Summary
Differensiering av hvitt og beige adipocytter fra fettvev vaskulær progenitors bærer metabolske forbedringspotensial i fedme. Vi beskriver protokoller for en CD34 + CD31 + endothelial celle isolasjon fra menneskelige fat og en senere i vitro ekspansjon og differensiering i hvitt og beige adipocytter. Flere nedstrøms programmer diskuteres.
Abstract
Fedme er ledsaget av en omfattende ombygging av fettvev hovedsakelig via adipocyte hypertrofi. Ekstrem adipocyte vekst resulterer i en dårlig respons på insulin, lokale hypoksi og betennelser. Ved å stimulere differensiering av funksjonelle hvite adipocytter fra progenitors, radikale hypertrofi av befolkningen adipocyte kan forebygges og følgelig fettvev metabolske helse kan forbedres med en reduksjon av betennelse. Også ved å stimulere en differensiering av beige/brun adipocytter, kan av hele kroppen energi utgiftene økes resulterer i vekttap. Denne tilnærmingen kan hindre utvikling av fedme Co-morbidities som type 2 diabetes og hjerte-og karsykdommer.
Dette dokumentet beskriver isolasjon, utvidelse og differensiering av hvitt og beige adipocytter fra et delsett av menneskelig fettvev endotelceller som co uttrykker markørene CD31 og CD34. Metoden er relativt billig og er ikke arbeidskrevende. Det krever tilgang til menneskelig fettvev og underhud depot er egnet for prøvetaking. For denne protokollen, frisk fettvev prøver sykelig overvektige fag [kroppsmasseindeks (BMI) > 35] er samlet under bariatric kirurgi prosedyrer. Bruker en sekvensiell immunoseparation fra pancreatic, produseres nok celler fra så lite som 2-3 g av fett. Disse cellene kan utvides i kultur over 10-14 dager, kan være cryopreserved og beholde sine adipogenic egenskaper med passaging opp til passasjen 5-6. Cellene behandles i 14 dager med en adipogenic cocktail ved hjelp av en kombinasjon av menneskelig insulin og PPARγ agonist-rosiglitazon.
Denne metoden kan brukes for å få bevis på konseptet eksperimenter på molekylære mekanismer som driver adipogenic svar i adipose endotelceller eller screening nye stoffer som kan forbedre adipogenic svar gjorde enten mot hvit eller beige/brun adipocyte differensiering. Bruker små subkutan biopsier, kan denne metoden brukes til å sile ut ikke-responder fag for kliniske forsøk å stimulere beige/brun og hvit adipocytter for behandling av fedme og Co-morbidities.
Introduction
Nyere bevis viser at både i mus og hos mennesker, et delsett av cellene er bosatt i fettvev blodkar kan differensieres til enten hvitt eller beige/brun adipocytter1,2,3. Fenotypen av slike celler er omstridt, med bevis som støtter endotelceller, glatt muskel/pericyte eller et spekter av mellomliggende fenotyper4,5,6,7. Omfanget av utvikle denne metoden var å teste adipogenic potensialet i CD34 + CD31 + endotelceller isolert fra ulike fett depoter fra overvektige mennesker. Andre studier i litteraturen fokuserer på adipogenic potensielle av den totale pancreatic eller kjente adipocyte progenitors2,8,9. Siden eksisterende teknologier kan målrette spesielt fettvev endotelceller for stoffet levering10, er forstå potensialet i slike celler gjennomgå adipogenic induksjon mot hvit eller beige adipocytter viktig for fremtidige målrettet terapi.
Ulike grupper rapportert kombinasjonen av CD31 og CD34 markører som surrogater isolere endotelceller menneskelige fettvev11,12,13. Vanligvis utføres isolasjon med to sammenhengende trinn og en positiv utvalg med magnetiske perler. I denne rapporten, ble immunoseparation med CD34 + magnetiske perler kombinert med CD31 plast perler benyttet. Vi fant denne teknikken bedre enn den sekvensielle magnetiske immunoseparation med hensyn til bevaring av typiske brosteinsbelagte endothelial morfologi. Også var vi kunne generere nok celler kreves for ekspansjon og adipogenic induksjon starter fra så lite som 1-2 g av fett. En liten prøve biopsy av subkutant fett er nok til å produsere det nødvendige antallet celler for nedstrøms programmer. Dette aspektet er potensielt viktig, spesielt hvis denne metoden vil bli benyttet for screening for en respons til adipogenic induksjon i mennesker.
I motsetning til andre systemer rapportert i litteraturen, benytter denne metoden bare to ingredienser for adipogenic induksjon av CD34 + CD31 + celler: en PPARγ agonist-rosiglitazon- og menneskelige insulin. Viktigere, ligger hvor mye insulin brukes innenfor normal/høy av sirkulerende post-absorptive insulin i mennesker14. Graden av respons på insulin på celler i vitro, målt ved Akt fosforylering, samsvarer ikke med deres evne til å svare på induksjon cocktail. Interessant, bruker denne induksjon cocktail og eksperimentelle forhold, en blanding av hvite og beige/brun celler ble innhentet etter størrelse og antall intracellulær lipid dråper og uttrykket av molekylære markører. Denne enkel og kostnadseffektiv induksjon protokollen sammen med kvantitative evalueringen av fenotypen av responder cellene (hvitt og beige) gir en screening av agenter som potensielt kan endre balansen av differensiert beige : hvit adipocytter.
Denne metoden gir også en translational tilnærming for å forstå de underliggende mekanismene adipogenesis av vaskulær endotelial progenitors i menneskelig fettvev. Bruker denne bestemte isolasjon/differensiering teknikken, kan etterforskere forhøre ulike veier ansvarlig for adipogenesis i et delsett av vaskulær endotelceller fra ulike fett depoter i mager og overvektige mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institusjonelle gjennomgang styret komiteen i øst Virginia Medical School godkjent forskning og samling av menneskelig fettvev prøver som brukes i studien. Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra pasienter.
