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Genetics

복제 설정된 방법: 양적 측정 꼬마 선 충 수명에 접근 높은 처리량

doi: 10.3791/57819 Published: June 29, 2018

Summary

여기 우리가 설명 복제 설정 방법, 양적 측정 C. 선 충 수명/생존 하 접근법 및 healthspan 높은 처리량 및 강력한 방법으로 데이터 품질을 희생 하지 않고도 많은 조건의 심사 되므로. 이 프로토콜은 전략 하 고 데이터 복제 집합의 분석을 위한 소프트웨어 도구를 제공 합니다.

Abstract

복제 설정 방법은 양적 측정 수명 또는 꼬마 선 충 선 충의 생존의 동일한 금액에 더 많은 치료 또는 조건 화면을 단일 조사 되므로 높은 처리 방식에 대 한 접근 데이터 품질의 손실 없이 시간. 방법 C. 선 충 작업 대부분 실험실에서 발견 하는 일반적인 장비를 요구 한다 고 따라서 채택 간단 합니다. 접근 각 관측 지점에서 모집단의 독립 샘플 보다 시간이 지남에 단일 샘플 전통적인 경도 방법 시 금에 센터. 점수 다 잘 접시의 우물에 액체를 추가 하는 수반는 자극 하는 선 충 C. 이동 하 고 healthspan에서 측정 변화를 용이 하 게. 복제 설정 방법의 다른 주요 장점으로는 agar 표면 (예: 형 또는 곰 팡이), 공 수 오염 물질의 감소 된 노출 최소한의 동물, 및 견고성 산발적 잘못 채 점 (예: 때 그것은 여전히 죽은 동물을 호출을 처리 살아 있는). 적절 하 게 분석 하 고 복제 세트 스타일 실험에서 데이터 시각화, 사용자 정의 소프트웨어 도구는 또한 개발 되었다. 소프트웨어의 현재 기능 모두 복제 설정 및 전통적인 (카 플 란-마이어) 실험으로 통계 분석 생존 곡선의 복제 세트에 대 한 표시 포함 됩니다. 여기에 제공 된 프로토콜 전통적인 실험적인 접근 복제 설정 방법 뿐만 아니라 해당 데이터 분석에 대 한 개요를 설명 합니다.

Introduction

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노화의 유전 기초 이해를 향한 가장 transformative 기술 발전의 한 개 이었다 C. 선 충1; 먹이 기반 RNAi의 개발 RNAi의 실험적인 사용 전에 노화의 많은 고기 유전자 세공 되지 않았습니다. 먹이-기반 RNAi dsRNA 일치 하는 대장균 내에서 생산을 통해 이루어집니다는 선 충 C. mRNA: IPTG 중 선 충 C. cDNA의 삽입 또는의 부분에서 양방향 전사를 유도 한 플라스 미드2내의 열려있는 독서 프레임. C. 선 충 에 그대로 피드 박테리아에 의해 생산 하는 대장균, dsRNA 루멘에서 SID-2 막 횡단 단백질3을 통해 장 세포로 수송 이며 다음 SID-14를 통해 동물의 나머지 부분을 통해 배포. 각 셀 내에서 외 인 dsRNA에 의해 처리 됩니다 Dicer 복잡 한 siRNA에 새로운 만들려고 보완 기본 페어링 통해 성숙한 mRNA와 상호 작용 하는 siRNA mRNA 이중. 이 이중 RISC 복합물에 의해 인식 하 고, 그로 인하여 죽 습 생 mRNA5저하. 따라서, 단지 플라스 미드 삽입 변경, 하나 C. 선 충 게놈 내에서 거의 모든 유전자의 기능을 비활성화 수 있습니다. 이 발견의 라이브러리 컬렉션 변형 대장균 주식의 약 86%의 범위를 달성 하기 위해 결합 될 수 있는 몇 가지 큰 먹이 기반 RNAi의 창조에 주도 알려진 C. 선 충 유전자6, 7.

먹이-기반 RNAi의 발전 이후 종합 화면 C. 선 충 에 수명 비활성화 (로 WormBase에 큐레이터 RNAi 형 협회 입증) 때 우리가 참조를 변경 하는 900 개 이상의 유전자의 발견에 지도 gerogenes로. 대부분 장 수 제어에 gerogenes의 역할 몇 정액 보고서에 RNAi 먹이-기반을 통해 발견 되었다 (자세한 내용은 그림 1A추가 파일 1 참조). 경우에 따라 이러한 gerogenes는 RNAi 치료와 수명에 정량 측정을 제공할 수 있는 단일 또는 몇 시간 지점에서 생존 능력 측정에 따라 확인 되었습니다. 다른 경우에,이 유전자가 수명, 추가 나이 관련 된 고기에 있는 변화에 대 한 양적 평가 되었습니다. 예를 들어, 우리는 이전 159 유전자를 정상적이 고 증가 수명 감소 인슐린/IGF-1 신호, 동물의 필요 그리고 healthspan에서 변화를 정량 확인. 이들의 103 유전자 inactivations 귀 착될 progeric 표현 형으로 손실 귀착되 었 다 조기 노화8의 하나 이상의 표시.

일부 gerogenes 100 이상의 연구 (예: daf-16, daf-2, 선생님-2.1)와 연결 된, 400 gerogenes 10 이하의 인용 (그림 1B보조 파일 2) 있다. 따라서, 동안 포괄적인 먹이 기반 RNAi 스크린 발견 하 고 엉 특징 상 상속 gerogenes의 수백, 장 수 제어에서 이러한 유전자 기능 및 이러한 유전자 제품 사이 유전 상호 관계 유지 하는 방법을 제대로 공부. 나이 관련 된 고기에 대 한 전체 경도 분석 gerogenes (예: epistatic 상호 작용, asynthetic 상호 작용, 등등) 사이 유전 상호 작용을 식별 하는 데 필수입니다. Gerogenes 사이 유전 상호 관계에 대 한 깊은 통찰력을 얻고 또한 먹이 기반 RNAi의 장점을 활용 하 여 높은 처리량 양적 방법을 필요 합니다.

노화의 가장 일반적인 대리 측정은 수명. C. 선 충 사망률을 측정 하기 위한 전통적인 방법은 작은 인구 샘플 내에서 시간이 지남에 개별 동물의 죽음을 추적 합니다. 동물의 비교적 적은 수 시간이 지남에 따라 하 고 정기적으로 부드럽게 백 금 철사 또는 속눈썹, 생존 (그림 2A)의 지표로 서 운동으로 prodded. 이 방법은 널리 사용 되었습니다, 평균 및 최대 수명, 직접 측정을 제공 합니다. 그러나,이 전통적인 방법은 이다 시간과 상대적으로 낮은 처리량을 동시에 제어 방식으로 측정할 수 있는 조건과 동물의 수를 제한. 시뮬레이션 연구는 최근 많은 C. 선 충 수명 연구 조건9사이의 작은 변화를 안정적으로 감지 수 동물의 충분히 큰 수를 시험 하지 않습니다 발견. 또한,이 전통적인 방법은 차례로 수 소개, 오염 및 손상 하거나 점점, 세 동물을 죽 일 시간 동안 동물의 동일한 코 호트를 반복적으로 처리를 포함 한다.

C. 선 충 수명 측정에 대 한 대체 "복제 세트" 방법론을 개발 했습니다. 이 위해, 나이 동기화, isogenic 동물의 큰 인구 수 작은 인구 (또는 복제)으로 나누어집니다. 충분 한 복제 샘플 계획 된 실험에서 각 시간 포인트를 충당 하기 위해 생성 됩니다. 각 관찰 시간이 시점에서 복제본 중 하나가 죽은 생활의 수를 위해 득점 하 고 검열된 동물, 다음 그 복제 동물 삭제 됩니다. 따라서, 이상의 독립 모집단의 시리즈 전체 인구의 예상된 수명은 주기적으로 샘플링 (그림 2B). 복제 세트를 사용 하 여 잠재적인 환경 오염 없이 반복된 노출의 아무 반복 괴롭히는 있다. 1 회 시점에서 관찰 생존 모든 다른 관측, 처리를 최소화 하 고 적어도 크기 순서에 의해 처리량 증가의 완전히 독립적입니다. 이 RNAi의 수백 클론8,10동시에 대 한 수명에 변화를 quantitate 하을 수 있다.

여기 C. 선 충 수명 복제 세트와 C. 선 충 장 수 득점을 위한 전통적인 방법을 통해 수행을 위한 상세한 프로토콜 선물이. 우리는 방법 사이 비슷한 결과 얻은 것을 보여 줍니다. 우리는 우리가 자유롭게 GPL V3 라이센스 (참조 자료의 테이블)에서 제공 하는 어느 접근 방식을 통해 생성 된 수명 데이터의 그래픽 분석을 지원 하기 위해 개발 된 소프트웨어를 있다. "WormLife" R11, 작성 하 고 Mac OS와 리눅스에서 테스트 되었습니다 데이터를 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)를 포함 한다. 마지막으로, 우리가 비교 하 고 각 방법의 한계를 대조 C. 선 충 수명에 양적 변화를 측정 하는 방법을 선택할 때 다른 고려를 강조.

