Obs: Kluster av pigmenterade celler kan ses som små mörka prickar på en cell kultur tallrik med blotta ögat (figur 1A-B, överst). Enskilda pigmenterade celler med signatur kullersten formen kan ses i 20 X Mikroskop (figur 1A-B, botten).
2. isolering och kultur av differentierade RPE-celler
- Ta bort differentiering medium, tvätta en gång med PBS, tillsätt 1 mL 0,05% trypsin plus 1 U/µL kollagenas i varje brunn, och inkubera vid 37 ° C i 20 – 30 min. ta bort de trypsin/kollagenas och försiktigt och tillsätt 2 mL av pre värmde RPE medium i varje brunn av 6-väl plattan (< C0 > tabell 2).
Obs: Använd en inverterade Mikroskop för att övervaka morfologi av hPSC-RPE-cellerna, vilka polygonal före trypsin/kollagenas behandling, och bli runda efter tillräcklig matsmältningen. -
Använd en bunsenbrännare till pull glas Pasteur-pipetter.
- Håll med båda händerna, en lång (9 tum) Pasteur-pipett i båda ändar så det är horisontell, och framför bunsenbrännare ca 2/3 ned längden på den tunna delen av pipetten.
- När glaset blir mjuka från lågan, snabbt dra två ändar isär, så att en micro skrapan-liknande spets bildas nya slutet av pipetten (figur 2).
- Upprepa flera gånger för att skapa flera ”cell skrapor”. Spraya de drog pipetterna med 70% etanol för sterilisering och lufttorka dem i cellen kultur huven.
-
I Mikroskop, använda en mikro ”cell skrapan” att sära försiktigt pigmenterade hPSC-RPE kluster från plattan.
- Knacka försiktigt (inte skrapa) direkt på pigmenterade celler, som kommer att flyta upp i odlingsmediet när de tar avstånd från botten av brunnen.
- Använd omedelbart en 20 µL mikropipett för att försiktigt sug dissocierade hPSC-RPE-cellerna och överföra dem till en pre belagda 6-well platta med RPE medium24.
- Samla in ~ 5 x 103 celler (~ 10% konfluens som observerats i 20 X Mikroskop) i varje pre belagda väl av en 12-well platta genom att upprepa steg 2.3.1–2.3.2 flera gånger, som behövs. Ta sista volymen av medium till 2 mL.
Obs: För att förhindra dissocierade hPSC-RPE celler från flytande bort, undvika rörelse av plattorna under processen dissociation sådan att dissocierade cellerna är flytande medium men fortfarande lokalt koncentrerade.
- Kultur nyligen isolerade hPSC-RPE-celler (P0) på 12 brunnar i RPE medium i ytterligare 6-8 veckor att tillåta dem att bilda en pigmenterad enskiktslager (figur 1 c).
- Ändra mediet 3 x / vecka. När du ändrar mediet, lämna ca 1/3 volym av gamla medium i varje brunn och Lägg 2/3 volym av färska, pre värmde RPE medium. I detta skede, Använd 2 mL av RPE medium för varje brunn i en 12-well platta (således exchange 1,3 mL medium varje gång).
Obs: Enskiktslager av P0 hPSC-RPE-celler kan bilda kupoler, tyder på att cellerna aktivt transportera vätskor, och är förankrad med åtsittande föreningspunkter25. Därför är dome bildandet en indikator på mogen RPE status.
3. RPE öde validering av Immunoblotting
- Göra den hPSC-RPE cellen lysate med däggdjursprotein utvinning buffert kompletteras med proteinas hämmare cocktail. Inkubera i den cell lysate ice för 30 min innan centrifugering vid 13 000 x g i 15 minuter vid 4 ° C att kassera oupplösta cellfragment. Mätning av totala protein koncentrationen av lysat.
- Denaturera 40 µg totalt protein i Laemmli SDS prov buffert vid 75 ° C för 10 min. separera proteinet prover på en 10% Tris-glycin SDS-PAGE gel vid en konstant spänning på 90 V för 15 min och sedan 150 V tills dye front når botten av gelen.
- Överföra proteinerna på ett nitrocellulosa membran i nedkylda Tris-glycin buffert kompletteras med 10% metanol vid 100 V för 1 h.
- Blockera membranet i Tris buffrad koksaltlösning med 0,1% icke-joniskt rengöringsmedel (TBST) och 5% fettfri torr mjölk för 1 h i rumstemperatur.
