Summary
वसा ऊतक संवहनी progenitors से सफेद और बेज रंग adipocytes के भेदभाव मोटापा में चयापचय सुधार के लिए संभावित भालू । हम एक CD34 के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन + CD31 + endothelial मानव वसा से सेल अलगाव और इन विट्रो विस्तार और सफेद और बेज रंग adipocytes में विभेद के लिए बाद में । कई बहाव आवेदन पर चर्चा कर रहे हैं ।
Abstract
मोटापा मुख्य रूप से adipocyte अतिवृद्धि के माध्यम से वसा ऊतक के एक व्यापक remodeling के साथ है । अति adipocyte विकास इंसुलिन, स्थानीय हाइपोक्सिया, और सूजन के लिए एक गरीब प्रतिक्रिया में परिणाम । progenitors से कार्यात्मक सफेद adipocytes के भेदभाव उत्तेजक द्वारा, adipocyte जनसंख्या के कट्टरपंथी अतिवृद्धि और रोका जा सकता है, नतीजतन, वसा ऊतक के चयापचय स्वास्थ्य की कमी के साथ साथ सुधार किया जा सकता है सूजन. इसके अलावा, बेज रंग/ब्राउन adipocytes के एक भेदभाव उत्तेजक द्वारा, कुल शरीर ऊर्जा व्यय बढ़ सकता है, वजन घटाने में जिसके परिणामस्वरूप । इस दृष्टिकोण से मोटापा सह रुग्णता जैसे टाइप 2 मधुमेह और हृदय रोग के विकास को रोका जा सकता है ।
यह कागज मानव वसा ऊतक endothelial कोशिकाओं के एक सबसेट से अलगाव, विस्तार, और सफेद और बेज रंग adipocytes के भेदभाव का वर्णन है कि सह CD31 और CD34 मार्करों व्यक्त करते हैं । विधि अपेक्षाकृत सस्ता है और श्रम गहन नहीं है । यह मानव वसा ऊतक और चमड़े के नीचे डिपो के लिए उपयोग की आवश्यकता है नमूना के लिए उपयुक्त है । इस प्रोटोकॉल के लिए, रुग्ण मोटापे से ग्रस्त विषयों से ताजा वसा ऊतक नमूने [बॉडी मास इंडेक्स (बीएमआई) > 35] बैरिएट्रिक सर्जरी प्रक्रियाओं के दौरान एकत्र कर रहे हैं । stromal संवहनी अंश से एक अनुक्रमिक immunoseparation का उपयोग करना, पर्याप्त कोशिकाओं के रूप में छोटे से उत्पादित कर रहे हैं 2 – 3 वसा के जी. इन कोशिकाओं को संस्कृति में 10 से अधिक का विस्तार किया जा सकता है-14 दिन, cryopreserved जा सकता है, और passaging के साथ अपने adipogenic गुणों को बनाए रखने के लिए 5-6 । कोशिकाओं को एक adipogenic कॉकटेल के साथ 14 दिनों के लिए इलाज कर रहे है मानव इंसुलिन और PPARγ एगोनिस्ट-rosiglitazone का एक संयोजन का उपयोग कर ।
इस पद्धति आणविक तंत्र पर अवधारणा प्रयोगों का सबूत प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि वसा endothelial कोशिकाओं में adipogenic प्रतिक्रियाओं ड्राइव, या नई दवाओं है कि adipogenic प्रतिक्रिया में वृद्धि कर सकते है या तो सफेद की ओर निर्देशित या जांच के लिए बेज रंग/भूरा adipocyte विभेद. छोटे चमड़े के नीचे बायोप्सी का उपयोग करना, इस पद्धति बाहर स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है नैदानिक परीक्षण के लिए विषयों को बेज रंग को उत्तेजित करने के उद्देश्य से और मोटापा और सह रुग्णता के उपचार के लिए सफेद adipocytes ।
Introduction
हाल के सबूत से पता चलता है कि दोनों चूहों में और मनुष्यों में, वसा ऊतक vasculature में रहने वाले कोशिकाओं का एक सबसेट या तो सफेद या बेज रंग में विभेदित किया जा सकता है/ब्राउन adipocytes1,2,3। ऐसी कोशिकाओं का phenotype विवाद का विषय है, endothelial कोशिकाओं के समर्थन सबूत के साथ, चिकनी मांसपेशी/pericyte, या मध्यवर्ती phenotypes4,5,6,7की एक स्पेक्ट्रम । इस कार्यप्रणाली को विकसित करने की गुंजाइश CD34 + CD31 + endothelial कोशिकाओं को मोटे इंसानों से अलग मोटे डिपो से पृथक करने की adipogenic क्षमता का परीक्षण करना था. साहित्य के अन्य अध्ययनों में कुल stromal संवहनी अंश या ज्ञात adipocyte progenitors2,8,9की adipogenic क्षमता पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं । चूंकि वर्तमान में मौजूदा प्रौद्योगिकियों विशेष रूप से दवा वितरण के लिए वसा ऊतक endothelial कोशिकाओं को लक्षित कर सकते हैं10, इस तरह की कोशिकाओं की क्षमता को समझने adipogenic प्रेरण से गुजरना करने के लिए सफेद या बेज रंग adipocytes के लिए महत्वपूर्ण है भविष्य लक्षित चिकित्सा ।
विभिंन समूहों CD31 और CD34 मार्करों के संयोजन के रूप में मानव वसा ऊतक11,12,13से endothelial कोशिकाओं को अलग करने की रिपोर्ट । आमतौर पर, अलगाव दो अनुक्रमिक चरणों और एक सकारात्मक चयन चुंबकीय मोतियों का उपयोग कर का उपयोग किया जाता है । इस रिपोर्ट में, CD31 प्लास्टिक मोतियों के साथ संयुक्त CD34 + चुंबकीय मोतियों का उपयोग immunoseparation इस्तेमाल किया गया था । हम इस तकनीक ठेठ cobblestone endothelial आकृति विज्ञान के संरक्षण के संबंध में अनुक्रमिक चुंबकीय immunoseparation से बेहतर पाया । इसके अलावा, हम पर्याप्त विस्तार और adipogenic प्रेरण के रूप में के रूप में छोटे से शुरू करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं उत्पंन करने में सक्षम थे 1-वसा के 2 जी । चमड़े के नीचे वसा का एक छोटा सा नमूना बायोप्सी बहाव अनुप्रयोगों के लिए कोशिकाओं की आवश्यक मात्रा का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त है । यह पहलू संभावित रूप से महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से अगर इस विधि एक जवाबदेही के लिए मानव विषयों में प्रेरण adipogenic के लिए उपयोग किया जाएगा ।
अंय साहित्य में रिपोर्ट प्रणालियों के विपरीत, इस विधि CD34 + CD31 + कोशिकाओं के adipogenic प्रेरण के लिए केवल दो अवयवों का इस्तेमाल: एक PPARγ एगोनिस्ट — rosiglitazone-और मानव इंसुलिन । महत्वपूर्ण बात, इस्तेमाल किया इंसुलिन की मात्रा में मानव14में घूम पोस्ट-अवशोषण इंसुलिन के सामान्य/ इन विट्रो मेंकोशिकाओं के इंसुलिन के लिए जवाबदेही की डिग्री, एकेटी फास्फारिलीकरण द्वारा मापा, प्रेरण कॉकटेल का जवाब देने की क्षमता के साथ सहसंबंधी नहीं है । दिलचस्प है, इस प्रेरण कॉकटेल और प्रयोगात्मक शर्तों का उपयोग कर, सफेद और बेज रंग/ब्राउन कोशिकाओं का मिश्रण आकार और intracellular लिपिड बूंदों की संख्या और आणविक मार्करों की अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित के रूप में प्राप्त किया गया । यह सरल और लागत प्रभावी उत्तरदाता कोशिकाओं के phenotype के मात्रात्मक मूल्यांकन के साथ प्रेरण प्रोटोकॉल (सफेद बनाम बेज रंग) एजेंटों कि संभवतः विभेदित बेज रंग का संतुलन बदल सकते हैं की एक स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है : white adipocytes.