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Protocol

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1. 전통적인 방법 점수 C. 선 충 장 수

  1. 시 약의 준비
    1. 유전자 먹이 기반 RNAi 통해 비활성화를 식별 합니다. 관심의 RNAi 클론을 포함 하는 HT115 대장균2 의 변형 된 주식을 구입. 또는, L4440 플라스 미드의 multicloning 사이트에 관심사의 유전자의 cDNA를 subclone.
      참고: HT115은 IPTG을 유도할 수 있는 T7 중 합 효소 활동, 박테리아 내의 dsRNA의 저하를 방지 하는 데 사용 되는 RNase III 불충분 한 E. 콜라이 긴장. 먹이-기반 RNAi를 사용 하지 않는 수명 연구, HT115 또는 OP50 표준 NGM 접시에 대장균 수 사용된.
    2. 3-6 (또는 더 많은) 6 cm 테스트 조건 (제조 법에 대 한추가 파일 3 ) 당 RNAi 접시를 준비 합니다. 몇 개월에 대 한 박테리아와 뿌리기 전에 4 ° C에서 RNAi 접시를 저장.
    3. 성장 변형된 대장균 하룻밤 (16-20 h, 180-220 RPM에서 인큐베이터를 떨고 37 ° C).
      참고: HT115 대장균 암 피 실린 (50 mg/mL)와 파운드에 성장 된다. 표준 OP50 대장균 은 항생제 내성 고 암 피 실린 없이 성장. 문화 볼륨 판, #에 따라 다릅니다 하지만 일반적으로 실험적인 디자인에 따라 파운드의 8, 100 mL 사이.
      1. 벤치탑 원심 분리기에서 15-20 분 3000 x g 에서 원심 분리 하 여 박테리아를 집중. 상쾌한, 발음 하 고 다시 1에서 펠 릿을 일시 중지/10 시작 볼륨 (즉, 10 x) 암 피 실린 HT115 (또는 표준 OP50에 대 한 암 피 실린 없이)와 파운드에.
      2. Aliquot 200 µ L의 각 6 cm 접시 10 x 박테리아 집중. 테스트 상태, 오염 시 사용 될 2 여분의 백업 플레이트와 당 3-4 복제를 준비 합니다. 접시를 준비할 때 점수 분석 결과 실험은 실험 조건에 눈 먼 색상 코드 또는 유사한 코딩 구성표를 사용 하 여 그들을 라벨. 코드가 기록 됩니다 확인 합니다.
      3. 모든 액체를 흡수 하는 층 류 벤치 등 깨끗 한 환경에서 건조 또는 벤치에 하룻밤 건조 커버 플레이트 오픈 격판덮개를 허용 한다. 지나치게 건조 하지 않고는 agar는 건조 되도록 건조 하는 동안 접시를 모니터링 합니다.
        참고:-접시 건조 한 선 충 C. 는 agar에 뚫으 하는 것은 천의 크래킹 이끌어 낸다. 서 부 유럽 표준시 agar 표면도 내 홍보
    4. DsRNA 생산의 유도 있도록 실 온에서 하룻밤 (최대 24 h) 웜 상자 내에서 말린된 접시를 저장. RT에서 1 일 후 (접시 밖으로 건조 하지 않도록) 하려면 밀봉된 지퍼 잠금 가방에 접시 4 ° C에서 최대 2 주 동안 저장 합니다. 사용 하기 전에 공 수 곰 팡이 오염 물질을 소개에서 응축을 방지 하기 위해 지퍼 잠금 가방 내에서 실내 온도에 번호판을 반환 합니다.
  2. 차 아 염소 산 치료 C. 선 충 의 동기화
    주: M9과 차 아 염소 산 솔루션 조리법에 대 한 추가 파일 3 을 참조 하십시오.
    1. M9 벗 성인 동물을 수집 합니다. 연결된 유리 피 펫을 사용 하 여 2 x 15 mL 튜브로 이동.
    2. 30"~ 2000 rpm에 대 한 튜브를 회전 합니다. 튜브의 아래쪽에 선 충에의 한 풀에 대 한 확인 하십시오. 상쾌한 발음 M9 솔루션, 스핀과 열망을 반복 두 번 씻어.
    3. 다시 m 9의 4 mL에 C. 선 충 을 일시 중단 합니다. 차 아 염소 산 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다. 정기적인 활기찬 동요와 함께 ~ 3 분, 즉시 소용돌이. 3 분 후 계란 해 현미경의 구름을 찾습니다. 소용돌이 추가로 10-20의 계란 3 분 후 해제 되지 않은 경우.
      참고: 차 아 염소 산 치료 타이밍은 필수적입니다. 벗 성인 내 계란은 어떤 치료 생존. 3 분 후 벗 성인 깨 그리고 계란을 밖으로 유출. 그러나, 계란은 차 아 염소 산 솔루션에서 출시 후 너무 오래 그들은 죽을 것 이다. 반대로, 만약 벗 성인은 충분히 차 아 염소 산 솔루션에 빠지지 않고, 계란이 나올 것 이다.
    4. 빠르게 M9 솔루션 단계 2.1.2 에서처럼 두 번 세척.
    5. 다시 3 mL M9에 새로운 15 mL 튜브에 C. 선 충 계란 펠 릿을 일시 중단 합니다. 20 ° c.에 회전 M9 솔루션의 3 mL에서 하룻밤 해치 배아 허용
    6. L1 솔루션 3의 10 µ L를 놓아 µ L 당 L1 동물 (또는 배아)의 밀도 계산 x 6 cm 접시 및 수 L1s / µ L의 평균 수를 계산 하는 L1 동물 수.
      참고: L1 동물 시간이 지남에 정착 됩니다. 따라서, L1 솔루션 주기적으로 혼합 되어야 한다.
    7. 접시 당 종자 50 L1 동물입니다. 접시를 반전 하 고 고무 밴드와 함께 인감. 플라스틱 웜 상자에 접시를 놓습니다. 큰 지퍼 잠금 가방에 상자를 봉인 합니다. 20 ° C 인큐베이터로 이동 합니다.
  3. Deoxyuridine (FUdR)-5-플 루 오로-2'의 추가 의해 자손 생산을 방지
    1. 동물 20 ° c.에 L4 단계까지 성장 확인 하십시오 동기화 여부 동물 L4를 개발한 시드 (2.1.7 단계) 후 약 40 h.
      참고:선 충 C. 발달 시간12 및 성장 속도는 요금 하지 특징 되는 돌연변이 동물의 실험적으로 테스트 해야 합니다 서로 다른 온도에서 달라질 수 있습니다.
      1. 추가 50의 160 µ L L4 동물과 각 6 cm 접시에 x FUdR.
        참고: FUdR L4 단계에 추가 하는. 편의 위해 만들 1000 FUdR x 주식 1 g FUdR 10 mL에 용 해 하 여 초순 H2o. 필터를 소독 주식 FUdR 0.2 µ m 필터와 10 cc 주사기. Aliquot 살 균 1.5 mL 튜브에 재고 mL ~ 1 와-20 ° c.에 저장
    2. 남자의 존재에 대 한 번호판을 검사 C. 선 충. 모든 남성을 제거 합니다.
      참고: 수명은 일반적으로 광고에 나온 것 하 고 없는 남성에 대 한 측정. 친구는 광고에 나온 것도 FUdR13존재 unmated 동물 보다 짧은 라이브. 남성 작고 얇은 다음 광고에 나온 것 이며, 독특한 구부려 진된 꼬리14에 의해 쉽게 확인 될 수 있다.
    3. 지퍼 잠금 가방에 다시 상자를 넣어. 20 ° C 인큐베이터를 반환 합니다.
  4. 생존 점수
    1. 백 금 철사 또는 속눈썹 머리에 동물을 부드럽게 만져 매일 생존을 점수. 동물 죽은로 이동 하 고 (그림 2A) 접시에서 그들을 제거에 실패 하는 점수. 죽은 모든 관찰 시간 지점에 대 한 각 조건에 대 한 관찰 번호를 기록 합니다.
      참고: 득점 편견의 위험을 줄이려면는 실험 실험 조건에 눈 먼 있어야와 마찬가지로 참조 하지 않아야 합니다 결과 이전 시간에서에서 득점 하는 동안.
    2. 파열, 검열 동물 접시의 측면을 다른 명백한 개발 결점, 또는 크롤 링에서 죽을: 통계 분석에서 고려에 대 한 이러한 동물과 각 번호 관찰 시간 기록 지점 제거. 또한, 남성 발견 되 면, 그들을 제거 하 고 관찰 하는 수를 기록.
    3. 반복 단계 1.4.1에서에서 매일 아무 동물 살아 남아 때까지.
      참고: 대장균 의 잔디 크게 축소 해야 하거나 곰 팡이 접시에 성장, 적절 한 RNAi와 FUdR 신선한 접시에 모든 나머지 동물을 전송 하기 시작 합니다.
  5. 데이터 분석-플로팅 및 통계
    1. 입력 또는 비패라메트릭 카 플 란 Meier 견적15 와 로그-순위 생존 분석을 지 원하는 소프트웨어에 오픈 기록된 관찰 데이터 테스트16 ( 보충 파일 3참조). 검열 된 동물을 포함 해야 합니다. 있는 경우에 관찰 된 남성을 포함 하지 마십시오.
      참고: 데이터 형식 소프트웨어, 사이 다를 수 있습니다 하지만 일반적인 포맷은 별도 줄에 관찰 각 개별 동물 기록. 죽은 동물은 관찰 실험 timepoint "이벤트" 시간 이다. "이벤트" 시간을 검열, 이면 timepoint는 동물을 검열 했다. 일반적으로 필드 또는 검열 된 관측 하려면 확인란입니다.
    2. 카 플 란-마이어 생존 곡선을 플롯. 가독성을 높이기 위해 많은 조건을 분석 했다 단일 줄거리에 대 한 미만 6 조건을 선택 합니다.
      1. 시각적으로 명백한-누락 된 관측값, 예기치 않은 컨트롤 결과, 데이터 문제를 확인 -통계 분석 하기 전에 이러한 해결.
    3. 소프트웨어에서 로그-순위 테스트 함수를 사용 하 여 쌍 수행 통계 비교. 데이터 오른쪽 검열 검열된 결과의 처리에 대 한 모든 사용 가능한 옵션 적절 하 게 설정 되어 있는지 확인 합니다.