- Inkubera membranet med primära antikroppar utspätt i det blockerande buffert vid 4 ° C över natten. Späd antikropparna inriktning RPE specifik markör proteiner som följer: RPE65, 1:1, 000; CRALBP, 1:1, 000; BEST1, 1:1, 000. Späd antikroppen mot β-aktin på 1:10,000 att upptäcka β-aktin som lastning kontroll.
- Tvätta membranet med TBST 3 gånger, med 5 min för varje tvätt.
- Inkubera membranet med fluorophore konjugerade get antimus IgG sekundär antikropp utspädd 1:10,000 i blockerande buffert för 1 h i rumstemperatur.
- Tvätta membranet med TBST 4 gånger, med 10 min för varje tvätt.
- Upptäcka de proteiner via IR imaging system (figur 3).
4. Kontrollera BEST1 subcellulär lokalisering av immunfärgning
- Tvätta hPSC-RPE-celler med 2 mL PBS en gång och fixa i 2 mL 4% PARAFORMALDEHYD för 45 min i rumstemperatur.
- Tvätta två gånger med 2 mL PBS och inkubera cellerna i 2 mL PBS med 0,1% icke-joniskt ytaktivt ämne och 2% åsna serum för 45 min att blockera icke-specifik bindning webbplatser.
- Inkubera cellerna med BEST1 antikropp (spädning 1: 200) för 2 h i rumstemperatur.
- Tvätta cellerna med 2 mL PBS 3 gånger. Inkubera med fluorophore konjugerat sekundära IgG (1:1, 000) för 1 h i rumstemperatur.
- Tvätta med 2 mL PBS 3 gånger för att avlägsna obunden sekundär antikropp.
- Observera färgade celler av konfokalmikroskopi (figur 4).
5. inspelning Ca2 +-beroende Cl– ström i hPSC-RPE av hela-cell Patch Clamp
- 24-72 h innan patch klämman, dela en fullt konfluenta väl (på en 12-väl tallrik) av mogna P0 hPSC-RPE-celler (kullersten-formade och pigmenterad). Aspirera medium, tvättas en gång med PBS och tillsätt 1 mL 0,05% trypsin plus 1 U/µL kollagenas i brunnen.
Obs: Varm före den trypsin/kollagenas till 37 ° C precis före användning. - Inkubera vid 37 ° C i 8 min.
Obs: Efter detta steg, hPSC-RPE-cellerna är fortfarande vidhäftande och anslutna. - Använd en 1 mL mikropipett för att försiktigt tvätta cellerna bort plattan och överföra celler i matsmältningen blandningen till en 15 mL koniska rör. Tvätta väl med 1 mL före värmde trypsin/kollagenas att samla in de resterande cellerna och kombinera dem till 15 mL koniska röret.
Obs: HPSC-RPE-cellerna är fortfarande i stora klumpar på denna punkt. Försök inte att bryta cell klumpar av kraftig pipettering. Några klumpar kan hålla sig till den inre väggen av 1 mL spets. - Inkubera koniska röret i ett 37 ° C torr bad i 8 min.
- Använd en 1 mL mikropipett att försiktigt pipett up-and-down 10 – 15 gånger matsmältningen mixen.
Obs: Cell klumpar blivit mycket mindre men fortfarande synliga. Undvik kraftig pipettering. - Upprepa föregående två steg.
Obs: De flesta av cellerna bör vara i encelliga suspension efter pipettering. Det kan fortfarande finnas vissa små cell klumpar, som är godtagbara. Valfritt: Inkubera koniska röret vid 37 ° C för en ytterligare 5 min följt av mild pipettering. Den totala tiden i den trypsin/kollagenas vid 37 ° C bör inte överstiga 30 min (8 + 8 + 8 + 5 = 29). - Tillsätt 5 mL av pre värmde RPE medium till 15 mL koniska röret som innehåller smält celler. Snurra på 200 x g för 5 min att samla cellerna. Återsuspendering och utsäde celler före belagda 35 mm rätter på 10 – 20% konfluens (t.ex., en 100% konfluenta väl på en 12-well platta till fem 35 mm rätter för 10% konfluens).
Obs: I alla tider, undvika kraftig pipettering, vilket kan orsaka betydande celldöd som representeras av uppenbara mörka cellfragment i supernatanten efter centrifugering. Väl separerade encelliga sådd är viktigt för patch clamp inspelning. - Utför hela-cell patch clamp som tidigare beskrivits18,26,27,28,29,30,31. Förvärva nuvarande spår från en familj av steg potentialer (-100 till + 100 mV från en anläggning potential 0 mV) (figur 5).