यह विधि भी मानव वसा ऊतक में संवहनी endothelial progenitors के adipogenesis के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए एक शोधों दृष्टिकोण प्रदान करता है । इस विशिष्ट अलगाव/भेदभाव तकनीक का प्रयोग, जांचकर्ताओं दुबला और मोटापे से ग्रस्त मनुष्यों में विभिंन वसा डिपो से संवहनी endothelial कोशिकाओं का एक सबसेट में adipogenesis के लिए जिंमेदार विभिंन रास्ते पूछताछ कर सकते हैं ।
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Protocol
पूर्वी वर्जीनिया मेडिकल स्कूल में संस्थागत समीक्षा बोर्ड समिति ने अध्ययन में प्रयुक्त मानव वसा ऊतक नमूनों के अनुसंधान और संग्रह को मंजूरी दी । मरीजों से कुशलक्षेम लिखित सहमति एकत्रित की गई ।
1. बफ़र्स, मीडिया, और उपकरणों की तैयारी
- एक Krebs घंटी तैयार बिकारबोनिट बफर समाधान (KRBBS): १३५ मिमी सोडियम क्लोराइड, 5 मिमी पोटेशियम क्लोराइड, 1 मिमी मैग्नीशियम सल्फेट, ०.४ मिमी पोटेशियम फॉस्फेट dibasic, ५.५ मिमी ग्लूकोज, 1 मिमी adenosine, ०.०१% एंटीबायोटिक/antimycotic मिश्रण (५० µ जी/ ५० µ g/streptomycin, 30 µ g/ml की gentamicin, 15 एनजी/एमएल के amphotericin) और 10 mM HEPES (pH = ७.४) । यह समाधान ऊतक संग्रह और पाचन के लिए ताजा हर बार तैयार है ।
- एक ताजा collagenase समाधान तैयार करें: collagenase के 1 मिलीग्राम/एमएल, KRBSS में 1, प्रकार; वसा के 3 मिलीलीटर/ ऊतक पाचन से पहले एक पानी स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस पर collagenase समाधान पूर्व गर्म ।
- एक CD34 सेल आइसोलेशन बफर तैयार करें: 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1 mM EDTA बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) में ।
- Adipogenesis मीडिया तैयार करें: DMEM/F12, 5% FBS, ५० µ g/ml/streptomycin, १.२५ µ l/एमएल के मानव इंसुलिन (5 µ g/एमएल या १४४ ंयू/एमएल), और ०.३६ µ l/एमएल के २.८ mM rosiglitazone (1 µ m) ।
- isopropanol के १०० मिलीलीटर में ओरो के ०.३ जी भंग करके एक ०.३% तेल लाल ओ (ओरो) शेयर समाधान (वजन/
2. वसा Stromal संवहनी अंश अलगाव
नोट: अध्ययन एक पार रुग्ण मोटापे से ग्रस्त प्रकार के अनुभागीय पलटन 2 मधुमेह (T2D) और गैर मधुमेह विषयों, आयु वर्ग के 18-65 साल, सेंट्रा चयापचय और वजन घटाने सर्जरी केंद्र (सेंट्रा चिकित्सा समूह, नॉरफ़ॉक, VA) में बैरिएट्रिक सर्जरी के दौर से गुजर शामिल थे. बहिष्करण मानदंड प्रकार सहित एक स्व-प्रतिरक्षित रोग शामिल 1 मधुमेह, क्रोनिक immunosuppressive थेरेपी, विरोधी भड़काऊ दवाओं, thiazolinendiones, सक्रिय तंबाकू का उपयोग, क्रोनिक या तीव्र संक्रमण, या एक इतिहास की आवश्यकता होती है स्थितियों द्रोह के पिछले 12 महीनों के भीतर इलाज किया । T2D एक उपवास के प्लाज्मा ग्लूकोज के रूप में परिभाषित किया गया था १२६ मिलीग्राम/डीएल या अधिक, एक ग्लूकोज की २०० मिलीग्राम/डीएल या अधिक के बाद एक 2 एच ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण, या मधुमेह दवाओं का उपयोग.
- मानव omental (ओम) और चमड़े के नीचे (अनुसूचित जाति) वसा ऊतक बैरिएट्रिक सर्जरी के दौर से गुजर मानव विषयों से ले लीजिए ।
- ओम और के साथ अलग शीशियों में है हांक बफर नमक समाधान युक्त ५० µ जी/streptomycin के साथ कमरे के तापमान पर तुरंत ऊतक निष्कर्षण के बाद पेनिसिलिन/
- सावधानी से साफ और ऊतक के fibrotic और cauterized वर्गों को हटाने ७०% इथेनॉल swabbed कैंची और चिमटी का उपयोग करके जब नमूना ऊतक निष्कर्षण के बाद प्रयोगशाला में आता है.
- वसा ऊतक वजन और यह 5 जी में विभाजन (या कम) collagenase पाचन के लिए aliquots ।
- पतले 5 ग्राम में एक collagenase समाधान के 5 मिलीलीटर में कमरे के तापमान पर एक जुटाना शीशी में, कैंची के दो जोड़े का उपयोग कर कीमा बनाया हुआ है ।
- 15 मिलीलीटर कुल के लिए कीमा बनाया हुआ ऊतक के लिए collagenase समाधान की एक अतिरिक्त 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
- 1 एच के लिए नमूनों को पचाने में, ३७ डिग्री सेल्सियस पर, निरंतर मिलाने के साथ एक पानी के स्नान में.
- एक 20 मिलीलीटर सिरिंज बंद टिप कट एक कुंद अंत बनाने के लिए ।
- एक २५० µm मेष से एक 9 सेमी x 9 सेमी वर्ग में कटौती और इसे आधे रास्ते में एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब कुंद अंत सिरिंज का उपयोग कर धक्का ।
- 20 मिलीलीटर कुंद अंत सिरिंज में नमूने डालो और २५० µm नायलॉन जाल के माध्यम से फ़िल्टर ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में adipocytes और stromal संवहनी कोशिकाओं अपच ऊतक से अलग करने के लिए ।
नोट: प्रति ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब से अधिक 5 जी का उपयोग न करें, के रूप में जाल अतिरिक्त fibrotic अपच सामग्री के कारण भरा हो जाएगा । - KRBBS के 10 मिलीलीटर के साथ जुटाना शीशी बाहर धोने और यह फिल्टर के माध्यम से डालने के लिए अवशिष्ट कोशिकाओं को इकट्ठा ।
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए फ़िल्टर किए गए नमूनों की मशीन ।
नोट: इस कदम के लिए adipocytes ट्यूब के शीर्ष पर नाव और stromal संवहनी कोशिकाओं के कुछ ट्यूब के तल पर बसने के लिए अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है । - एक 20 मिलीलीटर सिरिंज और pipetting सुई में एक 20 जी एक्स 6 का उपयोग करने के लिए stromal संवहनी अंश परत को हटाने और यह एक साफ ५० एमएल शंकु ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
- KRBBS के 10 मिलीलीटर जोड़ें और नमूने 5 मिनट के लिए बेंच पर बैठने के लिए अनुमति देते हैं, कमरे के तापमान पर ।
- दोहराएं चरण 2.12 – 2.14 दो बार ।
नोट: इन चरणों सुनिश्चित करेंगे कि वहां stromal संवहनी कोशिकाओं की कोई संदूषण फ़्लोटिंग adipocytes के साथ है । - आगे की प्रोसेसिंग के लिए बर्फ पर दोनों डिपो से stromal संवहनी भागों रखें, जैसा कि नीचे दिए गए चरणों में वर्णित है ।
नोट: 1 से अधिक एच के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को छोड़ मत करो, के रूप में यह सेल व्यवहार्यता पर प्रभाव पड़ सकता है । adipocytes लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में फ्लैश जम सकता है या प्रयोगों के लिए ताजा इस्तेमाल किया ।
3. वसा ऊतक Endothelial कोशिकाओं का अलगाव
- 5 मिनट के लिए ५०० x g पर stromal संवहनी अंशों (SVF), 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन ।
- केंद्रापसारक से नमूने निकालें और ध्यान से supernatant डालना; SVF कोशिकाओं युक्त गोली रखो ।
- धीरे से पंजाब के 5 मिलीलीटर में सेल छर्रों resuspend ।
नोट: यदि डिपो में एक से अधिक 5 जी एक से अधिक aliquots में संसाधित किया गया था (चरण २.४ देखें), कक्ष छर्रों एक साथ पूल. - 5 मिनट के लिए ५०० x g पर नमूनों स्पिन, 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
