Summary
La différenciation des adipocytes blancs et beiges de tissu adipeux progéniteurs vasculaire porte le potentiel d’amélioration métabolique dans l’obésité. Les auteurs décrivent des protocoles pour un CD34 + CD31 + isolation de cellules endothéliales de la graisse humaine ainsi qu’un subséquent in vitro de l’expansion et la différenciation en adipocytes blancs et beiges. Plusieurs applications en aval sont discutées.
Abstract
L’obésité s’accompagne d’un vaste remodelage du tissu adipeux principalement par l’intermédiaire de l’hypertrophie adipocytaire. Adipocyte extrême croissance résulte en une mauvaise réponse à l’insuline, l’hypoxie locale et l’inflammation. En stimulant la différenciation des adipocytes blancs fonctionnels de progéniteurs, hypertrophie radicale de la population d’adipocytes peut être évitée et, par conséquent, la santé métabolique du tissu adipeux peut être améliorée ainsi qu’une réduction de inflammation. En outre, en stimulant une différenciation des adipocytes beige/brun, la dépense d’énergie totale du corps peut être augmentée, entraînant une perte de poids. Cette approche pourrait prévenir le développement de co-morbidité de l’obésité comme les maladies cardiovasculaires et le diabète de type 2.
Cet article décrit l’isolement, l’expansion et la différenciation des adipocytes blancs et beiges d’un sous-ensemble de cellules endothéliales de tissu adipeux humain qui expriment conjointement les marqueurs CD31 et CD34. La méthode est relativement bon marchée et n’est pas beaucoup de travail. Il requiert l’accès aux tissus adipeux humains et le dépôt sous-cutané est adapté pour l’échantillonnage. Pour ce protocole, les tissus adipeux frais échantillons provenant de sujets souffrant d’obésité morbide [indice de masse corporelle (IMC) > 35] sont collectées pendant les procédures de chirurgie bariatrique. À l’aide d’une immunoseparation séquentielle de la fraction stroma vasculaire, suffisamment de cellules est produites à aussi peu que 2 à 3 g de matières grasses. Ces cellules peuvent être développés en culture sur une période de 10 à 14 jours, peuvent être cryoconservés et conservent leurs propriétés adipocytaire avec passage jusqu'à passage 5-6. Les cellules sont traitées pendant 14 jours avec un cocktail à l’aide d’une combinaison de l’insuline humaine et l’agoniste-rosiglitazone PPARγ adipocytaire.
Cette méthode peut être utilisée pour l’obtention de preuve d’expériences de notion sur les mécanismes moléculaires qui animent les réponses adipocytaire dans les cellules endothéliales adipeuses, ou pour le dépistage des nouveaux médicaments qui peuvent augmenter l’adipocytaire réponse dirigée soit vers le blanc ou différenciation adipocytaire beige/marron. À l’aide de petites biopsies sous-cutanée, cette méthodologie permet d’écarter les sujets non-répondeur pour des essais cliniques visant à stimuler les adipocytes beige/marron et blancs pour le traitement de l’obésité et les comorbidités.
Introduction
Des données récentes montrent que, chez les souris et chez l’homme, un sous-ensemble de cellules résidant dans la vascularisation du tissu adipeux peut être différencié en soit les adipocytes blancs ou beige/marron1,2,3. Le phénotype de ces cellules est un sujet de controverse, avec preuves à l’appui des cellules endothéliales, musculaires lisses/pericyte ou un spectre de phénotypes intermédiaires4,5,6,7. Le champ d’application de cette méthodologie de développement était de tester le potentiel adipocytaire de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales isolées de différents dépôts gras contre les hommes obèses. D’autres études dans la littérature mettent l’accent sur le potentiel de la fraction totale de vasculaire stromale ou des progéniteurs adipocytaires connu2,8,9adipocytaire. Étant donné que les technologies existantes peuvent cibler spécifiquement les cellules endothéliales tissu adipeux pour drogue livraison10, compréhension du potentiel de ces cellules à subir adipocytaire induction vers les adipocytes blancs ou beiges est importante pour futures thérapies ciblées.
Différents groupes ont signalé la combinaison de marqueurs CD31 et CD34 comme substituts pour isoler les cellules endothéliales du tissu adipeux humain11,12,13. En règle générale, l’isolement est effectuée à l’aide de deux étapes séquentielles et une sélection positive à l’aide de billes magnétiques. Dans ce rapport, immunoseparation à l’aide de CD34 + billes magnétiques combinés avec des perles en plastique CD31 a été utilisée. Nous avons constaté que cette technique est supérieure à l’immunoseparation magnétique séquentielle en ce qui concerne la conservation de la morphologie endothéliale pavées typiques. Aussi, nous étions en mesure de produire suffisamment de cellules nécessaires à l’expansion et adipocytaire induction à partir d’aussi peu que 1 à 2 g de matières grasses. Une biopsie du petit échantillon de graisse sous-cutanée est suffisant pour produire la quantité requise de cellules pour les applications en aval. Cet aspect est potentiellement important, surtout si cette méthode sera utilisée pour le dépistage d’une réactivité à induction adipocytaire chez des sujets humains.
Contrairement aux autres systèmes rapportés dans la littérature, cette méthode utilise seulement deux ingrédients pour l’induction adipocytaire des cellules CD34 + CD31 + : un agoniste PPARγ — rosiglitazone — et l’insuline humaine. Ce qui est important, la quantité d’insuline utilisée correspond à la fourchette de normale/haute de circulation insuline post-absorptif chez les humains,14. Le degré de sensibilité à l’insuline du cellules in vitro, mesurée par la phosphorylation de l’Akt, n’est pas corrélée avec leur capacité de répondre à l’induction cocktail. Fait intéressant, un mélange de blancs et beige/marron de cellules en utilisant des conditions expérimentales et cocktail cette induction, ont été obtenues tel que déterminé par la taille et le nombre de gouttelettes de lipides intracellulaires et l’expression des marqueurs moléculaires. Ce protocole d’induction simple et rentable ainsi que l’évaluation quantitative du phénotype des cellules répondeur (blanc ou beige) permet un dépistage d’agents qui peuvent potentiellement modifier l’équilibre du beige différenciée : blanc d’adipocytes.