1. forberedelse buffere, Media og instrumenter
- Forberede en Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered løsning (KRBBS): 135 mM natriumklorid, 5 mM kalium klorid, 1 mM Magnesiumsulfat, 0.4 mM kalium fosfat dibasic, 5,5 glukose, 1 mM adenosin, 0,01% antibiotika/antimycotic blanding (50 µg/mL av penicillin, 50 µg/mL streptomycin, 30 µg/mL gentamicin, 15 ng/mL amfotericin) og 10 mM HEPES (pH = 7.4). Denne løsningen er tilberedt ferske hver gang for vev innsamling og fordøyelsen.
- Utarbeide en fersk collagenase løsning: 1 mg/mL collagenase, Skriv inn 1 i KRBSS; gjør 3 mL/g av fett. Forvarm collagenase løsning på 37 ° C i et vannbad før vev fordøyelsen.
- Forberede en CD34 celle isolasjon Buffer: 2% fosterets bovin serum (FBS) og 1 mM EDTA i sterilt fosfat-bufret saltvann (PBS).
- Forbered Adipogenesis Media: DMEM/F12, 5% FBS, 50 µg/mL av penicillin/streptomycin, 1,25 µL/mL av menneskelig insulin (5 µg/mL eller 144 mU/mL) og 0.36 µL/mL av 2,8 mM rosiglitazon (1 µM).
- Klargjør en 0,3% olje Red O (ORO) lager løsning (vekt/volum) ved oppløsning 0,3 g ORO i 100 mL isopropanol.
2. adipose pancreatic isolasjon
Merk: Studien inkluderte en cross-sectional kohort av sykelig overvektige type 2 diabetiker (T2D) og ikke-diabetikere fag, i alderen 18-65 år, gjennomgår bariatric kirurgi Sentara metabolske og vekt tap Surgery Center (Sentara medisinske gruppen, Norfolk, VA). Utelukkelse inkluderte en autoimmun sykdom inkludert type 1 diabetes mellitus, tilstander som krever kronisk suppressive terapi, anti-opphissende medications, thiazolinendiones, aktiv tobakksbruk, kronisk eller akutt infeksjon eller en historie av malignitet behandlet i de siste 12 månedene. T2D ble definert som en fasting plasma glukose 126 mg/dL eller større, en glukose på 200 mg/dL eller høyere etter en 2t glukosetoleranse test eller bruk av antidiabetika medisiner.
- Samle menneskelig omental (OM) og fettvev for subcutaneous (SC) (AT) fra menneskelig fag gjennomgår bariatric kirurgi.
- Holde OM og SC AT i separate ampuller som inneholder Hanks bufret saltløsning med 50 µg/mL av penicillin/streptomycin ved romtemperatur umiddelbart etter vev utvinning.
- Forsiktig feilfri og fjerne fibrotiske og cauterized delene av vev med 70% etanol swabbed saks og pinsett når prøven ankommer laboratoriet etter vev utvinning.
- Veie fettvev og deling it til 5 g (eller mindre) dele på collagenase fordøyelsen.
- Fint hakke 5 g av AT i 5 mL av en collagenase løsning i scintillation ampuller i romtemperatur, med to par saks.
- Legge til en ekstra 10 mL collagenase løsning til hakket vev for 15 mL totalt.
- Fordøye prøvene 1t, ved 37 ° C, i et vannbad med kontinuerlig risting.
- Klippe tuppen av en 20 mL sprøyte å gjøre en stump slutt.
- Skjær en 9 cm x 9 cm kvadrat fra en 250 µm mesh og skyve den halvveis inn i et 50 mL konisk rør med den butte end sprøyten.
- Hell prøvene i 20 mL sløv slutten sprøyte og filtrere gjennom 250 µm nylon mesh i 50 mL konisk røret å skille adipocytter og stromal vaskulære celler fra ufordøyd vev.
Merk: Ikke bruk mer enn 5 g av AT per 50 mL konisk tube, som mesh vil komme tett på grunn av fibrotiske ufordøyd materiale. - Vask ut scintillation ampullen med 10 mL KRBBS og hell den gjennom filteret å samle gjenværende celler.
- Inkuber filtrerte prøvene i 5 minutter ved romtemperatur.
Merk: Dette trinnet er viktig å tillate adipocytter å flyte på toppen av røret og noen av stromal vaskulære celler for å bosette seg på bunnen av røret. - Benytte en 20 mL sprøyte og en 20 G x 6 i pipettering p å fjerne pancreatic laget og overføre den til en ren 50 mL konisk rør.
- Legg til 10 mL av KRBBS og tillate prøvene å sitte på benken for 5 min, ved romtemperatur.
- Gjenta trinn 2.12-2.14 to ganger.
Merk: Disse trinnene sikrer at det er ingen kontaminering av stromal vaskulære celler med flytende adipocytter. - Holde stromal vaskulær fraksjoner fra begge depoter på is for videre behandling, som beskrevet i fremgangsmåten nedenfor.
Merk: Ikke la cellene på is mer enn 1 h, da dette kan ha innvirkning på celle levedyktighet. Adipocytter kan flash-frosne i flytende nitrogen for langtidslagring eller brukt friske for eksperimenter.
3. isolering av fettvev endotelceller
- Spin stromal vaskulær fraksjoner (sendinger) på 500 x g i 5 min, på 4 ° C.
- Fjern prøvene fra sentrifuge og forsiktig helle av nedbryting; holde pellets inneholder sendinger cellene.
- Forsiktig resuspend celle pellets i 5 mL av PBS.
Merk: Hvis mer enn 5 g av en på depot ble behandlet i Quidel (se trinn 2.4), basseng celle pellets sammen. - Spin prøvene på 500 x g i 5 min, på 4 ° C.
- Fjerne nedbryting, resuspend cellene i 1 mL av PBS og telle celler.
