Summary
Дифференциация белых и бежевых адипоцитов из жировой ткани сосудистой прародителями медведи потенциал повышения метаболизма ожирения. Мы описываем протоколы для CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток изоляции из человеческого жира и последующих в vitro расширения и дифференцировку в белом и бежевом адипоцитов. Обсуждаются несколько нисходящие приложения.
Abstract
Ожирение сопровождается обширной реконструкции жировой ткани главным образом через Адипоцит гипертрофия. Экстремальные Адипоцит роста приводит к плохой ответ на инсулин, местные гипоксии и воспаления. Стимулируя дифференциация функциональных белый адипоцитов из прародителей, радикальные гипертрофия Адипоцит населения могут быть предотвращены, и, следовательно, метаболически здоровье жировой ткани могут быть улучшены наряду с сокращением воспаление. Кроме того стимулируя дифференциация бежевый/коричневый адипоциты, расходование энергии всего тела может быть увеличена, что приводит к потере веса. Этот подход может предотвратить развитие ожирения сопутствующие заболевания, такие как тип 2 диабет и сердечно-сосудистых заболеваний.
Этот документ описывает изоляции, расширение и дифференциации белых и бежевых адипоцитов из подмножества жировых тканях человека эндотелиальных клеток, которые совместно Экспресс CD31 и CD34 маркеров. Метод является относительно дешевым и не является трудоемким. Она требует доступа к человека жировой ткани и подкожные депо подходит для выборки. Для этого протокола, свежие жировой ткани образцов из morbidly ожирением предметы [индекс массы тела (ИМТ) > 35] собраны во время процедур бариатрической хирургии. Использование последовательных immunoseparation стромальные сосудистой фракции, достаточно клетки производятся из всего лишь 2-3 g жира. Эти клетки могут быть расширены в культуре в течение 10-14 дней, может быть криоконсервированных и сохраняют свои свойства адипогенном с пассированый до прохождения 5-6. Клетки обрабатываются в течение 14 дней с адипогенном коктейль, используя сочетание человеческого инсулина и PPARγ агонист Росиглитазон.
Эта методология может использоваться для получения доказательство концепции экспериментов на молекулярные механизмы, которые управляют адипогенном ответы в жировых клетках эндотелия, или для скрининга новых лекарств, которые могут повысить адипогенном ответ направлена либо на белый или бежевый/коричневый Адипоцит дифференциации. С помощью небольших подкожной биопсий, эта методология может использоваться для экрана-ответчик предметам для клинических испытаний, направленных на стимулирование бежевый/коричневый и белый адипоциты для лечения ожирения и сопутствующие заболевания.
Introduction
Последние данные показывают, что в мышей и людей, подмножество ячеек, проживающих в сосудистую жировой ткани могут быть продифференцированы в белый или бежевый/коричневый адипоцитов1,2,3. Фенотип таких клеток является предметом споров, с подтверждающей эндотелиальных клеток, гладкие мышцы/перицит или спектр промежуточных фенотипов4,5,6,7. Область разработки этой методологии было проверить адипогенном потенциал CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток, изолированных от различных жировых отложений из тучных людей. Другие исследования в литературе сосредоточены на адипогенном потенциал всего стромальные сосудистой дроби или известных Адипоцит прародителями2,8,9. Поскольку в настоящее время существующих технологий можно ориентировать конкретно эндотелиальные клетки жировой ткани для доставки наркотиков10, понимание потенциал таких клеток пройти адипогенном индукции к белый или бежевый адипоцитов имеет важное значение для будущее целевой терапии.
Различные группы сообщили сочетание CD31 и CD34 маркеры как суррогаты изолировать эндотелиальных клеток от жировых тканях человека11,12,13. Как правило изоляция выполняется с использованием двух последовательных шагов и положительный выбор с помощью магнитной бусины. В настоящем докладе была использована immunoseparation с помощью CD34 + магнитные шарики в сочетании с CD31 пластиковые бусины. Мы нашли этот метод превосходит последовательный магнитные immunoseparation в отношении сохранения типичных булыжником эндотелиальной морфологии. Кроме того мы были способны генерировать достаточно клеток, необходимых для расширения и адипогенном индукции, начиная от всего лишь 1 – 2 g жира. Небольшой пример биопсии подкожного жира достаточно производить необходимое количество клеток для нисходящие приложения. Этот аспект является потенциально важным, особенно, если этот метод будет использоваться для скрининга для оперативности адипогенном индукции в человеке.
В отличие от других систем, в литературе о, этот метод использует только два ингредиенты для индукции адипогенном CD34 + CD31 + клеток: агонист PPARγ — Росиглитазон — и человеческого инсулина. Важно отметить, что количество инсулина используются попадает в диапазон нормальный/высокий циркулирующих post-absorptive инсулина в людях14. Степень реагирования на инсулин клетки в пробирке, измеряется Akt фосфорилирование, не коррелирует с их способность реагировать на индукции коктейль. Интересно, что используя этот индукции коктейль и экспериментальных условиях, смесь белый и бежевый/коричневый клетки были получены как определяется размер и количество внутриклеточной липидного капель и проявление молекулярных маркеров. Этот простой и экономически индукции протокол наряду с количественной оценки фенотипа клетки ответчика (белый и бежевый) позволяет для скрининга агентов, которые потенциально могут изменить баланс дифференцированных бежевый : белый адипоцитов.
Этот метод также предоставляет поступательного подхода для понимания основных механизмов adipogenesis сосудистого эндотелия прародителей в жировых тканях человека. Используя эту технику конкретных изоляции/дифференциация, следователи могут допросить различных путей, ответственный за adipogenesis в подмножестве сосудистой эндотелиальных клеток от различных жировых отложений в худой и тучных людей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Организационного комитета Правления обзор Восточной Вирджинии медицинской школы одобрил исследований и сбора образцах адипозных тканей человека, используемые в исследовании. Обоснованное письменное согласие была собрана из пациентов.