2. 복제 점수 C. 선 충 장 수에 대 한 Set 메서드

참고: 전통적인 방법 필요 조건 당 3-6 판 (1.1.2 참조. 위), 복제 설정 방법을 사용 (단계 2.2.2 아래 참조) 더 많은. 전통적인 방법 (그림 2A) 실험을 통해 같은 접시에 동물을 다음과 같습니다. 반면, 복제 세트와 동물만 득점 된다 한 번: 한 복제 (재판) 당 각 시간 지점에서 득점은 되도록 많은 동일한 복제 실험의 시작 부분에 설정 되어 (그림 2B).

  1. 라이브러리 설정입니다.
    참고: 나눠 RNAi 클론에 추가 세부 사항 여기, 프로토콜은 많은 RNAi 클론의 동시 득점 의무가 복제 세트로 덮여 고 잘 100 클론을 한 번에 확장할 수 있습니다. RNAi 클론의 컬렉션 형식 96 잘 접시에 유지 하는 글리세롤 주식으로 유지 됩니다. 복제 설정된 실험 24-잘 접시를 사용합니다. 각 잘 RNAi 클론, 다른 화학 치료, 동물, 긴장과 등의 컬렉션에 해당 수는 다른 테스트 조건입니다.
    1. 다음 조건이 충족 되는 RNAi 클론의 컬렉션에 대 한 sublibrary의 레이아웃을 조립.
      1. 96-잘 컬렉션에서 잘 a 1은 빈 벡터 부정적인 제어를 확인 합니다.
      2. 모든 24 웰 스 내에서 임의로 추가 빈 벡터 제어를 삽입 합니다.
      3. 각 24-잘 접시가 하나에 무작위로 삽입 부정적인 컨트롤 (그림 2C)는 96 잘 접시 24 웰 스의 블록으로 분할.
      4. 24-웰 스 (그림 2C)의 각 그룹 내에서 무작위로 긍정적인 컨트롤을 삽입 합니다.
        참고: 긍정적인 제어 실험 질문에 따라 달라 집니다. 예를 들어 그 증가 수명 클론 RNAi의 컬렉션을 보고, daf-2(RNAi) 자주 포함 되어 있습니다. 반대로, 짧은 수명에서 볼 때, daf-16(RNAi) 자주 사용 됩니다.
  2. 복제 세트의 준비
    참고: 복제 필요한 수는 최소 수를 시간 포인트 (그림 2B). 하나는 귀납적은 주파수 (예: 모든 다른 날 점수와 함께 40 일을 실행 하는 복제 세트 실험 준비 20 복제 세트에 대 한 최소 요구 점수 뿐만 아니라 실험의 시작에 앞서 수명 측정을 얼마나 알고 있어야 합니다. 각 조건에서 실험의 시작). 그것은 ~ 5 여분의 백업 세트 (2.2.2 및 2.2.2.3 아래 참조)를 확인 하는 것이 좋습니다.
    1. RNAi sublibrary의 신선한 스탬프를 만들려면 다음 단계에 의해 96 핀 플레이트 복제기를 사용 하 여 96 잘 형식 (600 µ L 플레이트)에 잘 당 200 µ L 파운드 + 앰프 예방:
      1. 순차적으로 50%의 표 백제, 초순 H2O, 그리고 에탄올에 핀을 immersing 하 여 96 핀 플레이트 복제기를 소독. 계속 적어도 30에 대 한 몰입 핀 표 백제와 에탄올 단계에 대 한 s.  에탄올에 침수 후 팁을 간단히 불꽃. 반복 합니다.
        참고: 씻어 모든 표 백제, 그리고 노출 장기간, 표 백제 표 백제 스테인리스 스틸 핀 부식 수 있습니다 핀을 두지 마십시오.
      2. 냉동된 96 잘 글리세롤 재고 라이브러리 플레이트와 부드럽게 접착 호 일 덮개를 조심 스럽게 제거 하지만 단단히 여전히 냉동된 글리세롤의 우물에 소독된 판 복제기의 팁을 갈기. Inoculate 200 µ L 파운드 + 앰프 문화 고 침투성 막으로 접종된 접시를 봉인. 벤치탑에 밤새 껏 성장 하는 문화를 허용 한다.
      3. 2.1.1 단계 같이 격판덮개 복제기 소독, 신중 하 게 하룻밤 성장 후 액체 문화 판에서 물개를 제거 하 고 복제기 핀의 끝을 젖어. 적절 한 공간 인접 지점 사이 남아 있도록 작은 원형 모션으로 부드럽게 플레이트에 핀에서 직사각형 파운드 앰프 + tet 천 배지 및 전송 박테리아 심지어 압력으로 팁을 적용. 한 천 배지에서 37 ° c.에 하룻밤 성장 식민지 허용 LB + 앰프/Tet의 준비에 대 한 추가 파일 3 참조 접시.
      4. 이전에 사용, 4 ° C 거꾸로 (아래 뚜껑 쪽)에서 한 천 배지 파라핀 영화에 싸여 저장 합니다.
        참고: 교차 오염 RNAi 클론을 응축 수 식민지 뚜껑 쪽을 저장! RNAi 클론 유지 시간 가변 길이 IPTG 유도 후 dsRNA를 유도에 효능으로 특정 RNAi 클론에 따라 4 ° C에서 2-8 주에 대 한 대장균 의 식민지를 저장할 수 있습니다. RNAi 클론의 작은 컬렉션, RNAi 효율 결정 되어야 합니다 경험적으로 실시간 정량 Pcr에 의해 최저 확인 하.
    2. 24-잘 접시 실험에의 한 재판에 필요한 최소 수를 계산: (복제 세트 당 # 접시) x (예상된 # 시간 점). 몇 가지 추가 복제 세트 (그림 2B) 오염 등의 문제를 처리 하기 위한 포함 되어 있는지 확인 합니다.
      참고: RNAi 클론의 총 수는 각 시간 포인트 (그림 2C)에 대 한 복제본의 한 세트를 만들기 위해 24-잘 접시의 수를 결정 합니다.
      1. 1.1.2 (제조 법에 대 한추가 파일 3 ) 단계 24-잘 접시를 준비 합니다. 실험 분석 결과 득점 색상 코드 또는 유사한 코딩 구성표를 사용 하 여 실험 조건에 눈 먼 것 들을 준비할 때 접시를 레이블.
      2. 한 세트 1.5 mL 파운드 + 앰프 문화 (2.2.2 참조) 모든 10 복제본의 예방 문화 (2.1.3)로 접시 복제기 2.1.4 (그림 2C, 왼쪽)에서 세균성 식민지를 사용 하 여 96 잘 깊은 잘 격판덮개에 접종 숨 막 인감, 동요를 가진 20 h (37 ° C) 성장.
      3. (그림 2C, 오른쪽) 간격 조절 팁 6 잘 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 각 접시에 하룻밤 문화의 120 µ L 씨 모든 액체를 흡수 하는 층 류 흐름 후드에서 발견 건조 접시. -건조 하지 않습니다. 하룻밤 실 온에서 접시를 저장.
  3. C. 선 충 도 발견 됐 죠 치료를 사용 하 여 동기화
    1. 동물 실험에 필요한 최소 수를 계산: 필요 L1s의 최소 # = (15-20 동물/잘) (24 웰 스/접시) (접시/복제 세트 X)(Y replica sets).
      참고: 복제 설정 방법을 사용 하는 기존의 방법 보다 더 많은 동물. 한 10 cm 접시 가득 벗 웜 20000-50000 L1 동물 벗 성인의 밀도 따라 제공할 수 있습니다. 마찬가지로, 20 6 cm 접시 ~ 30000 L1 동물 주위 얻을 수 있습니다. 필요한 동물의 최소 수를 두배로 하는 계란 준비를 준비 하려고 합니다. 준비에서 인구는 굶 어 다시 공급 또는 새로운 접시에 덩어리 고 넘어가기17,18전에 음식에 적어도 3 세대를 허용. 다시 남은 L1s을 동결 해야 합니다.
    2. 따라 단계를 전통적인 방법에서 1.2 1.2.6 L1 동물 동기화. 씨앗 잘 사용 하 여 각 6-잘 조정 가능한 간격 피 펫 및 시 약 저수지, 1.2.7 비슷합니다으로 15-20 L1 동물. 주기적으로 혼합 솔루션 동물의 침전을 방지 하는 L1.
  4. Deoxyuridine (FUdR)-5-플 루 오로-2'의 추가 의해 자손 생산의 예방
    1. 1.3.1 단계를 따릅니다.  살 균 50 FUdR 주식 x를 준비 (단계 1.3.1.1 참조).
    2. 동물 도달 L4, 추가 50의 25 µ L 24-잘의 각 음에 x FUDR 6 채널 가변 간격 피 펫을 사용 하 여 격판덮개.
  5. 점수 생존
    1. 복제 격판덮개의 1 세트를 제거 하 고 잘, 당 레코드 총 동물 M9 솔루션과 우물 홍수 다음 부드럽게 움직이지 않는 동물 웜 선택 (그림 2B)과 머리에 터치. 동물 이동 하는 실패는 죽음으로 주어진 다. 삭제 판 득점입니다. 매일 기록 생존 능력입니다.
      참고: 동물 파열, 쇼 총 형태학 결함, 개발, 실패 하거나 잘 측면을 크롤 링을 죽은 및 총 값에서 그들을 제외 하 여 검열 하는.
      1. 다른 값에서 별도로 각 시간 지점에서 각 잘 내에서 검열 하는 동물의 수를 기록 합니다.
      2. 식품 또는 오염 웰 스 점수 하지 마십시오 (예: 곰 팡이 또는 점액); 이러한 웰 스 검열 된 것으로 간주 됩니다. 또한, 모든 동물의 형태학 또는 발달의 결함을 표시 하는 경우는 잘을 검열. 이 시간 지점에서 복제/잘이이 RNAi에 대 한 검열 이벤트를 기록 합니다.
      3. 복제 판, 득점 후 그것을 폐기. 새로운 복제 점수 설정 모든 우물에 걸쳐 모든 동물은 죽은 때까지 매일 계속. 바이어스 득점의 위험을 줄이려면는 실험 실험 조건에 눈 먼 남아 있어야 하 고 유사 하 게 참조 하지 않아야 합니다 결과 이전 시간에서에서 득점 하는 동안.
      4. 잘 모든 동물 했다 주어진된 시간 포인트에서 죽은 다음 그 날의 득점 후, 검사 모든 동물에 대 한 두 개의 연속 시간 포인트 죽은 골 되었습니다 여부는 잘 주어진. 그렇다면, 생존 점수 이상 필요 후속 시간 포인트에서 잘 합니다.
      5. 추가 독립 실험 시험을 실시 합니다. 추적 연속 시험의 결과 별도로 그 이전 재판에서 재판 수 지적 했다.