Merk: Her, en automatisk celle teller ble brukt for cellen opptelling. Cellen levedyktigheten ble oppnådd ved å blande 12 µL av cellen suspensjon med 12 µL av en Akridin oransje/propidium iodide (AO/PI) løsning (se Tabell for materiale). Gjennomsnittlig antall celler per gram AT for hver depot er: (a) OM Depot: 1.69 x 105 ± 4.51 x 104; (b) SC Depot: 1.24 x 105 ± 6,45 x 104. Levedyktigheten til cellene fra begge depoter var > 90%. - Pellets prøvene på 500 x g i 5 min, på 4 ° C.
Merk: En CD34 immunomagnetic utvalg protokoll (se Tabell for materiale) ble tilpasset for trinn 3.7-3.15. - Resuspend pellet i 100 µL CD34 isolasjon bufferen.
Merk: De totale celletall krever følgende re-oppheng volumer: (a) < 2 x 107 celler: resuspend pellet i 100 µL; (b) 2 x 108–5 x 108 celler: resuspend pellet i 1 mL. I trinn 3.9-3.16, volum av reagensene brukes ble skalert ned for < 2 x 107 celler. - Legg til 10 µL av CD34 cocktail og ruge prøven i 15 min, ved romtemperatur.
- Legg til 5 µL av magnetiske perler og ruge utvalget for 10 min, ved romtemperatur.
- Legge til 2,5 mL av CD34 isolasjon buffer hvert utvalg og plasser prøvene i magneten, etter 5 min, ved romtemperatur.
- Invertere magneten 5 s å helle av isolasjon buffer.
- Fjern prøvene fra magneten og gjenta trinn 3,10 og 3.11 4 x.
- Fjern røret fra magneten og tilsett 2 mL CD34 isolasjon buffer.
- Pellets cellene på 500 x g i 5 min, på 4 ° C.
- Resuspend celle pellets i 1 mL av CD34 isolasjon buffer og telle celler.
Merk: Her, gjennomsnittlig antall celler per gram på er: (a) OM Depot: 4,75 x 104 ± 3.36 x 104; (b) SC Depot: 1,06 x 104 ± 9.53 x 103. En CD31 plast immunobead protokoll ble tilpasset for trinn 3.16-3.34 (se Tabell for materiale). - Pellets cellene på 500 x g i 5 min og resuspend pellet i 250 µL av Buffer B og 250 µL av vaskebuffer.
- Grundig resuspend CD31 perler av vortexing røret.
- Legge til 20 µL av CD31 perler.
Merk: På grunn av total-celle teller > 1 x 106, volumet ble skalert ifølge produsenten inndataene. - Inkuber prøven med rock i 30 min, ved romtemperatur.
- Knytte en sil til et sterilt 50 mL konisk rør.
Merk: Større åpningen av silen må være på toppen. - Før cellen separasjon, Legg 1 mL av vaskebuffer til equilibrate silen. Påfør blandingen generert under trinn 3.16 til silen.
- Vask silen med 5 mL vaskebuffer i en sirkulær bevegelse for et totalvolum på 20 mL. Knytte kontakten til et sterilt 50 mL konisk rør og Lukk luer-lock.
- Feste silen til kontakten. Legg 1 mL av vaskebuffer langs silen. Legg 1 mL av aktivert buffer D langs silen. Swirl prøven forsiktig og ruge det for 10 min, ved romtemperatur.
- Legg 1 mL av vaskebuffer. Skille cellene fra perler av pipettering opp og ned 10 x.
Merk: Unngå å generere luftbobler. - Åpne luer-lock og at frittliggende cellene å strømme inn 50 mL konisk røret. Vask silen 10 x med 1 mL av vaskebuffer hver gang.
- Forkaste kontakt og sil og sentrifuge prøvene på 300 x g for 10 min, på 4 ° C. Resuspend celle pellet i 2 mL komplett EGF-2 Media for kultur.
Merk: Gjennomsnittlig antall celler per gram av AT på dette punktet er: (a) OM Depot: 5.92 x 103 ± 4.27 x 10-3; (b) SC Depot: 4,12 x 103 ± 2.1 x 103. Levedyktigheten til celler fra begge depoter var over 90%.
4. induksjon av Adipogenesis i isolerte endotelceller
- Vokse cellene i 6-og vev kultur-behandlet plater med komplett EGF-2 media på en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Erstatte media hver 3-4 dager til cellene kommer 80-90% samløpet.
Merk: Befolkningen dobling er mellom 2-3 dager. - Utvid cellene ved plating dem på 100 mm Petri retter og dele cellene 1:3 gang. På dette stadiet er cellene på avsnitt 2.
- Antall celler ved hjelp av en automatisk celle counter (se Tabell for materiale).
- Frø ca 100-200 000 celler i 6-vel platene sikrer like brønner for hver depot og kultur dem i fullføre EGF-2 media for 2 dager.
- Sug opp av noen vekst medier og erstatte den med 2 mL DMEM/F12 med 5% FBS 50 µg/mL av penicillin/streptomycin for kontrollen celler og erstatte den med 2 mL Adipogenesis media (se trinn 1.4) for cellene som behandling.
- Inkuber cellene på 37 ° C i en fuktet 5% CO2 inkubator for 13 dager, erstatte respektive media hver 3-4 dager.
Merk: Celler vil begynne å samle lipider etter 4 dager behandling. - Gjennomføre ORO og Nile røde flekker ifølge publiserte metoder15-17.
- For å isolere celler for uttrekking RNA, fjerner mediet fra 6-vel induksjon platene og vask det med 1 mL steril PBS.
- Legge til 350 µL av en guanidium thiocyanate-fenol-kloroform løsning (se Tabell of Materials) til hver godt og ruge det ved romtemperatur for 5-10 minutter.
- Skrape cellene av platen med en celle skraper og overføre cellene til en 1,5 mL microcentrifuge tube.
Merk: Prøvene kan lagres i-80 ° C fryseren for RNA utvinning og videre behandling senere. - Ekstra mRNA fra prøvene med en tilpasset RNA utvinning protokollen (se Tabell for materiale).
