Summary
De differentiatie van wit en beige adipocytes uit vetweefsel vasculaire progenitoren beren mogelijkheden voor metabole verbetering in obesitas. We beschrijven protocollen voor een CD34 + CD31 + endothelial cel los van menselijk vet en voor een latere in vitro expansie en de differentiatie in wit en beige adipocytes. Verschillende downstream toepassingen worden besproken.
Abstract
Obesitas gaat vergezeld van een uitgebreide verbouwing van vetweefsel voornamelijk via adipocyte hypertrofie. Extreme adipocyte groei resulteert in een slechte reactie op insuline, lokale hypoxie en ontsteking. Door het stimuleren van de differentiatie van functionele witte adipocytes van voorlopercellen, radicale hypertrofie van de adipocyte bevolking kan worden voorkomen en, bijgevolg, de metabole gezondheid van vetweefsel verbeterd kan worden samen met een vermindering van ontsteking. Ook, door het stimuleren van een differentiatie van beige/bruin adipocytes, de totale lichaam energie-uitgaven kan worden verhoogd, wat resulteert in gewichtsverlies. Deze aanpak kan voorkomen dat de ontwikkeling van obesitas co morbiditeit zoals type 2 diabetes en hart-en vaatziekten.
Deze paper beschrijft de isolatie, uitbreiding en differentiatie van wit en beige adipocytes uit een subset van menselijk vetweefsel endotheliale cellen die mede het uitdrukken van de markeringen van CD31 en CD34. De methode is relatief goedkoop en kan niet arbeidsintensief. Het vereist toegang tot menselijke adipeus weefsel en de subcutane depot is geschikt voor monsternemingen. Voor dit protocol, verse adipeus weefsel monsters van morbide obesitas onderwerpen [index van de lichaamsmassa (BMI) > 35] worden verzameld tijdens procedures voor Bariatrische chirurgie. Met behulp van een sequentiële immunoseparation uit de stromale vasculaire afvalfractie, worden voldoende cellen geproduceerd van zo weinig zoals 2 – 3 g vet. Deze cellen kunnen worden uitgebreid in cultuur gedurende 10-14 dagen, kunnen worden cryopreserved, en behouden hun eigenschappen van de adipogenic met passaging tot de passage 5 – 6. De cellen worden gedurende 14 dagen met een cocktail met behulp van een combinatie van menselijke insuline en de PPARγ agonist-rosiglitazone adipogenic behandeld.
Deze methode kan worden gebruikt voor het verkrijgen van bewijs van concept experimenten op moleculaire mechanismen die adipogenic reacties in obesitas endotheliale cellen rijden, of voor het screenen van de nieuwe drugs die de adipogenic verbeteren kunnen reactie geleid ofwel naar wit of beige/bruin adipocyte differentiatie. Met behulp van kleine onderhuidse biopsieën, kan deze methode worden gebruikt om het scherm uit non-responder onderwerpen voor klinische tests gericht op het stimuleren van beige/bruin en wit adipocytes voor de behandeling van obesitas en co-morbiditeit.
Introduction
Recente gegevens blijkt dat zowel bij muizen en bij de mens, een subset van cellen die woonachtig zijn in het vetweefsel therapieën kan worden gedifferentieerd in ofwel wit of beige/bruin adipocytes1,2,3. Het fenotype van dergelijke cellen is een onderwerp van controverse, met bewijs ter ondersteuning van endotheliale cellen, vlotte spier/pericyte of een spectrum van intermediaire fenotypen4,,5,,6,7. De werkingssfeer van de ontwikkeling van deze methode was voor het testen van het adipogenic potentieel van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van verschillende vet depots van zwaarlijvige mensen geïsoleerd. Andere studies in de literatuur zijn gericht op het potentieel van de totale stromale vasculaire fractie of van de bekende adipocyte progenitoren2,8,9adipogenic. Aangezien momenteel bestaande technologieën specifiek adipeus weefsel endotheliale cellen voor drug delivery10 richten kunnen, het begrip van het potentieel van dergelijke cellen ondergaan adipogenic-inductie naar wit of beige adipocytes is belangrijk voor toekomst gerichte therapieën.
Verschillende groepen gemeld de combinatie van CD31 en CD34-markeringen als surrogaten endotheliale cellen van menselijke adipeus weefsel11,12,13te isoleren. Doorgaans is de isolatie wordt uitgevoerd met behulp van twee opeenvolgende stappen en een positieve selectie met behulp van magnetische kralen. In dit verslag werd immunoseparation gebruikt CD34 + magnetische kralen gecombineerd met CD31 Kunststof kralen gebruikt. We vonden deze techniek superieur aan de sequentiële magnetische immunoseparation met betrekking tot het behoud van de typische geplaveide endothelial morfologie. Ook konden we genereren genoeg cellen die nodig zijn voor de uitbreiding en adipogenic inductie vanaf zo weinig als 1-2 g vet. De biopsie van een kleine steekproef van onderhuids vet is genoeg om de vereiste hoeveelheid cellen voor downstream toepassingen te produceren. Dit aspect is potentieel belangrijk, vooral als deze methode zal worden gebruikt voor de screening voor een alertheid op adipogenic inductie in menselijke proefpersonen.
In tegenstelling tot andere systemen gemeld in de literatuur, deze methode maakt gebruik van slechts twee ingrediënten voor de inductie van de adipogenic van de CD34 + CD31 + cellen: een agonist PPARγ — Rosiglitazon — en menselijke insuline. Nog belangrijker is, valt de hoeveelheid insuline gebruikt binnen het bereik van de normale/hoge van de circulerende post-absorptive insuline in mensen14. De mate van alertheid op insuline van de cellen in vitro, gemeten door Akt fosforylatie, doet niet correleren met hun vermogen om te reageren op de inductie cocktail. Interessant, deze inductie cocktail en experimentele voorwaarden gebruiken, een mix van witte en beige/bruin cellen werden verkregen zoals bepaald door de grootte en het aantal intracellulaire lipide druppels en de uitdrukking van moleculaire merkers. Dit eenvoudige en kosteneffectieve inductie protocol samen met de kwantitatieve beoordeling van het fenotype van de responder cellen (witte vs. beige) zorgt voor een screening van agenten die het saldo van gedifferentieerde beige potentieel kan veranderen : wit adipocytes.