1. Подготовка буферов, средств массовой информации и инструментов
- Подготовить раствор Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS): 135 мм натрия хлорида, 5 мм хлорид калия, магния сульфата 1 мм, 0,4 мм калия фосфат двухосновной, 5,5 мм глюкозы, 1 мм аденозина, 0,01% антибиотик/противогрибковое микс (50 мкг/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 30 мкг/мл гентамицина, амфотерицин 15 нг/мл) и 10 мм HEPES (рН = 7,4). Этот раствор готовят свежий каждый раз для сбора ткани и пищеварение.
- Приготовить свежие коллагеназы раствор: 1 мг/мл коллагеназы, тип 1, в KRBSS; Сделайте 3 мл/г жира. Предварительно теплой коллагеназы решение при 37 ° C на водяной бане до ткани пищеварение.
- Подготовить CD34 ячейки изоляции буфера: 2% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1 мм ЭДТА в стерильных фосфат амортизированное saline (PBS).
- Подготовить Adipogenesis СМИ: В среде DMEM/F12, 5% FBS, 50 мкг/мл пенициллина/стрептомицина, 1,25 мкл/мл человеческого инсулина (5 мкг/мл или 144 му/мл) и 0,36 мкл/мл Росиглитазон 2,8 мм (1 мкм).
- Подготовьте O красный нефти (Оро) Стоковый раствор 0,3% (вес/объем), растворяя 0,3 г в 100 мл изопропанола Оро.
2. жировой стромальные сосудистой фракция изоляции
Примечание: Исследование включало кросс-секционное когортное morbidly ожирением тип 2 диабетом (T2D) и не диабетиков предметов, в возрасте 18 – 65 лет, проходят бариатрической хирургии в Sentara метаболических и центр хирургии потери веса (Sentara медицинская группа, Норфолк, VA). Критерии исключения включали аутоиммунных заболеваний, включая сахарный диабет типа 1, условия, требующие хронический иммуносупрессивной терапии, противовоспалительные препараты, thiazolinendiones, активный табака, хронических или острых инфекций или история злокачественности лечение в течение последних 12 месяцев. T2D был определен как поста глюкозы плазмы 126 мг/дл или более, глюкозы, 200 мг/дл или больше после того, как тест толерантности к глюкозе 2 h или использование антидиабетических препаратов.
- Соберите человека сальниковый (ом) и подкожной жировой клетчатки (SC) (AT) от человеческих субъектов, переживает бариатрической хирургии.
- Держите ом и SC AT в отдельных флаконах, содержащих Хэнка буфер солевой раствор с 50 мкг/мл пенициллина/стрептомицина при комнатной температуре сразу же после извлечения тканей.
- Тщательно очистить и удалить разделы фиброзных и прижигание ткани с помощью 70% этанол обработанных тампонами ножницы и щипчики, когда образец прибывает в лаборатории после извлечения тканей.
- Весят жировой ткани и разделов аликвоты ИТ в 5 g (или меньше) для переваривания коллагеназы.
- Мелко фарш 5 g AT в 5 мл коллагеназы раствора во флаконе мерцания при комнатной температуре, используя две пары ножниц.
- Добавьте дополнительные 10 мл раствора коллагеназы фарш из ткани для всего 15 мл.
- Дайджест образцы за 1 ч, при 37 ° C, на водяной бане с непрерывной тряски.
- Отрежьте кончик от 20 мл шприц сделать тупой конец.
- Вырезать квадрат 9 х 9 см от 250 мкм сетки и вставьте его на полпути в 50 мл Конические трубки с помощью шприца тупой конец.
- Полейте образцы в 20 мл шприц тупой конец и процеживают через 250 мкм нейлоновая сетка в 50 мл Конические трубки отделить адипоциты и стромальных клеток сосудистой от непереваренных ткани.
Примечание: Не используйте более чем 5 g на за 50 мл Конические трубки, как сетка будет получить забиты из-за избыточного фиброзных непереваренных материала. - Промыть сцинтилляционные флакон с 10 мл KRBBS и полить его через фильтр для сбора остаточной клетки.
- Инкубируйте отфильтрованных проб для 5 мин при комнатной температуре.
Примечание: Этот шаг имеет важное значение для адипоцитов плавать в верхней части трубки и некоторые из стромальных клеток сосудистой поселиться в нижней части трубки. - Используйте 20 мл шприц и 20 G x 6 в дозирования иглой, чтобы удалить слой стромы сосудистой дроби и передаче его на чистую 50 мл Конические трубки.
- Добавить 10 мл KRBBS и позволяют образцы сидеть на скамейке за 5 мин, при комнатной температуре.
- Повторите шаги 2.12 – 2.14 дважды.
Примечание: Эти шаги будет гарантировать, что нет никакого загрязнения стромальных клеток сосудистой с плавающей адипоцитов. - Держите стромальные сосудистой дроби от обоих складов на льду для дальнейшей обработки, как описано ниже.
Примечание: Не оставляйте клетки на льду для более чем 1 h, как это может иметь влияние на жизнеспособность клеток. Адипоцитов может быть флэш замороженные в жидком азоте для длительного хранения или свежие для экспериментов.
3. изоляция эндотелиальных клеток жировой ткани
- Спиновые стромальные сосудистой фракций (СФДВ) в 500 x g за 5 мин, при 4 ° C.
- Удаление примеров из центрифуги и тщательно слейте супернатант; Держите гранулы, содержащие клетки СФДВ.
- Нежно ресуспензируйте клетки окатышей в 5 мл ФСБ.
Примечание: Если в несколько аликвоты (см. шаг 2.4) было обработано более чем 5 g в депо, объединения клеток окатышей. - Спиновые образцов 500 x g за 5 мин, при 4 ° C.
- Удалить супернатант, Ресуспензируйте клеток в 1 мл PBS и подсчитать количество ячеек.