- Utføre en sanntids polymerasekjedereaksjons (RT-PCR) å vurdere genuttrykk bruker følgende sonder: adiponectin, UCP-1, og CIDEA (se Tabell for materiale).
Merk: Her RT PCR prosedyrer ble utført ved hjelp av følgende standard-protokoll: rødsprit (95 ° C, 15 s), avspenning, og utvidelse (60 ° C; 1 min) for 40 sykluser. Eksemplene som uttrykt gener med CT verdier > 35 ble vurdert som umulig å oppdage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Våre protokollen mål å gi i vitro tilnærming adipogenic potensialet av CD34 + CD31 + vaskulære celler fra ulike depoter av menneskelig fettvev. En forenklet flytskjema diagrammet vises i figur 1A. Det første trinnet bruker en positiv utvalg av CD34 uttrykke celler fører > 95% CD34 + celler i befolkningen av fersk isolert cellene (figur 1A). Viktigere, er denne indikatoren tapt når cellene er kultivert for et par avsnitt. Siden CD34 er en vanlig markør for mangfoldig blodkreft og ikke-blodkreft progenitors, er følgende trinn kreves for separasjon av endothelial progenitors positiv valg av CD31 + celler av CD34 + celle befolkningen (figur 1A). Selv om CD31 er en markør for endotelceller, kan det også finnes på delsett med blodkreft cellene. Vi analysert flere preparater fra både omental og subkutant fett av flowcytometri og funnet stadig at CD34 + CD31 + celler ikke uttrykke CD45 markøren (figur 1B, toppen panelene). Vanligvis < 1% av cellene viste CD45 positivitet, av total-celle befolkningen. Dette resultatet førte oss å konkludere med at vi sannsynligvis fått en forberedelse nesten gratis blodkreft progenitors. For å avgjøre hvis cellene express adipocyte stilk cellen merket CD24, vi analysert celler fra både omental og underhud depoter og fant at nesten ingen celler uttrykt CD24 markøren i omental depot (figur 1B, nedre paneler) og mindre enn 5% av cellene uttrykte markøren i subcutaneous depot (vises ikke). For å konkludere, innhentet med denne separasjon metoden, vi CD34 + CD31 + CD45-CD24-celler fra både omental og underhud depoter av overvektige.
Bruke plast perler konjugert med et CD31 antistoff, vi fikk celler som vises brosteinsbelagte endothelial morfologi under tidlig passasjer, i motsetning til celler atskilt med magnetiske perler konjugert med et CD31 antistoff som vises en spindel-formet mesenchymal fenotypen umiddelbart etter separasjonen (figur 2A). For å ytterligere underbygge endothelial identiteten til CD34 + CD31 + celler, vi utført to funksjonelle analyser: et opptak av DiI-Ac-LDL og en kjeller membran matrise (referert til som matrise heretter) rør formasjonen i vitro. CD34 + CD31 + celler ble inkubert med DiI-Ac-LDL og det store flertallet av cellene var positivt for opptak (figur 1 c). Som en positiv, vi brukte en menneskelig fettvev mikrovaskulær endothelial primære celle linje (HAMVEC) som er kommersielt tilgjengelig (se Tabell av materialer og figur 1 c). Vi testet om den CD34 + CD31 + celler beholde deres endothelial funksjon etter dyrking ved å bestemme evne til slike celler å danne spontan fartøy-lignende strukturer i vitro, i en 3D-matrise. Etter 3 passasjer, CD31 + CD34 + skjemaer rørformede fartøy-lignende strukturer i en matrise sammenlignes med en HAMVEC primære menneskelige endothelial celle linje (tallet 1 d).
Etter utvidelsen av celler for 2-3 passasjer byttet vi cellene fra EGF-2 fullstendig mediet som inneholder pro-angiogenic vekstfaktorer i DMEM/F12 media med 5% FBS, rosiglitazon (1µM) og insulin (144 mU/mL). Opprettholde cellene i EGF-2 fullføre media dramatisk redusert sine adipogenic differensiering. Også en tilføyelse av dexamethasone og 3-isobuthyl-1-methylxanthine til media endre ikke hastigheten og omfanget av lipid akkumulering og en tilføyelse av indomethacin betydelig redusert lipid opphopning (data ikke vist). Basert på disse foreløpige eksperimenter, besluttet vi å bare bruke rosiglitazon og insulin for adipogenic induksjon. Etter 14 dager av kulturen i adipogenic medier, cellene var fast og farget med olje Red O eller Nilen rød og kjerner var counterstained med DAPI (figur 2B). Tallene vises representant bilder celler isolert fra sammenkoblede subcutaneous (SC) (figur 2B, toppen panelene) og omental (OM) (figur 2B, nedre paneler) fettvev med tre menneskelige emner med en BMI mellom 37 – 45 kg/m2. Vær oppmerksom på at responsen på induksjon varierer mye mellom fagene og mellom depoter i samme fag. Sett fluorescerende bildet i figur 2B, en blandet befolkning unilocular (røde piler) og multilocular (hvite piler) er lipid inneholder celler og celler som ikke akkumuleres lipider (gule piler) vanligvis tilstede. Andelen mellom numrene på disse cellene er også svært variabel med både emnet og depot opprinnelsesland. En kvantifisering av andelen lipid inneholder celler (basert på olje Red O positivitet) fra de totale cellene (basert på DAPI-farget kjerner) viste en signifikant forskjell mellom SC og OM depoter av samme person, med cellene fra SC depot å være mer lydhør overfor adipogenic induksjon (figur 2C). Forklaringen på heterogenitet svar mellom fagene og depoter i samme fag er ikke klart. Men spekulere vi som sannsynligvis gjelder den iboende naturen befolkningen cellen som bærer fingeravtrykket i vivo fenotypen/miljøet og ikke på grunn av variasjon i isolasjon protokollen.