Cette méthode fournit également une approche translationnelle pour comprendre les mécanismes sous-jacents de l’adipogenèse des progéniteurs endothéliales vasculaires dans le tissu adipeux humain. Utilisant cette technique d’isolation/différenciation spécifique, les enquêteurs peuvent interroger diverses voies chargées de l’adipogenèse dans un sous-ensemble de cellules endothéliales vasculaires de différents dépôts de graisse chez l’homme maigre et obèses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le Comité d’examen institutionnel à Eastern Virginia Medical School a approuvé la recherche et la collecte d’échantillons de tissus adipeux humains utilisés dans l’étude. Consentement éclairé par écrit ont été recueilli chez les patients.
1. préparation des tampons, des médias et Instruments
- Préparer une Solution de Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS) : 135 mM chlorure de sodium, chlorure de potassium de 5 mM, 1 mM sulfate de magnésium, 0,4 mM de phosphate de potassium dibasique, glucose 5,5 mM, 1 mM l’adénosine, 0,01 % de mélange antibiotique/Antimycosique (50 µg/mL de pénicilline, 50 µg/mL de streptomycine, 30 µg/mL de gentamicine, 15 ng/mL d’amphotéricine) et 10 mM HEPES (pH = 7,4). Cette solution est préparée fraîche chaque fois pour le prélèvement tissulaire et la digestion.
- Préparer une solution de collagènase fraîches : 1 mg/mL de collagénase, tapez 1, dans KRBSS ; faire 3 mL/g de matière grasse. Réchauffez la solution de la collagénase à 37 ° C dans un bain d’eau avant la digestion du tissu.
- Préparer un tampon d’isolement cellulaire CD34 : 2 % sérum fœtal (SVF) et 1 mM EDTA stérile solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Préparer l’adipogenèse Media : DMEM/F12, 5 % FBS, 50 µg/mL de pénicilline/streptomycine, 1,25 µL/mL de l’insuline humaine (5 µg/mL ou 144 mU/mL) et 0,36 µL/mL de 2,8 mM rosiglitazone (1 µM).
- Préparer une solution de réserve d’huile rouge O (ORO) 0,3 % (poids/volume) en dissolvant 0,3 g de ORO dans 100 mL d’isopropanol.
2. tissu adipeux Fraction vasculaire stromales isolement
Remarque : L’étude a inclus une cohorte transversale d’obésité morbide type 2 diabétiques (T2D) et des sujets non diabétiques, âgés de 18 à 65 ans, qui subissent une chirurgie bariatrique au Sentara métaboliques et centre de chirurgie de perte de poids (Sentara Medical Group, Norfolk, Virginie). Critères d’exclusion incluent une maladie auto-immune, y compris le diabète de type 1, conditions nécessitant une thérapie immunosuppressive chronique, anti-inflammatoires, thiazolinendiones, tabagisme actif, les infections chroniques ou aiguës ou une histoire de malignité traitées dans les 12 derniers mois. T2D était définie comme une glycémie plasmatique à jeun de 126 mg/dL ou plus, une glycémie de 200 mg/dL ou plus après une tolérance au glucose 2 h test ou l’utilisation de médicaments antidiabétiques.
- Collecte humaine épiploïques (OM) et du tissu adipeux sous-cutané (SC) (AT) des sujets humains qui subissent une chirurgie bariatrique.
- Garder l’OM et SC AT dans des flacons séparés contenant mis en mémoire tampon salin de Hank avec 50 µg/mL de pénicilline/streptomycine à température ambiante immédiatement après l’extraction des tissus.
- Soigneusement nettoyer et supprimer les articles fibreux et cautérisation du tissu à l’aide de pinces et ciseaux écouvillonnée de l’éthanol 70 % lorsque l’échantillon arrive au laboratoire après l’extraction des tissus.
- Peser le tissu adipeux et partitionner les aliquotes de TI en 5 g (ou moins) pour la digestion de collagénase.
- Finement hacher 5 g de l’AT dans 5 mL d’une solution de collagènase dans un flacon à scintillation à température ambiante, à l’aide de deux paires de ciseaux.
- Ajouter 10 mL de solution de collagènase supplémentaire au tissu haché pour total 15 mL.
- Digérer les échantillons pendant 1 h, à 37 ° C, dans un bain d’eau sous agitation continue.
- Couper l’extrémité loin une seringue de 20 mL pour faire une extrémité arrondie.
- Découper un carré de 9 x 9 cm d’un maillage de 250 µm et poussez-le à mi-chemin dans un tube conique de 50 mL à l’aide de la seringue à extrémité arrondie.
- Versez les échantillons dans la seringue de 20 mL extrémité arrondie et le filtre à travers les mailles de nylon 250 µm dans le tube conique de 50 mL pour séparer les adipocytes et les cellules du stroma vasculaires des tissus non digérés.
Remarque : N’utilisez pas plus de 5 g d’AT / tube conique de 50 mL, comme le maillage va se boucher à cause de l’excès de matériau fibreux non digérés. - Nettoyez le flacon à scintillation avec 10 mL de KRBBS et versez-la dans le filtre pour recueillir des cellules résiduelles.
- Incuber les échantillons filtrés pendant 5 min à température ambiante.
Remarque : Cette étape est importante pour permettre les adipocytes de flotter dans le haut du tube et certaines cellules stromales vasculaires à se déposent au fond du tube. - Utiliser une seringue de 20 mL et un 20 x 6 en pipettant aiguille pour enlever la couche stromale fraction vasculaire et l’introduire dans un tube conique propre 50 mL.
- Ajouter 10 mL de KRBBS et laisser les échantillons de s’asseoir sur le banc pendant 5 min, à température ambiante.
- Répétez les étapes 2.12 – 2.14 deux fois.
Remarque : Ces étapes assurera qu’il n’y a aucune contamination des cellules stromales vasculaires avec les adipocytes flottants. - Garder les fractions stroma vasculaires de deux dépôts sur la glace pour un traitement supplémentaire, tel que décrit dans les étapes ci-dessous.
Remarque : Ne laissez pas les cellules sur la glace pendant plus de 1 h, comme cela peut avoir une incidence sur la viabilité des cellules. Les adipocytes peuvent être congelés dans l’azote liquide pour le stockage à long terme flash ou utilisée fraîches pour des expériences.
3. isolement des cellules endothéliales du tissu adipeux
- Faites tourner les fractions stroma vasculaires (SVF) à 500 x g pendant 5 min, à 4 ° C.
- Enlever les échantillons de la centrifugeuse et soigneusement décanter le liquide surnageant ; Gardez le culot contenant les cellules SVF.
- Resuspendre doucement les boulettes de cellule dans 5 mL de PBS.
NOTE : Si plus de 5 g d’un dépot de AT a été transformé en plusieurs parties aliquotes (voir étape 2,4), regrouper les granules cellulaires. - Faites tourner les échantillons à 500 x g pendant 5 min, à 4 ° C.
- Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de PBS compter les cellules non vides.
NOTE : Ici, un compteur de cellule automatique a été utilisé pour le comptage des cellules. La viabilité cellulaire a été obtenue par mélange de 12 µL de suspension cellulaire avec 12 µL d’une solution de l’acridine orange/propidium iodure (AO/PI) (voir la Table des matières). Le nombre moyen de cellules par gramme d’AT pour chaque dépôt est : (a) Depot OM : 1,69 x 105 ± 4.51 x 104; (b) SC Depot : 1,24 x 105 ± 6,45 x 104. La viabilité des cellules de deux dépôts était > 90 %. - Pellet les échantillons à 500 x g pendant 5 min, à 4 ° C.
Remarque : Un protocole de sélection d’immunomagnetic CD34 (voir Table des matières) a été adapté pour étapes 3.7 – 3,15. - Resuspendre le culot dans 100 µL de tampon d’isolement CD34.
Remarque : Le nombre total de cellules nécessite les volumes suivants de la remise en suspension : (a) < 2 x 107 cellules : Resuspendre le culot dans 100 µL ; (b) 2 x 108– 5 x 108 cellules : Resuspendre le culot dans 1 mL. En étapes 3,9 – 3.16, les volumes des réactifs utilisés ont été revus à la baisse pour < 2 x 107 cellules. - Ajouter 10 µL de cocktail CD34 et incuber l’échantillon pendant 15 minutes, à température ambiante.
- Ajouter 5 µL de billes magnétiques et incuber l’échantillon pendant 10 min, à température ambiante.
- Ajouter 2,5 mL de tampon d’isolement CD34 dans chaque échantillon et placer les échantillons dans l’aimant, pendant 5 min, à température ambiante.
- Inverser l’aimant pour 5 s pour décanter le tampon de l’isolement.
- Enlever les échantillons de l’aimant et répétez les étapes 4 de x 3.10 et 3.11.
- Retirer le tube de l’aimant et ajouter 2 mL de tampon d’isolement CD34.
- Pellet les cellules à 500 x g pendant 5 min, à 4 ° C.
- Remettre en suspension les granules cellulaires dans 1 mL de tampon d’isolement CD34 et compter les cellules non vides.
NOTE : Ici, le nombre moyen de cellules par gramme d’AT est : (a) Depot OM : 4.75 x 104 ± 3,36 x 104; (b) SC Depot : 1,06 x 104 ± 9.53 x 103. Un protocole de plastique immunobead CD31 a été adapté pour obtenir la procédure 3.16 – 3.34 (voir Table des matières). - Cellules à 500 x g pendant 5 min de granule et Resuspendre le culot dans 250 µL de tampon B et 250 µL de tampon de lavage.
- Bien remettre en suspension les perles CD31 au vortex le tube.
- Ajouter 20 µL de perles CD31.
Remarque : En raison de la cellule total compte > 1 x 106, le volume a été réduit après l’entrée du constructeur. - Incuber l’échantillon avec bascule pendant 30 minutes, à température ambiante.
- Fixer un filtre dans un tube conique stérile de 50 mL.
Remarque : L’ouverture plus grande de la crépine doit être sur le dessus. - Avant la séparation de la cellule, ajouter 1 mL de tampon de lavage s’équilibrer la crépine. Appliquer le mélange généré sous étape 3.16 à la crépine.
- Lavez le filtre avec 5 mL de tampon de lavage dans un mouvement circulaire pour un volume total de 20 mL. Branchez le connecteur sur un tube conique stérile de 50 mL et fermer le raccord luer-lock.
- Posez la passoire sur le connecteur. Ajouter 1 mL de tampon de lavage le long du mur de la crépine. Ajouter 1 mL de tampon activée D le long du mur de la crépine. Agiter l’échantillon doucement et il incuber pendant 10 min, à température ambiante.
- Ajouter 1 mL de tampon de lavage. Séparer les cellules les perles en pipettant également monter et descendre de 10 x.
Remarque : Ne pas produire des bulles d’air. - Ouvrir le raccord luer-lock et laisser les cellules individuelles s’écouler dans le tube conique de 50 mL. Lavez le tamis 10 x 1 ml de tampon de lavage chaque fois.
- Jeter le connecteur et la crépine et centrifuger les échantillons à 300 x g pendant 10 min, à 4 ° C. Resuspendre le culot dans 2 mL d’EGM-2 médias de la culture.
Remarque : Le nombre moyen de cellules par gramme d’AT, à ce stade est : (a) Depot OM : 5,92 x 103 ± 4,27 x 103; (b) SC Depot : 4.12 x 103 ± 2.1 x 103. La viabilité des cellules de deux dépôts était supérieur à 90 %.
4. l’induction de l’adipogenèse dans les cellules endothéliales isolées
- Cultiver les cellules dans 6 plats traitée pour la culture de tissu avec les médias complet EGM-2 a 37 ° C, 5 % CO2 incubateur. Remplacer les médias tous les jours 3 et 4 jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence de 80 à 90 %.
Remarque : Le doublement de la population est entre 2 à 3 jours. - Développez les cellules en les ensemençant sur boîtes de Petri de 100 mm et fractionner les cellules une fois 1:3. À ce stade, les cellules sont sur passage 2.
- Compter les cellules à l’aide d’une cellule automatique contrer (voir Table des matières).
- Cellules de graines environ 100 – 200 000 en plaques 6 puits assurant les puits dédoublés pour chaque dépôt et de la culture complète en EGM-2 supports pour 2 jours.
- Aspirer hors des milieux de culture et remplacez-le par 2 mL de DMEM/F12 avec 5 % FBS et 50 µg/mL de pénicilline/streptomycine pour le contrôle des cellules et remplacez-le par 2 mL de l’adipogenèse médias (Voir l’étape 1.4) pour le traitement de cellules.
- Incuber les cellules à 37 ° C dans un humidifié 5 % CO2 incubateur pendant 13 jours, remplaçant les médias respectifs tous les 3 à 4 jours.
Remarque : Les cellules commence à accumuler les lipides après 4 jours de traitement. - Conduite d’ORO et du Nil rouge de coloration selon les méthodes publiées15–17.
- Pour isoler des cellules pour une extraction de l’ARN, retirez le support des plaques induction 6 puits et lavez-le avec 1 mL de PBS stérile.
