Summary
La diferenciación de los adipocitos blancos y beiges de tejido adiposo vascular progenitores tiene potencial para mejoramiento metabólico en obesidad. Se describen los protocolos para un CD34 + CD31 + aislamiento de células endoteliales de la grasa humana y un posterior en vitro expansión y diferenciación a adipocitos blancos y beiges. Se discuten varias aplicaciones posteriores.
Abstract
La obesidad se acompaña de una amplia remodelación del tejido adiposo sobre todo a través de la hipertrofia del adipocito. Crecimiento del adipocito extremas resulta en una pobre respuesta a la insulina, la hipoxia local y la inflamación. Mediante la estimulación de la diferenciación de los adipocitos blancos funcionales de progenitores, hipertrofia radical de la población de adipocitos puede prevenirse y, en consecuencia, se puede mejorar la salud metabólica del tejido adiposo junto con una reducción de inflamación. También, estimulando una diferenciación de los adipocitos beige/marrón, el gasto de energía total del cuerpo puede aumentar, lo que resulta en pérdida de peso. Este enfoque podría prevenir el desarrollo de comorbilidades de la obesidad como diabetes tipo 2 y enfermedad cardiovascular.
Este papel describe el aislamiento, expansión y diferenciación de los adipocitos blancos y beiges de un subconjunto de las células endoteliales humanas de tejido adiposo que conjuntamente expresan los marcadores CD31 y CD34. El método es relativamente barato y no se requiere mano de obra. Requiere acceso a tejido adiposo humano y el depósito subcutáneo es adecuado para el muestreo. De este protocolo, muestras de tejido adiposo fresco de sujetos obesos mórbidos [índice de masa corporal (IMC) > 35] se recogen durante los procedimientos de cirugía bariátrica. Utilizando un immunoseparation secuencial de la fracción vascular estromal, se producen suficientes células desde tan poco como 2-3 g de grasa. Estas células pueden ampliarse en cultura durante 10 – 14 días, pueden ser criopreservadas y retienen sus propiedades adipogenic con pases hasta el paso 5 y 6. Las células se tratan durante 14 días con un coctel utilizando una combinación de la insulina humana y lo agonistas PPARy-rosiglitazona adipogenic.
Esta metodología puede utilizarse para la obtención de la prueba de los experimentos de concepto en los mecanismos moleculares que conducen a respuestas adipogenic en adiposas células endoteliales, o para la detección de nuevos fármacos que pueden mejorar la adipogenic respuesta dirigida ya sea hacia el blanco o diferenciación del adipocito marrón/beige. Utilizando pequeñas biopsias subcutáneas, esta metodología puede utilizarse para descartar temas no respondedor ensayos clínicos dirigidos a estimular los adipositos beige/marrón y blanco para el tratamiento de la obesidad y comorbilidades.
Introduction
La evidencia reciente muestra que tanto en ratones como en seres humanos, se puede distinguir un subconjunto de células residentes en la vasculatura de tejido adiposo en ya sea blanco o beige/brown adipocytes1,2,3. El fenotipo de estas células es un tema de controversia, con evidencias que las células endoteliales, músculo liso/pericyte o un espectro de fenotipos intermedios4,5,6,7. El alcance del desarrollo de esta metodología fue probar el potencial de adipogenic de CD31 + CD34 + células endoteliales aisladas de diferentes depósitos de grasa de los seres humanos obesos. Otros estudios en la literatura se centran en el potencial de la fracción vascular estromal total o del adipocito conocidos progenitores2,8,9adipogenic. Puesto que las tecnologías actualmente existentes pueden apuntar específicamente células endoteliales del tejido adiposo de drogas entrega10, entender el potencial de estas células a adipogenic inducción hacia adipocitos blancos o beiges es importante para futuras terapias dirigidas.
Diferentes grupos informaron la combinación de marcadores CD31 y CD34 como sustitutos para aislar las células endoteliales del tejido adiposo humano11,12,13. Por lo general, el aislamiento se realiza utilizando dos pasos secuenciales y una selección positiva mediante bolas magnéticas. En este informe, se utilizó immunoseparation usando CD34 + granos magnéticos combinados con bolas de plástico de CD31. Encontramos esta técnica superior a la immunoseparation magnético secuencial con respecto a la preservación de la morfología endoteliales típicas empedradas. También, hemos sido capaces de generar suficientes células necesarios para la expansión y adipogenic inducción a partir de tan poco como 1-2 g de grasa. Una biopsia pequeña muestra de la grasa subcutánea es suficiente para producir la cantidad necesaria de células para aplicaciones posteriores. Este aspecto es potencialmente importante, sobre todo si este método será utilizado para la detección de una respuesta a la inducción de adipogenic en sujetos humanos.
A diferencia de otros sistemas registrados en la literatura, este método utiliza sólo dos ingredientes para la inducción de adipogenic de las células de CD34 + CD31 +: un agonistas PPARy, rosiglitazona y la insulina humana. Lo importante es la cantidad de insulina utilizada cae dentro del rango de normal alta de circulante post-absorptive insulina en seres humanos14. El grado de sensibilidad a la insulina de las células en vitro, medido por el phosphorylation de Akt, no se correlaciona con su capacidad para responder a la inducción de cóctel. Curiosamente, esta inducción cóctel y experimental las condiciones de uso, una mezcla de células blancas y beige/marrón fueron obtenidos según lo determinado por el tamaño y número de gotas lipídicas intracelulares y la expresión de marcadores moleculares. Este protocolo de inducción directa y rentable junto con la evaluación cuantitativa del fenotipo de las células de la respuesta (blanca y beige) permite una proyección de agentes que potencialmente pueden alterar el equilibrio diferenciado beige : blanco adipocytes.
Este método también proporciona un enfoque traslacional para entender los mecanismos subyacentes de la adipogénesis de progenitores endoteliales vasculares en el tejido adiposo humano. Usando esta técnica de aislamiento/diferenciación específica, los investigadores pueden interrogar diversas vías responsables de Adipogénesis en un subconjunto de las células endoteliales vasculares de diferentes depósitos de grasa en los seres humanos lean y obesos.