3. 그래프 데이터

참고: 복제 세트와 곡선 맞춤 방법은 평균 및 최대 수명을 적용 됩니다. C. 선 충 사망률을 평가 하기 위한 매개 변수 적합 로짓 곡선19.  새로운 프로그램 (복제 세트);에 대 한 로짓 커브를 개발한 대부분의 생존 도구 로짓 곡선 맞춤을 지원 하지 않습니다, 카 플 란-마이어 곡선 (전통적인 방법)에 대 한 지원 됩니다.

  1. 소프트웨어와 함께 시작. 최신판 (참고 자료 섹션)에 대 한 릴리스 zip 파일을 다운로드 합니다. 폴더에 zip 파일을 압축을 풉니다. 추가 설치 지침에 대 한 압축 푼된 폴더에서 "추가 정보" 파일을 참조 하십시오.
  1. 플로팅 인터페이스를 시작 합니다. Zip 파일에서 추출한 폴더에서 "코드" 디렉터리의 위치를 찾아 (예:  "/ 사용자/사용자 이름 /Desktop/WormLife/코드").
    1. 그냥 확인 폴더 경로 대 한 대체 R 콘솔에서 다음 명령을 입력 합니다. 눌러 입력 하거나 각 줄을 입력 한 후: 1) setwd("/Users/UserName/Desktop/WormLife/code"), 2) source("plotGUI.R"), 3) openMain().
    2. 그림 3A와 같이 기본 화면을 키우는 새 창에서 로드를 인터페이스에 대 한 시간을 허용 합니다. R는 백그라운드에서 실행 하자.
  2. 쉼표로 구분 된 값 (CSV) 또는 탭 구분 된 값 (TSV) 파일 포맷 데이터. 열과 분석의 종류에 따라 이름을 지정 합니다. 미리 서식이 지정 된 예제 데이터에 대 한 추가 파일 4 (복제 설정) 및 보조 파일 5 (전통/카 플 란-마이어) 참조.
    참고: "긴" 형태로, 변형/치료 시간 포인트 재판 당 당 당 즉, 한 행 데이터를 지정 해야 합니다. CSV 파일은 플랫폼 간의 최고의 호환성을 위해 권장 됩니다.
    1. 생략 되거나 검열 된 관측에 해당 하는 행을 제거 합니다. 확인 누락 또는 숫자가 아닌 값의 부재로 데이터를 가져올 때 오류가 발생할 수 있습니다.
    2. 전통적인 카 플 란-마이어 스타일 분석, 독립적인 재판-줄거리에서 데이터 풀 할 하지 그들 별도로. 다음 "TrialView" 기능을 사용 하 여 조사 하 고 분석 복제 세트에 대 한 여러 실험에서 데이터 풀 (6.3.3.4 참조).
  3. 플로팅 인터페이스를 사용 하 여
    1. ("가져오기" "파일" 메뉴에서) 데이터 파일 로드 대화 상자를 사용 하 여. 파일을 열려면 ".csv", ".csv" 내려 놓기에서 파일 형식을 변경 합니다 (기본값은 ".txt/.tsv"), 데이터 파일 폴더로 이동 합니다. 여기는 파일 복제 설정 예제 데이터 (보충 파일 4)입니다.
      참고: dataset가 이미 열려 있을 때 파일 가져오기 현재 데이터 집합을 대체 합니다.
    2. 가져오기 마법사를 선택한 파일 (그림 S1A 복제 세트에 대 한)의 열을 식별 안내 시작을 가져올 파일을 선택 합니다. 입력된 데이터는 복제 세트 실험에 대응, 연구 유형에 대 한 "로짓"를 선택 합니다.
      참고: 가져오기 워크플로 복제 세트 (그림 s 1A)와 전통 (카 플 란-마이어) (그림 s 1B) 사이 다르다.
    3. "데이터 플롯". 데이터를 플롯 하려면 "추가 라인"을 선택 합니다. (선 한 조건 집합에 해당합니다. 특징이 있다 실험에 도움이 많은 조건 시험 되었다).
      1. 플롯은 제어 조건-N2 (WT) L4440 예제 데이터의 경우 (빈 벡터) RNAi는 적절 한. 선 추가 마법사를 시작 하려면 "그래프" 메뉴에서 "추가 라인"을 선택: 라인을 나타내는 플롯 및 그래픽 매개 변수에 조건을 선택.
        1. 3.3.3.1 단계를 반복 하는 다른 조건에 대 한 곡선을 수동으로 추가 하려면
        2. 색 변경 또는 플롯 라인에 대 한 기호, "그래프 메뉴"에서 "수정 라인"을 선택 합니다.
        3. 모든 라인을 삭제 하지 않고 한 줄을 제거 하려면 "그래프 메뉴"에서 "삭제 라인"을 선택 합니다.
        4. 현재 플롯에서 모든 라인을 취소 하려면 "그래프 메뉴"에서 "명확한 선"을 선택 합니다.
        5. 자동으로 선택 된 최대 x 축 (시간) 값을 재정의 하려면 "그래프 메뉴"에서 "설정 X 규모"를 사용 합니다.
          참고: y (살아남은 분수) 20%의 증가 0% (아래) 100% (위) 항상 표시 됩니다. X 축은 항상 5 단위로 표시 됩니다. 축 레이블은 하지 작 이미지를 저장 한 후 라벨에 유연성 있게 그려집니다.
      2. 현재 표시 된 줄거리의 JPEG 형식 이미지를 저장 하려면 "파일 메뉴";에 "그림 저장" 옵션을 사용 현재 플롯에만 저장 됩니다.
      3. 한 실험에서 많은 다른 조건에 대 한 개별 플롯을 만들기 위한 소프트웨어 정의 및 플롯 "시리즈" 수 있습니다.
        참고: 시리즈 개념의 구현 작업 큰 실험을 할 때 효율성을 향상 시킵니다.
        1. 빈 플롯 작업 영역에서 시작 해 서, 모든 플롯 (3.3.3.1 참조) 시리즈에 걸쳐 일관 되 게 제어 조건에 해당 하는 라인을 추가 합니다.
        2. 그래프 메뉴에서 "정의 시리즈" 시리즈를 정의 합니다. 해당 라인 시리즈;에 먼저 표시 하는 조건을 선택합니다 하나만 선택할 수 있습니다. 3.3.3.1에서 라인에 대 한 그래픽 매개 변수 (선 색깔과 그림 기호)을 선택 합니다.
        3. 다양 한 테스트 조건에 대 한 플롯을 검토 합니다. 상단 메뉴바 (그림 3A-C) 뿐만 아니라 주요 줄거리 창 측면에 왼쪽/오른쪽 화살표 단추를 사용 하 여 조건을 사이 "시리즈 라인"의 표시를 전환 합니다.
          참고: 선택한 시리즈 라인은 이전에 추가 된 컨트롤/참조 라인 중 하나로 동일한 조건, 새로운 라인 나타날 수 있습니다 중첩 된.
        4. 특정 다른 기능 사용 가능 (저장 시리즈 플롯 및 Trialview 참조 3.3.3.4 후자에 대 한)을 시리즈를 정의 합니다. 시리즈를 정의한 후 새 폴더에 시리즈에서 각 플롯에 대 한 개별 플롯 이미지 파일을 저장 하는 "파일" 메뉴에서 "저장 시리즈 플롯" 옵션을 사용 합니다.