- Ajouter 350 µL d’une solution de thiocyanate-phénol-chloroforme de guanidium (voir Table des matières) pour chaque bien et il incuber à température ambiante pendant 5 à 10 min.
- Gratter les cellules de la plaque à l’aide d’un grattoir de cellules et de transférer les cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
Remarque : Les échantillons peuvent être conservés dans le congélateur-80 ° C pour l’extraction de l’ARN et la transformation ultérieure à une date ultérieure. - Extraire les ARNm des échantillons à l’aide d’une extraction adaptée de l’ARN du protocole (voir Table des matières).
- Effectuer une réaction en chaîne par polymérase en temps réel (RT-PCR) afin d’évaluer l’expression des gènes en utilisant les sondes suivantes : adiponectine, UCP-1 et CIDEA (voir Table des matières).
NOTE : Ici, les procédures de RT-PCR ont été effectuées en utilisant le protocole standard suivant : dénaturation (95 ° C ; 15 s), recuit et extension (60 ° C, 1 min) pendant 40 cycles. Les échantillons qui expriment des gènes avec des valeurs de CT > 35 étaient considérés comme indétectable.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Notre protocole vise à fournir une approche in vitro afin de déterminer le potentiel adipocytaire de CD34 + CD31 + des cellules vasculaires de différents dépôts de tissus adipeux humains. Un diagramme de l’organigramme simplifié est montré dans la Figure 1 a. La première étape à l’aide d’une sélection positive de CD34 exprimant des cellules entraîne > 95 % cellules CD34 + dans la population des cellules fraîchement isolées (Figure 1 a). Ce qui est important, ce marqueur est perdu après que les cellules sont cultivées pendant quelques passages. CD34 est un marqueur commun pour divers progéniteurs hématopoïétiques et non hématopoïétiques, l’étape suivante nécessaire pour la séparation des cellules souches endothéliales étant donné que la sélection positive de cellules CD31 + hors de la population de cellules CD34 + (Figure 1 a). Bien que CD31 est un marqueur des cellules endothéliales, il peut également être trouvé sur sous-ensembles de cellules hématopoïétiques. Nous avons analysé plusieurs préparations du fois gras épiploïques et sous-cutanée par cytométrie en flux et toujours trouvé que CD34 + CD31 + cellules n’expriment pas le marqueur de CD45 (Figure 1 b, panneaux supérieure). En général, < 1 % des cellules ont montré CD45 positivité, sur une population totale de cellules. Ce résultat nous amène à conclure que nous avons probablement obtenu une préparation pratiquement exempte de progéniteurs hématopoïétiques. Pour déterminer si les cellules expriment le marqueur de cellules souches de l’adipocyte CD24, nous avons analysé les cellules provenant de dépôts fois épiploïques et sous-cutanée et trouvé que pratiquement aucune cellules n’expriment le marqueur CD24 dans le dépôt épiploïques (Figure 1 b, panneaux de fond) et moins de 5 % de les cellules expriment le marqueur dans le dépôt sous-cutané (non illustré). Pour conclure, en utilisant cette méthode de séparation, nous avons obtenu CD34 + CD31 + CD45-CD24-cellules de dépôts fois épiploïques et sous-cutanée de sujets obèses.
Les billes de plastique conjugué avec un anticorps CD31, nous avons obtenu des cellules qui affichent la morphologie endothéliale pavées lors des passages au début, par opposition aux cellules séparées à l’aide de billes magnétiques conjuguées avec un anticorps CD31 qui affiche un fusiformes mésenchymateuse phénotype immédiatement après la séparation (Figure 2 a). Pour plus amples étayer l’identité endothéliale de cellules CD34 + CD31 +, nous avons effectué deux essais fonctionnels : une absorption de DiI-Ac-LDL et une matrice de la membrane basale (appelée matrice sur le connaissement) tube formation in vitro. CD34 + CD31 + cellules ont été incubées avec DiI-Ac-LDL et la grande majorité des cellules était positif pour l’absorption (Figure 1). Comme témoin positif, nous avons utilisé une ligne de cellulaires endothéliales microvasculaires du tissu adipeux humain (HAMVEC) qui est disponible dans le commerce (voir Table des matières et Figure 1). Aussi, nous avons vérifié si les cellules + CD34 + CD31 conservent leur fonction endothéliale après mise en culture en déterminant la capacité de ces cellules pour former des structures ressemblant à des navires spontanée in vitro, dans une matrice 3D. Après 3 passages, CD31 + CD34 + structures ressemblant à des navires tubulaire de formes dans une matrice comparable à une ligne de cellules endothéliales humaines primaire HAMVEC (Figure 1).
Après l’expansion des cellules pour 2 ou 3 passages, nous sommes passés les cellules de EGM-2 media complet contenant des facteurs de croissance pro-angiogénique dans milieu DMEM/F12 additionnée de 5 % FBS, rosiglitazone (1µM) et insuline (144 mU/mL). Maintenir que les cellules en EGM-2 toutes les médias considérablement réduit leur différenciation adipocytaire. En outre, une addition de dexaméthasone et 3-isobuthyl-1-méthylxanthine aux médias n’a pas changé le taux et l’étendue de l’accumulation de lipides et un ajout d’indométhacine considérablement réduit l’accumulation de lipides (données non présentées). Basé sur ces expériences préliminaires, nous avons décidé de n’utiliser pour l’induction adipocytaire rosiglitazone et insuline. Après 14 jours de culture dans les médias adipocytaire, les cellules ont été fixées et colorées avec de l’huile rouge O ou du Nil rouge et les noyaux étaient Eosine au DAPI (Figure 2 b). Dans les figures, les images représentatives sont représentées de cellules isolées de paire sous-cutanée (SC) (Figure 2 b, panneaux supérieure) et le tissu adipeux épiploïques (OM) (Figure 2 b, panneaux de fond) des trois sujets humains avec un BMI entre 37-45 kg/m2. Veuillez noter que la réponse à l’induction varie considérablement entre les sujets et les dépôts d’un même sujet. Comme on le voit dans l’image fluorescente dans la Figure 2 b, une population mixte d’uniloculaires (flèches rouges) et multiloculaires (flèches blanches) contenant des lipides des cellules comme les cellules qui n’accumulent pas de lipides (flèches jaunes) sont généralement présents. La proportion entre le nombre de ces cellules est également très variable à la fois le sujet et le dépôt d’origine. Une quantification du pourcentage contenant des lipides des cellules (basés sur la positivité Oil Red O) hors des cellules totales (issus des noyaux colorés au DAPI) a montré une différence significative entre les entrepôts de SC et l’OM du même individuels, avec les cellules de l’entrepôt de SC étant plus sensibles à l’induction adipocytaire (Figure 2). L’explication de l’hétérogénéité en réponse entre les sujets et les dépôts d’un même sujet n’est pas claire. Cependant, nous pensons qui est vraisemblablement liée à la nature intrinsèque de la population cellulaire qui porte l’empreinte de l’in vivo phénotype/environnement et non pas en raison de la variabilité dans le protocole d’isolement.