Deze methode biedt ook een translationeel aanpak voor het begrip van de onderliggende mechanismen van adipogenesis van vasculaire endotheliale voorlopercellen in menselijke adipeus weefsel. Met behulp van deze specifieke isolatie/differentiatie techniek, kunnen onderzoekers verschillende trajecten verantwoordelijk voor adipogenesis in een subset van vasculaire endotheliale cellen van verschillende vet depots in mager en zwaarlijvige mensen ondervragen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De institutionele Commissie bestuur ter beoordeling aan Oost-Virginia Medical School goedgekeurd het onderzoek en het verzamelen van monsters van menselijke adipeus weefsel gebruikt in de studie. Geïnformeerde schriftelijke toestemming was verkregen van de patiënten.
1. bereiding van Buffers, Media en instrumenten
- Bereiden van een oplossing van Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS): 135 mM natriumchloride, kaliumchloride van 5 mM, 1 mM magnesium-sulfaat, 0,4 mM kalium fosfaat dibasische, 5.5 mM glucose, 1 mM adenosine, 0,01% antibioticum/antimycotic mix (50 µg/mL penicilline, 50 µg/mL streptomycine, 30 µg/mL gentamicine, 15 ng/mL Amfotericine) en 10 mM HEPES (pH = 7.4). Deze oplossing is telkens voor het weefsel verzamelen en spijsvertering vers bereid.
- Bereid een verse collagenase-oplossing: 1 mg/mL collagenase, type 1, in KRBSS; 3 mL/g vet maken Vooraf warm de collagenase oplossing bij 37 ° C in een waterbad voorafgaand aan de vertering van het weefsel.
- Voorbereiden van een CD34 isolatie van de cel Buffer: 2% foetale runderserum (FBS) en 1 mM EDTA in steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Het bereiden van Adipogenesis Media: DMEM/F12, 5% FBS, 50 µg/mL penicilline/streptomycine, 1,25 µL/mL van menselijke insuline (5 µg/mL of 144 mU/mL) en 0,36 µL/mL van 2,8 mM Rosiglitazon (1 µM).
- Bereid een stamoplossing 0,3% olie Red O (ORO) (gewicht/volume) door ontbinding van 0,3 g Oro in 100 mL isopropanol.
2. obesitas stromale vasculaire breuk isolatie
Opmerking: De studie omvatte een transversale cohort van morbide obesitas type 2-diabetes (T2D) en niet-diabetische onderwerpen, leeftijd 18-65 jaar, een bariatrische operatie ondergaan op de Sentara Metabolic en Weight Loss Surgery Center (Sentara Medical Group, Norfolk, VA). Uitsluitingscriteria opgenomen een auto-immune ziekte, met inbegrip van type 1 diabetes mellitus, aandoeningen waarvoor chronische immunosuppressieve therapie, anti-inflammatoire geneesmiddelen, thiazolinendiones, actieve tabaksgebruik, chronische of acute infecties of een geschiedenis van maligniteit behandeld binnen de afgelopen 12 maanden. T2D werd gedefinieerd als een plasma glucosegehalte van 126 mg/dL of hoger, een glucose van 200 mg/dL of groter nadat een 2 h glucosetolerantie test, of het gebruik van antidiabetica medicijnen.
- Menselijke omental (OM) en onderhuidse (SC) adipeus weefsel (AT) ophalen door proefpersonen een bariatrische operatie ondergaan.
- Houd de OM en SC AT in aparte flesjes met Henks gebufferde zoutoplossing met 50 µg/mL penicilline/streptomycine bij kamertemperatuur onmiddellijk na extractie van het weefsel.
- Zorgvuldig reinigen en verwijderen van fibrotische en dichtgeschroeid secties van het weefsel met 70% ethanol afgestreken schaar en pincet, wanneer het monster in het lab na de extractie weefsel arriveert.
- Weeg het vetweefsel en partitioneren van it in 5 g (of minder) aliquots voor de vertering van collagenase.
- Fijn blad voor 5 g van het AT in 5 mL van de oplossing van een collagenase in een flesje Scintillatie bij kamertemperatuur, met behulp van twee paar van schaar.
- Voeg een extra 10 mL van collagenase oplossing aan het gehakt weefsel voor 15 mL totaal.
- Verteren de monsters gedurende 1 uur, bij 37 ° C, in een waterbad met continue schudden.
- Snijd het puntje uit een 20 mL spuit om een botte uiteinde.
- Knip een 9 x 9 cm vierkant van een 250 µm mesh en duw het halverwege in een conische tube van 50 mL, met het botte uiteinde spuit.
- Giet de monsters in de spuit van 20 mL botte uiteinde en filter via de 250 µm nylon gaas in de conische buis van 50 mL te scheiden van adipocytes en stromale vasculaire cellen van onverteerd weefsel.
Opmerking: Gebruik niet meer dan 5 g AT per conische tube van 50 mL, zoals de Maas raken als gevolg van overtollig fibrotische onverteerd materiaal verstopt zal. - De Scintillatie flacon met 10 mL van KRBBS wassen en giet het door het filter voor het verzamelen van de resterende cellen.
- Incubeer de gefilterde monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: Deze stap is belangrijk met het oog op de adipocytes te zweven op de top van de buis en een aantal vasculaire stromale cellen te vestigen op de onderkant van de buis. - Gebruik maken van een 20 mL spuit en een 20 G x 6 in pipetting naald te verwijderen van de laag stromale vasculaire breuk en overbrengen naar een schone 50 mL conische buis.
- Voeg 10 mL van de KRBBS en laat van de monsters te zitten op de Bank voor 5 min, bij kamertemperatuur.
- Herhaal stap 2.12-2.14 tweemaal.
Opmerking: Deze stappen zullen ervoor zorgen dat er geen besmetting van de stromale vasculaire cellen met de zwevende adipocytes. - Houd de stromale vasculaire breuken van beide depots op ijs voor verdere verwerking, zoals beschreven in de onderstaande stappen.
Opmerking: Laat de cellen niet op het ijs voor meer dan 1 h, zoals dit een effect op de levensvatbaarheid van de cellen hebben kan. De adipocytes kunnen flash-bevroren in vloeibare stikstof voor langdurige opslag of vers gebruikt voor experimenten.
3. isolatie van vetweefsel endotheliale cellen
- Draai de stromale vasculaire breuken (SVF) bij 500 x g gedurende 5 min, bij 4 ° C.
- Verwijder de monsters uit de centrifuge en zorgvuldig giet af het supernatant; Houd de pellet met de FØROYA-cellen.
- Resuspendeer de cel-pellets voorzichtig in 5 mL PBS.
Opmerking: Als er meer dan 5 g van een AT-depot werd verwerkt tot meerdere aliquots (zie stap 2.4), zwembad de cel pellets samen. - Draaien van de monsters bij 500 x g gedurende 5 min, bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 mL PBS cellen tellen.