      4. Trialview-복제 세트 실험의 독립 시험에서 결과 머릿속으로. 여러 실험 샘플 그룹의 하나 이상의 실행 했다, 개별 시험에서 데이터와 별도로 독립 실험 (참조 그림 3D) 사이의 일관성을 평가 하는 모든 시험에서 풀링된 데이터 플롯.
        1. 3.3.3.3에 설명 된 대로 일련을 설정 합니다. 다른 시험 지정된 참조/컨트롤 샘플에 대 한 각 실험을 통해 각 다른 이미지에서 "다양 한" 샘플 그룹의 플롯 됩니다.
        2. TrialView 이미지를 저장 하려면 이동 "인쇄 TrialViews" 데이터 메뉴; JPEG 이미지는 시리즈에서 각 플롯에 대 한 출력 될 것입니다.
          참고: 그림 3d에서 예제 결과 두 실험의 경우입니다.
    4. 평균 수명 데이터 복제 집합에 대 한 요약 테이블입니다. 시각적으로 데이터의 적당 한 적합을 보장 하기 위해 커브를 검사 "요약 테이블을 선택한 다음" 각 샘플 형식. 에 대 한 평균 수명 값 (로짓 곡선에 50% 생존 시간)의 테이블을 저장 하 고 데이터 메뉴에서 옵션
  4. 복제 설정 메서드를 통해 생성 된 데이터의 통계 평가
    1. 복제 세트 실험에서 두 그룹 간의 통계 분석에 대 한 수정 하 고 릴리스 zip 파일에 제공 하는 R 스크립트를 실행 (참조 "WormLife 통계 분석 템플릿 스크립트입니다. R ")입니다.
      연구에서 능력 참고:이 스크립트를 실행할 필요가 없습니다. 추가 문서 파일에 코멘트에 있다입니다. 스크립트 예제 데이터 복제 집합의 분석에 대 한 준비가 되어있습니다. 사용자 생성 데이터를 적절 한 형식에서 ( 보충 파일 4참조) 또한 분석할 수 있습니다.
      1. R (R GUI 또는 RStudio)에서 스크립트 파일을 엽니다.
        참고:이 그것을 실행 하지 않고 스크립트를 표시 합니다.
      2. 컴퓨터에서 위치를 일치 하도록 필요한 파일의 위치를 수정 합니다.
        참고: 이러한 파일 경로 "정규화" 수 있어야 합니다 (즉, 폴더를 포함 하 여 전체 파일 위치를 포함 한다).
        1. "WlDir" (디렉터리의 위치), "데이터 파일" (복제 세트 데이터 파일을 분석), "compFile" (해당 되는 경우를 실행 하 고 비교의 사양), 및 "outputPath" (결과 파일이 작성 될 위치에 대 한 경로 (파일/폴더 위치) 수정 에)입니다.
      3. 분석 파일에 있는 열 이름을 예제 파일에서 다른 경우 "데이터 파일의 열 지정" 섹션에서 열 이름을 설정 합니다. 각 매개 변수에 대 한 열을 지정 합니다. 경우는 연구는 여러 변종, 하지만 아무 RNAi (또는 다른 처리) (예: "no_treatment", ) 모든 행에 대해 빈 항목 또는 같은 데이터 파일에 항목을 포함.
      4. "CompFile" 매개 변수를 설정 합니다. 나를 "compFile" 매개 변수를 설정 하는 경우 그룹의 모든 가능한 없음을 비교 실행 됩니다.
        참고: 그룹 스트레인/유전자와 연결 되 고 "strain_treatment"로 표시 되는 치료의 조합에 의해 정의 됩니다. 많은 그룹 큰 연구에 대 한 비교를 지정 하 여 CSV 파일을 제공할 수 있습니다. 예제 파일 "comps_rsm_example.csv"를 참조 하십시오.
      5. 몬테 카를로 리샘플링 반복의 수를 설정 ("k.resamp", 기본값은 1, 000).
        참고: 너무 몇 반복; 수행 될 때 반환 될 수 있습니다 0의 P-값 이러한 경우에 그것은 보고서에 적합 한 "p < 0.01" (경우 k.resamp = 100), 또는 "p < 0.001" (경우 k.resamp = 1000),
      6. 스크립트 실행: RStudio에서 "소스" 버튼 (편집 창 오른쪽 상단) 또는 R GUI에서 "편집" 메뉴에서 "소스 문서". (실행 시간이 좀 걸릴 수 있습니다.)
      7. R "바쁜" 표시기가 더 이상 표시 됩니다 때 열고 출력 디렉터리 거기 각 비교 (메디아 생존, p-값, % 평균 수명 변화)의 결과 테이블을 될 것입니다.

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Representative Results

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어떤 새로운 방법론의 개발, 새로운 방법 이전 접근 허용된 결과 고 필드 내에서 표준 충족 필수적입니다. 우리는 이전 표시 경험적으로 복제 설정 및 C. 선 충 수명 시 금를 위한 전통적인 방법 유사한 결과20생산. 야생-타입 C. 선 충 (N2) 일반적으로 20 ° C에서 유지 우리 전통 (그림 4A, 검은 선)과 복제 세트 접근 (그림 4B, 블랙) 관찰 20 ~ 25 일 살고 있다. 따라서, 두 방법 모두 합리적으로 야생-타입 수명 근사치. 또한 새로운 방법을 테스트 조건 및 상당한 변화를 감지 하는 통계적 인 힘 사이 변화를 정확 하 게 계량을 해상도 필수적 이다. 우리의 이전 연구에서 우리가 발견 Myc 가족 녹음 방송 요인의 C. 선 충 장 수의 결정 요인. mml-1 mxl-2 인코딩 포유류 몬도의 C. 선 충 homologs / 탄수화물 응답 요소 바인딩 단백질 (ChREBP) 및 Mlx, 각각. C. 선 충 과 포유류, 전사 조절 하이 Myc 가족 구성원 heterodimerize. 우리는 mml 1 또는 mxl-2 의 손실을 크게는 전통적인 수명 분석 결과 또는 복제 세트 (그림 4A-B, 황색, 적갈색) 측정으로 정상적인 수명 감소를 발견. MML-1::MXL-2 복잡 한 반면 우리 mdl-1 (포유류 매드 동종) 또는 mxl-1 (최대)의 손실을 크게 C. 선 충 수명 중 방법론 (그림 4 에 의해 측정 된 증가 발견 보라색과 파란색, 두 패널에 각각,).