- supernatant निकालें, पंजाब के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend, और कोशिकाओं की गिनती ।
नोट: यहां, एक स्वचालित सेल काउंटर सेल गिनती के लिए इस्तेमाल किया गया था । सेल व्यवहार्यता एक acridine ऑरेंज के 12 µ एल के साथ सेल निलंबन के 12 µ एल मिश्रण द्वारा प्राप्त किया गया था/propidium आयोडाइड (ओ/PI) समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) । प्रत्येक डिपो के लिए पर प्रति ग्राम की कोशिकाओं की औसत संख्या है: (एक) ओम डिपो: १.६९ x 105 ± ४.५१ x 104; (ख) अनुसूचित जाति डिपो: १.२४ x 105 ± ६.४५ x 104। दोनों डिपो से कोशिकाओं की व्यवहार्यता था > 90% । - 5 मिनट के लिए ५०० x g पर नमूनों की गोली, 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
नोट: एक CD34 immunomagnetic चयन प्रोटोकॉल ( सामग्री की तालिकादेखें) कदम 3.7-3.15 के लिए अनुकूलित किया गया था । - CD34 अलगाव बफर के १०० µ एल में गोली resuspend ।
नोट: कुल कक्ष गणना निम्न re-suspension खंड की आवश्यकता होती है: (a) < 2 x 107 कक्ष: १०० µ l में गोली पुनः निलंबित; (ख) 2 x 108-5 x 108 कोशिकाओं: 1 मिलीलीटर में गोली resuspend । चरण 3.9 – में, उपयोग किए गए एजेंट के वॉल्यूम नीचे < 2 x 107 कक्षों के लिए स्केल किए गए थे । - CD34 कॉकटेल के 10 µ एल जोड़ें और 15 मिनट के लिए नमूना मशीन, कमरे के तापमान पर ।
- चुंबकीय मोतियों की 5 µ एल जोड़ें और 10 मिनट के लिए नमूना मशीन, कमरे के तापमान पर ।
- प्रत्येक नमूने के लिए CD34 अलगाव बफर के २.५ मिलीलीटर जोड़ें और चुंबक में नमूनों जगह, 5 मिनट के लिए, कमरे के तापमान पर ।
- 5 एस के लिए चुंबक पलटना अलगाव बफर बंद डालो ।
- चुंबक से नमूने निकालें और दोहराएँ चरण ३.१० और ३.११ 4x.
- चुंबक से ट्यूब निकालें और CD34 अलगाव बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर, 5 मिनट के लिए ५०० x g पर कोशिकाओं गोली ।
- CD34 आइसोलेशन बफ़र के 1 मिलीलीटर में कक्ष छर्रों resuspend और कोशिकाओं की गणना ।
नोट: यहां, के प्रति ग्राम की कोशिकाओं की औसत संख्या है: (क) ओम डिपो: ४.७५ x 104 ± ३.३६ x 104; (ख) अनुसूचित जाति डिपो: १.०६ x 104 ± ९.५३ x 103। एक CD31 प्लास्टिक immunobead प्रोटोकॉल कदम के लिए अनुकूलित किया गया था-3.34 ( सामग्री की तालिकादेखें) । - 5 मिनट के लिए ५०० x जी में गोली कोशिकाओं और बफर बी और २५० µ एल की धो बफर के २५० µ एल में गोली resuspend ।
- अच्छी तरह से ट्यूब भंवर द्वारा CD31 मोती resuspend ।
- CD31 मोतियों की 20 µ एल जोड़ें ।
नोट: कुल सेल गणना के कारण > 1 x 106, मात्रा निर्माता के इनपुट के अनुसार स्केल किया गया था । - कमरे के तापमान पर, 30 मिनट के लिए कमाल के साथ नमूना मशीन ।
- एक बाँझ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए एक छलनी संलग्न ।
नोट: छलनी के बड़े उद्घाटन शीर्ष पर होना चाहिए । - सेल जुदाई से पहले, छलनी equilibrate करने के लिए 1 मिलीलीटर धोने बफर जोड़ें । दबाव के लिए कदम ३.१६ के तहत उत्पंन मिश्रण लागू करें ।
- 20 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए एक परिपत्र गति में धोने बफर के 5 मिलीलीटर के साथ छलनी धो लो । एक बाँझ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए कनेक्टर अनुलग्न करें और luer-lock बंद करें ।
- कनेक्टर के लिए छलनी अनुलग्न करें । छलनी की दीवार के साथ धोने बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें । छलनी की दीवार के साथ सक्रिय बफर डी के 1 मिलीलीटर जोड़ें । धीरे से नमूना भंवर और यह 10 मिनट के लिए गर्मी, कमरे के तापमान पर ।
- 1 मिलीलीटर की धुलाई बफ़र जोड़ें । ऊपर और नीचे 10x pipetting द्वारा मोतियों से कोशिकाओं को अलग करें ।
नोट: हवा के बुलबुले पैदा करने से बचें । - luer-ताला खोलो और अलग कोशिकाओं ५० एमएल शंकु ट्यूब में प्रवाह करने के लिए अनुमति देते हैं । धोने के बफर के 1 मिलीलीटर के साथ 10x छलनी हर बार ।
- कनेक्टर और छलनी त्यागें और नमूने ३०० x g पर 10 मिनट के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक । संस्कृति के लिए पूरा ईजीएम-2 मीडिया के 2 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend ।
नोट: पर इस बिंदु पर प्रति ग्राम कक्षों की औसत संख्या है: (a) ओम डिपो: ५.९२ x 103 ± ४.२७ x 103; (ख) अनुसूचित जाति डिपो: ४.१२ x 103 ± २.१ x 103। दोनों डिपो से कोशिकाओं की व्यवहार्यता ९०% से अधिक था ।
4. पृथक Endothelial कोशिकाओं में Adipogenesis की प्रेरण
- 6-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति में कोशिकाओं को विकसित-पूर्ण ईजीएम के साथ प्लेटों का इलाज किया-एक ३७ डिग्री सेल्सियस में 2 मीडिया, 5% CO2 मशीन । मीडिया की जगह हर 3-4 दिन तक कोशिकाओं तक पहुंच 80 – 90% संगम.
नोट: जनसंख्या दोहरीकरण 2 के बीच है-3 दिन । - उन्हें १०० mm पेट्री व्यंजन पर चढ़ाना और कोशिकाओं 1:3 एक बार विभाजित करके कोशिकाओं का विस्तार करें । इस स्तर पर, कोशिकाओं 2 बीतने पर हैं ।
- स्वचालित कक्ष काउंटर ( सामग्री तालिकादेखें) का उपयोग करके कक्ष गिनना.
- बीज लगभग 100-200000 कोशिकाओं में 6-अच्छी तरह से प्रत्येक डिपो और उंहें पूरा ईजीएम में संस्कृति के लिए डुप्लिकेट कुओं सुनिश्चित करने के प्लेटें 2 दिनों के लिए 2 मीडिया ।
- किसी भी विकास मीडिया बंद महाप्राण और यह DMEM/F12 के साथ 2 मिलीलीटर की जगह 5% FBS और ५० µ g/ml/streptomycin के नियंत्रण कोशिकाओं के लिए और यह Adipogenesis मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ बदलें (चरण १.४ देखें) उपचार कोशिकाओं के लिए ।
- 13 दिनों के लिए एक humidified 5% CO2 मशीन में ३७ ° c में कोशिकाओं की मशीन, संबंधित मीडिया की जगह हर 3 से 4 दिन ।
नोट: कोशिकाओं के उपचार के 4 दिनों के बाद लिपिड जमा करने के लिए शुरू हो जाएगा । - आचरण ओरो और नील नदी लाल धुंधला प्रकाशित तरीकों के अनुसार15-17।
- एक आरएनए निष्कर्षण के लिए कोशिकाओं को अलग करने के लिए, 6-अच्छी तरह से प्रेरण प्लेटों से मीडिया को हटा दें और इसे बाँझ पंजाबियों के 1 मिलीलीटर से धो लें ।
- एक guanidium thiocyanate के ३५० µ एल जोड़ें-phenol-क्लोरोफॉर्म समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए एक अच्छी तरह से और 5 के लिए कमरे के तापमान पर यह गर्मी-10 मिनट ।
- एक सेल खुरचनी का उपयोग कर प्लेट बंद कोशिकाओं परिमार्जन और एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण ।
नोट: नमूने एक बाद की तारीख में आरएनए निष्कर्षण और आगे प्रसंस्करण के लिए-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत किया जा सकता है । - एक अनुकूलित आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल का उपयोग नमूनों से mRNA निकालें ( सामग्री की तालिकादेखें).