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Protocol
El Comité de revisión institucional en Eastern Virginia Medical School aprobó la investigación y recolección de muestras de tejido adiposo humano utilizado en el estudio. Se obtuvo consentimiento informado de los pacientes.
1. preparación de tampones, medios e instrumentos
- Preparar una solución de Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS): 135 mM cloruro sódico, cloruro de potasio 5 mM, sulfato de magnesio 1 m m, 0.4m m potasio Fosfato dibásico, 5,5 mM de glucosa, adenosina 1 mM, 0.01% antibiótico/antimicótico mezcla (50 μg/mL de penicilina, 50 μg/mL de estreptomicina, 30 μg/mL de gentamicina, 15 ng/mL de anfotericina) y 10 mM HEPES (pH = 7,4). Esta solución se prepara fresca cada vez para la colección de tejidos y la digestión.
- Preparar una solución fresca de colagenasa: 1 mg/mL de colagenasa, tipo 1, en KRBSS; hacer 3 mL/g de grasa. Precalentar la solución de la colagenasa a 37 ° C en un baño de agua antes de la digestión del tejido.
- Preparar un Buffer de aislamiento de células CD34: 2% de suero bovino fetal (FBS) y 1 mM EDTA en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
- Preparar medios de Adipogénesis: DMEM/F12, 5% FBS, 50 μg/mL de penicilina/estreptomicina, 1.25 μl/mL de insulina humana (5 μg/mL o mU/mL 144) y 0,36 μl/mL de rosiglitazona de 2,8 mM (1 μm).
- Preparar una solución stock de aceite rojo O (ORO) de 0,3% (peso/volumen) disolviendo 0,3 g de ORO en 100 mL de isopropanol.
2. adiposo fracción Vascular estromal de aislamiento
Nota: El estudio incluyó a una cohorte transversal de diabético obeso tipo 2 (T2D) y sujetos no diabéticos, de 18 – 65 años, sometidos a cirugía bariátrica en la Sentara metabólica y centro de cirugía de pérdida de peso (Sentara Medical Group, Norfolk, VA). Criterios de exclusión fueron una enfermedad autoinmune como diabetes mellitus tipo 1, condiciones que requieren terapia inmunosupresora crónica, medicamentos antiinflamatorios, thiazolinendiones, tabaquismo activo, infecciones agudas o crónicas o una historia de malignidad tratados dentro de los últimos 12 meses. T2D se definió como una glucemia plasmática en ayunas de 126 mg/dL o mayor, una glucosa de 200 mg/dL o mayor después de la prueba de una tolerancia a la glucosa 2 h o el uso de medicamentos antidiabéticos.
- Recoger humano omental (OM) y subcutánea (SC) el tejido adiposo (AT) de sujetos humanos sometidos a cirugía bariátrica.
- Manten el OM en SC en viales independientes que contienen y tamponada con solución de Hank salina con 50 μg/mL de penicilina/estreptomicina a temperatura ambiente inmediatamente después de la extracción de tejido.
- Limpieza y remover secciones del tejido fibróticas y cauterizan utilizando pinzas y tijeras limpia de etanol 70% cuando la muestra llega al laboratorio después de la extracción de tejido.
- Pesa el tejido adiposo y alícuotas de él a 5 g (o menos) para la digestión de la colagenasa de la partición.
- Finamente picada 5 g de a en 5 mL de una solución de colagenasa en un vial de centelleo a temperatura ambiente, usando dos pares de tijeras.
- Agregar un adicional 10 mL de solución de colagenasa en el tejido picadito para total 15 mL.
- Digerir las muestras durante 1 h, a 37 ° C, en baño de agua con agitación continua.
- Cortar la punta de una jeringa de 20 mL para un extremo romo.
- Cortar un cuadrado de 9 cm x 9 cm de una malla de 250 μm y empuje hasta la mitad en un tubo cónico de 50 mL, utilizando la jeringa de extremo romo.
- Vierta las muestras en la jeringa de 20 mL extremo romo y el filtro a través de las 250 μm de malla de nylon en el tubo cónico de 50 mL para separar adipocitos y células del estroma vasculares del tejido sin digerir.
Nota: No use más de 5 g de en por el tubo cónico de 50 mL, como la malla conseguir estorbada debido al exceso de material sin digerir fibrótico. - Lavar el vial de centelleo con 10 mL de KRBBS y vierta a través del filtro para recoger células residuales.
- Incubar las muestras filtradas por 5 min a temperatura ambiente.
Nota: Este paso es importante para permitir que los adipocitos a flotar en la parte superior del tubo y algunas de las células del estroma vasculares a instalarse en la parte inferior del tubo. - Utilizar una jeringa de 20 mL y 20 x 6 pipeteo aguja para eliminar la capa de la fracción vascular estromal y transferirlo a un tubo cónico de 50 mL limpio.
- Añadir 10 mL de KRBBS y permita que las muestras a sentarse en el Banco durante 5 minutos, a temperatura ambiente.
- Repita los pasos 2.12-2.14 dos veces.
Nota: Estos pasos se aseguran de que no hay contaminación de las células del estroma vasculares con los adipocitos flotantes. - Mantenga las fracciones vasculares stromal de ambos depósitos de hielo para su posterior procesamiento, tal como se describe en los pasos siguientes.
Nota: No deje las células en hielo por más de 1 h, como esto puede tener un impacto en la viabilidad celular. Los adipocitos pueden ser flash-congeladas en nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo o frescos para experimentos.
3. aislamiento de las células endoteliales del tejido adiposo
- Girar las fracciones vasculares stromal (SVF) a 500 x g durante 5 minutos, a 4 ° C.
- Extraer las muestras de la centrifugadora y retirar cuidadosamente el sobrenadante; mantener el pellet que contiene las células SVF.
- Suavemente vuelva a suspender los pellets de células en 5 mL de PBS.