For å bekrefte at cellene gjennomgikk differensiering å modne adipocytter, målt vi genuttrykk pan-adipocyte markør adiponectin og brun/beige markører UCP-1 og CIDEA i cellene etter 13 dager med adipogenic induksjon sammenlignet un indusert kontroll celler. Adiponectin uttrykket ble økt til 10,000-fold i differensierte celler sammenlignet med kontrollene (figur 2D). Gene uttrykk for CIDEA og UCP1 var bare synlig i cellene etter adipogenic stimulering (figur 2D). Spesielt UCP-1 uttrykket var svært variabel, som reflekterer ulike proporsjoner av den hvite: brunt / beige celler i celle befolkningen. Uttrykk for housekeeping genet RPL27 var bemerkelsesverdig enhetlige prøvene med CT verdier varierer mellom 18-20 sykluser og ble ikke funnet noen betydelige forskjeller mellom cellene som gjennomgikk adipogenic differensiering og ubehandlet kontroller. Vi har også oppdaget en UCP-1 protein uttrykk i cellene som vises flere locular fenotypen, i en at det dukker opp mønster som antyder en mitokondrie lokalisering (figur 2E). UCP-1 protein var ikke synlig i celler som ikke akkumulere lipider eller i cellene med flere, svært små dråper som trolig ikke fullt differensiert adipocytter (figur 2E).
Vår observasjon at adipogenic potensialet av CD34 + CD31 + celler er depot-spesifikke og variabel blant ulike fag bedt oss å søke etter mulige sammenhenger med BMI, alder og HbA1c. Blant 28 prøvene testet, fant vi ikke noen viktige sammenhenger mellom adipogenic potensielle og alder eller BMI; Men, fant vi en betydelig negativ korrelasjon mellom HbA1c og lipid akkumulering i cellene fra OM depot (figur 3A). Dette funnet angir en potensielle koblingen med kronisk hyperglycemic miljøet og fortjener fremtidige undersøkelser. Dette antyder også at CD34 + CD31 + celler trolig bære i vivo signaturen evne til å svare på en adipogenic induksjon. Vi viser også at disse cellene vise variable beskyttelsesnivåer Akt fosforylering etter en i vitro insulin stimulering (figur 3B, topp). Men samsvarer denne variasjonen svar ikke med deres evne til å gjennomgå en adipogenic differensiering som vist av den olje Red O flekker på bilder av samsvarende prøvene (figur 3B, bunnen).
Figur 1: separasjon og karakterisering av CD34 + CD31 + celler fra menneskelige fettvev. (A) flytskjema diagrammet viser hovedtrinnene av isolasjon og differensiering. Etter at positiv bruker CD34 magnetiske perler, > 95% av fersk isolert celler, før det andre utvalg trinnet er CD34 +. (B) Denne representant flowcytometri viser en spredt tomten gated for levende celle befolkningen; en unstained kvinne prøve på FITC (BluFl2) kanalen. og CD45 farging av et representativt omental utvalg på toppen. Bunnen viser samme sekvens som vist på toppen, men for CD24 (Alexafluor 647-merket) cellene fra omental eksempel. (C) disse representative micrographs vise et opptak av DiI-Ac-LDL (rød) ved CD34 + CD31 + celler etter 4 h i vitro inkubering (topp panel). En lignende opptaket ble funnet i en menneskelig fettvev mikrovaskulær endothelial celle primære cellen linje (HAMVEC) (nederste panel). Kjerner, vises blå av DAPI. (D) disse representant micrographs viser en i vitro tube dannelsen av CD34 + CD31 + celler seeded i en 3D-matrise. CD34 + CD31 + celler (passering 3) ble sådd i 24-vel plater etter en farging med FITC-calcein og inkubert 4 h i fullstendig endothelial celle medier. Cellene ble fotografert med en invertert fluorescerende mikroskop. HAMVEC, seeded på samme tetthet, ble brukt for sammenligning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Adipogenic induksjon og markører CD34 + CD31 + celler som. (A) disse representant micrographs Vis morfologiske forskjellene mellom CD34 + CD31 + celler isolert hjelp av et positivt med CD31 + magnetiske perler vs CD31 + plast perler. Cellene ble fotografert på passage 1 etter isolasjon. Forstørrelsen brukes er 100 X. (B) disse panelene er representative micrographs av olje Red O farget CD34 + CD31 + celler fra sammenkoblede subcutaneous (SC) og omental visceral (OM) prøver av 3 ulike fag. Cellene ble kultivert for 2-3 ganger i EGF-2 komplett medier, så slått på DMEM/F12 media med 5% FBS og behandles med insulin (144 mU/mL) og rosiglitazon (1 µM) i 14 dager, med mediet endret hver tredje dag. Forstørrelsen brukes er 100 X. Representant fluorescerende bildet viser adipo rød lipid dråper (grønn) og DAPI kjernefysiske flekker (blå). Merk en blanding av celler som inneholder unilocular lipider (rød pil), multilocular lipid dråper (hvit pil) eller celler som viser lipid aldri (gul pil). Forstørrelsen brukes er 200 X, skala bar = 50 µm. (C) dette panelet viser en kvantifisering av adipogenic potensielle uttrykt som olje Red O (ORO) positive celler normalisert til totalt DAPI-farget kjerner. CD34 + CD31 + celler fra OM og SC depoter i samme fag viser en betydelig forskjell i adipogenic potensial av en parvis Student t-test (n = 7). (D) genuttrykk av eldre adipocyte markører (adiponectin UCP-1 og CIDEA) ble målt ved RT PCR i cellene etter 14 dager av adipogenic induksjon og kontroll cellene. Dataene er uttrykt som en fold-endring for adiponectin genuttrykk. Uttrykk for CIDEA og UCP-1 var ikke i kontroll prøvene. Verdiene representerer ΔCt normalisert til RPL27 som et housekeeping gen. CT verdiene for RLP27 var mellom 18-20 sykluser for alle prøvene i analysen (n = 3 – 5 fag). Dataene er uttrykt som betyr ± SD. En parvis Student t-test ble brukt for en statistisk analyse av dataene. p < 0,05 avviser den null-hypotesen. (E) dette panelet viser protein uttrykk for UCP-1 i CD34 + CD31 + celler etter 13 dager med induksjon med insulin og rosiglitazon. Immunocytochemistry bruker et menneskelig polyklonale UCP-1 antistoff viste en selektiv uttrykk av UCP-1 i flere locular adipocytter. Gjenkjenning ble oppnådd ved hjelp av en rhodamine-konjugerte sekundære antistoff (rød) og DAPI flekker for kjerner (blå). Store forstørrelsen i rammemargen viser at det dukker opp røde signalet tilsvarer UCP-1 (rød pil) samt flere lipid dråper (LD) i ulike størrelser rundt cellekjernen (N). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Sammenheng mellom adipogenic differensiering, HbA1c og i vitro insulin signalering. (A) Spearman (ikke-parametriske) og Pearson (parametrisk) korrelasjonskoeffisienter for OM og SC cellene, henholdsvis, ble brukt til å angi sammenhengen mellom HbA1c og lipid akkumulering (n = 20). Nullhypotesen ble avvist p < 0,05. (B) øverst, en vestlig blotting viser den phosphorylated Akt (grønn) og total Akt (rød) uttrykket i CD34 + CD31 + celler stimuleres i vitro med 5 nM insulin i 30 min før adipogenic induksjon (n = 8). Nederst vises en olje Red O farging av de samme cellene etter adipogenic induksjon i 14 dager. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fokus for denne utredningen er å gi en metodikk for isolasjon, utvidelse og adipogenic induksjon av CD34 + CD31 + endotelceller fra visceral og underhud depoter av menneskelig fettvev.