- निम्न जांचों का उपयोग करके जीन व्यंजक का आकलन करने के लिए एक रीयल-टाइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (RT-पीसीआर) निष्पादित करें: adiponectin, UCP-1 और CIDEA ( सामग्री की तालिकादेखें).
नोट: यहां, RT-पीसीआर प्रक्रियाओं को निम्न मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करके किया गया था: विकार (९५ ° c; 15 एस), एनीलिंग, और विस्तार (६० ° c; 1 min) ४० चक्र के लिए. नमूनों कि सीटी मूल्यों के साथ जीन व्यक्त > 35 undetect माना जाता था ।
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Representative Results
हमारे प्रोटोकॉल के लिए एक इन विट्रो दृष्टिकोण में प्रदान करना है CD34 + CD31 के adipogenic क्षमता का निर्धारण करने के लिए मानव वसा ऊतक के विभिंन डिपो से संवहनी कोशिकाओं + । चित्र 1aमें सरलीकृत फ़्लोचार्ट आरेख दिखाया गया है । CD34 व्यक्त कोशिकाओं का एक सकारात्मक चयन का उपयोग कर पहला कदम में परिणाम > ९५% CD34 + कोशिकाओं हौसले से अलग कोशिकाओं की जनसंख्या में (आंकड़ा 1a). महत्वपूर्ण बात, इस मार्कर के बाद कोशिकाओं को मार्ग के एक जोड़े के लिए संस्कृति रहे है खो दिया है । चूंकि CD34 विविध टेम और गैर-टेम progenitors के लिए एक आम मार्कर है, endothelial progenitors की जुदाई के लिए आवश्यक निम्न चरण CD31 + सेल जनसंख्या (आंकड़ा 1a) से बाहर CD34 + कोशिकाओं के सकारात्मक चयन है । हालांकि CD31 endothelial कोशिकाओं के लिए एक मार्कर है, यह भी टेम कोशिकाओं के सबसेट पर पाया जा सकता है । हम दोनों omental और प्रवाह cytometry द्वारा चमड़े के नीचे वसा से कई तैयारियों का विश्लेषण किया और लगातार पाया कि CD34 + CD31 + कोशिकाओं CD45 मार्कर (आंकड़ा 1b, शीर्ष पैनलों) व्यक्त नहीं करते । सामांयतया, < 1% कक्षों में कुल कक्ष जनसंख्या से CD45 धनात्मकता दिखाई देती है । यह परिणाम हमें निष्कर्ष है कि हम की संभावना एक तैयारी वस्तुतः टेम progenitors से मुक्त प्राप्त करने के लिए नेतृत्व किया । निर्धारित करने के लिए यदि कोशिकाओं adipocyte स्टेम सेल मार्कर CD24 व्यक्त करते हैं, हम दोनों omental और चमड़े के नीचे डिपो से कोशिकाओं का विश्लेषण किया और पाया कि लगभग कोई कोशिकाओं omental डिपो में CD24 मार्कर व्यक्त (आंकड़ा 1b, नीचे पैनलों) और से कम 5% कोशिकाओं के चमड़े के नीचे डिपो में मार्कर व्यक्त (नहीं दिखाया गया है) । समाप्त करने के लिए, इस जुदाई पद्धति का उपयोग कर, हम CD34 प्राप्त + CD31 + CD45-CD24-दोनों omental और मोटापे से ग्रस्त विषयों के चमड़े के नीचे डिपो से कोशिकाओं ।
एक CD31 एंटीबॉडी के साथ प्लास्टिक मोतियों संयुग्मित का प्रयोग, हम जल्दी मार्ग के दौरान cobblestone endothelial आकृति विज्ञान प्रदर्शित कोशिकाओं को प्राप्त किया, के रूप में एक संयुग्मित CD31 है कि एक प्रदर्शित के साथ चुंबकीय मोती एंटीबॉडी का उपयोग कर अलग कोशिकाओं का विरोध धुरी के आकार का mesenchymal phenotype के तुरंत बाद जुदाई (चित्रा 2a) । आगे CD34 + CD31 + कोशिकाओं के endothelial पहचान पुष्ट करने के लिए, हम दो कार्यात्मक परख प्रदर्शन: दिी के एक-एसी-एलडीएल और एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (मैट्रिक्स hereon के रूप में निर्दिष्ट) इन विट्रो मेंट्यूब गठन । CD34 + CD31 + कोशिकाओं दिी के साथ मशीन-एसी-एलडीएल थे और कोशिकाओं के महान बहुमत (चित्रा 1C) के लिए सकारात्मक थे । एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, हम एक मानव वसा ऊतक microvascular endothelial प्राथमिक सेल लाइन (HAMVEC) है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है (सामग्री और चित्रा 1C की तालिका देखें) का इस्तेमाल किया । हम यह भी परीक्षण किया है कि CD34 + CD31 + कोशिकाओं को इस तरह की कोशिकाओं की क्षमता का निर्धारण करने के लिए संवर्धन के बाद अपने endothelial समारोह बनाए रखने के रूप में सहज पोत इन विट्रो मेंसंरचनाओं की तरह, एक 3d मैट्रिक्स में । 3 मार्ग के बाद, CD31 + CD34 + रूपों ट्यूबलर पोत एक HAMVEC प्राथमिक मानव endothelial सेल लाइन (चित्रा 1 डी) के लिए तुलनीय एक मैट्रिक्स में संरचनाओं की तरह ।
2-3 मार्ग के लिए कोशिकाओं के विस्तार के बाद, हम ईजीएम से कोशिकाओं बंद-2 पूर्ण DMEM/F12 मीडिया में प्रो angiogenic विकास कारकों युक्त मीडिया 5% FBS, rosiglitazone (1 µ m) और इंसुलिन (१४४ म्यू/एमएल) के साथ पूरक । ईजीएम में कोशिकाओं को बनाए रखने-2 पूरा मीडिया नाटकीय रूप से उनके adipogenic भेदभाव कम कर दिया । इसके अलावा, डेक्समेतएसॉनी और 3 के एक अतिरिक्त-isobuthyl-1-methylxanthine मीडिया के लिए दर में परिवर्तन नहीं किया और लिपिड संचय और indomethacin के एक अतिरिक्त की हद तक काफी कम लिपिड संचय (नहीं दिखाया गया है) । इन प्रारंभिक प्रयोगों के आधार पर, हम केवल adipogenic प्रेरण के लिए rosiglitazone और इंसुलिन का उपयोग करने का फैसला किया । adipogenic मीडिया में संस्कृति के 14 दिनों के बाद, कोशिकाओं को स्थिर और तेल लाल हे या नील लाल के साथ दाग और नाभिक थे DAPI (चित्रा बी1) के साथ counterstained थे । आंकड़ों में, प्रतिनिधि छवियों युग्मित चमड़े के नीचे से अलग कोशिकाओं (अनुसूचित जाति) (आंकड़ा 2बी, शीर्ष पैनलों) और omental (ओम) (चित्रा2बी, नीचे पैनलों) 37 के बीच एक बीएमआई के साथ तीन मानव विषयों के वसा ऊतक-45 kg/ कृपया ध्यान दें कि प्रेरण के लिए प्रतिक्रिया विषयों और एक ही विषय के डिपो के बीच के बीच व्यापक रूप से भिंन होता है । के रूप में चित्र बीएक में फ्लोरोसेंट छवि में देखा, unilocular की एक मिश्रित जनसंख्या (लाल तीर) और multilocular (सफेद तीर) लिपिड युक्त कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं है कि लिपिड जमा नहीं करते (पीले तीर) आम तौर पर मौजूद हैं । इन कोशिकाओं की संख्या के बीच अनुपात भी उच्च चर विषय और मूल के डिपो के साथ है । लिपिड युक्त कोशिकाओं के प्रतिशत का एक ठहराव (तेल लाल ओ धनात्मकता के आधार पर) कुल कोशिकाओं से बाहर (DAPI-सना हुआ नाभिक पर आधारित) अनुसूचित जाति और एक ही व्यक्ति के ओम डिपो के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर दिखा, एससी डिपो से कोशिकाओं के साथ adipogenic प्रेरण (चित्रा 2c) के लिए और अधिक उत्तरदाई होने के नाते । एक ही विषय के विषयों और डिपो के बीच जवाब में विविधता के लिए स्पष्टीकरण स्पष्ट नहीं है । हालांकि, हम सोचते है कि संभावना है कि सेल की आबादी की आंतरिक प्रकृति से संबंधित है कि vivo phenotype/वातावरण में और अलगाव प्रोटोकॉल में परिवर्तनशीलता के कारण नहीं के फिंगरप्रिंट वहन करती है ।