Nota: Si más de 5 g de un depósito en fue procesado en múltiples alícuotas (vea el paso 2.4), la piscina los pellets de células juntas. - Girar las muestras a 500 x g durante 5 minutos, a 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante, resuspender las células en 1 mL de PBS y contar las células.
Nota: Aquí, se utilizó un contador celular automático para el recuento celular. La viabilidad celular se obtuvo mezclando 12 μl de suspensión celular con 12 μl de una solución de acridina naranja, propidio (AO/PI) (véase Tabla de materiales). El número promedio de células por gramo de AT de cada depósito es: (a) depósito de OM: 1.69 x 105 ± 4.51 x 104; (b) SC Depot: 1.24 x 105 ± 6.45 x 104. La viabilidad de las células de ambos depósitos fue > 90%. - De la pelotilla de las muestras a 500 x g durante 5 minutos, a 4 ° C.
Nota: Un protocolo de selección Inmunomagnética de CD34 (véase Tabla de materiales) se ha adaptado para pasos 3.7 – 3.15. - Resuspender el sedimento en 100 μl de buffer de aislamiento de CD34.
Nota: El recuento total requiere los volúmenes re-suspensión: (a) < 2 x 107 células: Resuspender el precipitado en 100 μl; (b) 2 x 108– 5 x 108 células: Resuspender el precipitado en 1 mL. En pasos 3.9-3.16, se redujo los volúmenes de los reactivos usados para < 2 x 107 células. - Añadir 10 μl de CD34 cóctel e incubar la muestra durante 15 min, a temperatura ambiente.
- Añadir 5 μl de granos magnéticos e incubar la muestra durante 10 min, a temperatura ambiente.
- Añadir 2,5 mL de tampón de aislamiento CD34 a cada muestra y coloque las muestras en el imán, durante 5 minutos, a temperatura ambiente.
- Invertir el imán durante 5 s para retirar el tampón de aislamiento.
- Extraer las muestras del imán y repita los pasos 4 x 3.10 y 3.11.
- Retire el tubo del imán y añadir 2 mL de tampón de aislamiento de CD34.
- Sedimenten las células a 500 x g durante 5 minutos, a 4 ° C.
- Resuspender el pellet celular en 1 mL de tampón de aislamiento CD34 y contar las células.
Nota: Aquí, el número promedio de células por gramo de a es: (a) depósito de OM: 4.75 x 104 ± 3,36 x 104; (b) SC Depot: 1.06 x 104 ± 9.53 x 103. Un protocolo de immunobead plástico CD31 fue adaptado para pasos 3.16 – 3,34 (véase Tabla de materiales). - De la pelotilla de las células a 500 x g durante 5 minutos y resuspender el precipitado en 250 μl de tampón B y 250 μl de tampón de lavado.
- Resuspender bien los granos de CD31 con un vórtex los tubos.
- Añadir 20 μl de CD31 granos.
Nota: Debido a la célula total cuenta > 1 x 106, el volumen fue reducido según entrada del fabricante. - Incubar la muestra con mecedora durante 30 min, a temperatura ambiente.
- Adjuntar un filtro a un tubo cónico estéril 50 mL.
Nota: La apertura más grande del filtro debe estar en la parte superior. - Antes de la separación celular, agregar 1 mL de tampón de lavado para equilibrar el filtro. Aplique la mezcla generada bajo paso 3.16 a la coladera.
- Lave el filtro con 5 mL de tampón de lavado en un movimiento circular para un volumen total de 20 mL. Acople el conector a un tubo cónico estéril de 50 mL y cierre luer-lock.
- Sujete la cesta al conector. Añadir 1 mL de tampón de lavado a lo largo de la pared del filtro. Añadir 1 mL de buffer activado D a lo largo de la pared del filtro. Agitar suavemente la muestra e incubar durante 10 minutos, a temperatura ambiente.
- Añadir 1 mL de tampón de lavado. Separar las células de los granos mediante pipeteo arriba y abajo de 10 x.
Nota: Evitar la generación de burbujas de aire. - Abrir la cerradura de luer y permitir que las células separadas que fluyen en el tubo cónico de 50 mL. Lavar el filtro de 10 x con 1 mL de tampón de lavado cada vez.
- Deseche el conector y el colador y centrifugar las muestras a 300 x g durante 10 min, 4 ° c. Resuspender el precipitado de células en 2 mL de medios EGM-2 completo de la cultura.
Nota: El número promedio de células por gramo de AT en este punto es: (a) depósito de OM: 5.92 x 103 ± 4.27 x 103; (b) SC Depot: 4.12 x 103 ± 2.1 x 103. La viabilidad de las células de ambos depósitos fue superior al 90%.
4. inducción de la adipogénesis en células endoteliales aisladas
- Crecen las células en placas de cultivo de tejidos tratados 6 bien con medios EGM-2 completo en a 37 ° C, 5% CO2 incubadora. Sustituir los medios de comunicación cada 3 – 4 días hasta que las células alcancen 80-90% de confluencia.
Nota: La duplicación de la población es entre 2-3 días. - Ampliar las celdas por chapado en platos de Petri de 100 mm y dividir las celdas una vez de 1:3. En esta etapa, las células están en el paso 2.
- Recuento de las células usando una célula automática contador (véase Tabla de materiales).
- Células de la semilla aproximadamente 100-200.000 en placas de 6 pozos asegurando pocillos duplicados para cada depósito y la cultura les en completan los medios de comunicación EGM-2 durante 2 días.
- Aspire de cualquier medios de cultivo y reemplazarlo con 2 mL de DMEM/F12 con 5% FBS y 50 μg/mL de penicilina/estreptomicina para el control de las células y reemplazarlo con 2 mL de medio de Adipogénesis (ver paso 1.4) de las celdas de tratamiento.
- Incube las células a 37 ° C en un 5% humidificado CO2 incubadora durante 13 días, reemplazando los medios respectivos cada 3 a 4 días.
Nota: Las células se comienzan a acumular lípidos después de 4 días de tratamiento. - A cabo ORO y Nilo rojo coloración según métodos publicados15–17.