Metoder er rapportert for isolering av endotelceller fra ulike vaskulær senger til mus eller mennesker som involverer primært teknikker med CD31 antistoffer fluorescently merket eller koblet til magnetiske perler18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23. en stor utfordring for universell bruk følgende isolasjon er heterogenitet av endothelial celle befolkningen i ulike vaskulær senger og høy risiko for kontaminering med fibroblaster og vaskulære veggmaleri celler. Forbedringer av isolasjon-teknikker for å unngå slike forurensing har imidlertid vært rapportert24. Bruker disse teknikkene, er hovedsakelig eldre endotelceller isolert fra vev. Fettvev er et stort reservoar av stammen/stamfar celler, inkludert endothelial progenitors25,26. Noen papirer rapportert rensing av endotelceller fra menneskelige fettvev bruker en kombinasjon av CD34 + og CD31 + antistoffer11,27. Celler som uttrykker de to markørene er en blandet befolkning av modne endotelceller og endothelial progenitors11,28,29. Flere nyere banebrytende verk rapporterer at en undergruppe av endothelial (CD31 +) eller veggmaleri (PDGFRβ +) celler i er adipose blodkar er en rik kilde til adipocyte progenitors5,30. Disse vaskulære celler med adipogenic potensielle kan produsere både hvit eller brun/beige adipocytter og forbindes med aktiv angiogenese i adipose blodkar5. Disse funnene kan gi nye terapeutiske muligheter forbedre metabolske ytelsen i fedme og/eller å indusere vekttap ved å generere hvit og/eller thermogenic adipocytter fra vaskulær progenitors. Det er derfor av interesse å identifisere en metodikk for enkel og økonomisk isolasjon, utvidelse og vurdering av adipogenic potensialet av vaskulær endotelceller fra menneskelige fettvev.
CD34 + CD31 + celler fra menneskelige subkutan og omental visceral fettvev depoter var tidligere preget basert på deres angiogenic potensial, produksjon av inflammatoriske mediatorer, deres senescence indikatorer og andre funksjoner11 , 31. men det er ingen publiserte bevis for adipogenic potensialet i slike celler. Tidligere publikasjoner som atskilt CD34 + CD31 + celler ved hjelp av magnetiske perler rapport om data fra cellene samlet fra en rekke fag (10 eller flere)11. Dette papiret rapporter for første gang en protokoll for vellykket isolasjon og utvidelse av CD34 + CD31 + celler fra én menneskelig givere fra begge subkutan og omental depoter. Vi isolert og utvidet celler fra så lite som 2-3 g av fettvev. CD34 + CD31 + celler representerte 3 – 5% av totale sendinger cellene og vises > 90% levedyktighet etter isolasjon. Disse cellene var svært proliferativ og viste en rekke svar mot adipogenic differensiering etter en i vitro stimulering med rosiglitazon og insulin. Tidligere studier bare brukt adipose stilk celler eller totalt pancreatic fra menneskelige fettvev teste adipogenic svar4,32,33,34. En fersk studie brukt enkeltcelle suspensjoner fra microvasculature av menneskelig fettvev, men det er uklart om de differensiert adipocytter var veggmaleri eller endothelial i naturen3.
Flere immunophenotyping av CD34 + CD31 + celler ved hjelp av flowcytometri viste deres mangel på markører CD45 og CD24 uansett deres depot opprinnelsesland. Viktigere, vi viste at etter 3 passasjer i kultur, CD31 + CD34 + celler beholde endothelial funksjonaliteten demonstrert av akkumulering av acetylated LDL og en i vitro tube formasjon i en 3D-matrise. Også representerte de differensierte adipocytter en blandet befolkning av hvitt og beige/brun celler, basert på deres morfologi og molekylære markører, inkludert en UCP-1 protein uttrykk. Tidligere studier i mus viste at fettvev blodkar kan være en kilde til både hvit og brun adipocytter5,30 og nyere data viste et lignende resultat med hensyn til differensiering av hvite og funksjonelt thermogenic beige celler fra menneskelige adipose blodkar3.