장 수를 측정 하기 위한 전통적인 접근에 심각한 제한이 처리량입니다. 두 방법 모두 살아 동물 인지 전화 운동 또는 평가 하기 위해 점점 더 어려워진 죽은에 의존 합니다. 젊은 동물 자극의 부재에서 접시에 걸쳐 이동 하 고 따라서 점수 쉽다. C. 선 충 되 고 점점 노화 앉아있는 하지만 접시에 반전 운동에 의해 머리에 가벼운 터치에 반응할 것 이다. 그러나, 동물 이전으로 뒤로 이동 하는 능력 감소 그리고 점점 uncoordinated 된다. 궁극적으로 동물, sarcopenia, 강력 하 게 닮은 형 마비 되 고 전통적인 방법 생존을 통해 득점 때만 동물의 극단적인 앞쪽 끝에 미묘한 트 위치를 관찰 하 여 결정 될 수 있다. 반면, 복제 설정 방법을 통해 생존 점수, 액체 healthspan8의 판독으로 측정할 수 수 탈 곡 응답을 생성 하는 자극 역할 우물에 추가 됩니다. 액체에 운동 조차 더 오래 된 동물에 대 한 관찰 하기 쉽습니다: 날짜순 나이 일치 하는 늙은 동물 생산 건조 접시 더 발음에 미묘한 머리 움직임 (이기는 하지만 느린) 액체에 바디 벤드. 마지막으로 때 복제 세트 점수, 전체 잘 시야 (직경 ~1.1 cm) 이내 이며 동시에 서 스 펜 션-수 있도록 관찰 모든 동물의 모든 동물 들. 대조적으로, 전통적인 방법을 통해 6 cm 접시를 득점 하는 경우 하나의 전체에 걸쳐 스캔 해야 합니다 접시-세균성 잔디를 동물에 대 한 가장자리를 따라 검색. 이러한 차이의 그물 결과 복제 설정 메서드를 사용 하는 경우 처리량 적어도 크기 순서 동시에 100 개 이상의 전체 수명에 변화를 계량 가능 하 게 하는 전통적인 접근 보다는 한 수 사관으로 단일 실험에서 조건입니다. 예를 들어 게놈 넓은 먹이 기반 RNAi 화면에서 이전 했다 증가 수명에 의해 수 여에 필요한 159 유전자 식별 감소 daf-2 /8신호 인슐린 같이. 우리 야생-타입, 긴 daf-2(e1370) 돌연변이 및 단기 daf-2(e1370);daf-16(mgDf47) 이중 돌연변이 동물 (그림 5A), 유전자 해독 하는 수명에 변화를 계량 분석, 그 100 progeric 유전자 inactivations 인슐린 같이 신호 사이의 관계. 또한, 우리 평가이 progeric 유전자 inactivations에서 healthspan ("activespan" 라는 시간)에서 변경 하는 방법을 복제 (그림 5B) 시간에 걸쳐 때리는 C. 선 충 의 감소를 관찰 하 여.

Figure 1
그림 1: 먹이의 출현 기반 RNAi 리드 노화 연구에서 유전자 발견의 시대에 아직 대부분 gerogenes 남아 제대로 공부. (A) 많은 gerogenes 대규모 기능 게놈 스크린에서 처음 발견 되었다. 발견 날짜에 900 선 충 C. gerogenes의 많은 먹이 기반 RNAi, 유전자 검색에서 기능 게놈 접근의 가치를 강조 표시를 사용 하 여 확인 되었다. RNAi를 사용 하 여 원고 당 발견 하는 gerogenes의 수를 표시 하는 그래프, 기반 형에 주석 ( 재료의 표참조) 형 온톨로지 확장된 수명, 용어에 대 한 단축 수명, 수명 변종. Gerogenes을 발견 연구의 전체 목록에 대 한 추가 파일 1 을 참조 하십시오. (B) 대부분 gerogenes 남아 제대로 공부. 반면에 daf-16같은 게 잘 공부 gerogenes /FOXO (화살표), 이상의 800 참조, gerogenes의 대다수는 10 미만 참조 (일반 참조-아니 반드시 수명에 초점을 맞춘) 있다. 신뢰할 수 있는 높은 처리량 방법 gerogenes 사이 유전 상호 관계에 대 한 깊은 통찰력을 파생 하기 위하여 필수적인 것입니다. 그래프 pubmed에서 출판물과 RNAi 고기에서 발견 C.elegans gerogenes 간의 매핑을 기반으로 합니다. Gerogenes와 각각 연관 연구의 번호의 전체 목록에 대 한 추가 파일 2 를 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2:는 전통적인 고 C.elegans 수명 (A) 점수에 대 한 복제 설정 방법. C. 선 충 수명 점수는 전통적인 방법. 조건 당 isogenic 동물의 여러 작은 동기화 된 인구는 시간이 지남에 따라. 동물의 동일한 인구 연구 과정을 통해 따 랐 다. 생존 능력은 부드러운 괴롭히는 의해 자극 될 수 있습니다 운동에 의해 평가 됩니다. 이동에 실패 하는 득점 하 고 죽은 동물과 제거 (포부 표시)는 아무 가능한 동물 남아 때까지. (B). 는 복제 설정 방법 C. 선 충 수명 득점. Isogenic 동물 나이 동기화의 큰 인구는 동일한 복제 번호판의 숫자에 걸쳐 배포 됩니다. 각 시간 지점에서 단일 복제 득점: 가벼운 버퍼 솔루션 (M9) 추가 되는 자극 하는 운동. 홍수 우물을 통해 평가 저절로 이동 하지 못하는 동물 터치 자극. 실험에 대 한 채 점 기간 시작 전에 결정 됩니다. 각 동물 한 번만 득점 하 고 더 큰 인구에 대 한 장 수는 많은 독립적인 관측에서 파생 됩니다. (C). 복제 설정 방식은 양적 C. 선 충 수명 측정 하는 높은 처리량 방법입니다. 100 또는 더 독립적인 RNAi 클론을 동시에 추적할 수 있습니다. HT115 대장균 주어진 RNAi 클론 dsRNA를 나타내는 표시 됩니다. 사실상, 모든 24 샘플 96 잘 접시에서 단일 24-잘 접시 나누어집니다. 각 결과 24-잘 접시 네거티브 (즉, 빈 벡터, 레드 잘) 있으며 긍정적인 제어 (잘 그린) 무작위로 RNAi 클론 (노란색 우물)의 컬렉션에서 배포. 일반적으로, 컬렉션에서 첫 번째 잘 (A1)에 빈 벡터를 포함 되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI). (A). 기본 시작 화면을 보여주는 주요 줄거리 창 인터페이스. 이것은 어떤 소프트웨어를 열 때 표시 됩니다. 플랫폼 간의 모양이 다른 플랫폼 독립적인 윈도우 도구 키트의 사용 최소화 해야 합니다. (B). 주요 줄거리 창에서 사용할 수 있는 드롭-다운 메뉴에 대 한 메뉴 옵션의 개요. (C). 두 복제 세트에 대 한 예제 플롯 출력 스타일 (왼쪽)와 전통적인 카 플 란-마이어 스타일 (오른쪽) 데이터. 표시 되는 데이터는 독립적인 실험에서 수집 했다. 내보낸된 플롯 같은 레이블을 추가 최대 유연성을 위해 미리 그려진된 축 레이블을 포함 하지 않습니다. 이것을 촉진 하기 위하여 축 항상 y에 대 한 20% 씩 증가 하 고 x 축에 대 한 5의 증가에 분할 된다. 이 예제에서는 축과 선 레이블 (변형/치료)는 매우 간단 하 고 일반적인 이미지 편집 도구를 사용 하 여 저장 된 플롯에 추가 되었습니다. (D). 예의 출력에서 스타일 데이터 집합 복제 세트에 대 한 독립적인 실험의 결과 사이 시각적인 비교에 대 한 수 있도록 "TrialView" 기능. 이 음모는 두 개의 서로 다른 시련과 daf-2 EV(RNAi) (블루, 닫힌 원)에 대 한 해당 풀링된 결과 사이 결과 보여줍니다 N2 EV (RNAi) (검정, 닫힌 원)와 daf-16 (RNAi) (빨강, 오픈 다이아몬드)와 daf-2 . TrialView 풀링된 dataset의 적합의 품질에 영향을 미칠 수 있는 재판 관련 데이터 문제에 대 한 신속 하 게 확인 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 비슷한 결과 생성 하는 복제 세트의 전통적인 방법. 손실 MDL-1(Mad)::MXL-1(Max) heterodimer의 어느 부품의 수명을 증가합니다. 반면, MML-1의 어느 부품의 손실 (Mondo/ChREBP)::MXL-2(Mlx) 감소 수명이이 그림 (CC에서) 크리에이 티브 코몬즈 저작자 표시 라이센스 (참조 자료)를 통해 허가 기준20 에서 재 인 쇄입니다. (A). 카 플 란-마이어는 전통적인 방법으로 발생합니다. (B). 복제 설정 방법을 사용 하 여 맞는 로짓 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: RNAi 동시에 복제 복제 설정 방법 변화 수명 (A) 및 healthspan (B) 100 이상에서 변경에 따라 유전 상호 작용을 해독할 수 있습니다. 이 그림은 크리에이티브 커먼즈 저작자 표시-비-상업적 4.0 국제 라이센스 (CC-의해-NC) (참조 자료) 허가8 에서 증 쇄. Progeric 유전자 inactivations 감소 인슐린 같이 신호 (ILS) (daf-2, x 축)의 맥락에서 그리고 daf-16/FoxO (y 축), ILS21의 중앙 transcriptional 이펙터의 부재에서의 (A) 유전자 수명 분석 . Daf-16 으로 비슷한 기능을 가진 유전자 inactivations daf-16 (검은 점)의 부재에 수명이 더 단축 하지 않습니다. Daf-16 에서 완전히 독립적인 기능을 가진 유전자 inactivations 마찬가지로 두 유전 배경 단축 (회색). 유전자 inactivations 부정적인 daf 2에서 수명에 효과 > daf-2; daf-16, 병렬 (화이트) 기능 제안. (B) 시간이 지남에 탈 곡 속도에 변화는 수명 (y 축)에 변화를 평가 하는 동안 많은 유전 섭 (x 축)에 대 한 평균 healthspan을 파생 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