Pour confirmer que les cellules subissent la différenciation pour mûrir des adipocytes, nous avons mesuré l’expression du gène de l’adiponectine de marqueurs pan-adipocytaire et les marqueurs de marron/beige UCP-1 et CIDEA dans les cellules après 13 jours d’induction adipocytaire par rapport à hématies non induits. L’expression de l’adiponectine a augmenté jusqu'à 10,000-fold dans les cellules différenciées par rapport aux contrôles (Figure 2D). L’expression de gène de CIDEA et UCP1 n’est détectable dans les cellules suite à la stimulation adipocytaire (Figure 2D). En particulier, l’expression de l’UCP-1 a été très variable, ce qui reflète les différentes proportions du blanc : brown / beige des cellules au sein de la population cellulaire. L’expression du gène ménage RPL27 a été remarquablement constante entre les échantillons avec des valeurs de CT comprises entre 18 et 20 cycles et aucune des différences significatives entre les cellules qui ont subi la différenciation adipocytaire et le témoins non traités. Nous avons également découvert une expression de la protéine UCP-1 dans les cellules qui affichent le phénotype multi-loculaire, dans un modèle punctated qui suggère une localisation mitochondriale (Figure 2E). La protéine UCP-1 n’a pas été détectable dans les cellules qui n’ont pas accumulé des lipides ou dans des cellules avec de multiples, très petites gouttelettes qui ne sont probables pas entièrement différencient des adipocytes (Figure 2E).
Notre observation que le potentiel adipocytaire des cellules CD34 + CD31 + est spécifique au depot et très variable parmi les différents sujets nous a poussés à chercher d’éventuelles corrélations avec BMI, l’âge et HbA1c. Parmi les 28 échantillons testés, nous n’avons trouvé aucune des corrélations significatives entre le potentiel adipocytaire et l’âge ou l’IMC ; Cependant, nous avons constaté une corrélation négative significative entre HbA1c et l’accumulation de lipides dans les cellules de l’entrepôt de l’OM (Figure 3 a). Cette constatation indique un lien possible avec l’environnement hyperglycémique chronique et mérite enquête future. Cela suggère également que le CD34 + CD31 + cellules susceptibles de portent la signature en vivo de leur capacité à répondre à une induction adipocytaire. Nous montrons également que ces cellules affichent des niveaux variables de Akt phosphorylation suite à une stimulation in vitro par l’insuline (Figure 3 b, haut). Toutefois, cette variabilité de la réponse n’est pas corrélée avec leur capacité à subir une différenciation adipocytaire, comme en témoigne la coloration à l’huile rouge O dans les images des échantillons correspondants (Figure 3 b, en bas).
Figure 1 : séparation et caractérisation de cellules provenant de tissus adipeux humains + CD34 + CD31. (A), ce diagramme organigramme montre les principales étapes de l’isolement et de différenciation. Après la sélection positive à l’aide de billes magnétiques CD34, > 95 % des cellules fraîchement isolées, avant la deuxième étape de sélection, sont CD34 +. (B) Ce cytométrie en flux représentatif montre attaquant épars intrigue bloquée pour la population de cellules vivantes ; un échantillon non colorée sur le canal de la FITC (BluFl2) ; et CD45 coloration d’un échantillon représentatif d’épiploïques sur le dessus. Le bas montre la même séquence comme indiqué sur le dessus, mais pour les CD24 (Alexafluor 647-étiqueté) cellules de l’échantillon épiploïques. (C) ces micrographies représentatifs montrent une absorption de DiI-Ac-LDL (rouge) de CD34 + CD31 + cellules après 4 h de l’incubation in vitro (panneau supérieur). Une absorption similaire a été trouvée dans une lignée de cellules primaires de cellules endothéliales microvasculaires de tissus adipeux humains (HAMVEC) (panneau inférieur). Les noyaux sont indiqués en bleus par DAPI. (D) ces micrographies représentatifs montrent une formation de tube in vitro de cellules ensemencées dans une matrice 3D + CD34 + CD31. Cellules (passage 3) + CD34 + CD31 ont été ensemencées en plaques 24 puits après une coloration avec FITC-calcéine et incubées pendant 4 h dans les médias de cellules endothéliales complet. Les cellules ont été projetés à l’aide d’un microscope inversé à fluorescent. HAMVEC, injectée à la même densité, a été utilisé pour la comparaison. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : adipocytaire induction et des marqueurs de cellules CD34 + CD31 +. Spectacle de micrographies de (A) ces représentant les différences morphologiques entre CD34 + CD31 + cellules isolement à l’aide d’une sélection positive avec CD31 + billes magnétiques vs CD31 + perles en plastique. Les cellules ont été projetés au passage 1 après l’isolement. Le grossissement utilisé est 100 X. (B) ces panneaux est représentatifs de micrographies de Oil Red O teinté CD34 + CD31 + cellules de paire sous-cutanée (SC) et des épiploïques viscérale (OM) échantillons de 3 sujets différents. Les cellules ont été cultivées pour 2 ou 3 passages à EGM-2 médias complète, puis allumé DMEM/F12 médias avec 5 % FBS et traités par l’insuline (144 mU/mL) et de la rosiglitazone (1 µM) pendant 14 jours, avec les médias a changé tous les 3 jours. Le grossissement utilisé est 100 X. L’image fluorescente représentant montre adipo gouttelettes de lipides rouge (verts) et DAPI (bleu) de la coloration nucléaire. Veuillez noter un mélange de cellules qui contiennent des lipides uniloculaires (flèche rouge), des gouttelettes de lipides multiloculaire (flèche blanche) ou des cellules qui ne montrent aucune accumulation de lipides (flèche jaune). Le grossissement utilisé est 200 X, section Echelle = 50 µm. (C) ce panneau montre une quantification des adipocytaire potentiel exprimé comme huile rouge O (ORO) cellules positives normalisés au totales noyaux colorés au DAPI. CD34 + CD31 + cellules de OM et SC dépôts d’un même sujet montrent une différence significative dans adipocytaire potentiels de test t apparié de l’élève (n = 7). (D), l’expression de gène d’adipocytes matures marqueurs (adiponectine, UCP-1 