Примечание: Здесь, счетчик автоматически клеток был использован для подсчета клеток. Жизнеспособность клеток был получен путем смешивания 12 мкл суспензии клеток с 12 мкл раствора акридин оранжевый/пропидий йодидом (AO/PI) (см. Таблицу материалы). Среднее количество клеток на грамм на для каждого склада: (a) ом депо: 1.69 x 105 ± 4,51 x 104; (b) SC депо: 1,24 x 105 ± 6.45 x 104. Жизнеспособность клеток от обоих депо было > 90%. - Пеллет образцы на 500 x g за 5 мин, при 4 ° C.
Примечание: Выбор протокола CD34 иммуномагнитная (см. Таблицу материалы) был адаптирован для шагов 3.7 – 3,15. - Ресуспензируйте гранулы в 100 мкл буфера CD34 изоляции.
Примечание: Общая клеток требуют следующие тома ресуспендирования: (a) < ячейки 2 x 10-7 : Ресуспензируйте гранулы в 100 мкл; (b) 2 x 10 – 5 x 1088 клеток: Ресуспензируйте гранулы в 1 мл. В шагах 3,9-3.16, были сокращены объемы реагентов, используемых для < ячейки 2 x 10-7 . - 10 мкл CD34 коктейль и Проинкубируйте образцы для 15 мин, при комнатной температуре.
- 5 мкл магнитной бусины и Проинкубируйте образцы для 10 мин при комнатной температуре.
- Добавить 2,5 мл буфера CD34 изоляции для каждой пробы и образцы в магнит, за 5 мин, при комнатной температуре.
- Инвертировать магнитом для 5 s, чтобы слить изоляции буфера.
- Удаление образцов из магнита и повторите шаги 4 x 3.10 и 3.11.
- Снять трубку из магнита и добавить 2 мл CD34 изоляции буфера.
- Пелле клетки на 500 x g за 5 мин, при 4 ° C.
- Ресуспензируйте гранулы клеток в 1 мл CD34 изоляции буфера и подсчитать количество ячеек.
Примечание: Здесь, это среднее количество клеток на грамм на: (a) ом депо: 4,75 x 104 ± 3,36 x 104; (b) SC депо: 1,06 х 104 ± 9,53 x 103. Пластиковые immunobead CD31 протокол был адаптирован для шагов 3.16 – 3,34 (см. Таблицу материалы). - Пелле клетки на 500 x g 5 мин и Ресуспензируйте гранулы в 250 мкл буфера B и 250 мкл буфера мытья.
- Тщательно Ресуспензируйте CD31 бусы, vortexing трубки.
- 20 мкл CD31 бусы.
Примечание: Из-за общей клетки подсчитывает > 1 x 106, объем было уменьшено по данным производителя ввода. - Инкубируйте образца с качания на 30 мин, при комнатной температуре.
- Прикрепите ситечко для стерильных 50 мл Конические трубки.
Примечание: Большее открытие ситечко должны быть на вершине. - До разделения клеток добавьте 1 mL мыть буфера, чтобы сбалансировать ситечко. Примените смесь, сформировавшейся под шаг 3.16 ситечко.
- Промойте ситечко с 5 мл буфера мытья в круговом движении за общим объемом 20 мл. Подключите разъем для стерильных 50 мл Конические трубки и закрыть luer-lock.
- Подключите фильтр к разъему. Добавьте 1 mL мыть буфера вдоль стены ситечко. Добавьте 1 mL активированного буфера D вдоль стены ситечко. Вихревой мягко образца и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 1 mL мыть буфера. Отдельные клетки из бисера, закупорить вверх и вниз 10 x.
Примечание: Избегайте создания пузырьков воздуха. - Откройте luer-lock и позволяют отдельные клетки впадают в 50 мл Конические трубки. Мыть сито 10 x с 1 мл буфера мыть каждый раз.
- Удалить соединитель и сетчатый фильтр и Центрифугуйте образцы на 300 x g за 10 мин., на 4 ° C. Ресуспензируйте Пелле клеток в 2 мл полной ЭГМ-2 СМИ для культуры.
Примечание: Среднее количество клеток на грамм на на данный момент это: (a) ом депо: 5,92 x 103 ± 4,27 x 103; (b) SC депо: 4.12 x 103 ± 2,1 x 103. Жизнеспособность клеток от обоих депо было свыше 90%.
4. индукция Adipogenesis в изолированных эндотелиальных клеток
- Рост клеток в 6-хорошо лечить культуры ткани пластины с полным ЭГМ-2 СМИ в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора. Замените носитель каждые 3 – 4 дня до 80 – 90% слияния ячеек.
Примечание: Удвоение населения составляет 2 – 3 дня. - Разверните клетки путем покрытия их на чашки Петри 100 мм и разбить ячейки 1:3 раз. На этой стадии клетки находятся на проход 2.
- Счетчик клеток с использованием автоматической клеток противостоять (см. Таблицу материалы).
- Семя приблизительно 100 – 200 000 клеток в 6-ну пластины, обеспечение повторяющиеся скважин для каждого депо и культуры их в полный ЭГМ-2 СМИ за 2 дня.
- Аспирационная от любого средства роста и заменить его с 2 мл DMEM/F12 с 5% FBS и 50 мкг/мл пенициллина/стрептомицина для управления клетки и заменить его с 2 мл Adipogenesis СМИ (см. шаг 1.4) для лечения клеток.
- Инкубировать клетки при 37 ° C в увлажненные 5% CO2 инкубатора для 13 дней, заменив соответствующих средств массовой информации каждые 3 до 4 дней.
Примечание: Клетки начинают накапливаться липиды после 4 дней лечения. - Проведение Оро и Нил красное окрашивание согласно опубликованным методы15–17.
- Чтобы изолировать клетки для извлечения РНК, удалить медиафайл из 6-ну индукционных плит и мыть его с 1 мл стерильного PBS.
- 350 мкл раствора тиоцианат фенол хлороформ guanidium (см. Таблицу материалы) для каждой хорошо и проинкубируйте его при комнатной температуре за 5 – 10 мин.
- Скрип клетки от пластину с помощью скребка клетки и передать клетки пробки microcentrifuge 1,5 мл.