I motsetning til de fleste publikasjoner som brukes adipogenic cocktailer som inneholder flere ingredienser for adipocyte differensiering fra en rekke progenitors i vitro, fant vi at rosiglitazon og insulin er nødvendig og tilstrekkelig for adipogenic induksjon av CD34 + CD31 + celler. Mens vi er klar over at rosiglitazon alene kan indusere en lipid akkumulering i ikke-liggende under adipose celler35, molekylær signaturen for pan-adipocyte og brun/beige adipocyte markører, inkludert et UCP-1 protein bekrefter uttrykk i merke celler, den eldre adipocyte fenotypen av noen av differensierte celler. Våre to-ingrediens adipogenic cocktail forenkler fremgangsmåter for protokollen og gjør det mer kostnadseffektive.
En viktig observasjon var at adipogenic svar CD34 + CD31 + celler var svært variabel med donor emnet og adipose depot. Mens depot-spesifikke forskjeller i adipogenic svar adipose stamceller eller stromal vaskulær progenitors har vært rapportert tidligere32,34, er emnet variasjon av slik respons en roman observasjon. Av de 20 menneskelige prøvene analysert, 3 SC og 7 OM celler svarte ikke på adipogenic induksjon. Mest robuste svarene viste > 90% av cellene mottakelig for induksjon for 4 prøver fra SC og 2 eksempler fra OM. interessant, fant vi at responsen er negativt korrelert med HbA1c og ikke samsvarer med svaret på en i vitro insulin stimulering i udifferensierte celler. Vi hevder at forskjellen i svaret er ikke på grunn av dårlig reproduserbarhet av teknikken, men snarere gjenspeiler personlige fingeravtrykk av celler som etterligner i vivo svar. Bevaring av denne differensial svar krever ytterligere validering og kan representere en relativt enkel screening metode for respons til behandling som mål å stimulere adipogenesis i vivo. For ytterligere å forstå kilden til individuelle variasjon i adipogenic potensielle, er ekstra immunophenotyping nødvendig å identifisere celle subpopulasjoner i den CD34 + CD31 + befolkningen som bærer en bestemt adipocyte stamfar funksjon.
Noen av begrensningene i denne protokollen inkludere en ufullstendig karakteristikk av celle populasjoner; relativt lange ekspansjon og differensiering ganger (2 uker + 2 uker); potensielle begrensninger i prøver fra mennesker og behovet for umiddelbar behandling av fersk samlet vev; og gjeldende mangel av funksjonelle data for de differensierte cellene. Det er flere fordeler med denne metodikken som inkluderer en reproduserbar og ikke arbeidskrevende protokoll; celler som sannsynligvis beholde fingeravtrykk av deres i vivo fenotypen; utvidelse av celler fra svært små mengder vev med relativt lave kostnader; muligheten til å cryopreserve cellene og beholde sin adipogenic signatur etter re kultur; og alternativet for å generere repositories til disse cellene slik at de kan brukes for fremtidige screening eller andre formål.
Denne protokollen og CD34 + CD31 + celler oppnådd som et sluttresultat kan brukes som en translational plattform både for mekanistisk studier og screening formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne Becky Marquez, klinisk koordinator på Sentara Bariatric Center, for henne hjelp med prosessen med pasienten screening og samtykke. Denne forskningen ble støttet av R15HL114062 til Anca D. Dobrian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Large Equipment |
|||
| Biosafety Cabinet |
Nuaire |
nu-425-400 |
|
| Cell Culture Incubator |
Thermo-Fisher Scientific |
800 DH |
|
| Water Bath |
Forma Scientific |
2568 |
Reciprocal Shaker |
| RT-PCR Machine |
BIO-RAD |
CFX96-C1000 |
|
| Electrophoresis Box |
BIO-RAD |
Mini PROTEAN 3 Cell |
|
| Transblot Box |
BIO-RAD |
Mini Trans-Blot Cell |
|
| Electrophoresis Power Supply |
BIO-RAD |
PowerPac Basic |
|
| ELISA Reader |
Molecular Devices |
SpectraMax M5 |
|
| Blot Reader |
LI-COR |
Odyssey |
Near Infrared |
| Refrigerated Centrifuge |
Eppendorf |
5810 R |
|
| Tabletop Centrifuge |
Eppendorf |
MiniSpin Plus |
|
| Fluorescent Microscope |
Olympus |
BX50 |
|
| Inverted Microscope |
Nikon |
TMS |
|
| KRBSS Buffer |
|||
| HEPES |
Research Products International |
H75030 |
|
| Sodium bicarbonate |
Sigma-Aldrich |
792519 |
|
| Calcium chloride dihydrate |
Sigma-Aldrich |
C7902 |
|
| Potassium phosphate monobasic |
Sigma-Aldrich |
P5655 |
|
| Magnesium sulfate |
Sigma-Aldrich |
M2643 |
|
| Sodium chloride |
Sigma-Aldrich |
746398 |
|
| Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich |
S9638 |
|
| Potassium chloride |
Sigma-Aldrich |
P9333 |
|
| Glucose |
Acros Organics |
410950010 |
|
| Adenosine |
Acros Organics |
164040250 |
|
| Bovine Serum Albumin |
GE Healthcare Bio-Sciences |
SH30574.02 |
|
| Penicillin/Streptomycin |
Thermo-Fisher Scientific |
15070063 |
|
| Tissue Digestion |
|||
| 20 mL Syringe |
Global Medical |
67-2020 |
|
| Nylon Mesh, 250 µm |
Sefar |
03-250/50 |
|
| Pipetting Needles |
Popper |
7934 |
|
| Fine Scissors |
Fine Science Tools |
14058-11 |
|
| Tissue Forceps |
George Tiemann & Co |
160-20 |
|
| Collagenase, Type I |
Worthington Biochemical |
LS004196 |
|
| Petri Dishes, 100 mm |
USA Scientific |
5666-4160 |
TC Treated |
| Eppendorf Tubes, 1.5 mL |
USA Scientific |
1615-5500 |
|
| Conical Tubes, 15 mL |
Nest Scientific |
601052 |
|
| Conical Tubes, 50 mL |
Nalgene |
3119-0050 |
|
| Scintillation Vials |
Kimble |
74505-20 |
Tissue Dicing |
| Cell Isolation |
|||
| Cellometer |
Nexcelom |
Auto 2000 |
|
| Cellometer Slides |
Nexcelom |
CHT4-SD100-002 |
|
| Cellometer Viability Stain |
Nexcelom |
CS2-0106-5mL |
Acridine Orange/Propidium Iodine |
| Anti-CD34 Magnetic Beads |
StemCell Technologies |
18056 |
Kit |
| EasySep Magnet |
StemCell Technologies |
18000 |
|