Opmerking: Hier, een automatische cel teller werd gebruikt voor het tellen van de cel. De levensvatbaarheid van de cellen werd verkregen door menging van 12 µL celsuspensie met 12 µL van een oplossing van acridine oranje/propidium jodide (AO/HD-PI) (Zie Tabel van materialen). Het gemiddeld aantal cellen per gram AT voor elke depot is: (a) OM Depot: 1.69 x 105 ± 4,51 x 10-4; (b) SC-Depot: 1,24 x 105 ± 6.45 x 10-4. De levensvatbaarheid van de cellen van beide depots was > 90%. - Pellet van de monsters bij 500 x g gedurende 5 min, bij 4 ° C.
Opmerking: Een CD34 protocol voor de selectie van de immunomagnetic (Zie Tabel van materialen) werd aangepast voor stappen 3.7-3.15. - Resuspendeer de pellet in 100 µL CD34 isolatie buffer.
Opmerking: De cel totaal graven vereisen de volgende resuspensie volumes: (a) < 2 x 107 cellen: resuspendeer de pellet in 100 µL; (b) 2 x 108–5 x 108 cellen: resuspendeer de pellet in 1 mL. In stappen 3.9 – 3.16, het volume van de gebruikte reagentia werden verlaagd voor < 2 x 107 cellen. - Voeg 10 µL van CD34 cocktail en Incubeer het monster gedurende 15 minuten, bij kamertemperatuur.
- Voeg 5 µL van magnetische kralen en Incubeer het monster gedurende 10 minuten, bij kamertemperatuur.
- 2,5 mL CD34 isolatie buffer toevoegen aan elk monster en plaats de monsters in de magneet, voor 5 min, bij kamertemperatuur.
- Omkeren van de magneet voor 5 s tot giet af de isolatie-buffer.
- Verwijder de monsters uit de magneet en herhaal stap 3,10 en 3.11 4 x.
- Verwijderen van de buis van de magneet en voeg 2 mL CD34 isolatie buffer.
- Pellet de cellen bij 500 x g gedurende 5 min, bij 4 ° C.
- Resuspendeer de cel pellets in 1 mL CD34 isolatie buffer en de cellen tellen.
Nota: Hier, het gemiddeld aantal cellen per gram AT is: (a) OM Depot: 4,75 x 104 ± 3.36 x 10-4; (b) SC-Depot: 1,06 x 104 ± 9,53 x 10-3. Een CD31 plastic immunobead protocol werd aangepast voor stappen 3.16 – 3,34 (Zie Tabel van materialen). - Pellet cellen bij 500 x g gedurende 5 min en resuspendeer de pellet in 250 µL van Buffer B en 250 µL van was buffer.
- Grondig resuspendeer de kralen CD31 door vortexing de buis.
- Voeg 20 µL van CD31 kralen.
Opmerking: Als gevolg van de cel totaal telt > 1 x 106, het volume was verlaagd volgens de fabrikant input. - Incubeer het monster met rockende gedurende 30 minuten, bij kamertemperatuur.
- Een zeef hechten aan een steriele 50 mL conische buis.
Opmerking: De grotere opening van de zeef moeten op de top. - Voorafgaand aan de scheiding van de cel, voeg 1 mL was buffer naar de zeef equilibreer. Breng het mengsel die zijn verkregen onder stap 3.16 naar de zeef.
- Het wassen van de zeef met 5 mL was buffer in een cirkelvormige beweging voor een totaal volume van 20 mL. De verbindingslijn koppelt aan een steriele 50 mL conische buis en sluit de luer-lock.
- Bevestigt de zeef op de connector. Voeg 1 mL was buffer langs de muur van de zeef. Voeg vervolgens 1 mL van geactiveerde buffer D langs de muur van de zeef. Swirl van het monster zachtjes en laat het 10 min, bij kamertemperatuur inwerken.
- Voeg 1 mL was buffer. De cellen van de kralen door pipetteren op en neer 10 x scheiden.
Opmerking: Vermijd het genereren van luchtbellen. - Open de luer-lock en laat de vrijstaande cellen te stromen in de conische buis van 50 mL. Wassen van de zeef 10 x met 1 mL was buffer telkens.
- Negeren van de connector en zeef en centrifugeren van de monsters bij 300 x g gedurende 10 minuten, bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet cel in 2 mL zuiver volledige BAVA-2 Media voor cultuur.
Opmerking: Het gemiddeld aantal cellen per gram AT op dit punt is: (a) OM Depot: 5.92 x 103 ± 4.27 x 10-3; (b) SC-Depot: 4.12 x 103 ± 2.1 x 10-3. De levensvatbaarheid van cellen van beide depots was meer dan 90%.
4. de inductie van Adipogenesis in geïsoleerde endotheliale cellen
- Het groeien van de cellen in 6-Wells-platen Weefselkweek behandeld met volledige BAVA-2 media in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. Vervang de media elke 3-4 dagen totdat de cellen samenvloeiing van 80-90%.
Opmerking: De verdubbeling van de bevolking is tussen 2-3 dagen. - Vouw de cellen door hen op 100 mm petrischalen plating en Splits de cellen 1:3 keer. In dit stadium zijn de cellen op passage 2.
- Graaf de cellen met behulp van een automatische cel counter (Zie Tabel van materialen).
- Zaad ongeveer 100 – 200.000 cellen 6-Wells-platen zorgen voor dubbele putten voor elke depot en de cultuur die hen voltooien in BAVA-2 media voor 2 dagen.
- Gecombineerd uit alle media groei en 2 mL DMEM/F12 met 5% te vervangen FBS en 50 µg/mL penicilline/streptomycine voor het besturingselement cellen en 2 mL Adipogenesis media (zie stap 1.4) voor de behandeling cellen te vervangen.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 incubator voor 13 dagen, ter vervanging van de respectieve media elke 3 tot 4 dagen.
Opmerking: Cellen zal beginnen te accumuleren lipiden na 4 dagen behandeling. - ORO en Nile rode kleuring volgens gepubliceerde methoden15-17verrichten.
- U kunt cellen voor een RNA extractie isoleren, verwijder het medium van de 6-well inductie platen en wassen met 1 mL steriele PBS.
- Voeg 350 µL van een guanidium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroformoplossing (Zie Tabel van materialen) elk goed en na het bebroeden bij kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten.
- De cellen uit de plaat met behulp van een cel schraper Schraap en de cellen overbrengen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.
Opmerking: De monsters kunnen worden opgeslagen in de vriezer-80 ° C voor RNA extractie en verdere verwerking op een later tijdstip. - Uittreksel van mRNA uit de monsters met behulp van een aangepast RNA extractie protocol (Zie Tabel van materialen).