- Para aislar las células para una extracción de RNA, retire los medios de comunicación de las placas de inducción de 6 bien y lava con 1 mL de PBS estéril.
- Añadir 350 μl de una solución de tiocianato-fenol-cloroformo guanidínicos (véase Tabla de materiales) cada uno bien e incubar a temperatura ambiente durante 5-10 minutos.
- Raspar las células de la placa usando un raspador celular y transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
Nota: Las muestras pueden guardarse en el congelador de-80 ° C para la extracción de RNA y procesamiento posterior en una fecha posterior. - Extraiga el mRNA de las muestras mediante una extracción de RNA adaptada del Protocolo (véase Tabla de materiales).
- Realizar una reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (RT-PCR) para evaluar la expresión del gene usando las puntas de prueba siguientes: adiponectina, UCP-1 y CIDEA (véase Tabla de materiales).
Nota: Aquí, procedimientos de RT-PCR se llevaron a cabo utilizando el protocolo estándar siguiente: desnaturalización (95 ° C; 15 s), recocido y extensión (60 ° C, 1 min) para 40 ciclos. Las muestras que expresan genes con valores de CT > 35 se considera indetectable.
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Representative Results
Nuestro protocolo tiene como objetivo proporcionar un enfoque en vitro para determinar el potencial de adipogenic de CD31 + CD34 + células vasculares de diferentes depósitos de tejido adiposo humano. En la figura 1Ase muestra un diagrama de diagrama de flujo simplificado. El primer paso mediante una selección positiva de CD34 expresando células resulta en > 95% CD34 + células en la población de las células recién aisladas (figura 1A). Lo importante, este marcador se pierde después de que las células se cultivan para un par de pasajes. CD34 es un marcador común de diversos progenitores hematopoyéticas y no hematopoyéticas, el siguiente paso requerido para la separación de los progenitores endoteliales es la selección positiva de células CD31 + fuera de la población de la célula de CD34 + (figura 1A). Aunque CD31 es un marcador para las células endoteliales, también se puede encontrar en subconjuntos de células hematopoyéticas. Analizamos varias preparaciones de la grasa omental y subcutánea por citometría de flujo y constantemente encuentra que CD31 + CD34 + células no expresan el marcador CD45 (figura 1B, paneles superiores). Por lo general, < 1% de las células positividad CD45, fuera de la población total de la célula. Este resultado nos llevó a concluir que probablemente obtenido una preparación prácticamente libre de progenitores hematopoyéticos. Para determinar si las células expresan el marcador de la célula de vástago del adipocito CD24, analizábamos las células de depósitos omentales y subcutáneos y encontró que prácticamente no hay células expresaron el marcador CD24 en el depósito omental (figura 1B, paneles inferiores) y menos del 5% de las células expresan el marcador en el depósito subcutáneo (no mostrado). Para terminar, con esta metodología de separación, obtuvimos CD34 + CD31 + CD45-CD24-células de depósitos omentales y subcutáneos de sujetos obesos.
Con las perlas de plástico conjugado con un anticuerpo CD31, obtuvimos las células que muestran la morfología endoteliales empedradas durante los primeros pasajes, a diferencia de las células separadas usando las bolas magnéticas conjugadas con un anticuerpo CD31 que muestra un fenotipo mesenquimal en forma de huso inmediatamente después de la separación (figura 2A). Para fundamentar aún más la identidad endotelial de las células de CD34 + CD31 +, realizamos dos análisis funcionales: una absorción de DiI-CA-LDL y una matriz de la membrana del sótano (denominada matriz de aquí en adelante) formación in vitrodel tubo. CD34 + CD31 + las células se incubaron con DiI-CA-LDL y la gran mayoría de las células era positiva para la absorción (figura 1). Como control positivo se utilizó una línea de células endoteliales microvasculares de primaria de tejido adiposo humano (HAMVEC) que está comercialmente disponible (véase Tabla de materiales y figura 1). También Probamos si el CD31 + CD34 + células conservan su función endotelial después de cultivo mediante la determinación de la capacidad de estas células para formar estructuras vaso espontáneo en vitro, en una matriz 3D. Después de 3 pasos, CD31 + CD34 + formas tubulares buque-como las estructuras en una matriz similar a una línea de células endoteliales humanas primaria HAMVEC (figura 1).
Después de la expansión de las células para los pasos 2 y 3, nos cambiamos las células de EGM-2 medios completo que contiene factores de crecimiento pro-angiogénica en medio DMEM/F12 suplementado con 5% FBS, rosiglitazona (1μm) e insulina (144 mU/mL). Mantener que las células en el EGM-2 completan medios dramáticamente reducida su diferenciación adipogenic. Además, una adición de dexametasona y 3-isobuthyl-1-metilxantina para los medios de comunicación no cambiaron el tipo y el grado de acumulación de lípidos y una adición de indometacina redujeron significativamente la acumulación de lípidos (datos no mostrados). Basándose en estos experimentos preliminares, se decidió sólo utilizar rosiglitazona e insulina para la inducción de adipogenic. Después de 14 días de cultivo en medios adipogenic, las células eran fijadas y teñidas con aceite rojo O o Nilo rojo y los núcleos fueron contratinción con DAPI (figura 2B). En las figuras, se muestran imágenes representativas de células aisladas de pares subcutánea (SC) (figura 2B, paneles superiores) y omental (OM) (figura 2B, paneles inferiores) del tejido adiposo de tres seres humanos con un IMC entre 37 – 45 kg/m2. Tenga en cuenta que la respuesta a la inducción varía ampliamente entre los sujetos y entre los depósitos del mismo tema. Como se ve en la imagen fluorescente en la figura 2B, una población mixta de (flechas rojas) uniloculares y multiloculares (flechas blancas) que contiene lípidos células como las células que no se acumulan lípidos (flechas amarillas) están típicamente presentes. La proporción entre el número de estas células es también muy variable con el tema y el depósito de origen. Una cuantificación del porcentaje de lípidos que contiene células (basadas en aceite rojo O positividad) fuera de las células totales (basadas en núcleos tinción DAPI) mostraron una diferencia significativa entre el SC y OM depósitos del mismo individuales, con las celdas del depósito de SC ser más sensible a la inducción de adipogenic (figura 2). La explicación para la heterogeneidad en la respuesta entre los sujetos y los depósitos del mismo tema no está clara. No obstante, especulamos que probablemente se relaciona con la naturaleza intrínseca de la población de la célula que lleva la huella del en vivo fenotipo/medio ambiente y no debido a la variabilidad en el protocolo de aislamiento.