S 1 그림: WormLife에서 워크플로. 그림의 일부의 단계 워크플로 (때때로 "마법사"에 게 불리는) 안내. 이러한 경우, 워크플로의 마지막 단계 후의 각 초점 주요 줄거리 창으로 다시 반환 됩니다. (A) 데이터 가져오기 워크플로 스타일 데이터 집합 (B) 데이터 복제 설정 가져오기 워크플로 전통적인 카 플 란 Meier 스타일 데이터 집합에 대 한 대 한. (C) 복제 세트 스타일 데이터 집합에 대 한 음모에 라인을 추가 하기 위한 워크플로. (D) 전통적인 카 플 란 Meier 스타일 데이터 집합에 대 한 음모에 라인을 추가 하기 위한 워크플로. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 파일 1: gerogenes 식별 연구. 먹이-기반 RNAi의 출현 앞으로 유전자, 노화를 포함 하 여에 의해 세공 되지 않은 고기에 대 한 유전자 발견의 시대에 지도 했다. 리스트, 발견, gerogenes의 수의 순서 대로 그 활동 수명이 변경 유전자를 확인 하는 독립적인 연구 된다. Note gerogenes 가장 식별 연구 복제 설정된 방법8을 활용. 어떻게 유전자 inactivations 변경 수명 또한 표시의 자연: 장 수 및 progeric 유전자는 그 증가 또는 감소 수명 때 비활성화, 각각. "수명 변종" 경우를 말합니다 어디 변화의 방향 ( 증가 또는 수명 감소) 지정 되지 않았거나 없습니다 큐레이터. RNAi 치료 수명의 추가 함께 WormBase WS262 (1 월 2018) (참조 자료)에서 데이터 결과 참조10, 아직 WormBase RNAi 고기의 큐레이터 컬렉션에 포함 되지 않습니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보조 파일 2: 각 gerogene와 관련 된 연구 수. 대부분 gerogenes는 가난 하 게 공부 했다. 일부 유전자 daf-16/FoxO 같은 많은 연구 관심의 대상이 되어, 이상의 400 gerogenes가 10 미만 관련된 간행물. RNAi 치료 수명의 추가 함께 WormBase WS262 (1 월 2018)에서 데이터 WormBase RNAi 고기의 큐레이터 컬렉션에 아직 포함 되지 않은10 에서 유래한 다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 파일 3:에 대 한 일반적인 시 약의 준비 C. 선 충 실험. (A). 표준 NGM, RNAi 접시에 대 한 제조 법. (B). M9 차 아 염소 산 및 버퍼 솔루션에 대 한 제조 법. (C). 준비의 파운드 + 앰프/Tet 접시. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 파일 4: 예제 데이터 복제 세트. 복제 설정 수명 실험에서 예제 데이터 집합. 이 데이터 집합 이미 가져오기/분석에 적합 하도록 형식이 지정 됩니다. 조건 (스트레인/인 자형 및 RNAi의 조합) 당 두 개의 실험을 포함 한다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 파일 5: 전통적인 경도 예제 데이터. 오른쪽-검열와 전통적인 경도 수명 실험에서 예제 데이터 집합 준비 가져오기/분석의 카 플 란-마이어 생존 플롯 기능을 사용 하 여 포맷. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

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두 전통 및 복제 설정된 방법 날짜순 세 동물의 동기화가 필요합니다. 우리는 수정 된 달걀만 벗 성인 치료를 생존 벗 성인, 차 아 염소 산 치료를 사용 하는 동물을 동기화 하는 메서드를 포함 합니다. 이러한 배아 액체에 해치 고 발달 첫번째 애벌레 단계 (L1)에서 체포. L1 동물 식품 (예: 대장균 표현 dsRNA의 유전자)에 시드, 후 동물 개발을 다시 시작 합니다. L1 동물 벗 성인의 차 아 염소 산 처리에 의해 동기화 장점이 남은 unseeded L1 동물 동결 되 고 무한정 액체 질소 또는-80 ° C 냉장고에서 저장 될 수 있습니다. 이 방법에서는, 미래 연구를 위한 귀중 한 자원 만들기 및 재현성을 향상 실험 설치의 시간에 각 스트레인의 샘플 보존 됩니다. 그러나, 차 아 염소 산 벗 성인 동물의 치료는 노화 연구22에 대 한 동기화 된 동물을 얻을 수 있는 일반적인 방법을, L1 체포 기아 응답 이다. 따라서, 어떤 실험실 접시에 발생 전부 차 아 염소 산 치료를 지 내 다 고 (즉, 그는 누워) 몇 시간 동안 알을 낳 기를 잠시 벗 성인을 화 수를 선호 합니다. 후자의 경우에, 부모는 제거 하 고 자손 수명 뒤에. 우리의 지식 최선을 수명에 분명 한 차이가 M9, 접시, 또는 달걀 누워에서 자손에 부 화에 동기화 된 동물 사이 보고 되었습니다. 그러나, 그 양분 가용성에서 변화는 수명에 변화에 밀접 한, 우선 특정 유전 배경 동기화 방법 사이 다른 결과 생성할 수 있다. 좀 더 조심 분석이 이론적인 문제를 해결 하기 위해 필요 합니다.

시작 인구를 동기화 하는 데 사용 하는 방법에도 자손 생산을 방지 하거나 미래의 자손에서 동기화 시작 인구를 분리 단계를가지고 한다. 우리의 프로토콜에서 우리는 FUdR 자손 생산을 방지 하기 위해 사용 하는 방법을 개요 동물 구분으로 실행 가능한 옵션이 아니다 복제 설정 방법에 대 한. 그것은 또한 유전자 feminized 유전 배경 (예: fer-15(b26);fem-1(hc17), 온도 따른 불 임 스트레인23입니다)를 사용 하 여 자손 생산을 방지 하기 위해 가능한. 그러나도 결점 없이 이다: 유전 배경의 사용 수 후속 분석을 복잡 하 게 하 고 일부 유전 배경 FUdR 장 수24,,2526을 변경할 수 있습니다.

자손을 방지 하는 대신 화학 또는 유전을 통해 생산, 성인 동물 이동 될 수 있다 주기적으로 신선한 RNAi 번호판에서 그들의 자손 들을 의미 합니다. 이 처리량 비용 고려 사항을 배경 단순화합니다. 정기적으로 신선한 음식에 동물을 이동 가능한 기아를 방지 하 고 갱신 dsRNA에 노출의 추가 이점이 있다. 그러나, 수명에 영향을 주는 몇 가지 유전 상호 작용만 발견 했다 자손 생산을 저해 하는 때: 수명 표현 형에 대 한 TGFβ 통로의 초기 분석 잘못 감소 TGFβ 신호 영향 C. 선 충을 결론 dauer 형성 하지27,28노화 하지만. 그러나, FUdR을 사용 하는 연구를 수행 하는 TGFβ 신호 인슐린 신호29통해 증가 장 수 감소 밝혔다. 이전 연구는 왜 증가 수명 TGFβ 돌연변이 동물에서 볼 수 실패 했 어? TGFβ 통로 돌연변이 결함 (egl) 누워 약간의 달걀을 생산 하 고 나중에 부모를 죽이 자손의 내부 화를 일으키는 원인이 되는 생식 장 수 확장. 그것은 수명이 긴 TGFβ 돌연변이 동물 야생-타입 동물 일반적으로 죽을 때 무렵 동물 살해 egl 형 때문에 정상적인 수명을가지고 등장. 굶주린된 야생-타입 동물 또한 매니페스트 egl 형 아마도 낮은 식품의 조건에서 자손을 적응 생존 장점으로 서 박사에 연결 된 다른 유전자 경로에 관련 된 수 있습니다. 이 설계 수명 실험 동물 스트레스 조건과 주의 분석 및 고려 사항에 대 한 필요성에서 받아야 하는 적응형 응답에 기본 복잡성을 강조 표시 합니다.