Примечание: Образцы можно хранить в морозильной камере-80 ° C для извлечение RNA и дальнейшей обработки на более поздний срок. - Извлечение mRNA из примеров с использованием адаптированных РНК добыча протокола (см. Таблицу материалы).
- Выполнять в реальном времени полимеразной цепной реакции (ПЦР) для оценки экспрессии генов, используя следующие датчики: адипонектина, UCP-1 и CIDEA (см. Таблицу материалы).
Примечание: Здесь, RT-PCR были проведены процедуры с использованием следующих стандартный протокол: денатурация (95 ° C; 15 s), отжига и расширение (60 ° C; 1 мин) 40 циклов. Образцы, которые выразили генов с значения CT > 35 были рассмотрены обнаружить.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Наш протокол направлен на обеспечение в vitro подход для определения адипогенном потенциал CD34 + CD31 + сосудистой клетки из разных депо жировых тканях человека. Упрощенная схема схема изображена на рисунке 1A. Первый шаг, используя положительный выбор CD34 выражая клеток приводит к > 95% CD34 + клеток в населенности свежевыделенных клеток (рис. 1A). Важно отметить, что этот маркер теряется после того, как клетки культивировали несколько проходов. Так как CD34 является общим маркером для разнообразных кроветворную и не гемопоэтических прародителями, следующий шаг для разделения эндотелиальной прародителями является положительный выбор CD31 + клеток из популяции клеток CD34 + (рис. 1A). Хотя CD31 является маркером эндотелиальных клеток, его также можно найти на подмножества гемопоэтических клеток. Мы проанализировали несколько препаратов из сальниковый и подкожного жира подачей cytometry и последовательно нашли что CD34 + CD31 + клетки не выразить CD45 маркер (Рисунок 1B, верхней панели). Как правило < 1% клеток показали CD45 позитивности, из населения общей ячейки. Этот результат привели нас к выводу, что мы вероятно получили подготовку практически бесплатно гемопоэтических прародителей. Чтобы определить, если клетки выразить Адипоцит стволовых клеток маркер CD24, мы проанализировали клетки от сальниковый и подкожные депо и обнаружил, что практически никакие клетки выразил CD24 маркер в сальниковый депо (Рисунок 1B, нижней панели) и менее 5% клетки выразил маркер в подкожные депо (не показан). В заключение, с использованием этой методологии разделение, мы получили CD34 + CD31 + CD45-CD24-клетки от сальниковый и подкожные депо тучных субъектов.
Использование пластиковых бисер проспряганное с CD31 антитела, мы получили клетки, отображаемые булыжником эндотелиальной морфология во время ранних пассажей, в отличие от клеток, разделяются с помощью магнитной бусины конъюгированных с CD31 антитела, которые отображаются шпиндель образный мезенхимальных фенотип сразу после разъединения (рис. 2A). Для дальнейшего обоснования эндотелиальной личность CD34 + CD31 + клеток, мы провели два функциональных анализов: поглощение DiI-Ac-ЛПНП и базальной мембраны матрица (упоминаемый как матрица расписка) трубка формирования в пробирке. CD34 + CD31 + клетки инкубировали с дии-Ac-ЛПНП и подавляющее большинство клеток были положительными для поглощения (рис. 1 c). Как положительный контроль, мы использовали линию микрососудистой эндотелиальных клеток первичного человека жировой ткани (HAMVEC), которая коммерчески доступных (см. Таблицу материалов и Рисунок 1 c). Мы также проверили ли CD34 + CD31 + клетки сохраняют свои функции эндотелия после культивирования, определяя способность таких клеток сформировать спонтанное корабля как структуры в пробирке, в 3D-матрицы. После 3 проходов, CD31 + CD34 + формы трубчатых корабля как структуры в матрице, сопоставимые с HAMVEC линии первичной эндотелиальных клеток человека (рис. 1 d).
После расширения клеток для 2-3 места мы перешли клетки от ЭГМ-2 полный носителя, содержащего pro ангиогенных факторов роста в среде DMEM/F12 СМИ с 5% FBS, Росиглитазон (1µм) и инсулина (144 му/мл). Поддержание жилым клетки в ЭГМ-2 СМИ резко сократить их адипогенном дифференциации. Кроме того дополнение дексаметазона и 3-isobuthyl-1-метилксантина в СМИ не изменяет скорость и степень накопления липидов и дополнение индометацина значительно уменьшить накопление липидов (данные не показаны). Основываясь на этих предварительных экспериментов, мы решили использовать только Росиглитазон и инсулина в адипогенном индукции. После 14 дней культуры в адипогенном СМИ клетки были исправлены и витражи с O Красного масла или красный Нила и ядра были counterstained с DAPI (рис. 2B). В цифрах представитель изображения показаны клеток, изолированный от спаренных подкожной (SC) (Рисунок 2B, верхней панели) и сальниковый жировой ткани (ом) (Рисунок 2B, нижней панели) три человека предметов с ИМТ между 37 – 45 кг/м2. Пожалуйста, обратите внимание, что ответ на индукции широко варьируется между субъектами и складах по той же теме. Как видно в флуоресцентного изображения в Рисунок 2B, смешанное население однокамерные (красные стрелки) и многокамерный (белые стрелки) обычно присутствуют липидов содержащих клеток, а также клетки, которые не накапливают липиды (Желтые стрелки). Соотношение между количеством этих клеток является также высоко переменная с предметом и депо происхождения. Количественная оценка доли липидов содержащих клеток (на основе нефти красный O позитивности) из общего числа клеток, (на основании DAPI-окрашенных ядер) показал существенное различие между SC и ом депо же индивидуальные, с ячейками от SC депо будучи более чутко реагировать в адипогенном индукции (рис. 2 c). Объяснение для гетерогенности в ответ между субъектами и складах по тому же вопросу не ясно. Однако мы предположить, что это скорее всего связано с самим характером популяции клеток, что несет в себе отпечаток в vivo фенотип/окружающей среды и не из-за изменчивости в протоколе изоляции.