- Uitvoeren van een real-time polymerasekettingreactie (RT-PCR) te beoordelen van de genexpressie met behulp van de volgende sondes: adiponectin, UCP-1 en CIDEA (Zie Tabel van materialen).
Opmerking: Hier, RT-PCR procedures werden uitgevoerd met behulp van de volgende standaard protocol: denaturatie (95 ° C; 15 s), gloeien en uitbreiding (60 ° C; 1 min) voor 40 cycli. De monsters die genen met CT -waarden uitgedrukt > 35 werden beschouwd als niet detecteerbaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ons protocol is bedoeld om een in vitro -aanpak om te bepalen van het adipogenic potentieel van CD34 + CD31 + vasculaire cellen uit verschillende magazijnen van menselijke adipeus weefsel. Een vereenvoudigd stroomdiagram wordt weergegeven in figuur 1A. De eerste stap met behulp van een positief aantal CD34 cellen uiten resulteert in > 95% CD34 + cellen in de bevolking van de vers geïsoleerde cellen (figuur 1A). Nog belangrijker is, is deze markering gaat verloren nadat de cellen worden gekweekt voor een paar passages. Aangezien CD34 een gemeenschappelijk marker voor uiteenlopende hematopoietische en niet-hematopoietische progenitorcellen, is de volgende stap die nodig is voor de scheiding van endotheliale voorlopercellen de positieve selectie van CD31 + cellen uit de CD34 + celpopulatie (figuur 1A). CD31 weliswaar een marker voor endotheliale cellen, kan het ook worden gevonden op deelverzamelingen van hematopoietische cellen. We verschillende preparaten van het omental en onderhuids vet geanalyseerd door stroom cytometry en consequent vond dat CD34 + CD31 + cellen niet de markering van de CD45 (figuur 1B, top panelen) uitgedrukt. Typisch, < 1% van de cellen toonde CD45 positiviteit, uit de cel Totaal bevolking. Dit resultaat leidde ons tot de conclusie dat we waarschijnlijk een voorbereiding vrijwel vrij van hematopoietische progenitorcellen verkregen. Om te bepalen of de cellen de adipocyte stamcel markering CD24 express, we geanalyseerd cellen uit zowel de omental als de subcutane depots en vond dat vrijwel geen cellen de markering van de CD24 in de omental depot (figuur 1B, onderste panelen) en minder dan 5% van uitgedrukt de cellen uitgedrukt de markering in de subcutane depot (niet afgebeeld). Tot slot, verkregen met behulp van deze scheiding methodiek, we CD34 + CD31 + CD45-CD24-cellen zowel omental en onderhuidse magazijnen van zwaarlijvige onderwerpen.
Met behulp van de kunststof kralen geconjugeerd met een antilichaam CD31, we verkregen cellen die de geplaveide endothelial morfologie tijdens de vroege passages, in tegenstelling tot cellen gescheiden met behulp van de magnetische kralen geconjugeerd met een CD31-antilichaam dat weergegeven weergegeven een spindel-vormig mesenchymale fenotype onmiddellijk na de scheiding (figuur 2A). Om te substantiëren verder de endothelial identiteitvan de CD34 + CD31 + cellen, we twee functionele tests uitgevoerd: een opname van DiI-Ac-LDL- en een kelder membraan-matrix (hierna aangeduid als matrix tonkilometers) buis vorming in vitro. CD34 + CD31 + cellen werden geïncubeerd met DiI-Ac-LDL en de grote meerderheid van de cellen waren positief voor de opname (Figuur 1 c). Als positieve controle, gebruikten we een menselijk vetweefsel microvasculaire endothelial cel van de primaire lijn (HAMVEC) die commercieel beschikbaar is (Zie Tabel van materialen en Figuur 1 c). Wij ook getest of de CD34 + CD31 + cellen hun endothelial functie behouden na kweken door bepaling van het vermogen van dergelijke cellen vormen spontane vaartuig-achtige structuren in vitro, in een 3D-matrix. Na 3 passages, CD31 + CD34 + formulieren buisvormige vaartuig-achtige structuren in een matrix die vergelijkbaar is met een HAMVEC primaire menselijke endothelial cellijn (Figuur 1 d).
Na de uitbreiding van de cellen voor 2 – 3 gangen overstapten we van de cellen van EGM-2 volledige media met groeifactoren pro-angiogenic in DMEM/F12 media aangevuld met 5% FBS, Rosiglitazon (1µM) en insuline (144 mU/mL). Behoud van dat de cellen in de BAVA-2 voltooien media drastisch verlaagd hun adipogenic differentiatie. Ook een toevoeging van dexamethason en 3-isobuthyl-1-methylxanthine aan de media niet veranderen het tempo en de omvang van lipide accumulatie en een toevoeging van indomethacin aanzienlijk verminderd lipide accumulatie (gegevens niet worden weergegeven). Gebaseerd op deze voorbereidende experimenten, besloten we om alleen gebruik maken van rosiglitazone en insuline voor de adipogenic-inductie. Na 14 dagen van cultuur in adipogenic media, de cellen werden vastgesteld en gekleurd met olie Red O of Nijl rood en de kernen werden counterstained met DAPI (figuur 2B). In de cijfers, representatieve beelden getoond van cellen geïsoleerd van gepaarde onderhuidse (SC) (figuur 2B, top panelen) en omental (OM) (figuur 2B, onderste panelen) adipeus weefsel drie proefpersonen met een BMI tussen 37-45 kg/m2. Houd er rekening mee dat het antwoord op de inductie sterk tussen de onderwerpen en depots van hetzelfde onderwerp varieert. Zoals gezien in de fluorescerende afbeelding in figuur 2B, een gemengde bevolking van unilocular (rode pijlen) en multilocular (witte pijlen) zijn lipide-bevattende cellen evenals cellen die niet lipiden (gele pijlen accumuleren doen) meestal aanwezig. De verhouding tussen de nummers van deze cellen is ook zeer variabele met zowel het onderwerp als het depot van oorsprong. Een kwantificering van het percentage van het lipide-bevattende cellen (gebaseerd op olie Red O positiviteit) uit het totaal aantal cellen (gebaseerd op de DAPI gebeitste kernen) toonde een significant verschil tussen de SC en OM depots van hetzelfde individu, met de cellen van het SC-depot wordt beter inspelen op de adipogenic-inductie (figuur 2C). De verklaring voor de heterogeniteit in reactie tussen de onderwerpen en de depots van hetzelfde onderwerp is niet duidelijk. Echter speculeren we dat waarschijnlijk in verband met de intrinsieke aard van de cel bevolking die de vingerafdruk van het in vivo fenotype/milieu en niet als gevolg van de variabiliteit in het protocol van de isolatie draagt.