Obs: Recept av interna och externa lösningar beskrivs i tabell 3 och tabell 4, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det mest tekniskt utmanande steget är den manuella isolering, som syftar till att uppnå en hög renhet av en differentierad P0 hPSC-RPE befolkning. Efter en framgångsrik isolering, > 90% celler i P0 befolkningen kommer att växa och mogna för att Visa signatur RPE morfologier (figur 1 c). Förekomsten av en mindre del av icke-RPE eller omogna RPE-celler i P0 befolkningen är nästan oundvikligt, men kommer inte störa de efterföljande experiment så länge antalet pigmenterad och kullersten-formad hPSC-RPE-celler är överväldigande majoritet.
Med hPSC-RPE baserat sjukdom-i-ett-skålen inställning kan varje patient-specifika BEST1 mutation vara omfattande kännetecknas i vivo för dess proteinuttryck (immunoblotting, figur 3), människohandel () membran immunfärgning, figur 4), och kanal Jonfunktionen (hela-cell patch clamp, figur 5). Dessa resultat kommer att ge viktig information för att klarlägga de patologiska mekanismerna av kanal mutationerna och utveckla personlig medicin.
Som BEST1 uttrycks huvudsakligen i RPE-celler, kan det användas som en cellulär markör för validering av en mogen RPE-status. Det bör noteras att vissa BEST1 mutationer kan påverka dess proteinuttryck, så andra väletablerade RPE markörer såsom RPE65 och CRALBP fortfarande måste utvärderas (figur 3).
Mognat P0 hPSC-RPE-celler kan bibehållas för 2-3 månader innan uppdelning (att P1) för hela-cell patch clamp. P0 celler äldre än 3 månader rekommenderas inte för patch-clamp men kan fortfarande användas för immunoblotting och immunfärgning experiment.
Figur 1: differentierade hPSC-RPE-celler i olika stadier. Representativa bilder av pigmenterade hPSC-RPE kluster i kultur plattorna vid första framträdande (A), före isolering (B) och efter tillväxt till förfall efter isolering (C). Öga-view och 20 X fas kontrast bilder visas i övre och nedre panelerna, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativ bild av micro cell skrapan drog från en Pasteur-pipett. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: validering av mogen RPE status för differentierade hPSC-RPE-celler av immunoblotting. Blotting visar uttrycket av RPE-specifika protein markörer BEST1 och RPE65 CRALBP i WT hPSC och hPSC-RPE-cellerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: immunfärgning av BEST1 i WT hPSC-RPEs. (A) representanten Immunofluorescerande bilder visar membran localizationen av WT BEST1 på kullersten-formad hPSC-RPE-celler. (B) immunfärgning negativ kontroll utelämna den BEST1 primär antikroppen.
Figur 5: hela-cell patch clamp inspelningar av hPSC-RPEs. (A) A enda hPSC-RPE cell för hela-cell patch clamp. (B) representativa nuvarande spår inspelade från en BEST1 WT hPSC-RPE och en BEST1 muterade hPSC-RPE vid peak Ca2 +. Spänning protokollet som används för att framkalla strömmar visas i skäret. Skalstapeln = 1 nA, 150 ms. se tabellerna 3 och tabell 4 för patch clamp förberedelse Detaljer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens | Belopp |
| Knock-Out (KO) DMEM | 500 mL |
| KO serum ersätter | 15% (75 mL) |
| Onödiga aminosyror | 1% (5 mL) |
| Glutamin | 1% (5 mL) |
| Penicillin-streptomycin | 1% (5 mL) |
| Nikotinamid | 10 mM |
| Mänskliga activin-A * | 100 ng/mL |
| * Mänskliga activin-A kompletteras under dagarna 15-28 av protokollet differentiering. | |
Tabell 1: RPE differentiering Medium.
| Reagens | Belopp |
| MEM (α ändring) | 500 mL |
| Fetalt bovint Serum | 5% (25 mL) |
| N1 tillägg | 1% (5 mL) |
| Glutamin-penicillin-streptomycin | 1% (5 mL) |
| Onödiga aminosyror | 1% (5 mL) |
| Taurin | 125 mg |
| Hydrokortison | 10 µg |
| Triiodo-thyronin | 0.0065 µg |
Tabell 2: RPE odlingsmedium.
| Reagens | Koncentration |
| CsCl | 130 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| EGTA | 10 mM |
| Magnesium ATP | 2 mM |
| HEPES (pH 7,4) | 10 mM |
| CaCl2* | Varierar |
| Glukos ** | ~ 5 mM |
| * Lägg till CaCl2 för att erhålla önskad Ca2 + koncentration | |
| ** Använd glukos för att justera osmolaritet till 290 – 295 mOsm/L | |
Tabell 3: Patch Clamp intern lösning.