Para confirmar que las células experimentaron la diferenciación madurar adipocytes, medimos la expresión génica de la pan-adipocito marcador adiponectina y los marcadores de marrón/beige UCP-1 y CIDEA en las células después de 13 días de inducción adipogenic en comparación con células control no inducido. La expresión de adiponectina se incrementó hasta 10,000-fold en las células diferenciadas en comparación con los controles (Figura 2D). La expresión génica de CIDEA y UCP1 sólo era detectable en las células después de la estimulación de adipogenic (Figura 2D). En particular, la expresión de UCP-1 fue muy variable, reflejando las diferentes proporciones de blanco: marrón / beige células dentro de la población celular. La expresión del gene RPL27 del servicio de limpieza era notable constante entre las muestras con valores de CT que oscilan entre los 18 – 20 ciclos y no hay diferencias significativas entre las células que experimentaron la diferenciación adipogenic y el controles no tratados. También detectamos una expresión de la proteína UCP-1 en las células que muestran el fenotipo por múltiples, en un patrón punctated que sugiere una localización mitocondrial (Figura 2E). La proteína UCP-1 no fue detectable en las células que no acumulan lípidos o células con múltiples, gotitas muy pequeñas que probablemente no totalmente diferenciados adipocitos (Figura 2E).
Nuestra observación que la adipogenic potencial de las células de CD34 + CD31 + depósito específico y altamente variable entre diferentes temas nos incitó buscar posibles correlaciones con el índice de masa corporal, la edad y la HbA1c. Entre las 28 muestras analizadas, no encontramos ningún correlaciones significativas entre la adipogenic potencial y edad o IMC; sin embargo, encontramos una correlación negativa significativa entre la HbA1c y la acumulación de lípidos en las células del depósito de OM (Figura 3A). Este hallazgo indica un posible vínculo con el medio ambiente hiperglucémico crónica y merece una investigación futura. Esto también sugiere que las CD34 + CD31 + células probablemente llevan la firma en vivo de su capacidad para responder a una inducción de adipogenic. También mostramos que estas células presentan niveles variables de fosforilación de Akt, después de un estímulo de insulina en vitro (figura 3B, parte superior). Sin embargo, esta variabilidad en la respuesta no se correlaciona bien con su capacidad para someterse a una diferenciación de adipogenic como se muestra por el aceite rojo O manchas en las fotos de las muestras correspondientes (figura 3B, parte inferior).
Figura 1: separación y caracterización de células del tejido adiposo humano + CD34 + CD31. (A) este diagrama de diagrama de flujo muestra los pasos principales del aislamiento y la diferenciación. Después de la selección positiva mediante bolas magnéticas de CD34, > 95% de las células recién aislados, antes de la segunda etapa de selección, son CD34 +. (B) Esta citometría de flujo representativo muestra un avance disperso parcela cerrada para la población de células vivas; una muestra sin mancha en el canal FITC (BluFl2); y CD45 tinción de una muestra representativa de omental en la parte superior. La parte inferior muestra la misma secuencia como se muestra en la parte superior, pero las células CD24 de (etiquetado Alexafluor 647) de la muestra omental. (C) estas fotografías representativas muestran una absorción de DiI-CA-LDL (rojo) CD31 + CD34 + células después de 4 h de incubación en vitro (panel superior). Una absorción similar fue encontrada en una línea de celular primaria de células endoteliales microvasculares de tejido adiposo humano (HAMVEC) (panel inferior). Los núcleos aparecen azul por DAPI. (D) estas fotografías representativas muestran una formación de tubo en vitro de células sembradas en una matriz 3D + CD34 + CD31. CD31 + CD34 + células (paso 3) fueron sembradas en placas de 24 pocillos siguiendo una tinción con calceína FITC y se incubaron durante 4 horas en los medios de comunicación completa de la célula endotelial. Las células fueron fotografiadas con un microscopio fluorescente invertido. HAMVEC, cabeza de serie en la misma densidad, se utilizó para la comparación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Adipogenic inducción y marcadores de células CD34 + CD31 +. (A) estos representante ver micrografías las diferencias morfológicas entre CD31 + CD34 + células aislaron usando una selección positiva con CD31 + granos magnéticos frente a CD31 + cuentas de plástico. Las células fueron reflejadas en el paso 1 después del aislamiento. El aumento utilizado es 100 X. (B) estos paneles son micrografías representativas de aceite rojo O tinción de CD34 + CD31 + las células apareada subcutánea (SC) y omental visceral (OM) las muestras de 3 temas diferentes. Las células fueron cultivadas para 2 – 3 pasajes en medios completo EGM-2, luego cambió en medio DMEM/F12 con 5% FBS y tratados con insulina (144 mU/mL) y rosiglitazona (1 μm) durante 14 días, con los medios de comunicación cambiada cada 3 días. El aumento utilizado es 100 X. La imagen fluorescente representativa muestra adipo gotitas de lípido rojo (verde) y DAPI nuclear tinción (azul). Tenga en cuenta una mezcla de células que contienen lípidos uniloculares (flecha roja), gotitas de lípidos multilocular (flecha blanca) o células que no muestran ninguna acumulación de lípidos (flecha amarilla). El aumento utilizado es de 200 X, barra de escala = 50 μm. (C) este panel muestra una cuantificación de adipogenic potencial expresada como aceite rojo O (ORO), las células positivas normalizadas total núcleos teñidos de DAPI. CD31 + CD34 + células de OM y SC depósitos del mismo tema muestran una diferencia significativa de adipogenic potencial por t-test pares del estudiante (n = 7). (D) la expresión génica