यह पुष्टि करने के लिए कि कोशिकाओं को परिपक्व adipocytes के लिए भेदभाव से गुजरा, हम पैन की जीन अभिव्यक्ति मापा-adipocyte मार्कर adiponectin और भूरे रंग/बेज मार्कर UCP-1 और CIDEA की adipogenic प्रेरण की तुलना में 13 दिनों के बाद कोशिकाओं में अन-प्रेरित नियंत्रण कक्ष । adiponectin अभिव्यक्ति नियंत्रण (चित्रा 2d) की तुलना में विभेदित कोशिकाओं में १०,०००-गुना तक बढ़ गया था । CIDEA और UCP1 के जीन अभिव्यक्ति adipogenic उत्तेजना (चित्रा 2d) के बाद कोशिकाओं में ही detectable था । विशेष रूप से, UCP-1 अभिव्यक्ति उच्च चर था, सफेद के विभिंन अनुपात को दर्शाती है: भूरे रंग की कोशिका जनसंख्या के भीतर/ गृह व्यवस्था जीन RPL27 की अभिव्यक्ति सीटी के बीच 18-20 चक्र और कोई महत्वपूर्ण मतभेदों को लेकर मूल्यों के साथ नमूनों के बीच संगत उल्लेखनीय था कि adipogenic भेदभाव से गुजरा और कोशिकाओं के बीच पाया गया अनुपचारित नियंत्रण । हम भी एक mitochondrial स्थानीयकरण (चित्रा 2E) का सुझाव है कि एक punctated पैटर्न में बहु-locular phenotype, प्रदर्शित कोशिकाओं में एक UCP-1 प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता चला. UCP-1 प्रोटीन कोशिकाओं है कि लिपिड या कोशिकाओं में एकाधिक, बहुत छोटी बूंदों है कि संभावना पूरी तरह से विभेदित नहीं adipocytes (चित्रा 2E) के साथ जमा नहीं किया था में detectable नहीं था ।
हमारी टिप्पणी है कि CD34 + CD31 + कोशिकाओं के adipogenic क्षमता डिपो है विशिष्ट और विभिंन विषयों के बीच उच्च चर हमें प्रेरित बीएमआई, उंर के साथ संभावित सहसंबंध के लिए की तलाश करने के लिए, और HbA1c । 28 नमूनों के परीक्षण के बीच, हम adipogenic क्षमता और उम्र या बीएमआई के बीच किसी भी महत्वपूर्ण संबंध नहीं मिला; हालांकि, हम ओम डिपो (चित्रा 3ए) से कोशिकाओं में HbA1c और लिपिड संचय के बीच एक महत्वपूर्ण नकारात्मक संबंध मिल गया । यह खोज पुरानी hyperglycemic पर्यावरण के साथ एक संभावित कड़ी इंगित करता है और भविष्य की जांच के हकदार हैं । यह भी पता चलता है कि CD34 + CD31 + कोशिकाओं की संभावना उनके एक adipogenic प्रेरण का जवाब करने की क्षमता के vivo हस्ताक्षर में ले । हम यह भी बताते है कि इन कोशिकाओं को एक इन विट्रो इंसुलिन उत्तेजना (चित्र बी, ऊपर) के बाद एकेटी फास्फारिलीकरण के चर स्तर प्रदर्शन । हालांकि, प्रतिक्रिया में इस परिवर्तनशीलता अच्छी तरह से एक adipogenic भेदभाव से गुजरना करने की क्षमता के साथ सहसंबंधी नहीं है के रूप में तेल लाल ओ धुंधला मिलान नमूनों की तस्वीरों में दिखाया गया है (चित्र बी, नीचे) ।
चित्रा 1: पृथक्करण और CD34 के लक्षण वर्णन + CD31 + कोशिकाओं मानव वसा ऊतक से । (A) यह फ़्लोचार्ट आरेख अलगाव और विभेद के प्रमुख चरण दिखाता है । CD34 चुंबकीय मोतियों का उपयोग सकारात्मक चयन के बाद, > हौसले से पृथक कोशिकाओं के 95%, दूसरे चयन चरण से पहले, CD34 + हैं. (ख) इस प्रतिनिधि प्रवाह cytometry लाइव सेल जनसंख्या के लिए एक आगे बिखरे हुए भूखंड gated से पता चलता है; FITC (BluFl2) चैनल पर एक दाग नमूना; और शीर्ष पर एक प्रतिनिधि omental नमूना के CD45 धुंधला । नीचे शीर्ष पर दिखाए गए के रूप में एक ही क्रम से पता चलता है, लेकिन omental नमूना से CD24 (Alexafluor ६४७-लेबल) कोशिकाओं के लिए. (ग) ये प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ शो दिी के एक-एसी-एलडीएल (red) CD34 + CD31 + कोशिकाओं के बाद 4 इन विट्रो में मशीन (शीर्ष पैनल) के एच । इसी तरह के एक तीनो एक मानव वसा ऊतक microvascular endothelial सेल प्राथमिक सेल लाइन (HAMVEC) (नीचे पैनल) में पाया गया था । नाभिक नीले DAPI द्वारा दिखाए जाते हैं । (घ) ये प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ एक इन विट्रो ट्यूब CD34 के गठन + CD31 + कोशिकाओं एक 3d मैट्रिक्स में वरीयता प्राप्त । CD34 + CD31 + कोशिकाओं (गद्यांश 3) 24-well प्लेट्स में FITC-calcein के साथ एक दाग के बाद और पूरा endothelial सेल मीडिया में 4 ज के लिए दिया गया । कोशिकाओं को एक औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर imaged थे । HAMVEC, एक ही घनत्व पर वरीयता प्राप्त, तुलना के लिए इस्तेमाल किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: Adipogenic प्रेरण और CD34 + CD31 + कोशिकाओं के मार्करों । (क) ये प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ CD34 + CD31 + कोशिकाओं CD31 + चुंबकीय मोतियों बनाम CD31 + प्लास्टिक मोतियों के साथ एक सकारात्मक चयन का उपयोग कर अलग के बीच सुघड़ मतभेदों को दिखाते हैं । कोशिकाओं के अलगाव के बाद 1 गद्यांश में imaged थे । आवर्धन का उपयोग 100X है । (ख) इन पैनलों के प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ है तेल लाल हे सना हुआ CD34 + CD31 + कोशिकाओं से युग्मित चमड़े (अनुसूचित जाति) और omental आंत (ओम) के नमूने 3 विभिन्न विषयों के. कोशिकाओं 2 ईजीएम में 3 मार्ग-2 पूरा मीडिया के लिए, तो DMEM/F12 मीडिया पर बंद 5% FBS के साथ और इंसुलिन के साथ इलाज किया गया (१४४ म्यू/एमएल) और 14 दिनों के लिए rosiglitazone (1 µ m), मीडिया के साथ हर 3 दिन बदल गया । आवर्धन का उपयोग 100X है । प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवि adipo लाल लिपिड बूंदों (हरा) और DAPI परमाणु धुंधला (नीला) से पता चलता है । unilocular लिपिड (लाल तीर), multilocular लिपिड बूंदें (सफेद तीर), या कोशिकाओं है कि कोई लिपिड संचय (पीला तीर) दिखाने के लिए युक्त कोशिकाओं का मिश्रण कृपया ध्यान दें । आवर्धन का उपयोग किया जाता है 200X, स्केल बार = ५० µm । (ग) इस पैनल के तेल लाल ओ (ओरो) सकारात्मक कोशिकाओं को सामान्यीकृत कुल DAPI-सना नाभिक के रूप में व्यक्त adipogenic क्षमता का एक ठहराव से पता चलता है । CD34 + CD31 + एक ही विषय के ओम और अनुसूचित जाति डिपो से कोशिकाओं एक युग्मित छात्र टी परीक्षण (n = 7) द्वारा adipogenic क्षमता में एक महत्वपूर्ण अंतर दिखा । (घ) परिपक्व adipocyte मार्करों (adiponectin, UCP-१, और CIDEA) की जीन अभिव्यक्ति को adipogenic प्रेरण और नियंत्रण कक्षों में १४ दिनों के बाद कोशिकाओं में आरटी-पीसीआर द्वारा मापा गया था. डेटा adiponectin जीन अभिव्यक्ति के लिए एक गुना परिवर्तन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । नियंत्रण के नमूनों में CIDEA और UCP-1 की अभिव्यक्ति का पता नहीं था । मूल्यों ΔCt एक गृह व्यवस्था जीन के रूप में RPL27 को सामान्यीकृत प्रतिनिधित्व करते हैं । RLP27 के लिए सीटी मान विश्लेषण (n = 3 – 5 विषयों) में