Om te bevestigen dat de cellen onderging de differentiatie om oudere adipocytes, we de genexpressie van de pan-adipocyte marker adiponectin en de bruin/beige markers UCP-1 en CIDEA in de cellen na 13 dagen van adipogenic inductie vergeleken met gemeten un-geïnduceerde cellen. De expressie adiponectin werd verhoogd tot 10.000 in de gedifferentieerde cellen ten opzichte van de besturingselementen (figuur 2D). De genexpressie van CIDEA en UCP1 was alleen aantoonbaar in de cellen na de stimulatie van de adipogenic (figuur 2D). In het bijzonder de expressie UCP-1 werd zeer variabel, als gevolg van de verschillende verhoudingen van de Wit: bruin / beige cellen binnen de celpopulatie. De expressie van het huishouden gen RPL27 was opmerkelijk consistente tussen de monsters met CT -waarden variërend tussen 18-20 cycli en geen significante verschillen werden gevonden tussen de cellen die onderging de differentiatie van de adipogenic en de onbehandelde controles. Wij ook een UCP-1 eiwit expressie gedetecteerd in de cellen die het multi Uniloculair fenotype, weergegeven in een punctated patroon dat een mitochondriale lokalisatie (figuur 2E suggereert). Het UCP-1 eiwit was niet aantoonbaar in cellen die niet lipiden accumuleren deed of in cellen met meerdere, zeer kleine druppeltjes die waarschijnlijk niet volledig gedifferentieerde adipocytes (figuur 2E).
Onze waarneming dat het potentieel van de adipogenic van de CD34 + CD31 + cellen depot-specifieke is en zeer variabele onder verschillende onderwerpen gevraagd ons te zoeken naar mogelijke correlaties met BMI, leeftijd en HbA1c. Onder de 28 monsters getest, did we niet vondst ieder significante correlaties tussen de potentiële adipogenic en de leeftijd of de BMI; echter vonden wij een significante negatieve correlatie tussen HbA1c en de lipide-accumulatie in de cellen van het OM depot (figuur 3A). Deze bevinding geeft een mogelijke link met de chronische hyperglycemic omgeving en toekomstige onderzoek verdient. Dit suggereert ook dat het CD34 + CD31 + cellen waarschijnlijk dragen de handtekening in vivo van hun vermogen om te reageren op een adipogenic-inductie. We laten ook zien dat deze cellen weergeven variabele niveaus van Akt fosforylatie na een in vitro insuline stimulatie (figuur 3B, top). Deze variabiliteit reactie doet echter niet correleren goed met hun vermogen om het ondergaan van een differentiatie van de adipogenic, zoals blijkt uit de olie Red O kleuring in de foto's van de overeenkomende monsters (figuur 3B, bodem).
Figuur 1: scheiding en karakterisering van CD34 + CD31 + cellen uit menselijk vetweefsel. (A) dit stroomdiagram ziet u de grote stappen van isolatie en differentiatie. Na de positieve selectie met behulp van CD34 magnetische kralen, > 95% van de vers geïsoleerde cellen, voorafgaand aan de tweede stap voor selectie, zijn CD34 +. (B) Deze representatieve stroom cytometry toont een forward verspreide perceel gated voor levende cel bevolking; een onbevlekt monster op het kanaal van FITC (BluFl2); en CD45 vlekken van een steekproef van de omental op bovenkant. De onderkant toont de dezelfde volgorde zoals op de top, maar voor de CD24 (Alexafluor-647-geëtiketteerden) cellen uit het omental monster. (C) dit vertegenwoordiger microfoto tonen een opname van DiI-Ac-LDL (rood) door CD34 + CD31 + cellen na 4 uur van in vitro -incubatie (bovenste paneel). Een vergelijkbare opname werd gevonden in een menselijk vetweefsel microvasculaire endothelial cel primaire cellijn (HAMVEC) (onderkant). De kernen worden door DAPI blauw weergegeven. (D) deze representatieve microfoto Toon een in vitro buis vorming van CD34 + CD31 + cellen zaadjes in een 3D-matrix. CD34 + CD31 + cellen (doorgang 3) werden geplaatst in 24-Wells-platen na een kleuring met FITC-calceïne en 4 h in volledige endothelial cel media ge¨ uncubeerd. De cellen waren beeld met behulp van een omgekeerde fluorescente microscoop. HAMVEC, ontpit op de dezelfde dichtheid, werd gebruikt voor de vergelijking. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Adipogenic inductie en markeringen van CD34 + CD31 + cellen. (A) deze vertegenwoordiger microfoto Toon de morfologische verschillen tussen CD34 + CD31 + cellen geïsoleerd met behulp van een positieve selectie met CD31 + magnetische kralen vs. CD31 + Kunststof kralen. De cellen waren bij passage 1 beeld na het isolement. De vergroting gebruikt is 100 X. (B) deze panelen zijn vertegenwoordiger microfoto van olie Red O gekleurd CD34 + CD31 + cellen uit gekoppelde onderhuidse (SC) en omental viscerale (OM) monsters van 3 verschillende onderwerpen. De cellen werden gekweekt voor 2 – 3 passages van EGM-2 volledige media, dan overgeschakeld op DMEM/F12 media met 5% FBS behandeld met insuline (144 mU/mL) en Rosiglitazon (1 µM) voor 14 dagen, met media om de 3 dagen vervangen. De vergroting gebruikt is 100 X. De representatieve fluorescerende afbeelding toont adipo rode lipide druppels (groen) en DAPI nucleaire kleuring (blauw). Let op: een mix van cellen met unilocular lipiden (rode pijl), multilocular lipide druppels (witte pijl) of cellen waaruit geen accumulatie van lipide (gele pijl blijkt). De vergroting gebruikt is 200 X, schaal bar = 50 µm. (C) dit paneel toont een kwantificering van adipogenic potentiële uitgedrukt als olie Red O (ORO) positieve cellen genormaliseerd naar totale DAPI gebeitste kernen. CD34 + CD31 + cellen uit OM en SC depots van hetzelfde onderwerp tonen een significant verschil in adipogenic potentiële door een gepaarde t-toets (n = 7). (D) de genexpressie van volwassen adipocyte markeringen (adiponectin UCP-1 en CIDEA) werd gemeten door RT-PCR in de cellen na 14 dagen van adipogenic inductie en in de cellen. De gegevens worden uitgedrukt als een vouw-verandering voor de genexpressie adiponectin. De uitdrukking van CIDEA en UCP-1 was niet in de controlemonsters worden opgespoord. De waarden vertegenwoordigen ΔCt genormaliseerd naar RPL27 als een schoonmaak-gen. De CT -waarden voor RLP27 zijn tussen 18-20 cycli voor alle monsters in de analyse meegenomen (n = 3 – 5 onderwerpen). De gegevens worden uitgedrukt als bedoel ± SD. Een gepaarde t-toets werd gebruikt voor een statistische analyse van de gegevens. p < 0.05 verwerpt de null-hypothese. (E) dit paneel toont de eiwituitdrukking voor UCP-1 in CD34 + CD31 + cellen na 13 dagen van inductie met insuline en Rosiglitazon. Immunocytochemie met behulp van een menselijke polyclonal antilichaam van UCP-1 toonde een selectieve uitdrukking van UCP-1 multi Uniloculair adipocytes. De detectie tot stand gekomen met behulp van een rhodamine-geconjugeerde secundair antilichaam (rood) en de DAPI kleuring voor kernen (blauw). De grote vergroting in de inzet toont het punctated rood signaal overeenkomt met UCP-1 (rode pijl) evenals de meerdere lipide druppels (LD) van verschillende maten rondom de celkern (N). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Correlatie tussen adipogenic differentiatie, HbA1c en in vitro insuline signalering. (A) Spearman (niet-parametrische) en Pearson (parametrische) correlatiecoëfficiënten voor de cellen OM en SC, respectievelijk, werden gebruikt om te bepalen van de correlatie tussen HbA1c en de accumulatie van lipide (n = 20). De nulhypothese verworpen voor p < 0.05. (B) aan de top, een westelijke bevlekken toont de gefosforyleerd Akt (groen) en de totale expressie Akt (rood) in CD34 + CD31 + cellen gestimuleerd in vitro met 5 nM insuline gedurende 30 minuten voorafgaand aan de adipogenic-inductie (n = 8). Aan de onderkant, wordt een olie Red O kleuring van dezelfde cellen na de inductie van adipogenic voor 14 dagen weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De focus van dit document is bedoeld als een methode voor de isolatie, de uitbreiding en de adipogenic inductie van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van viscerale en onderhuidse magazijnen van menselijke adipeus weefsel.
Methoden zijn gemeld voor de isolatie van endotheliale cellen van de verschillende vasculaire bedden van knaagdieren of mensen waarbij voornamelijk technieken met behulp van CD31 antilichamen fluorescently label of gekoppeld aan magnetische kralen18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23. een grote uitdaging voor de universele toepassing van deze isolatie technieken is de heterogeniteit van de bevolking endothelial cel in verschillende vasculaire bedden en het hoge risico van besmetting met fibroblasten en vasculaire muurschildering cellen. Echter, verfijningen van de isolatie technieken om te voorkomen dat dergelijke verontreinigingen zijn gerapporteerde24. Met behulp van deze technieken, zijn meestal volwassen endotheliale cellen geïsoleerd uit de weefsels. Vetweefsel is een groot reservoir van stam/voorlopercellen, met inbegrip van Endotheliale progenitorcellen25,26. Een paar papieren gemeld de zuivering van endotheliale cellen van menselijke adipeus weefsel met behulp van een combinatie van CD34 + en CD31 + antilichamen11,27. Cellen die uitdrukking geven aan de twee markers zijn een gemengde bevolking van volwassen endotheliale cellen en Endotheliale progenitorcellen11,28,29. Verschillende recente baanbrekende artikels melden dat een kleine ondergroep van endothelial (CD31 +) of muurschildering (PDGFRβ +) cellen in de obesitas therapieën een rijke bron van adipocyte voorlopercellen5,30 is. Deze vasculaire cellen met adipogenic potentiële kunnen produceren zowel wit of bruin/beige adipocytes en zijn gekoppeld aan de actieve angiogenese in de obesitas therapieën5. Deze bevindingen kunnen nieuwe therapeutische mogelijkheden de metabole om prestaties te verbeteren in zwaarlijvigheid en/of voor het opwekken van verlies van het gewicht door het genereren van witte en/of thermogene adipocytes van vasculaire progenitoren bieden. Het is daarom van belang zijn voor het identificeren van een methodologie voor het gemakkelijk en economisch isolement, uitbreiding en beoordeling van het adipogenic potentieel van vasculaire endotheliale cellen van menselijke adipeus weefsel.
De CD34 + CD31 + cellen van menselijke subcutane en omental viscerale adipeus weefsel depots werden eerder gekenmerkt op basis van hun potentieel angiogenic, de productie van inflammatoire mediatoren, hun senescentie markeringen en andere functies11 , 31. er is echter geen gepubliceerde bewijs voor het adipogenic potentieel van dergelijke cellen. Eerdere publicaties die gescheiden CD34 + CD31 + cellen met behulp van magnetische kralen verslag op gegevens uit de cellen samengevoegd uit een groot aantal onderwerpen (10 of meer)11. Deze paper verslagen voor het eerst een protocol voor de succesvolle isolatie en de uitbreiding van de CD34 + CD31 + cellen uit één menselijke donoren uit de subcutane en omental depots. We geïsoleerd en uitgebreid cellen uit zo weinig als 2-3 g van vetweefsel. De CD34 + CD31 + cellen vertegenwoordigd van 3 – 5% van de totale SVF cellen en weergegeven > 90% levensvatbaarheid na het isolement. Deze cellen waren zeer proliferatieve en toonde een breed scala aan reacties naar de differentiatie van de adipogenic na een in vitro -stimulatie met Rosiglitazon en insuline. Eerdere studies alleen gebruikt obesitas stamcellen of totale stromale vasculaire Fractie van menselijke adipeus weefsel te testen adipogenic reacties4,32,33,34. Een recente studie gebruikt eencellige schorsingen van microvasculature van menselijk vetweefsel, maar het is onduidelijk of de gedifferentieerde adipocytes waren muurschildering of endotheel in natuur3.
Aanvullende immunophenotyping van de CD34 + CD31 + cellen met behulp van stroom cytometry toonde hun gebrek aan CD45 en CD24 markers ongeacht hun depot van oorsprong. Nog belangrijker is, wij bleek dat na 3 passages in de cultuur, de CD31 + CD34 + cellen behouden hun endothelial functionaliteit aangetoond door de accumulatie van geacetyleerd LDL en een in vitro buis vorming in een 3D-matrix. Ook vertegenwoordigd de gedifferentieerde adipocytes een gemengde bevolking van wit en beige/bruin cellen, op basis van hun morfologie en moleculaire merkers, met inbegrip van een UCP-1 eiwit expressie. Eerdere studies in muizen bleek dat vetweefsel therapieën een bron van zowel wit kunnen en bruin adipocytes5,30 en recentere gegevens een soortgelijk resultaat met betrekking tot de differentiatie van wit en functioneel toonde thermogene beige cellen van menselijke obesitas therapieën3.