de adipocito maduro marcadores (adiponectina, UCP-1 y CIDEA) se midió por RT-PCR en las células después de 14 días de inducción adipogenic y en las células del control. Los datos se expresan como un cambio de doblez para la expresión del gen de adiponectina. La expresión del CIDEA y UCP-1 no fue detectable en las muestras de control. Los valores representan ΔCt normalizado a RPL27 como un gen de la limpieza. Los valores de CT para RLP27 fueron entre 18 – 20 ciclos para todas las muestras incluidas en el análisis (n = 3 a 5 materias). Los datos se expresan como media ± SD Prueba de t del estudiante apareado fue utilizado para un análisis estadístico de los datos. p < 0.05 se rechaza la hipótesis nula. (E) este panel muestra la expresión de la proteína UCP-1 en CD31 + CD34 + células después de 13 días de inducción con insulina y rosiglitazona. Immunocytochemistry usando un anticuerpo policlonal humano de UCP-1 demostró una expresión selectiva de UCP-1 en adipocitos por múltiples. La detección se realiza mediante un anticuerpo secundario conjugado con rodamina (rojo) y tinción DAPI para el núcleo (azul). El gran aumento en el margen muestra la señal roja punctated correspondiente a la UCP-1 (flecha roja) así como las múltiples gotitas de lípidos (LD) de diferentes tamaños que rodea el núcleo (N). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Correlación entre diferenciación adipogenic, HbA1c y en vitro insulina señalización. (A) de Spearman (no paramétrica) y coeficientes de correlación de Pearson (paramétricos) para las células de la MO y SC, respectivamente, fueron utilizados para determinar la correlación entre HbA1c y la acumulación de lípidos (n = 20). La hipótesis nula fue rechazada para p < 0.05. (B) en la parte superior, un western blot muestra la Akt fosforilada (verde) y la total expresión de Akt (rojo) en CD31 + CD34 + células estimuladas en vitro con 5 insulina nM 30 min antes de la inducción de adipogenic (n = 8). En la parte inferior, se muestra un aceite rojo O la coloración de las mismas células después de la inducción de adipogenic durante 14 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El enfoque de este trabajo es proporcionar una metodología para el aislamiento, expansión y adipogenic inducción de CD31 + CD34 + de las células endoteliales de los depósitos viscerales y subcutáneos de tejido adiposo humano.
Metodologías se han divulgado para el aislamiento de las células endoteliales de varios lechos vasculares de roedores o humanos que implican principalmente técnicas usando CD31 anticuerpos fluorescente etiquetado o junto a granos magnéticos18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23. un desafío importante para el uso universal de estas técnicas de aislamiento es la heterogeneidad de la población de células endoteliales en diferentes lechos vasculares y el alto riesgo de contaminación con fibroblastos y células vasculares mural. Sin embargo, mejoras de las técnicas de aislamiento para evitar estas contaminaciones han sido divulgados24. Utilizando estas técnicas, sobre todo las células endoteliales maduras están aisladas de los tejidos. Tejido adiposo es una reserva grande de células madre/progenitoras, incluyendo progenitores endoteliales25,26. Algunos artículos informaron la purificación de las células endoteliales del tejido adiposo humano usando una combinación de CD34 y CD31 +2711,de anticuerpos. Las células que expresan los dos marcadores son una población mixta de células endoteliales maduras y progenitores endoteliales11,28,29. Varios trabajos seminales reciente informan que un pequeño subconjunto de endotelial (CD31 +) o mural (PDGFRβ +) células de la vasculatura adiposa es una fuente rica de adipocito progenitores5,30. Estas células vasculares con adipogenic potencial pueden producir adipocitos blancos o marrón/beige y se asocian con angiogénesis activa en la vasculatura adiposo5. Estos resultados pueden proporcionar nuevas oportunidades terapéuticas para mejorar el rendimiento metabólico en la obesidad o para inducir pérdida de peso mediante la generación de adipocitos blancos o termogénicos de progenitores vasculares. Por lo tanto, resulta de interés identificar una metodología para el aislamiento fácil y económico, la expansión y la evaluación del potencial de las células endoteliales vasculares del tejido adiposo humano adipogenic.
El CD34 + CD31 + células de depósitos humanos omental y subcutáneo tejido adiposo visceral se caracterizaron previamente basado en su potencial angiogénico, la producción de mediadores inflamatorios, sus marcadores de senescencia y otras funciones11 , 31. sin embargo, no existe evidencia publicada para el potencial de adipogenic de tales células. Publicaciones anteriores que separadas CD34 + CD31 + células mediante bolas magnéticas informan sobre datos de las células de un gran número de temas (10 o más)11. Este papel divulga por primera vez un protocolo para el aislamiento de éxito y expansión de las células de donantes humanos solo de los depósitos subcutáneos y omentales + CD34 + CD31. Había aislado y ampliado las células desde tan poco como 2-3 g de tejido adiposo. Las células de CD34 + CD31 + representado 3 – 5% de las células totales del SVF y aparece > 90% viabilidad después del aislamiento. Estas células fueron altamente proliferativas y mostraron una amplia gama de respuestas hacia la diferenciación de adipogenic tras un estímulo en vitro con rosiglitazona e insulina. Los estudios anteriores sólo utilizan células madre adiposas o total fracción vascular estromal de tejido adiposo humano para probar adipogenic respuestas4,32,33,34. Un estudio reciente utilizó suspensiones de la célula de la microcirculación del tejido adiposo humano, pero no está claro si los adipocitos diferenciados son murales o endotelial en la naturaleza3.