शामिल सभी नमूनों के लिए 18 – 20 चक्रों के बीच थे । डेटा अर्थ ± एसडी के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । एक युग्मित छात्र के टी परीक्षण डेटा के एक सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था । p < 0.05 नल परिकल्पना को अस्वीकारता है । (ङ) यह पैनल इंसुलिन और rosiglitazone के साथ प्रेरण के 13 दिनों के बाद CD34 + CD31 + कोशिकाओं में UCP-1 की प्रोटीन अभिव्यक्ति दिखाता है. Immunocytochemistry का उपयोग करते हुए मानव polyclonal UCP-1 एंटीबॉडी ने बहु-UCP locular में adipocytes-1 की चयनात्मक अभिव्यक्ति दिखाई । पता लगाने के एक rhodamine-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (लाल) और नाभिक के लिए DAPI धुंधला (नीला) का उपयोग कर हासिल किया गया था । इनसेट में बड़ा इज़ाफ़ा punctated लाल UCP-1 (लाल तीर) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विभिंन कोशिका नाभिक (एन) आसपास के आकारों के कई लिपिड बूंदों (LD) के लिए इसी संकेत दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: adipogenic विभेद, HbA1c और इन विट्रो इंसुलिन सिगनल के बीच सहसंबंध । (A) स्पीमरन (non-पैरामीट्रिक) और पियरसन (पैरामीट्रिक) के लिए सहसंबंध गुणांक OM और SC कक्षों, क्रमशः, HbA1c और लिपिड संचय (n = 20) के बीच सहसंबंध निर्धारित करने के लिए उपयोग किए गए थे । p < 0.05 के लिए नल परिकल्पना अस्वीकृत कर दी गई थी । (ख) शीर्ष पर, एक पश्चिमी सोख्ता से पता चलता है phosphorylated एकेटी (हरा) और CD34 में कुल एकेटी (लाल) अभिव्यक्ति + CD31 + कोशिकाओं के लिए 5 एनएम इंसुलिन के साथ इन विट्रो में उत्तेजित adipogenic प्रेरण (n = 8) से पहले 30 मिनट. नीचे, एक तेल लाल हे धुंधला एक ही कोशिकाओं के 14 दिनों के लिए adipogenic प्रेरण निंनलिखित दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
इस कागज का ध्यान अलगाव, विस्तार और CD34 + CD31 के adipogenic प्रेरण के लिए एक पद्धति प्रदान करना है + endothelial कोशिकाओं आंत और मानव वसा ऊतक के चमड़े के नीचे डिपो से ।
तरीके से कुतर या मनुष्यों के विभिंन संवहनी बिस्तरों से endothelial कोशिकाओं के अलगाव के लिए सूचित किया गया है कि मुख्य रूप से तकनीक शामिल CD31 एंटीबॉडी का उपयोग या तो फ्लोरोसेंट लेबल या चुंबकीय मोतियों को युग्मित18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23. इन अलगाव तकनीकों के सार्वभौमिक उपयोग के लिए एक प्रमुख चुनौती अलग संवहनी बिस्तरों में endothelial कोशिका आबादी के विविधता और fibroblasts और संवहनी भित्ति कोशिकाओं के साथ संक्रमण के उच्च जोखिम है । हालांकि, इस तरह के संदूषणों से बचने के लिए अलगाव तकनीकों के शोधन24सूचित किया गया है । इन तकनीकों का प्रयोग, ज्यादातर परिपक्व endothelial कोशिकाओं के ऊतकों से अलग कर रहे हैं । वसा ऊतक endothelial progenitors25,26सहित स्टेम/जनक कोशिकाओं का एक बड़ा जलाशय है । कुछ कागजात CD34 + और CD31 + एंटीबॉडी11,27का एक संयोजन का उपयोग कर मानव वसा ऊतक से endothelial कोशिकाओं की शुद्धि की सूचना दी । कोशिकाओं है कि दो मार्करों एक्सप्रेस परिपक्व endothelial कोशिकाओं और endothelial progenitors11,28,29की एक मिश्रित जनसंख्या हैं । कई हाल ही में प्राथमिक पत्रों की रिपोर्ट है कि endothelial के एक छोटे सबसेट (CD31 +) या भित्ति वसा vasculature में (PDGFRβ +) कोशिकाओं adipocyte progenitors5,30का एक समृद्ध स्रोत है । adipogenic क्षमता के साथ इन संवहनी कोशिकाओं दोनों सफेद या भूरे रंग/बेज adipocytes उत्पादन कर सकते हैं और वसा vasculature5में सक्रिय angiogenesis के साथ जुड़े रहे हैं । इन निष्कर्षों को नई चिकित्सकीय अवसर प्रदान करने के लिए मोटापा और/या संवहनी progenitors से thermogenic adipocytes उत्पादन से वजन घटाने प्रेरित में चयापचय प्रदर्शन में सुधार कर सकते हैं । यह है, इसलिए, ब्याज की आसान और आर्थिक अलगाव, विस्तार, और मानव वसा ऊतक से संवहनी endothelial कोशिकाओं की adipogenic क्षमता के आकलन के लिए एक पद्धति की पहचान करने के लिए ।
CD34 + CD31 + मानव चमड़े के नीचे और omental आंत वसा ऊतक डिपो से कोशिकाओं को पहले उनके angiogenic क्षमता के आधार पर विशेषता थे, भड़काऊ मध्यस्थों के उत्पादन, उनके वार्धक्य मार्करों, और अन्य कार्यों11 , 31. हालांकि, ऐसी कोशिकाओं की adipogenic क्षमता के लिए कोई प्रमाण प्रकाशित नहीं किया गया है । पिछले प्रकाशनों कि अलग CD34 + CD31 + कोशिकाओं से डेटा पर चुंबकीय मोतियों की रिपोर्ट का उपयोग कर कक्षों विषयों की एक बड़ी संख्या (10 या अधिक)11से परित । यह कागज पहली बार सफल अलगाव और CD34 के विस्तार के लिए एक प्रोटोकॉल + CD31 दोनों उपचर्म और omental डिपो से एकल मानव दाताओं से कोशिकाओं के लिए रिपोर्ट । हम अलग और विस्तारित कोशिकाओं के रूप में के रूप में छोटे वसा ऊतक के 2-3 जी । CD34 + CD31 + कोशिकाओं कुल SVF कोशिकाओं का 3-5% का प्रतिनिधित्व किया और अलगाव के बाद प्रदर्शित > 90% व्यवहार्यता । इन कोशिकाओं को अत्यधिक प्रफलन थे और adipogenic भिंनता के प्रति प्रतिक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में दिखाया एक के बाद इन विट्रो rosiglitazone और इंसुलिन के साथ उत्तेजना । पिछले अध्ययन केवल मानव वसा ऊतक से वसा स्टेम कोशिकाओं या कुल stromal संवहनी अंश का परीक्षण करने के लिए adipogenic प्रतिक्रियाएं4,३२,३३,३४का उपयोग किया । एक ताजा अध्ययन मानव वसा ऊतक के microvasculature से एकल सेल निलंबन का इस्तेमाल किया है, लेकिन यह स्पष्ट नहीं है कि विभेदित adipocytes3प्रकृति में भित्ति या endothelial थे ।
CD34 के अतिरिक्त immunophenotyping + CD31 + प्रवाह cytometry का उपयोग कर कोशिकाओं CD45 और CD24 मार्करों की अपनी कमी के मूल के अपने डिपो की परवाह किए बिना दिखाया । महत्वपूर्ण बात, हमें पता चला है कि संस्कृति में 3 मार्ग के बाद, CD31 + CD34 + कोशिकाओं को बनाए रखने के अपने endothelial कार्यक्षमता acetylated एलडीएल के संचय और एक 3 डी मैट्रिक्स में इन विट्रो ट्यूब गठन के द्वारा प्रदर्शन किया । इसके अलावा, विभेदित adipocytes एक UCP-1 प्रोटीन अभिव्यक्ति सहित उनकी आकृति विज्ञान और आणविक मार्करों के आधार पर सफेद और बेज रंग की एक मिश्रित जनसंख्या/ चूहों में पिछले अध्ययनों से पता चला है कि वसा ऊतक vasculature दोनों सफेद और भूरे रंग के adipocytes का एक स्रोत हो सकता है5,30 और अधिक हाल के डेटा सफेद और कार्यात्मक के भेदभाव के संबंध में एक समान परिणाम दिखाया thermogenic बेज कोशिकाओं से मानव वसा vasculature3.