In tegenstelling tot de meeste publicaties die gebruikt adipogenic cocktails met meerdere ingrediënten voor de differentiatie van de adipocyte uit een scala van voorlopercellen in vitro, vonden wij dat Rosiglitazon en insuline noodzakelijk en toereikend is voor de adipogenic inductie van CD34 + CD31 + cellen. Terwijl we weten dat alleen Rosiglitazon een lipide-accumulatie in niet-adipeus cellen35, de moleculaire handtekening voor pan-adipocyte en bruin/beige adipocyte markers kan veroorzaken, met inbegrip van een UCP-1 eiwit bevestigt expressie in cellen selecteren, de volwassen adipocyte fenotype van sommige van de gedifferentieerde cellen. Onze twee-ingrediënt adipogenic cocktail vereenvoudigt het procedurele protocol en maakt het meer rendabel.
Een belangrijke opmerking was dat de reactie van de adipogenic van de CD34 + CD31 + cellen zeer variabel met het onderwerp van de donor en obesitas depot. Terwijl eerder depot-specifieke verschillen in de reacties van de cellen van de stam van de obesitas of stromale vasculaire progenitoren geweest adipogenic32,34 gemelde, is de variabiliteit van het onderwerp van een dergelijk antwoord een nieuwe waarneming. Uit de 20 menselijke monsters geanalyseerd, 3 SC en 7 OM cellen niet reageren op de adipogenic-inductie. De meest robuuste reacties bleek > 90% van de cellen reageren op de inductie voor 4 monsters van SC en voor 2 monsters van OM. interessant, vonden we dat het reactievermogen is negatief gecorreleerd met HbA1c en niet met het antwoord op een correleren doet in vitro insuline stimulatie in ongedifferentieerde cellen. Wij beweren dat het verschil in reactie niet te wijten aan de slechte reproduceerbaarheid van de techniek is, maar eerder weerspiegelt de individuele vingerafdruk van cellen die in vivo reacties na te bootsen. Het behoud van deze differentiële reactie vereist verdere validatie en kan vertegenwoordigen een relatief eenvoudig screeningsmethode voor het reactievermogen te therapieën gericht op het stimuleren van adipogenesis in vivo. Om verder te begrijpen de bron van individuele variabiliteit in de potentiële adipogenic, is aanvullende immunophenotyping noodzakelijk te geven cel subpopulaties binnen de CD34 + CD31 + bevolking die het dragen van een specifieke adipocyte voorlopercellen functie.
Enkele van de beperkingen van dit protocol omvatten een onvolledige karakterisering van de cel populaties; relatief lange expansie en differentiatie tijden (2 weken + 2 weken); mogelijke beperkingen toegang tot menselijke specimens en de noodzaak voor de onmiddellijke verwerking van de vers verzamelde weefsels; en een huidige ontbreken van functionele gegevens voor de gedifferentieerde cellen. Er zijn verschillende voordelen van deze methodologie die een reproduceerbare en niet arbeidsintensief protocol bevatten; cellen dat waarschijnlijk behouden de vingerafdruk van hun fenotype in vivo ; de uitbreiding van de cellen van zeer kleine hoeveelheden weefsels met relatief lage kosten; de mogelijkheid om te cryopreserve van de cellen en behouden hun handtekening van de adipogenic na opnieuw cultuur; en de optie voor het genereren van repositories van deze cellen, zodat ze kunnen worden gebruikt voor toekomstige screening of andere doeleinden.
Dit protocol en de CD34 + CD31 + cellen verkregen als eindresultaat kunnen worden gebruikt als een translationeel platform mechanistisch onderzoek zowel voor screeningonderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen erkennen Becky Marquez, de klinische coördinator op de Sentara Bariatric Center, voor haar hulp bij het proces van patiënt screening en toestemming. Dit onderzoek werd gesteund door R15HL114062 aan Anca D. Dobrian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Large Equipment |
|||
| Biosafety Cabinet |
Nuaire |
nu-425-400 |
|
| Cell Culture Incubator |
Thermo-Fisher Scientific |
800 DH |
|
| Water Bath |
Forma Scientific |
2568 |
Reciprocal Shaker |
| RT-PCR Machine |
BIO-RAD |
CFX96-C1000 |
|
| Electrophoresis Box |
BIO-RAD |
Mini PROTEAN 3 Cell |
|
| Transblot Box |
BIO-RAD |
Mini Trans-Blot Cell |
|
| Electrophoresis Power Supply |
BIO-RAD |
PowerPac Basic |
|
| ELISA Reader |
Molecular Devices |
SpectraMax M5 |
|
| Blot Reader |
LI-COR |
Odyssey |
Near Infrared |
| Refrigerated Centrifuge |
Eppendorf |
5810 R |
|
| Tabletop Centrifuge |
Eppendorf |
MiniSpin Plus |
|
| Fluorescent Microscope |
Olympus |
BX50 |
|
| Inverted Microscope |
Nikon |
TMS |
|
| KRBSS Buffer |
|||
| HEPES |
Research Products International |
H75030 |
|
| Sodium bicarbonate |
Sigma-Aldrich |
792519 |
|
| Calcium chloride dihydrate |
Sigma-Aldrich |
C7902 |
|
| Potassium phosphate monobasic |
Sigma-Aldrich |
P5655 |
|
| Magnesium sulfate |
Sigma-Aldrich |
M2643 |
|
| Sodium chloride |
Sigma-Aldrich |
746398 |
|
| Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich |
S9638 |
|
| Potassium chloride |
Sigma-Aldrich |
P9333 |
|
| Glucose |
Acros Organics |
410950010 |
|
| Adenosine |
Acros Organics |
164040250 |
|
| Bovine Serum Albumin |
GE Healthcare Bio-Sciences |
SH30574.02 |
|
| Penicillin/Streptomycin |
Thermo-Fisher Scientific |
15070063 |
|
| Tissue Digestion |
|||
| 20 mL Syringe |
Global Medical |
67-2020 |
|
| Nylon Mesh, 250 µm |
Sefar |
03-250/50 |
|
| Pipetting Needles |
Popper |
7934 |
|
| Fine Scissors |
Fine Science Tools |
14058-11 |
|
| Tissue Forceps |
George Tiemann & Co |
160-20 |
|
| Collagenase, Type I |
Worthington Biochemical |
LS004196 |
|
| Petri Dishes, 100 mm |
USA Scientific |
5666-4160 |
TC Treated |
| Eppendorf Tubes, 1.5 mL |
USA Scientific |
1615-5500 |
|
| Conical Tubes, 15 mL |
Nest Scientific |
601052 |
|
| Conical Tubes, 50 mL |
Nalgene |
3119-0050 |
|
| Scintillation Vials |
Kimble |
74505-20 |
Tissue Dicing |
| Cell Isolation |
|||
| Cellometer |
Nexcelom |
Auto 2000 |
|
| Cellometer Slides |
Nexcelom |
CHT4-SD100-002 |
|