Adicional immunophenotyping de las células mediante citometría de flujo + CD34 + CD31 demostró su falta de marcadores de CD45 y CD24 independientemente de su depósito de origen. Lo importante, nos mostró que después de 3 pasos en la cultura, el CD31 + CD34 + células conservan su funcionalidad endotelial demostrada por la acumulación de LDL acetilada y una formación de tubo en vitro en una matriz 3D. Además, los adipocitos diferenciados representan una población mixta de células blancas y beige/marrón, basada en su morfología y marcadores moleculares, como una expresión de la proteína UCP-1. Estudios previos en ratones demostraron que la vasculatura de tejido adiposo puede ser una fuente de tanto blanco y adipocitos marrones5,30 y los datos más recientes mostraron un resultado similar con respecto a la diferenciación de blanco y funcionalmente células beiges termogénicas de vasculatura adiposo humano3.
A diferencia de la mayoría de las publicaciones que utilizan adipogenic cócteles que contienen múltiples ingredientes para la diferenciación del adipocito de una gama de progenitores en vitro, se encontró que la rosiglitazona e insulina son necesarias y suficientes para el adipogenic inducción de células + CD34 + CD31. Aunque somos conscientes que rosiglitazona sola puede inducir una acumulación de lípidos en las células no adiposo35, la firma molecular de pan-adipocito y marcadores del adipocito marrón/beige, incluyendo una proteína UCP-1 expresión en células selectas, confirma la fenotipo del adipocito de algunas de las células diferenciadas. Nuestro dos ingrediente adipogenic cóctel simplifica el protocolo procesal y hace que sea más rentable.
Una observación importante fue que la respuesta de adipogenic de las células de CD34 + CD31 + fue muy variable con el tema de la donante y depósito adiposo. Mientras que las diferencias específicas de depósito en el adipogenic respuestas de células adiposas o estromales vasculares progenitores han sido previamente registrados32,34, la variabilidad del sujeto de una respuesta es una observación nueva. De las 20 muestras humanas analizadas, 3 SC y 7 células de OM no respondieron a la inducción de adipogenic. Mostraron las respuestas más sólidas > 90% de las células sensibles a la inducción de 4 muestras de SC y 2 muestras de OM. Curiosamente, se encontró que la sensibilidad se correlaciona negativamente con la HbA1c y no se correlaciona con la respuesta a un en Vitro estimulación de la insulina en las células no diferenciadas. Sostenemos que la diferencia en la respuesta no es debido a la pobre reproducibilidad de la técnica sino más bien refleja la huella individual de las células que imitan en vivo las respuestas. La preservación de esta respuesta diferencial requiere más validación y pueden representan un método de investigación relativamente fácil para la capacidad de respuesta a las terapias destinadas a estimular la adipogénesis en vivo. Para entender aún más la fuente de la variabilidad individual en la potencial adipogenic, immunophenotyping adicional es necesario identificar subpoblaciones celulares dentro de las CD34 + CD31 + población que tienen una función de progenitor específicos del adipocito.
Algunas de las limitaciones de este protocolo incluyen una caracterización incompleta de las poblaciones celulares; extensión relativamente larga y los tiempos de diferenciación (2 semanas + 2 semanas); potenciales limitaciones al acceso a muestras de humanos y la necesidad de la transformación inmediata de los tejidos recién recogidos; y la falta actual de datos funcionales de las células diferenciadas. Hay varias ventajas de esta metodología que incluyen un protocolo reproducible y no requiere mano de obra; probables que las células conservan la huella de su fenotipo en vivo ; la expansión de las células de muy pequeñas cantidades de tejidos con costos relativamente bajos; la posibilidad de criopreservar las células y conservar su firma adipogenic tras volver a la cultura; y la opción de generar repositorios de estas células que pueden ser utilizados para otros fines o proyección futuro.
Este protocolo y el CD34 + CD31 + células obtenidas como resultado final pueden utilizarse como una plataforma traslacional para estudios mecanísticos y para fines de detección.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer Becky Márquez, el Coordinador de la clínica en el centro de bariátrica Sentara su asistencia con el proceso de paciente investigación y consintiendo. Esta investigación fue apoyada por R15HL114062 a Anca D. Dobrian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Large Equipment |
|||
| Biosafety Cabinet |
Nuaire |
nu-425-400 |
|
| Cell Culture Incubator |
Thermo-Fisher Scientific |
800 DH |
|
| Water Bath |
Forma Scientific |
2568 |
Reciprocal Shaker |
| RT-PCR Machine |
BIO-RAD |
CFX96-C1000 |
|
| Electrophoresis Box |
BIO-RAD |
Mini PROTEAN 3 Cell |
|
| Transblot Box |
BIO-RAD |
Mini Trans-Blot Cell |
|
| Electrophoresis Power Supply |
BIO-RAD |
PowerPac Basic |
|
| ELISA Reader |
Molecular Devices |
SpectraMax M5 |
|
| Blot Reader |
LI-COR |
Odyssey |
Near Infrared |
| Refrigerated Centrifuge |
Eppendorf |
5810 R |
|
| Tabletop Centrifuge |
Eppendorf |
MiniSpin Plus |
|
| Fluorescent Microscope |
Olympus |
BX50 |
|
| Inverted Microscope |