et CIDEA) a été mesurée par RT-PCR dans les cellules après 14 jours d’induction adipocytaire et dans les cellules du contrôle. Les données sont exprimées comme un pli-changement de l’expression génique de l’adiponectine. L’expression de CIDEA et UCP-1 n’était pas détectable dans les échantillons de contrôle. Les valeurs représentent ΔCt normalisé à RPL27 comme un gène de ménage. Les valeurs de CT pour RLP27 ont entre 18 et 20 cycles pour tous les échantillons inclus dans l’analyse (n = 3 – 5 sujets). Les données sont exprimées en moyenne ± SD Test t apparié de l’élève a été utilisé pour une analyse statistique des données. p < 0,05 rejette l’hypothèse nulle. (E) ce panneau présente l’expression de la protéine UCP-1 dans le CD34 + CD31 + cellules après 13 jours d’induction avec l’insuline et la rosiglitazone. Immunocytochimie utilisant un anticorps polyclonal humain de l’UCP-1 ont montré une expression sélective de l’UCP-1 dans les adipocytes multi-loculaire. La détection a été réalisée à l’aide d’un anticorps secondaire conjugué à la rhodamine (rouge) et la coloration DAPI pour les noyaux (bleu). Le grand grossissement dans l’encart montre le signal rouge punctated correspondant à l’UCP-1 (flèche rouge) ainsi que les multiples gouttelettes de lipides (LD) de différentes tailles qui entoure le noyau de la cellule (N). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Corrélation entre la différenciation adipocytaire, HbA1c et signalisation de l’insuline en vitro . (A) Spearman (non paramétrique) et Pearson (paramétriques) coefficients de corrélation pour les cellules de l’OM et SC, respectivement, ont été utilisés pour déterminer la corrélation entre HbA1c et l’accumulation de lipides (n = 20). L’hypothèse nulle est rejetée pour p < 0,05. (B) en haut, un western blot montre l’Akt phosphorylée (vert) et l’expression totale de Akt (rouge) dans les cellules + CD34 + CD31 stimulée in vitro avec 5 insuline nM pendant 30 min avant l’induction adipocytaire (n = 8). Au fond, une huile rouge O la coloration des cellules mêmes après l’induction adipocytaire pendant 14 jours s’affiche. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L’objectif de cet article est de fournir une méthodologie pour l’isolement, l’agrandissement et l’induction adipocytaire de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales de dépôts viscérales et sous-cutanée du tissu adipeux humain.
Méthodologies ont été rapportés pour l’isolement des cellules endothéliales de différents lits vasculaires des rongeurs ou des humains qui impliquent principalement les techniques utilisant des anticorps CD31 fluorescent étiquetés ou couplée à des billes magnétiques18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23. un défi majeur pour l’utilisation universelle de ces techniques d’isolation est l’hétérogénéité de la population de cellules endothéliales dans différents lits vasculaires et du risque élevé de contamination par les fibroblastes et les cellules vasculaires murales. Cependant, des améliorations des techniques d’isolement pour éviter ces contaminations ont été déclarés24. En utilisant ces techniques, pour la plupart des cellules endothéliales matures sont isolés des tissus. Le tissu adipeux est un important réservoir de cellules souches/progénitrices, y compris les cellules souches endothéliales25,26. Quelques papiers a signalé la purification des cellules endothéliales du tissu adipeux humain en utilisant une combinaison de CD34 + et CD31 + anticorps11,,27. Les cellules qui expriment les deux marqueurs sont une population mélangée de matures cellules endothéliales et les cellules souches endothéliales11,28,29. Plusieurs papiers séminales récents signalent qu’un petit sous-ensemble d’endothéliales (CD31 +) ou mural (PDGFRβ +) des cellules dans la vascularisation du tissu adipeuse est une riche source d’adipocytes progéniteurs5,30. Ces cellules vasculaires avec adipocytaire potentiel peuvent produire des adipocytes blancs ou marron/beige et sont associés à l’angiogenèse active dans le système vasculaire adipeux5. Ces résultats peuvent prévoir de nouvelles possibilités thérapeutiques pour améliorer les performances métaboliques de l’obésité ou d’induire une perte de poids en générant des adipocytes blancs et/ou thermogènes de progéniteurs vasculaires. Il est donc d’intérêt pour identifier une méthode pour l’isolement facile et économique, expansion et évaluation du potentiel des cellules endothéliales vasculaires du tissu adipeux humain adipocytaire.
Le CD34 + CD31 + des cellules du tissu adipeux viscéral humain sous-cutanée et omentaux dépôts ont été caractérisés auparavant basé sur leur potentiel angiogénique, la production de médiateurs inflammatoires, leurs marqueurs de sénescence et autres fonctions11 , 31. Toutefois, il n’y a aucune preuve publiée pour le potentiel adipocytaire de telles cellules. Les publications antérieures qui séparent les cellules à l’aide de billes magnétiques + CD34 + CD31 rapportent sur les données de cellules regroupées à partir d’un grand nombre de sujets (10 ou plus)11. Cet article rapporte pour la première fois un protocole pour la réussite de l’isolement et l’expansion des cellules provenant de donneurs humains unique auprès de ces deux dépôts sous-cutanés et omentaux de CD34 + CD31 +. Nous avons isolé et élargi des cellules d’aussi peu que 2 à 3 g de tissu adipeux. Les cellules + CD34 + CD31 représentaient 3 à 5 % des cellules SVF totales et affiche > 90 % viabilité après l’isolement. Ces cellules ont fortement prolifératives et une vaste gamme de réponses vers la différenciation adipocytaire, suite à une stimulation in vitro avec l’insuline et la rosiglitazone. Des études antérieures a utilisé uniquement les cellules souches adipeuses ou fraction vasculaire stromale totale du tissu adipeux humain pour tester adipocytaire réponses4,32,33,34. Une étude récente utilisée des suspensions cellulaires unique des capillaires du tissu adipeux humain, mais on ne sait pas si les adipocytes différenciés sont murales ou endothéliales dans la nature3.