Чтобы убедиться, что клетки прошли дифференциации в зрелые адипоциты, мы измерили экспрессии генов адипонектина Пан Адипоцит маркер и бежевый коричневый маркеры UCP-1 и CIDEA в клетках после 13 дней адипогенном индукции, по сравнению с клетки ООН индуцированных управления. Адипонектина выражение было увеличено до 10,000-fold в дифференцированных клетках, по сравнению с элементами управления (Рисунок 2D). Обнаружен в клетках после стимуляции адипогенном (Рисунок 2D) был только выражение гена CIDEA и UCP1. В частности, выражение UCP-1 был сильно варьирует, отражающие различные пропорции белый: коричневый / бежевый клеток внутри популяции клеток. Экспрессия гена уборки RPL27 удивительно согласуется между образцами с CT значения в диапазоне от 18 – 20 циклов и были найдены никаких существенных различий между клетками, которые прошли адипогенном дифференциации и необработанные элементы управления. Мы также обнаружен UCP-1 белков в клетках, которые отображаются мульти электрованна фенотипа, в punctated шаблон, который предполагает митохондриальной локализации (Рисунок 2E). ОГП-1 белок обнаружен не был в клетках, которые не накапливают липиды или в ячейках с несколькими очень маленькие капельки, которые, вероятно, не полностью дифференцированной адипоцитов (Рисунок 2E).
Наши наблюдения, что адипогенном потенциал CD34 + CD31 + клеток депо специфический и высоко переменная среди различных субъектов побудило нас искать потенциальных корреляции с BMI, возраст и HbA1c. Среди 28 образцов мы не нашли каких-либо значимые корреляции между адипогенном потенциал и возраста или BMI; Однако мы нашли о значительном отрицательном соотношении между HbA1c и накопление липидов в клетках от ом депо (рис. 3A). Этот вывод указывает на потенциальную связь с хронической гипергликемической окружающей среды и заслуживает будущих расследований. Это также предполагает, что CD34 + CD31 + клетки могут нести подпись в естественных условиях их способности реагировать на адипогенном индукции. Мы также показывают, что эти клетки отображения переменных уровня Akt фосфорилирования после стимуляции инсулина в пробирке (рис. 3Б, сверху). Однако эта изменчивость в ответ не хорошо коррелируют с их способностью проходить адипогенном дифференциации как показано путем пятнать Красного масла O в фотографии соответствующие примеры (рисунок 3B, внизу).
Рисунок 1: разделение и характеристика CD34 + CD31 + клетки из жировой ткани человека. (A) этот блок диаграмма показывает основные шаги изоляции и дифференциации. После позитивного выбора с помощью магнитной бусины CD34 > 95% свежевыделенных клеток, до второй этап отбора, являются CD34 +. (B) Этот представитель проточной цитометрии показывает вперед разрозненные участок, закрытом для живых клеток населения; безупречный образец на канале FITC (BluFl2); и CD45 окрашивание сальниковый репрезентативной на вершине. Внизу показывает ту же последовательность, как показано на вершине, но для CD24 (Alexafluor-647-меченых) клетки от сальниковый образца. (C) эти представитель микроскопии Показать поглощение DiI-Ac-ЛПНП (красный), CD34 + CD31 + -клеток, после 4 ч инкубации в пробирке (верхняя группа). Подобные поглощения обнаружен в жировых тканях человека микрососудистой эндотелиальных клеток линии главной ячейки (HAMVEC) (Нижняя панель). Ядра, показаны синий DAPI. (D) эти представительные микроскопии Показать в vitro трубки формирования CD34 + CD31 + клеток, посеяна в 3D-матрицы. CD34 + CD31 + клеток (проход 3) были посеяны в 24-ну пластины после окрашивания с FITC-Флуорексон и инкубированы для 4 h в средствах массовой информации полной эндотелиальных клеток. Клетки были образы с помощью инвертированного микроскопа флуоресцентные. HAMVEC, посеян на такой же плотности, использовался для сравнения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: адипогенном индукции и маркеры CD34 + CD31 + клеток. (A) эти представитель микроскопии шоу морфологические различия между CD34 + CD31 + клетки изолированы с помощью позитивного выбора с CD31 + магнитной бусины против CD31 + пластиковые бусины. Клетки были образы на проход 1 после изоляции. Увеличение используемых-100 X. (B) эти панели являются представительной микроскопии нефти красный O окрашенных CD34 + CD31 + клетки из парных подкожной (SC) и сальниковый висцеральных (OM) образцы 3 различных субъектов. Клетки были культивировали в течение 2-3 проходов в полной СМИ ЭГМ-2, а затем перешли в среде DMEM/F12 СМИ с 5% FBS и относились с инсулина (144 му/мл) и Росиглитазон (1 мкм) на 14 дней, со средствами массовой информации меняются каждые 3 дня. Увеличение используемых-100 X. Представитель флуоресцентные изображение показывает adipo красный липидного капель (зеленый) и DAPI ядерной окрашивание (синий). Пожалуйста, обратите внимание, смесь клеток, содержащих однокамерные липидов (красная стрелка), многокамерный липидного капель (белая стрелка) или клетки, которые показывают не накопление липидов (желтая стрелка). Увеличение использования составляет 200 X, шкалы бар = 50 µm. (C) Эта группа показывает количественную оценку адипогенном потенциал выражена как O Красного масла (Оро) позитивные клетки нормализуется до всего DAPI-окрашенных ядер. CD34 + CD31 + клетки от ом и SC депо по тому же вопросу показывают существенное различие в адипогенном потенциальных студентом паре t-тест (n = 7). (D) выражение гена зрелых Адипоцит маркеры (адипонектина, UCP-1 и CIDEA) был измерен RT-PCR в клетках после 14 дней адипогенном индукции и в ячейках элемента управления. Данные выражаются как раз изменение экспрессии генов адипонектина. Не обнаружен в контрольных образцах был выражение CIDEA и UCP-1. Значения представляют собой ΔCt, нормализуется к RPL27 как уборка ген. CT значения для RLP27 были в возрасте 18 – 20 циклов для всех образцов, включенных в анализ (n = 3-5 предметов). Данные выражаются как означает ± SD. Студент паре t тест был использован для статистического анализа данных. p < 0,05 отвергает нулевую гипотезу. (E) Эта группа показывает выражение протеина UCP-1 в CD34 + CD31 + клетки после 13 дней индукции с инсулина и Росиглитазон. Immunocytochemistry, используя человека Поликлональные антитела UCP-1 показан селективного выражение UCP-1 в мульти электрованна адипоцитов. Обнаружение было достигнуто с помощью родамин конъюгированных вторичное антитело (красный) и DAPI пятная для ядер (синий). Большой масштаб в врезные показывает punctated красный сигнал, соответствующий UCP-1 (красная стрелка) а также несколько капелек липидов (LD) разных размеров, вокруг клеточного ядра (N). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Корреляция между адипогенном дифференциации, HbA1c и в пробирке сигнализации инсулина. (A) Спирмена (непараметрические) и Пирсон (параметрический) коэффициенты корреляции для ом и SC клеток, соответственно, были использованы для определения корреляции между HbA1c и накопление липидов (n = 20). Null гипотеза было отклонено для p < 0,05. (B) на вершине, Западный blotting показывает фосфорилированных Akt (зеленый) и стимулировали общее выражение Akt (красный) в CD34 + CD31 + клеток в пробирке с 5 Нм инсулина за 30 мин до адипогенном индукции (n = 8). Внизу показана O Красного масла, окрашивание же клеток после индукции адипогенном 14 дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В центре внимания настоящего документа – обеспечить методологию для изоляции, расширения и адипогенном индукции CD34 + CD31 + эндотелиальных клеток от висцеральных и подкожные депо жировых тканях человека.
Методологии были зарегистрированы для изоляции эндотелиальных клеток из различных сосудов кровати грызунов или людей, которые связаны главным образом методы с использованием антител CD31 дневно помечены или в сочетании с магнитной бусины18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23. одной из основных задач для универсального использования этих методов изоляции является неоднородность населения эндотелиальных клеток в различных сосудистых кровати и высокий риск загрязнения с фибробластов и сосудистой росписи клетки. Однако уточнения методов изоляции, чтобы избежать таких загрязнений были сообщил24. Используя эти методы, главным образом пожилые эндотелиальные клетки изолированы от тканей. Жировой ткани является большой резервуар стволовых/прогениторных клеток, включая эндотелиальной прародителями25,26. Несколько документов сообщили очистки эндотелиальных клеток от человека жировой ткани, используя комбинацию CD34 + и CD31 + антитела11,,27. Клетки, которые выражают двух маркеров являются смешанного населения пожилые эндотелиальных клеток и эндотелиальных прародителями11,,2829. Несколько последних семенную работ сообщают, что небольшое подмножество эндотелия (CD31 +) или росписи (PDGFRβ +) клетки в жировой сосудистую является богатым источником Адипоцит прародителями5,30. Эти клетки сосудистой с адипогенном потенциальных может производить как белый или бежевый коричневый адипоциты и связаны с активной ангиогенеза в жировой сосудистую5. Эти выводы могут предоставлять новые терапевтические возможности для улучшения метаболизма ожирения и/или побудить потеря веса путем создания белого или термогенный адипоцитов из сосудов прародителями. Это, таким образом, интерес определить методологию для оценки потенциала адипогенном сосудистой эндотелиальных клеток от жировых тканях человека легко и экономической изоляции и расширения.
CD34 + CD31 + клетки от подкожного и сальниковый висцеральных жировых тканях человека склады ранее характеризовались основанные на их потенциал ангиогенных, производство воспалительных медиаторов, их старения маркеров и другие функции11 , 31. Однако, нет опубликованных доказательств для адипогенном потенциал таких клеток. Предыдущие публикации, которые разделены CD34 + CD31 + клеток с использованием магнитной бусины отчет о данных из ячейки объединяют большое количество предметов (10 или более)11. Этот документ впервые сообщает протокол для успешной изоляции и расширения CD34 + CD31 + клеток от одного человека доноров от подкожного и сальниковый депо. Мы изолированы и расширили клетки от как меньшего как 2-3 g жировой ткани. CD34 + CD31 + клеток представлены 3 – 5% от всего СФДВ клеток и отображается > 90% жизнеспособности после изоляции. Эти клетки были весьма пролиферативных и показал широкий спектр ответов к адипогенном дифференциации после стимуляции в пробирке с Росиглитазон и инсулина. Предыдущие исследования используется только жировых стволовых клеток или всего стромальные сосудистой дроби от жировых тканях человека для тестирования адипогенном ответы4,,3233,34. Одно недавнее исследование используется один клеточных суспензий от microvasculature человека жировой ткани, но неясно, были ли дифференцированной адипоцитов росписи или эндотелия в природе3.
Дополнительные Иммунофенотипирование CD34 + CD31 + клеток с помощью проточной цитометрии показал их отсутствие CD45 и CD24 маркеров, независимо от их депо происхождения. Важно отметить, что мы показали, что после 3 проходов в культуре, CD31 + CD34 + -клеток сохраняют их эндотелиальных функциональность, продемонстрированные накопление ацетилированный ЛПНП и в пробирке трубки формирования в 3D-матрицы. Кроме того дифференцированной адипоцитов представлял смешанное население белый и бежевый/коричневый клеток, основанный на их морфологии и молекулярных маркеров, включая выражение протеина УПО-1. Предыдущие исследования на мышах показали, что сосудистую жировой ткани может быть источником как белый и коричневый адипоцитов5,30 и более последних данных показал аналогичный результат в отношении дифференциации белого и функционально термогенный бежевый клетки от человека жировой сосудистую3.