| Reagens | Koncentration |
| NaCl | 140 mM |
| KCl | 5 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| CaCl2 | 2 mM |
| HEPES (pH 7,4) | 10 mM |
| Glukos * | ~ 5 mM |
| * Använda glukos för att justera osmolaritet till 300 – 305 mOsm/L. | |
Tabell 4: Patch Clamp extern lösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det viktigaste förfarandet för metoden sjukdom-i-ett-skålen är att differentiera hPSCs med en sjukdomsframkallande mutation till rätt cell härstamning, som är RPE för BEST1. Således, efter varje differentiering experiment, de resulterande hPSC-RPE-cellerna bör noggrant valideras för deras mogna status av RPE-specifika morfologier och protein markörer16,17,18. För att minimera klonal artefakt, bör flera hiPSC kloner från samma patient eller flera hESC kloner med samma mutation användas när det är möjligt.
Både hiPSC och hESC linjer kan differentieras till RPE med samma protokoll. hiPSCs med eller utan en mutation i BEST1 -genen kan omprogrammeras från huden fibroblaster av BEST1 patienter eller friska donatorer, respektive. hESCs bär en mutation i BEST1 kan vara genetiskt manipulerade från föräldrarnas hESC linjen, som har den vildtyp (WT) BEST1. De hiPSC-RPE och hESC-RPE linjerna har sina egna fördelar och nackdelar. Den förstnämnda är mer patient-specifika och kliniskt relevant, särskilt för personlig medicin. Det är dock värt att notera att det finns flera begränsningar för metoden hiPSC-RPE: 1) det är logistiskt svårt att få tillgång till ett fullt spektrum av BEST1 patientprover, som donationer från patienter inte alltid beviljas, och vissa mutationer är mycket sällsynt i första hand; (2) icke-specifik fenotyper kan resultera från olika genetiska bakgrunder och fysiska förhållanden givarnas; (3) hiPSC till RPE differentiering effektivitet varierar för olika givare, sådan att vissa fall kan vara tekniskt svårt för att få hiPSC-RPEs. Å andra hESC-RPE rutten, även om mer konstgjorda, erbjuder en mångsidig plattform för att generera syngena hESC-RPEs med önskad mutationer på efterfrågan på icke-partisk funktionella utredningar.
Mogen RPE-celler är pigmenterade, polygona och anslutna med tight junctions i en enskiktslager. Efter uppdelning i en enda cell befolkningen för patch-clamp, kommer att nymalen reseeded hPSC-RPE-cellerna förlora månghörnigt form, men fortfarande behålla pigmentering i flera dagar (figur 5A). Patch clamp är utfört 24-72 h efter cell delning, under vilken tid pigmentering kan fortfarande användas som en synlig markering markera celler med bra RPE status. En skonsam cell split vilket resulterar i en majoritet av väl separerade enstaka celler utan betydande celldöd är nyckeln till framgång för patch klämman.
Flera andra differentiering protokoll använder annan cell kulturmassmedia och tillväxtfaktorer har dokumenterats i litteraturen21,32. Den tid som krävs för differentiering av hPSC till RPE är liknande i alla dessa protokoll inklusive vår, medan det är svårt att berätta om det finns någon betydande skillnad i differentiering effektivitet utan en sida-vid-sida jämförelse. Det bör noteras att i det nuvarande protokollet, hPSC-RPE-celler odlas i vanlig platt botten pläterar men inte på tallrikar med membran skär, så hPSC-RPE genereras genom detta förfarande inte kan bäst sammanfatta polariteten av RPE-celler i vivo. De tekniker som beskrivs ovan passar därför mestadels i en forskning inställningen33, även om genererade hPSC-RPE-cellerna kan också vara odlade i Transwell plattor till formuläret enskiktslager RPE ark för kliniska ändamål17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta projekt har finansierats av NIH grants EY025290, GM127652 och University of Rochester startfinansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
References
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease). Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Boon, C. J., et al. The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).
- Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. Functional roles of bestrophins in ocular epithelia. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).
- Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium. Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane. J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines. Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).
- Milenkovic, A., et al. Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).
- Moshfegh, Y., et al. BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE. Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. Elife. 6, (2017).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).
- Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), e0125631 (2015).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Idelson, M., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maruotti, J., et al. A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nat Commun. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Gong, J., et al. Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate. PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).
- Zhang, Y., et al. ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction. Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).