Immunophenotyping supplémentaire du CD34 + CD31 + cellules utilisant l’écoulement cytometry a montré leur manque de marqueurs CD45 et CD24, indépendamment de leur dépôt d’origine. Ce qui est important, nous ont montré qu’après 3 passages dans la culture, le CD31 + CD34 + cellules conservent leurs fonctionnalités endothéliales témoigne de l’accumulation des LDL acétylé et une formation de tubes in vitro dans une matrice 3D. En outre, les adipocytes différenciés représentaient une population mixte de cellules blanches et beige/brun, selon leur morphologie et des marqueurs moléculaires, y compris une expression de la protéine UCP-1. Précédentes études chez la souris ont montré que la vascularisation du tissu adipeux peut être une source des deux blancs et adipocytes bruns5,30 et des données plus récentes ont montré un résultat similaire en ce qui concerne la différenciation du blanc et fonctionnellement thermogéniques cellules beiges du système vasculaire adipeux humain3.
Contrairement à la plupart des publications qui utilisé adipocytaire cocktails contenant plusieurs ingrédients pour la différenciation adipocytaire allant de progéniteurs in vitro, nous avons constaté que la rosiglitazone et insuline sont nécessaires et suffisantes pour l’adipocytaire induction des cellules + CD34 + CD31. Alors que nous sommes conscients que seul rosiglitazone peut provoquer une accumulation de lipides dans les cellules non-adipeux35, la signature moléculaire pour pan-adipocytaire et marqueurs de l’adipocyte brun/beige, y compris une protéine UCP-1 expression dans les cellules select, confirme la maturité phénotype adipocyte de certaines cellules différenciées. Nos deux ingrédients adipocytaire cocktail simplifie le protocole de procédure et, ce qui la rend plus rentable.
Une observation importante est que la réponse d’adipocytaire des cellules CD34 + CD31 + était très variable avec le sujet de donateurs et le dépôt de tissu adipeux. Alors que le dépôt des différences dans l’adipocytaire réponses des cellules souches adipeuses ou stromales progéniteurs vasculaires ont été signalés précédemment32,34, la variabilité de l’objet d’une telle réponse est une nouvelle observation. Hors de l’humain de 20 échantillons analysés, 3 SC et 7 cellules OM n’a pas répondu à l’induction adipocytaire. Les réponses plus robustes ont montré > 90 % des cellules sensibles à l’induction pour 4 échantillons de SC et pour les 2 échantillons d’OM. fait intéressant, nous avons trouvé que la réactivité est corrélée négativement avec l’HbA1c et n’est pas corrélée avec la réponse à une dans vitro stimulation par l’insuline dans les cellules indifférenciées. Nous croyons que la différence de réponse n’est pas en raison de la mauvaise reproductibilité de la technique, mais reflète plutôt l’empreinte individuelle des cellules qui imitent en vivo réponses. La préservation de cette réponse différentielle exige d’autres validation et peut représentent une méthode de dépistage relativement facile pour la réactivité aux thérapies visant à stimuler l’adipogenèse in vivo. Pour mieux comprendre la source de variabilité individuelle dans le potentiel adipocytaire, immunophénotypage supplémentaire est nécessaire pour identifier les sous-populations de cellules dans le CD34 + CD31 + population qui portent une fonction de progéniteurs adipocytaires spécifiques.
Les limites du présent protocole parmi une caractérisation incomplète des populations cellulaires ; relativement longue expansion et différenciation heures (2 semaines + 2 semaines) ; limites potentielles à l’accès à des échantillons humains et la nécessité pour la transformation immédiate des tissus fraîchement prélevés ; et le manque actuel de données fonctionnelles pour les cellules différenciées. Il y a plusieurs avantages de cette méthodologie qui incluent un protocole reproductible et pas beaucoup de travail ; les cellules qui probables conservent l’empreinte de leur phénotype en vivo ; l’expansion des cellules de très petites quantités de tissus avec des coûts relativement faibles ; la possibilité de cryopréserver des cellules et de conserver leur signature adipocytaire après re-culture ; et l’option pour générer des référentiels de ces cellules afin qu’elles peuvent servir de dépistage futur ou d’autres fins.
Le présent protocole et le CD34 + CD31 + cellules obtenues comme un résultat final peuvent servir comme une plateforme translationnelle pour études mécanistes et pour fins de présélection.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs souhaitent reconnaître Becky Marquez, le coordonnateur clinique au centre de Bariatric Sentara, pour son aide avec le processus du patient dépistage et consentante. Cette recherche a été financée par R15HL114062 à Anca D. Dobrian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Large Equipment |
|||
| Biosafety Cabinet |
Nuaire |
nu-425-400 |
|
| Cell Culture Incubator |
Thermo-Fisher Scientific |
800 DH |
|
| Water Bath |
Forma Scientific |
2568 |
Reciprocal Shaker |
| RT-PCR Machine |
BIO-RAD |
CFX96-C1000 |
|
| Electrophoresis Box |
BIO-RAD |
Mini PROTEAN 3 Cell |
|
| Transblot Box |
BIO-RAD |
Mini Trans-Blot Cell |
|
| Electrophoresis Power Supply |
BIO-RAD |
PowerPac Basic |
|
| ELISA Reader |
Molecular Devices |
SpectraMax M5 |
|
| Blot Reader |
LI-COR |
Odyssey |
Near Infrared |
| Refrigerated Centrifuge |
Eppendorf |
5810 R |
|
| Tabletop Centrifuge |
Eppendorf |
MiniSpin Plus |
|
| Fluorescent Microscope |
Olympus |
BX50 |
|
| Inverted Microscope |
Nikon |
TMS |
|
| KRBSS Buffer |
|||
| HEPES |
Research Products International |
H75030 |
|
| Sodium bicarbonate |
Sigma-Aldrich |
792519 |
|
| Calcium chloride dihydrate |
Sigma-Aldrich |
C7902 |
|
| Potassium phosphate monobasic |
Sigma-Aldrich |
P5655 |
|
| Magnesium sulfate |
Sigma-Aldrich |
M2643 |
|
| Sodium chloride |
Sigma-Aldrich |
746398 |
|
| Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich |
S9638 |
|
| Potassium chloride |
Sigma-Aldrich |
P9333 |
|
| Glucose |
Acros Organics |
410950010 |
|
| Adenosine |
Acros Organics |
164040250 |
|
| Bovine Serum Albumin |
GE Healthcare Bio-Sciences |
SH30574.02 |
|
| Penicillin/Streptomycin |
Thermo-Fisher Scientific |
15070063 |
|
| Tissue Digestion |
|||
| 20 mL Syringe |
Global Medical |
67-2020 |
|
| Nylon Mesh, 250 µm |
Sefar |
03-250/50 |
|
| Pipetting Needles |
Popper |
7934 |
|
| Fine Scissors |
Fine Science Tools |