В отличие от большинства публикаций, используемые адипогенном коктейли, содержащие несколько ингредиентов для дифференциации Адипоцит из целого ряда прародителями в пробиркемы обнаружили, что Росиглитазон и инсулина, необходимых и достаточных для адипогенном индукция CD34 + CD31 + клеток. Хотя мы осознаем, что только что Росиглитазон может вызвать накопление липидов в не жировой клетки35, молекулярные подпись для Пан Адипоцит и бежевый коричневый Адипоцит маркеры, включая белок UCP-1 выражение в выберите клетки, подтверждает Зрелые Адипоцит фенотипа некоторых дифференцированных клеток. Наши два ингредиент адипогенном коктейль упрощает процедурного протокола и делает его более рентабельным.
Важное замечание было сильно варьирует с темой доноров и жировых депо адипогенном ответ CD34 + CD31 + клеток. В то время как депо конкретные различия в адипогенном были ответы жировых стволовых клеток или стромы сосудистой прародителями сообщалось ранее32,34, изменчивость предметом такого ответа является роман наблюдение. Из 20 образцов человека проанализировали, 3 SC и 7 ом клетки не реагировать в адипогенном индукции. Самые надежные ответы показали > 90% клеток реагировать индукции для 4 образцов от SC и 2 образцов от ом. интересно, мы обнаружили, что оперативность негативно коррелируется с HbA1c и не коррелируют с ответом на в in vitro стимуляции инсулина в недифференцированных клеток. Мы утверждаем, что разница в ответ не является из-за плохой воспроизводимости метода, а скорее отражает индивидуальный отпечаток клеток, которые имитируют в vivo ответы. Сохранение этого дифференциального реагирования требует дальнейшей проверки и могут представляют сравнительно легко скрининг метод для реагирования на терапии, направленных для стимулирования adipogenesis в естественных условиях. Для более глубокого понимания источник индивидуальной изменчивости в адипогенном потенциал, дополнительные Иммунофенотипирование необходимо определить ячейки субпопуляций в пределах CD34 + CD31 + населения, которые несут конкретные Адипоцит прародитель функции.
Некоторые из ограничений этого протокола включают неполной характеристике клеточных популяций; относительно длительного расширение и дифференциации раз (2 недели + 2 недели); потенциальные ограничения доступа к человеческих образцов и необходимости для немедленной обработки свеже собранных тканей; и отсутствие функциональных данных для дифференцированных клеток. Существует несколько преимуществ этой методики, которые включают протокол воспроизводимость и не трудоемкий; клетки, что скорее всего сохранить отпечатки пальцев их в vivo фенотип; расширение клеток от очень небольшое количество тканей при относительно низких затратах; возможность для криоконсервации клеток и сохранить их адипогенном подпись, после повторного культуры; и параметр для создания репозиториев этих клеток, так что они могут использоваться для других целей или будущих скрининга.
Этот протокол и CD34 + CD31 + клеток, полученные как конечный результат может использоваться как переводческая платформа как для механистический исследований, так и для целей проверки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить Бекки Маркес, клинических координатором в центре Sentara лечение ожирения, для ее помощи с процессом скрининг и согласие пациента. Это исследование было поддержано R15HL114062 АНКА D. Dobrian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Large Equipment |
|||
| Biosafety Cabinet |
Nuaire |
nu-425-400 |
|
| Cell Culture Incubator |
Thermo-Fisher Scientific |
800 DH |
|
| Water Bath |
Forma Scientific |
2568 |
Reciprocal Shaker |
| RT-PCR Machine |
BIO-RAD |
CFX96-C1000 |
|
| Electrophoresis Box |
BIO-RAD |
Mini PROTEAN 3 Cell |
|
| Transblot Box |
BIO-RAD |
Mini Trans-Blot Cell |
|
| Electrophoresis Power Supply |
BIO-RAD |
PowerPac Basic |
|
| ELISA Reader |
Molecular Devices |
SpectraMax M5 |
|
| Blot Reader |
LI-COR |
Odyssey |
Near Infrared |
| Refrigerated Centrifuge |
Eppendorf |
5810 R |
|
| Tabletop Centrifuge |
Eppendorf |
MiniSpin Plus |
|
| Fluorescent Microscope |
Olympus |
BX50 |
|
| Inverted Microscope |
Nikon |
TMS |
|
| KRBSS Buffer |
|||
| HEPES |
Research Products International |
H75030 |
|
| Sodium bicarbonate |
Sigma-Aldrich |
792519 |
|
| Calcium chloride dihydrate |
Sigma-Aldrich |
C7902 |
|
| Potassium phosphate monobasic |
Sigma-Aldrich |
P5655 |
|
| Magnesium sulfate |
Sigma-Aldrich |
M2643 |
|
| Sodium chloride |
Sigma-Aldrich |
746398 |
|
| Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich |
S9638 |
|
| Potassium chloride |
Sigma-Aldrich |
P9333 |
|
| Glucose |
Acros Organics |
410950010 |
|
| Adenosine |
Acros Organics |
164040250 |
|
| Bovine Serum Albumin |
GE Healthcare Bio-Sciences |
SH30574.02 |
|
| Penicillin/Streptomycin |
Thermo-Fisher Scientific |
15070063 |
|
| Tissue Digestion |
|||
| 20 mL Syringe |
Global Medical |
67-2020 |
|
| Nylon Mesh, 250 µm |
Sefar |
03-250/50 |
|
| Pipetting Needles |
Popper |
7934 |
|
| Fine Scissors |
Fine Science Tools |
14058-11 |
|
| Tissue Forceps |
George Tiemann & Co |
160-20 |
|
| Collagenase, Type I |
Worthington Biochemical |
LS004196 |
|
| Petri Dishes, 100 mm |
USA Scientific |
5666-4160 |
TC Treated |
| Eppendorf Tubes, 1.5 mL |
USA Scientific |
1615-5500 |
|
| Conical Tubes, 15 mL |
Nest Scientific |
601052 |
|
| Conical Tubes, 50 mL |
Nalgene |
3119-0050 |
|
| Scintillation Vials |
Kimble |
74505-20 |
Tissue Dicing |
| Cell Isolation |
|||
| Cellometer |
Nexcelom |
Auto 2000 |
|
| Cellometer Slides |
Nexcelom |
CHT4-SD100-002 |
|
| Cellometer Viability Stain |
Nexcelom |
CS2-0106-5mL |
Acridine Orange/Propidium Iodine |
| Anti-CD34 Magnetic Beads |
StemCell Technologies |
18056 |
Kit |
| EasySep Magnet |