| Anti-CD31 Plastic Beads |
pluriSelect USA |
19-03100-10 |
|
| pluriSelect 10x Wash Buffer |
pluriSelect USA |
60-00080-10 |
|
| pluriSelect Connector Ring |
pluriSelect USA |
41-50000-03 |
|
| pluriSelect Detachment Buffer |
pluriSelect USA |
60-00046-12 |
|
| pluriSelect Incubation Buffer |
pluriSelect USA |
60-00060-12 |
|
| pluriSelect S Cell Strainer |
pluriSelect USA |
43-50030-03 |
|
| Cell Culture |
|||
| 6-well Plates |
USA Scientific |
CC7682-7506 |
TC Treated |
| 4-well chambered slides |
Corning Life Sciences |
354559 |
Fibronectin coated |
| 4-well chambered slides |
Thermo-Fisher Scientific |
154526PK |
Uncoated glass |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC) |
Sciencell Research Laboratories |
7200 |
Primary cell line |
| Endothelial Cell Media (ECM) |
ScienCell Research Laboratories |
1001 |
Complete Kit |
| DMEM/F12 Basal Media |
Thermo-Fisher Scientific |
11320082 |
|
| Fetal Bovine Serum (FBS) |
Rocky Mountain Biologicals |
FBS-BBT |
|
| Insulin |
Lilly |
U-100 |
Humalog |
| Rosiglitazone |
Sigma-Aldrich |
R2408 |
|
| Cell Analysis |
|||
| Oil Red O Dye |
Sigma-Aldrich |
O0625 |
Prepared in isopropanol |
| 96 well plates |
USA Scientific |
1837-9600 |
|
| 96 well PCR plates |
Genesee Scientific |
24-300 |
|
| RNA Extraction |
Zymo Research |
R2072 |
Kit |
| cDNA Synthesis |
BIO-RAD |
1708841 |
Supermix |
| JumpStart PCR Polymerase |
Sigma-Aldrich |
D9307-250UN |
Hot start, with PCR Buffer N |
| Magnesium Chloride Solution |
Sigma-Aldrich |
M8787-5ML |
3 mM final in PCR reaction |
| dNTPs |
Promega |
U1515 |
|
| TaqMan AdipoQ |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00605917_m1 |
|
| TaqMan CIDEA |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00154455_m1 |
|
| TaqMan RPL27 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs03044961_g1 |
|
| TaqMan UCP1 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00222453_m1 |
|
| BCA Assay |
Sigma-Aldrich |
QPBCA-1KT |
Kit |
| Bis-acrylamide |
BIO-RAD |
1610146 |
40% stock solution |
| Ammonium Persulfate |
BIO-RAD |
1610700 |
|
| TEMED |
BIO-RAD |
1610800 |
|
| Tris |
Sigma-Aldrich |
T1503 |
|
| Glycine |
BIO-RAD |
1610718 |
|
| Sodium Dodecal Sulfate |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
| EDTA |
Fisher Scientific |
S311-100 |
|
| Bromophenol Blue |
Sigma-Aldrich |
B8026 |
|
| Blot Membrane |
EMD Millipore |
IPFL00010 |
|
| Methanol |
Fisher Scientific |
A452-SK4 |
|
| Odyssey Blocking Buffer, Tris |
LI-COR |
927-50000 |
|
| Anti-AKT antibody |
Cell Signaling Technology |
2920S |
Mouse monoclonal |
| Anti-pAKT antibody |
Cell Signaling Technology |
9271S |
Rabbit polyclonal |
| Anti-UCP1 antibody |
Abcam |
ab10983 |
Rabbit polyclonal |
| Anti-Mouse IgG antibody |
LI-COR |
926-68070 |
Goat Polyclonal, IRDye 680RD |
| Anti-Rabbit IgG antibody |
LI-COR |
926-32211 |
Goat Polyclonal, IRDye 800CW |
| Anti-Rabbit IgG antibody |
Jackson ImmunoResearch |
111-025-003 |
Goat Polyclonal, TRITC |
| Phosphate Buffer Saline |
Thermo-Fisher Scientific |
10010049 |
|
| 37% Formaldehyde Solution |
Electron Microscopy Sciences |
15686 |
4% solution for cell fixation |
| Normal Goat Serum |
Vector Laboratories |
S-1000 |
10% blocking solution |
| Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
X-100 |
0.1% permeabilization solution |
| DAPI |
Thermo-Fisher Scientific |
D1306 |
|
| Calcein AM |
Thermo-Fisher Scientific |
65-0853-39 |
Cell fluorescent visualization |
| Matrigel Basement Membrane Matrix |
Corning Life Sciences |
356231 |
Growth factor reduced |
| DiI labeled Acetylated LDL |
Thermo-Fisher Scientific |
L3484 |
References
- Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).
- Min, S. Y., et al. Human 'brite/beige' adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice. Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Tran, K. V., et al. The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells. Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
- Miranville, A., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).
- Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).
- Moller, D. E., Flier, J. S. Insulin resistance--mechanisms, syndromes, and implications. The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes. The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).
- Satish, L., et al. Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage. BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization. Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).
- Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (105), e53072 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC). Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).
- Zhou, L., et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis. PLoS One. 10 (2), e0117644 (2015).
- Curat, C. A., et al. From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes. Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).
- Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).
- Traktuev, D. O., et al. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks. Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).
- Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis. Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).
- Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue. Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).
- Ong, W. K., et al. Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
- Ong, W. K., Sugii, S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots. American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).
- van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation. Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).