14058-11 |
|
| Tissue Forceps |
George Tiemann & Co |
160-20 |
|
| Collagenase, Type I |
Worthington Biochemical |
LS004196 |
|
| Petri Dishes, 100 mm |
USA Scientific |
5666-4160 |
TC Treated |
| Eppendorf Tubes, 1.5 mL |
USA Scientific |
1615-5500 |
|
| Conical Tubes, 15 mL |
Nest Scientific |
601052 |
|
| Conical Tubes, 50 mL |
Nalgene |
3119-0050 |
|
| Scintillation Vials |
Kimble |
74505-20 |
Tissue Dicing |
| Cell Isolation |
|||
| Cellometer |
Nexcelom |
Auto 2000 |
|
| Cellometer Slides |
Nexcelom |
CHT4-SD100-002 |
|
| Cellometer Viability Stain |
Nexcelom |
CS2-0106-5mL |
Acridine Orange/Propidium Iodine |
| Anti-CD34 Magnetic Beads |
StemCell Technologies |
18056 |
Kit |
| EasySep Magnet |
StemCell Technologies |
18000 |
|
| Anti-CD31 Plastic Beads |
pluriSelect USA |
19-03100-10 |
|
| pluriSelect 10x Wash Buffer |
pluriSelect USA |
60-00080-10 |
|
| pluriSelect Connector Ring |
pluriSelect USA |
41-50000-03 |
|
| pluriSelect Detachment Buffer |
pluriSelect USA |
60-00046-12 |
|
| pluriSelect Incubation Buffer |
pluriSelect USA |
60-00060-12 |
|
| pluriSelect S Cell Strainer |
pluriSelect USA |
43-50030-03 |
|
| Cell Culture |
|||
| 6-well Plates |
USA Scientific |
CC7682-7506 |
TC Treated |
| 4-well chambered slides |
Corning Life Sciences |
354559 |
Fibronectin coated |
| 4-well chambered slides |
Thermo-Fisher Scientific |
154526PK |
Uncoated glass |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC) |
Sciencell Research Laboratories |
7200 |
Primary cell line |
| Endothelial Cell Media (ECM) |
ScienCell Research Laboratories |
1001 |
Complete Kit |
| DMEM/F12 Basal Media |
Thermo-Fisher Scientific |
11320082 |
|
| Fetal Bovine Serum (FBS) |
Rocky Mountain Biologicals |
FBS-BBT |
|
| Insulin |
Lilly |
U-100 |
Humalog |
| Rosiglitazone |
Sigma-Aldrich |
R2408 |
|
| Cell Analysis |
|||
| Oil Red O Dye |
Sigma-Aldrich |
O0625 |
Prepared in isopropanol |
| 96 well plates |
USA Scientific |
1837-9600 |
|
| 96 well PCR plates |
Genesee Scientific |
24-300 |
|
| RNA Extraction |
Zymo Research |
R2072 |
Kit |
| cDNA Synthesis |
BIO-RAD |
1708841 |
Supermix |
| JumpStart PCR Polymerase |
Sigma-Aldrich |
D9307-250UN |
Hot start, with PCR Buffer N |
| Magnesium Chloride Solution |
Sigma-Aldrich |
M8787-5ML |
3 mM final in PCR reaction |
| dNTPs |
Promega |
U1515 |
|
| TaqMan AdipoQ |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00605917_m1 |
|
| TaqMan CIDEA |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00154455_m1 |
|
| TaqMan RPL27 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs03044961_g1 |
|
| TaqMan UCP1 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00222453_m1 |
|
| BCA Assay |
Sigma-Aldrich |
QPBCA-1KT |
Kit |
| Bis-acrylamide |
BIO-RAD |
1610146 |
40% stock solution |
| Ammonium Persulfate |
BIO-RAD |
1610700 |
|
| TEMED |
BIO-RAD |
1610800 |
|
| Tris |
Sigma-Aldrich |
T1503 |
|
| Glycine |
BIO-RAD |
1610718 |
|
| Sodium Dodecal Sulfate |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
| EDTA |
Fisher Scientific |
S311-100 |
|
| Bromophenol Blue |
Sigma-Aldrich |
B8026 |
|
| Blot Membrane |
EMD Millipore |
IPFL00010 |
|
| Methanol |
Fisher Scientific |
A452-SK4 |
|
| Odyssey Blocking Buffer, Tris |
LI-COR |
927-50000 |
|
| Anti-AKT antibody |
Cell Signaling Technology |
2920S |
Mouse monoclonal |
| Anti-pAKT antibody |
Cell Signaling Technology |
9271S |
Rabbit polyclonal |
| Anti-UCP1 antibody |
Abcam |
ab10983 |
Rabbit polyclonal |
| Anti-Mouse IgG antibody |
LI-COR |
926-68070 |
Goat Polyclonal, IRDye 680RD |
| Anti-Rabbit IgG antibody |
LI-COR |
926-32211 |
Goat Polyclonal, IRDye 800CW |
| Anti-Rabbit IgG antibody |
Jackson ImmunoResearch |
111-025-003 |
Goat Polyclonal, TRITC |
| Phosphate Buffer Saline |
Thermo-Fisher Scientific |
10010049 |
|
| 37% Formaldehyde Solution |
Electron Microscopy Sciences |
15686 |
4% solution for cell fixation |
| Normal Goat Serum |
Vector Laboratories |
S-1000 |
10% blocking solution |
| Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
X-100 |
0.1% permeabilization solution |
| DAPI |
Thermo-Fisher Scientific |
D1306 |
|
| Calcein AM |
Thermo-Fisher Scientific |
65-0853-39 |
Cell fluorescent visualization |
| Matrigel Basement Membrane Matrix |
Corning Life Sciences |
356231 |
Growth factor reduced |
| DiI labeled Acetylated LDL |
Thermo-Fisher Scientific |
L3484 |
References
- Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).
- Min, S. Y., et al. Human 'brite/beige' adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice. Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Tran, K. V., et al. The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells. Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
- Miranville, A., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).
- Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).
- Moller, D. E., Flier, J. S. Insulin resistance--mechanisms, syndromes, and implications. The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes. The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).
- Satish, L., et al. Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage. BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization. Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).
- Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (105), e53072 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC). Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).
- Zhou, L., et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis. PLoS One. 10 (2), e0117644 (2015).
- Curat, C. A., et al. From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes. Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).
- Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).
- Traktuev, D. O., et al. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks. Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).
- Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis. Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).
- Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue. Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).
- Ong, W. K., et al. Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
- Ong, W. K., Sugii, S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots. American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).
- van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation. Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).