StemCell Technologies |
18000 |
|
| Anti-CD31 Plastic Beads |
pluriSelect USA |
19-03100-10 |
|
| pluriSelect 10x Wash Buffer |
pluriSelect USA |
60-00080-10 |
|
| pluriSelect Connector Ring |
pluriSelect USA |
41-50000-03 |
|
| pluriSelect Detachment Buffer |
pluriSelect USA |
60-00046-12 |
|
| pluriSelect Incubation Buffer |
pluriSelect USA |
60-00060-12 |
|
| pluriSelect S Cell Strainer |
pluriSelect USA |
43-50030-03 |
|
| Cell Culture |
|||
| 6-well Plates |
USA Scientific |
CC7682-7506 |
TC Treated |
| 4-well chambered slides |
Corning Life Sciences |
354559 |
Fibronectin coated |
| 4-well chambered slides |
Thermo-Fisher Scientific |
154526PK |
Uncoated glass |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC) |
Sciencell Research Laboratories |
7200 |
Primary cell line |
| Endothelial Cell Media (ECM) |
ScienCell Research Laboratories |
1001 |
Complete Kit |
| DMEM/F12 Basal Media |
Thermo-Fisher Scientific |
11320082 |
|
| Fetal Bovine Serum (FBS) |
Rocky Mountain Biologicals |
FBS-BBT |
|
| Insulin |
Lilly |
U-100 |
Humalog |
| Rosiglitazone |
Sigma-Aldrich |
R2408 |
|
| Cell Analysis |
|||
| Oil Red O Dye |
Sigma-Aldrich |
O0625 |
Prepared in isopropanol |
| 96 well plates |
USA Scientific |
1837-9600 |
|
| 96 well PCR plates |
Genesee Scientific |
24-300 |
|
| RNA Extraction |
Zymo Research |
R2072 |
Kit |
| cDNA Synthesis |
BIO-RAD |
1708841 |
Supermix |
| JumpStart PCR Polymerase |
Sigma-Aldrich |
D9307-250UN |
Hot start, with PCR Buffer N |
| Magnesium Chloride Solution |
Sigma-Aldrich |
M8787-5ML |
3 mM final in PCR reaction |
| dNTPs |
Promega |
U1515 |
|
| TaqMan AdipoQ |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00605917_m1 |
|
| TaqMan CIDEA |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00154455_m1 |
|
| TaqMan RPL27 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs03044961_g1 |
|
| TaqMan UCP1 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00222453_m1 |
|
| BCA Assay |
Sigma-Aldrich |
QPBCA-1KT |
Kit |
| Bis-acrylamide |
BIO-RAD |
1610146 |
40% stock solution |
| Ammonium Persulfate |
BIO-RAD |
1610700 |
|
| TEMED |
BIO-RAD |
1610800 |
|
| Tris |
Sigma-Aldrich |
T1503 |
|
| Glycine |
BIO-RAD |
1610718 |
|
| Sodium Dodecal Sulfate |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
| EDTA |
Fisher Scientific |
S311-100 |
|
| Bromophenol Blue |
Sigma-Aldrich |
B8026 |
|
| Blot Membrane |
EMD Millipore |
IPFL00010 |
|
| Methanol |
Fisher Scientific |
A452-SK4 |
|
| Odyssey Blocking Buffer, Tris |
LI-COR |
927-50000 |
|
| Anti-AKT antibody |
Cell Signaling Technology |
2920S |
Mouse monoclonal |
| Anti-pAKT antibody |
Cell Signaling Technology |
9271S |
Rabbit polyclonal |
| Anti-UCP1 antibody |
Abcam |
ab10983 |
Rabbit polyclonal |
| Anti-Mouse IgG antibody |
LI-COR |
926-68070 |
Goat Polyclonal, IRDye 680RD |
| Anti-Rabbit IgG antibody |
LI-COR |
926-32211 |
Goat Polyclonal, IRDye 800CW |
| Anti-Rabbit IgG antibody |
Jackson ImmunoResearch |
111-025-003 |
Goat Polyclonal, TRITC |
| Phosphate Buffer Saline |
Thermo-Fisher Scientific |
10010049 |
|
| 37% Formaldehyde Solution |
Electron Microscopy Sciences |
15686 |
4% solution for cell fixation |
| Normal Goat Serum |
Vector Laboratories |
S-1000 |
10% blocking solution |
| Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
X-100 |
0.1% permeabilization solution |
| DAPI |
Thermo-Fisher Scientific |
D1306 |
|
| Calcein AM |
Thermo-Fisher Scientific |
65-0853-39 |
Cell fluorescent visualization |
| Matrigel Basement Membrane Matrix |
Corning Life Sciences |
356231 |
Growth factor reduced |
| DiI labeled Acetylated LDL |
Thermo-Fisher Scientific |
L3484 |
References
- Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).
- Min, S. Y., et al. Human 'brite/beige' adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice. Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Tran, K. V., et al. The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells. Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
- Miranville, A., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).
- Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).
- Moller, D. E., Flier, J. S. Insulin resistance--mechanisms, syndromes, and implications. The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes. The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).
- Satish, L., et al. Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage. BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization. Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).
- Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (105), e53072 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC). Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).
- Zhou, L., et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis. PLoS One. 10 (2), e0117644 (2015).
- Curat, C. A., et al. From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes. Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).
- Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).
- Traktuev, D. O., et al. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks. Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).
- Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis. Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).
- Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue. Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).
- Ong, W. K., et al. Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
- Ong, W. K., Sugii, S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots. American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).
- van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation. Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).