सबसे प्रकाशनों के विपरीत है कि adipogenic मेंprogenitors की एक सीमा से adipocyte भेदभाव के लिए कई अवयवों से युक्त कॉकटेल का इस्तेमाल किया, हमने पाया है कि rosiglitazone और इंसुलिन आवश्यक है और adipogenic के लिए पर्याप्त है CD34 + CD31 + कोशिकाओं की प्रेरण । जब तक हम जानते है कि अकेले rosiglitazone गैर में एक लिपिड संचय पैदा कर सकते है वसा कोशिकाओं३५, पैन के लिए आणविक हस्ताक्षर-adipocyte और ब्राउन/बेज रंग adipocyte मार्करों, एक UCP-1 चयन कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति सहित, परिपक्व की पुष्टि विभेदित कोशिकाओं के कुछ adipocyte phenotype । हमारे दो संघटक adipogenic कॉकटेल प्रक्रिया प्रोटोकॉल सरल और यह अधिक लागत प्रभावी बनाता है ।
एक महत्वपूर्ण अवलोकन यह था कि CD34 + CD31 + कोशिकाओं की adipogenic प्रतिक्रिया दाता विषय और वसा डिपो के साथ अत्यधिक परिवर्तनशील थी. जबकि डिपो वसा स्टेम सेल या stromal संवहनी progenitors के adipogenic प्रतिक्रियाओं में विशेष मतभेद पहले३२,३४, इस तरह के एक प्रतिक्रिया के विषय परिवर्तनशीलता सूचित किया गया है एक उपंयास अवलोकन है । बाहर 20 मानव नमूनों का विश्लेषण किया, 3 अनुसूचित जाति और 7 ओम कोशिकाओं adipogenic प्रेरण का जवाब नहीं दिया । सबसे मजबूत प्रतिक्रियाओं से पता चला > 90% अनुसूचित जाति से 4 नमूनों के लिए प्रेरण के लिए उत्तरदायी कोशिकाओं के और ओम से 2 नमूनों के लिए. दिलचस्प है, हमने पाया है कि जवाबदेही नकारात्मक HbA1c के साथ संबंधित है और एक में प्रतिक्रिया के साथ सहसंबंधी नहीं है इन विट्रो में विभेदित कोशिकाओं में इंसुलिन उत्तेजना होती है । हम तर्क है कि प्रतिक्रिया में अंतर तकनीक के गरीब reproducibility के कारण नहीं है बल्कि कोशिकाओं के व्यक्तिगत फिंगरप्रिंट कि vivo प्रतिक्रियाओं में नकल को दर्शाता है । इस अंतर प्रतिक्रिया के संरक्षण के आगे सत्यापन की आवश्यकता है और vivo मेंadipogenesis को उत्तेजित करने के उद्देश्य से चिकित्सा के लिए जवाबदेही के लिए एक अपेक्षाकृत आसान स्क्रीनिंग विधि का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । आगे adipogenic क्षमता में व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता के स्रोत को समझने के लिए, अतिरिक्त immunophenotyping CD34 + CD31 + जनसंख्या है कि एक विशिष्ट adipocyte जनक समारोह भालू के भीतर सेल उपजनसंख्या की पहचान करने के लिए आवश्यक है ।
इस प्रोटोकॉल की सीमाओं में से कुछ कोशिका आबादी का एक अधूरा लक्षण वर्णन शामिल हैं; अपेक्षाकृत लंबा विस्तार और भेदभाव बार (2 सप्ताह + 2 सप्ताह); मानव नमूनों तक पहुंचने और हौसले से एकत्र ऊतकों के तत्काल प्रसंस्करण की आवश्यकता के लिए संभावित सीमाएं; और विभेदित कोशिकाओं के लिए कार्यात्मक डेटा की एक मौजूदा कमी है । वहां इस पद्धति है कि एक reproducible और नहीं श्रम गहन प्रोटोकॉल शामिल के कई फायदे हैं; वे कोशिकाएं जो वीवो phenotype में उनके फ़िंगरप्रिंट की संभावना रखती हैं; अपेक्षाकृत कम लागत के साथ ऊतकों की बहुत छोटी मात्रा से कोशिकाओं के विस्तार; कोशिकाओं को cryopreserve और पुनः संस्कृति के बाद उनके adipogenic हस्ताक्षर बनाए रखने की संभावना; और विकल्प इन कोशिकाओं के खजाने उत्पंन करने के लिए इतना है कि वे भविष्य स्क्रीनिंग या अंय प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
इस प्रोटोकॉल और CD34 + CD31 + एक अंतिम परिणाम के रूप में प्राप्त कोशिकाओं दोनों यंत्रवत अध्ययन के लिए और स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए एक शोधों मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक बेकी Marquez, सेंट्रा बैरिएट्रिक केंद्र में नैदानिक समंवयक, रोगी स्क्रीनिंग और सहमति की प्रक्रिया के साथ उसकी सहायता के लिए स्वीकार करना चाहते हैं । इस शोध को R15HL114062 द्वारा ऐंका डी. Dobrian का समर्थन किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Large Equipment |
|||
| Biosafety Cabinet |
Nuaire |
nu-425-400 |
|
| Cell Culture Incubator |
Thermo-Fisher Scientific |
800 DH |
|
| Water Bath |
Forma Scientific |
2568 |
Reciprocal Shaker |
| RT-PCR Machine |
BIO-RAD |
CFX96-C1000 |
|
| Electrophoresis Box |
BIO-RAD |
Mini PROTEAN 3 Cell |
|
| Transblot Box |
BIO-RAD |
Mini Trans-Blot Cell |
|
| Electrophoresis Power Supply |
BIO-RAD |
PowerPac Basic |
|
| ELISA Reader |
Molecular Devices |
SpectraMax M5 |
|
| Blot Reader |
LI-COR |
Odyssey |
Near Infrared |
| Refrigerated Centrifuge |
Eppendorf |
5810 R |
|
| Tabletop Centrifuge |
Eppendorf |
MiniSpin Plus |
|
| Fluorescent Microscope |
Olympus |
BX50 |
|
| Inverted Microscope |
Nikon |
TMS |
|
| KRBSS Buffer |
|||
| HEPES |
Research Products International |
H75030 |
|
| Sodium bicarbonate |
Sigma-Aldrich |
792519 |
|
| Calcium chloride dihydrate |
Sigma-Aldrich |
C7902 |
|
| Potassium phosphate monobasic |
Sigma-Aldrich |
P5655 |
|
| Magnesium sulfate |
Sigma-Aldrich |
M2643 |
|
| Sodium chloride |
Sigma-Aldrich |
746398 |
|
| Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich |
S9638 |
|
| Potassium chloride |
Sigma-Aldrich |
P9333 |
|
| Glucose |
Acros Organics |
410950010 |
|
| Adenosine |
Acros Organics |
164040250 |
|
| Bovine Serum Albumin |
GE Healthcare Bio-Sciences |
SH30574.02 |
|
| Penicillin/Streptomycin |
Thermo-Fisher Scientific |
15070063 |
|
| Tissue Digestion |
|||
| 20 mL Syringe |
Global Medical |
67-2020 |
|
| Nylon Mesh, 250 µm |
Sefar |
03-250/50 |
|
| Pipetting Needles |
Popper |
7934 |
|
| Fine Scissors |
Fine Science Tools |
14058-11 |
|
| Tissue Forceps |
George Tiemann & Co |
160-20 |
|
| Collagenase, Type I |
Worthington Biochemical |
LS004196 |
|
| Petri Dishes, 100 mm |
USA Scientific |
5666-4160 |
TC Treated |
| Eppendorf Tubes, 1.5 mL |
USA Scientific |
1615-5500 |
|
| Conical Tubes, 15 mL |
Nest Scientific |
601052 |
|
| Conical Tubes, 50 mL |
Nalgene |
3119-0050 |
|
| Scintillation Vials |
Kimble |
74505-20 |
Tissue Dicing |
| Cell Isolation |
|||
| Cellometer |
Nexcelom |
Auto 2000 |
|
| Cellometer Slides |
Nexcelom |
CHT4-SD100-002 |
|
| Cellometer Viability Stain |
Nexcelom |
CS2-0106-5mL |
Acridine Orange/Propidium Iodine |
| Anti-CD34 Magnetic Beads |
StemCell Technologies |
18056 |
Kit |
| EasySep Magnet |
StemCell Technologies |