Nikon |
TMS |
|
| KRBSS Buffer |
|||
| HEPES |
Research Products International |
H75030 |
|
| Sodium bicarbonate |
Sigma-Aldrich |
792519 |
|
| Calcium chloride dihydrate |
Sigma-Aldrich |
C7902 |
|
| Potassium phosphate monobasic |
Sigma-Aldrich |
P5655 |
|
| Magnesium sulfate |
Sigma-Aldrich |
M2643 |
|
| Sodium chloride |
Sigma-Aldrich |
746398 |
|
| Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich |
S9638 |
|
| Potassium chloride |
Sigma-Aldrich |
P9333 |
|
| Glucose |
Acros Organics |
410950010 |
|
| Adenosine |
Acros Organics |
164040250 |
|
| Bovine Serum Albumin |
GE Healthcare Bio-Sciences |
SH30574.02 |
|
| Penicillin/Streptomycin |
Thermo-Fisher Scientific |
15070063 |
|
| Tissue Digestion |
|||
| 20 mL Syringe |
Global Medical |
67-2020 |
|
| Nylon Mesh, 250 µm |
Sefar |
03-250/50 |
|
| Pipetting Needles |
Popper |
7934 |
|
| Fine Scissors |
Fine Science Tools |
14058-11 |
|
| Tissue Forceps |
George Tiemann & Co |
160-20 |
|
| Collagenase, Type I |
Worthington Biochemical |
LS004196 |
|
| Petri Dishes, 100 mm |
USA Scientific |
5666-4160 |
TC Treated |
| Eppendorf Tubes, 1.5 mL |
USA Scientific |
1615-5500 |
|
| Conical Tubes, 15 mL |
Nest Scientific |
601052 |
|
| Conical Tubes, 50 mL |
Nalgene |
3119-0050 |
|
| Scintillation Vials |
Kimble |
74505-20 |
Tissue Dicing |
| Cell Isolation |
|||
| Cellometer |
Nexcelom |
Auto 2000 |
|
| Cellometer Slides |
Nexcelom |
CHT4-SD100-002 |
|
| Cellometer Viability Stain |
Nexcelom |
CS2-0106-5mL |
Acridine Orange/Propidium Iodine |
| Anti-CD34 Magnetic Beads |
StemCell Technologies |
18056 |
Kit |
| EasySep Magnet |
StemCell Technologies |
18000 |
|
| Anti-CD31 Plastic Beads |
pluriSelect USA |
19-03100-10 |
|
| pluriSelect 10x Wash Buffer |
pluriSelect USA |
60-00080-10 |
|
| pluriSelect Connector Ring |
pluriSelect USA |
41-50000-03 |
|
| pluriSelect Detachment Buffer |
pluriSelect USA |
60-00046-12 |
|
| pluriSelect Incubation Buffer |
pluriSelect USA |
60-00060-12 |
|
| pluriSelect S Cell Strainer |
pluriSelect USA |
43-50030-03 |
|
| Cell Culture |
|||
| 6-well Plates |
USA Scientific |
CC7682-7506 |
TC Treated |
| 4-well chambered slides |
Corning Life Sciences |
354559 |
Fibronectin coated |
| 4-well chambered slides |
Thermo-Fisher Scientific |
154526PK |
Uncoated glass |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC) |
Sciencell Research Laboratories |
7200 |
Primary cell line |
| Endothelial Cell Media (ECM) |
ScienCell Research Laboratories |
1001 |
Complete Kit |
| DMEM/F12 Basal Media |
Thermo-Fisher Scientific |
11320082 |
|
| Fetal Bovine Serum (FBS) |
Rocky Mountain Biologicals |
FBS-BBT |
|
| Insulin |
Lilly |
U-100 |
Humalog |
| Rosiglitazone |
Sigma-Aldrich |
R2408 |
|
| Cell Analysis |
|||
| Oil Red O Dye |
Sigma-Aldrich |
O0625 |
Prepared in isopropanol |
| 96 well plates |
USA Scientific |
1837-9600 |
|
| 96 well PCR plates |
Genesee Scientific |
24-300 |
|
| RNA Extraction |
Zymo Research |
R2072 |
Kit |
| cDNA Synthesis |
BIO-RAD |
1708841 |
Supermix |
| JumpStart PCR Polymerase |
Sigma-Aldrich |
D9307-250UN |
Hot start, with PCR Buffer N |
| Magnesium Chloride Solution |
Sigma-Aldrich |
M8787-5ML |
3 mM final in PCR reaction |
| dNTPs |
Promega |
U1515 |
|
| TaqMan AdipoQ |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00605917_m1 |
|
| TaqMan CIDEA |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00154455_m1 |
|
| TaqMan RPL27 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs03044961_g1 |
|
| TaqMan UCP1 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00222453_m1 |
|
| BCA Assay |
Sigma-Aldrich |
QPBCA-1KT |
Kit |
| Bis-acrylamide |
BIO-RAD |
1610146 |
40% stock solution |
| Ammonium Persulfate |
BIO-RAD |
1610700 |
|
| TEMED |
BIO-RAD |
1610800 |
|
| Tris |
Sigma-Aldrich |
T1503 |
|
| Glycine |
BIO-RAD |
1610718 |
|
| Sodium Dodecal Sulfate |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
| EDTA |
Fisher Scientific |
S311-100 |
|
| Bromophenol Blue |
Sigma-Aldrich |
B8026 |
|
| Blot Membrane |
EMD Millipore |
IPFL00010 |
|
| Methanol |
Fisher Scientific |
A452-SK4 |
|
| Odyssey Blocking Buffer, Tris |
LI-COR |
927-50000 |
|
| Anti-AKT antibody |
Cell Signaling Technology |
2920S |
Mouse monoclonal |
| Anti-pAKT antibody |
Cell Signaling Technology |
9271S |
Rabbit polyclonal |
| Anti-UCP1 antibody |
Abcam |
ab10983 |
Rabbit polyclonal |
| Anti-Mouse IgG antibody |
LI-COR |
926-68070 |
Goat Polyclonal, IRDye 680RD |
| Anti-Rabbit IgG antibody |
LI-COR |
926-32211 |
Goat Polyclonal, IRDye 800CW |
| Anti-Rabbit IgG antibody |
Jackson ImmunoResearch |
111-025-003 |
Goat Polyclonal, TRITC |
| Phosphate Buffer Saline |
Thermo-Fisher Scientific |
10010049 |
|
| 37% Formaldehyde Solution |
Electron Microscopy Sciences |
15686 |
4% solution for cell fixation |
| Normal Goat Serum |
Vector Laboratories |
S-1000 |
10% blocking solution |
| Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
X-100 |
0.1% permeabilization solution |
| DAPI |
Thermo-Fisher Scientific |
D1306 |
|
| Calcein AM |
Thermo-Fisher Scientific |
65-0853-39 |
Cell fluorescent visualization |
| Matrigel Basement Membrane Matrix |
Corning Life Sciences |
356231 |
Growth factor reduced |
| DiI labeled Acetylated LDL |
Thermo-Fisher Scientific |
L3484 |
References
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