| Cellometer Viability Stain |
Nexcelom |
CS2-0106-5mL |
Acridine Orange/Propidium Iodine |
| Anti-CD34 Magnetic Beads |
StemCell Technologies |
18056 |
Kit |
| EasySep Magnet |
StemCell Technologies |
18000 |
|
| Anti-CD31 Plastic Beads |
pluriSelect USA |
19-03100-10 |
|
| pluriSelect 10x Wash Buffer |
pluriSelect USA |
60-00080-10 |
|
| pluriSelect Connector Ring |
pluriSelect USA |
41-50000-03 |
|
| pluriSelect Detachment Buffer |
pluriSelect USA |
60-00046-12 |
|
| pluriSelect Incubation Buffer |
pluriSelect USA |
60-00060-12 |
|
| pluriSelect S Cell Strainer |
pluriSelect USA |
43-50030-03 |
|
| Cell Culture |
|||
| 6-well Plates |
USA Scientific |
CC7682-7506 |
TC Treated |
| 4-well chambered slides |
Corning Life Sciences |
354559 |
Fibronectin coated |
| 4-well chambered slides |
Thermo-Fisher Scientific |
154526PK |
Uncoated glass |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC) |
Sciencell Research Laboratories |
7200 |
Primary cell line |
| Endothelial Cell Media (ECM) |
ScienCell Research Laboratories |
1001 |
Complete Kit |
| DMEM/F12 Basal Media |
Thermo-Fisher Scientific |
11320082 |
|
| Fetal Bovine Serum (FBS) |
Rocky Mountain Biologicals |
FBS-BBT |
|
| Insulin |
Lilly |
U-100 |
Humalog |
| Rosiglitazone |
Sigma-Aldrich |
R2408 |
|
| Cell Analysis |
|||
| Oil Red O Dye |
Sigma-Aldrich |
O0625 |
Prepared in isopropanol |
| 96 well plates |
USA Scientific |
1837-9600 |
|
| 96 well PCR plates |
Genesee Scientific |
24-300 |
|
| RNA Extraction |
Zymo Research |
R2072 |
Kit |
| cDNA Synthesis |
BIO-RAD |
1708841 |
Supermix |
| JumpStart PCR Polymerase |
Sigma-Aldrich |
D9307-250UN |
Hot start, with PCR Buffer N |
| Magnesium Chloride Solution |
Sigma-Aldrich |
M8787-5ML |
3 mM final in PCR reaction |
| dNTPs |
Promega |
U1515 |
|
| TaqMan AdipoQ |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00605917_m1 |
|
| TaqMan CIDEA |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00154455_m1 |
|
| TaqMan RPL27 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs03044961_g1 |
|
| TaqMan UCP1 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00222453_m1 |
|
| BCA Assay |
Sigma-Aldrich |
QPBCA-1KT |
Kit |
| Bis-acrylamide |
BIO-RAD |
1610146 |
40% stock solution |
| Ammonium Persulfate |
BIO-RAD |
1610700 |
|
| TEMED |
BIO-RAD |
1610800 |
|
| Tris |
Sigma-Aldrich |
T1503 |
|
| Glycine |
BIO-RAD |
1610718 |
|
| Sodium Dodecal Sulfate |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
| EDTA |
Fisher Scientific |
S311-100 |
|
| Bromophenol Blue |
Sigma-Aldrich |
B8026 |
|
| Blot Membrane |
EMD Millipore |
IPFL00010 |
|
| Methanol |
Fisher Scientific |
A452-SK4 |
|
| Odyssey Blocking Buffer, Tris |
LI-COR |
927-50000 |
|
| Anti-AKT antibody |
Cell Signaling Technology |
2920S |
Mouse monoclonal |
| Anti-pAKT antibody |
Cell Signaling Technology |
9271S |
Rabbit polyclonal |
| Anti-UCP1 antibody |
Abcam |
ab10983 |
Rabbit polyclonal |
| Anti-Mouse IgG antibody |
LI-COR |
926-68070 |
Goat Polyclonal, IRDye 680RD |
| Anti-Rabbit IgG antibody |
LI-COR |
926-32211 |
Goat Polyclonal, IRDye 800CW |
| Anti-Rabbit IgG antibody |
Jackson ImmunoResearch |
111-025-003 |
Goat Polyclonal, TRITC |
| Phosphate Buffer Saline |
Thermo-Fisher Scientific |
10010049 |
|
| 37% Formaldehyde Solution |
Electron Microscopy Sciences |
15686 |
4% solution for cell fixation |
| Normal Goat Serum |
Vector Laboratories |
S-1000 |
10% blocking solution |
| Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
X-100 |
0.1% permeabilization solution |
| DAPI |
Thermo-Fisher Scientific |
D1306 |
|
| Calcein AM |
Thermo-Fisher Scientific |
65-0853-39 |
Cell fluorescent visualization |
| Matrigel Basement Membrane Matrix |
Corning Life Sciences |
356231 |
Growth factor reduced |
| DiI labeled Acetylated LDL |
Thermo-Fisher Scientific |
L3484 |
References
- Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).
- Min, S. Y., et al. Human 'brite/beige' adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice. Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Tran, K. V., et al. The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells. Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
- Miranville, A., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).
- Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).
- Moller, D. E., Flier, J. S. Insulin resistance--mechanisms, syndromes, and implications. The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes. The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).
- Satish, L., et al. Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage. BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization. Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).
- Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (105), e53072 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC). Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).
- Zhou, L., et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis. PLoS One. 10 (2), e0117644 (2015).
- Curat, C. A., et al. From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes. Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).
- Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).
- Traktuev, D. O., et al. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks. Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).
- Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis. Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).
- Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue. Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).
- Ong, W. K., et al. Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
- Ong, W. K., Sugii, S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots. American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).
- van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation. Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).