18000 |
|
| Anti-CD31 Plastic Beads |
pluriSelect USA |
19-03100-10 |
|
| pluriSelect 10x Wash Buffer |
pluriSelect USA |
60-00080-10 |
|
| pluriSelect Connector Ring |
pluriSelect USA |
41-50000-03 |
|
| pluriSelect Detachment Buffer |
pluriSelect USA |
60-00046-12 |
|
| pluriSelect Incubation Buffer |
pluriSelect USA |
60-00060-12 |
|
| pluriSelect S Cell Strainer |
pluriSelect USA |
43-50030-03 |
|
| Cell Culture |
|||
| 6-well Plates |
USA Scientific |
CC7682-7506 |
TC Treated |
| 4-well chambered slides |
Corning Life Sciences |
354559 |
Fibronectin coated |
| 4-well chambered slides |
Thermo-Fisher Scientific |
154526PK |
Uncoated glass |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC) |
Sciencell Research Laboratories |
7200 |
Primary cell line |
| Endothelial Cell Media (ECM) |
ScienCell Research Laboratories |
1001 |
Complete Kit |
| DMEM/F12 Basal Media |
Thermo-Fisher Scientific |
11320082 |
|
| Fetal Bovine Serum (FBS) |
Rocky Mountain Biologicals |
FBS-BBT |
|
| Insulin |
Lilly |
U-100 |
Humalog |
| Rosiglitazone |
Sigma-Aldrich |
R2408 |
|
| Cell Analysis |
|||
| Oil Red O Dye |
Sigma-Aldrich |
O0625 |
Prepared in isopropanol |
| 96 well plates |
USA Scientific |
1837-9600 |
|
| 96 well PCR plates |
Genesee Scientific |
24-300 |
|
| RNA Extraction |
Zymo Research |
R2072 |
Kit |
| cDNA Synthesis |
BIO-RAD |
1708841 |
Supermix |
| JumpStart PCR Polymerase |
Sigma-Aldrich |
D9307-250UN |
Hot start, with PCR Buffer N |
| Magnesium Chloride Solution |
Sigma-Aldrich |
M8787-5ML |
3 mM final in PCR reaction |
| dNTPs |
Promega |
U1515 |
|
| TaqMan AdipoQ |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00605917_m1 |
|
| TaqMan CIDEA |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00154455_m1 |
|
| TaqMan RPL27 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs03044961_g1 |
|
| TaqMan UCP1 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00222453_m1 |
|
| BCA Assay |
Sigma-Aldrich |
QPBCA-1KT |
Kit |
| Bis-acrylamide |
BIO-RAD |
1610146 |
40% stock solution |
| Ammonium Persulfate |
BIO-RAD |
1610700 |
|
| TEMED |
BIO-RAD |
1610800 |
|
| Tris |
Sigma-Aldrich |
T1503 |
|
| Glycine |
BIO-RAD |
1610718 |
|
| Sodium Dodecal Sulfate |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
| EDTA |
Fisher Scientific |
S311-100 |
|
| Bromophenol Blue |
Sigma-Aldrich |
B8026 |
|
| Blot Membrane |
EMD Millipore |
IPFL00010 |
|
| Methanol |
Fisher Scientific |
A452-SK4 |
|
| Odyssey Blocking Buffer, Tris |
LI-COR |
927-50000 |
|
| Anti-AKT antibody |
Cell Signaling Technology |
2920S |
Mouse monoclonal |
| Anti-pAKT antibody |
Cell Signaling Technology |
9271S |
Rabbit polyclonal |
| Anti-UCP1 antibody |
Abcam |
ab10983 |
Rabbit polyclonal |
| Anti-Mouse IgG antibody |
LI-COR |
926-68070 |
Goat Polyclonal, IRDye 680RD |
| Anti-Rabbit IgG antibody |
LI-COR |
926-32211 |
Goat Polyclonal, IRDye 800CW |
| Anti-Rabbit IgG antibody |
Jackson ImmunoResearch |
111-025-003 |
Goat Polyclonal, TRITC |
| Phosphate Buffer Saline |
Thermo-Fisher Scientific |
10010049 |
|
| 37% Formaldehyde Solution |
Electron Microscopy Sciences |
15686 |
4% solution for cell fixation |
| Normal Goat Serum |
Vector Laboratories |
S-1000 |
10% blocking solution |
| Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
X-100 |
0.1% permeabilization solution |
| DAPI |
Thermo-Fisher Scientific |
D1306 |
|
| Calcein AM |
Thermo-Fisher Scientific |
65-0853-39 |
Cell fluorescent visualization |
| Matrigel Basement Membrane Matrix |
Corning Life Sciences |
356231 |
Growth factor reduced |
| DiI labeled Acetylated LDL |
Thermo-Fisher Scientific |
L3484 |
References
- Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).
- Min, S. Y., et al. Human 'brite/beige' adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice. Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Tran, K. V., et al. The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells. Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
- Miranville, A., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).
- Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).
- Moller, D. E., Flier, J. S. Insulin resistance--mechanisms, syndromes, and implications. The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes. The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).
- Satish, L., et al. Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage. BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization. Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).
- Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (105), e53072 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC). Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).
- Zhou, L., et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis. PLoS One. 10 (2), e0117644 (2015).
- Curat, C. A., et al. From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes. Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).
- Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).
- Traktuev, D. O., et al. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks. Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).
- Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis. Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).
- Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue. Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).
- Ong, W. K., et al. Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
- Ong, W. K., Sugii, S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots. American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).
- van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation. Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).