설계 수명 실험 방법 중 하나에 의해 실시에 편견을 피하기 위해 긴요 하다. 더블 블라인드 방식으로 실험을 실시 해야 합니다: 어떻게 샘플 이전 이전 시간 지점에서 득점 했다 고 테스트 조건의 id는 실험 알 수 있어야 합니다. 또한, 그것은 항상 긍정적이 고 부정적인 컨트롤;를 포함 하는 데 필요한 복제 설정된 방법의 경우이 24-잘 접시에 무작위로 삽입 됩니다. 대장균 플라스 미드 삽입 시퀀스를 포함 하지 않는 표현 해당 선 충 C. 하 게놈은 빈 벡터 부정적인 컨트롤 (즉, "L4440"-참고 자료). 긍정적인 통제 실험의 특정 특성에 따라 달라 집니다. 예를 들어, daf-2 선 충 C. 인슐린/IGF-1 수용 체, 인코딩하고 먹이 기반 RNAi 통해 daf-2 비활성화 튼튼하게 수명 야생-타입 동물27에 적어도 2 배 증가 합니다. 따라서 수명 증가 유전자 inactivations를 찾을 때 daf-2(RNAi) 긍정적인 통제 역할 수 있습니다. 반대로, daf 16 FOXO 녹음 방송 요인 orthologue30인코딩합니다. DAF-16 많은 장 수 패러다임의 필수적인 구성 요소 이며, 야생-타입 동물 (N2) daf-16(RNAi) 로 치료는 짧은 살면서 progeria31의 흔적을 보여줍니다.

전통적인 경도 수명 접근의 기본 장점은 그것을 아주 잘 설립, 실험은 쉽게 설정입니다. 상대적으로 적은 동물 각 테스트 조건에 대 한 몇 접시에 필요 합니다. 따라서, 가난 하 게 성장 하거나 전파를 분산을 요구 하는 종자는 쉽게 테스트할 수 있습니다. 전통적인 접근은 높은 적응력 및 자손 생산 처리, FUdR로 치료를 포함 하 여, feminized 유전 배경으로 건너 또는 주기적으로 새로운 번호판 성인 동물을 이동 가능한 방법 중 하나를 함께 사용할 수 있습니다. 동안 낳는 기간. 크게 동물 이동 처리량 감소, 돌연변이 배경 작업은 결코 이상적인, 그리고 FUdR 팬 들은 야생-타입 수명32,,3334의 정보를 변경 하지 않습니다, 비록 그것은 수명에 영향을 미칠 수 있으며 관련된 고기 나이 일부 유전 배경35,,2526에. Note FUdR의 사용으로도 남성의 존재 것입니다 상당히 자웅 동체 수명13단축, 따라서 광고에 나온는 것 도달 L4 후 남성을 포함 하는 접시는 사용할 수 없습니다. 마찬가지로, 카 플 란 Meier 견적 및 관련된 커브와 로그-순위 테스트를 통해 분석 사망률 데이터에 대 한 잘 설립 이다. 그러나, 전통적인 수명 분석을 몇 가지 단점이 있다. 접시의 처리를 반복 (즉, 공기 판 노출) 공 수 곰 팡이 오염의 도입을 용이 하 게. 또한, 반복 손상 또는 동물, 특히 죽 일 수 있는 파고 인구 나이에서 발전 하 고 깨지기 쉬운 되. 오래 된 동물 대장균 된다 기회 주의 병원 체 (루멘을 식민지 화 하 고 인 두 포장)36동안 크게 마비 하 고 대장균 에 mired 되었다. 아주 오래 된 살아있는 동물만 미묘한 머리 움직임에 의해 식별할 수 있습니다. 따라서, 죽은 늙은 라이브 동물을 분류 하는 것이 쉽습니다. 마지막으로, 전통적인 접근은 처리량에 의해 제한 됩니다.

복제 설정 방법은 높은 처리량 및 양적. 그러나,이 방법의 단점은 시간과 리소스를 설정 하는 초기에 더 큰 투자입니다. 20 시간 포인트 30000 L1 동물 (약 15 동물 RNAi 복제 시간 포인트 당 당 시험 했다)는 대부분 긴장, 쉽게 하는 동안 문제가 될 수 있습니다 어떤 경우에 필요 합니다 100 RNAi 클론을 검사 하는 적당히 큰 실험. 예를 들어, 분산 또는 운반 하는 유전자 변형 라인 유지 되어야 하는 큰 입자 분류 ("벌레 정렬") 긴장 없이 제대로 전송 된 여분 염색체 배열 수 없습니다 쉽게 검사이 방법으로. 두 번째 단점은 그 자손 생산 해야 합니다 수 저해, FUdR 또는 feminized 유전 배경의 사용을 요구 하입니다. 마지막으로, 하나 하나 복제 실험의 시작 부분에 각 시간 점의 세트를 준비 해야 합니다 분석 결과 실행 됩니다 시간의 길이 알고 있어야 합니다. 그러나,이 방법의 이점은 수 많다. 무엇 보다도, 생존을 득점 하는 것은 훨씬 더 빨리 그리고 하나 쉽게 따를 수 동물 100 테스트 조건에 동시에 (즉, RNAi 클론). 복제 데이터베이스 집합 이므로 한 번 득점 다음 격판덮개의 아무 반복된 처리 하는, 또는 동물, 곰 팡이 오염의 가능성을 최소화 하 고 가끔 거친 괴롭히는 웜에 의해 발생 하는 사망률을 제거의 파고를 선택 합니다. 또한, 잘 하는 액체의 추가 크게 점수 용이. 접시에서 오래 된 동물을 해방 하 고 박테리아를 둘러싼 미묘한 머리 움직임에서 더 쉽게 득점을 지원 합니다. 액체의 추가 또한 피트 니스 (예: healthspan8,37)의 때리는 속도 측정을 기회를 제공 한다.

노후화는 여러 인과 메커니즘 해명에 시스템 생물학 접근의 사용을 요구 하는 관련 된 복잡 한 현상 이다. 이러한 방식을 자주 게놈/transcriptomic 데이터의 큰 볼륨을 사용 하 여 데이터 기반 모델링을 통합 하 고 수명 및 healthspan 측정을 보완 강력 하 고 높은 처리량 방법 필요. 높은 처리량 복제 설정 방법은 수 많은 RNAi 클론의 비교 경도, 일괄 처리 효과 인과 경로 간의 상호 작용을 유추할 수 있는 동적 모델의 개발을 촉진 하는 기술적인 오류를 최소화 하면서 양적 방식입니다. 또한, 복제 설정 방법 여러 가지 게놈 넓은 유전체학 접근의 통합은 나이 동기화 동물의 큰 인구 작은 인구 수로 나누어져 있기 때문에 가능 합니다.

다른 방법은 이전 C. 선 충 수명 실험, 종종 전통적인 경도 접근을 적응에 초점을 맞추고의 처리량을 개선 하기 위해 개발 되었습니다 (즉, 시간이 지남에 동물의 동일한 집합을 다음)에 자동 관찰 그리고 일반적인 평판 스캐너38,39또는 미세 판40등 보다 전문적인된 장비를 사용 하 여 녹음. 스캐너-기반 접근 자극으로 빛을 사용 하 고 살아/죽은 상태를 한 번에; 여러 접시에 대 한 움직임에 따라 결정을 순차적으로 캡처된 이미지를 비교 이러한 접근 독자적인 과학적 하드웨어를 필요로 하지 않는, 시간 워크플로 설정에 관련 된 원하는 규모에 따라 상당한 수 있습니다. 또는, 사용자 지정 미세 장치에서 수명 실험 깊이 phenotypic 특성 분석을 위한 단일 동물의 시간, 그리고 치료 자손, 하지만 미세 접시와 수집의 제조를 할 거 없이 허용 관련 된 미세 펌프 및 영상 장비. 반면, 복제 설정 방법, 상세한 소프트웨어와 함께에서 수 있습니다 이미 있는 일반적인 실험실 C. 선 충작업 도구를 사용 하 여 크게 향상 된 처리량을.

WormLife 소프트웨어 통계 비교 및 추가 플랫폼 호환성에 쉽게 액세스를 제공 하는 미래에 개선 될 것입니다. 소프트웨어에 대 한 최신 설명서는 소프트웨어 테스트 되었습니다 플랫폼에 대 한 설치 지침을 포함 하 여 GitHub 페이지에서 찾을 수 있습니다. 웹 기반 버전 또한 어떤 소프트웨어를 설치할 필요 없이 편리 하 게 액세스할 수 있도록 개발 될 것 이다.

요약, 복제 설정 방법 및 상세한 여기 자유롭게 사용할 수 있는 소프트웨어의 조합을 처리량 및 수명 실험의 견고성과 광범위 한 생존 기반 분석 (예: 향상을 위한 강력한 플랫폼을 제공 스트레스 내성, 독성 연구, healthspan, ). 기능 유전체학과 결합 하는 때에 특히이 이렇게 활용 metazoan 모델 시스템 C. 선 충 의 많은 혜택. 노화의 진행에 기여 하는 유전 상호 작용의 무수 한 해독

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Disclosures

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Acknowledgments

이 원고에 설명 된이 작업에 의해 제공 된에 대 한 자금:는 학장 및 대학원 의학 및 건강 과학 센터에 대 한 계산 혁신 (HSCCI);를 통해 치과 학장의 사무실의 로체스터의 대학 사무실 에이징 화목 (AG-NS-0681-10) 엘리슨 의료 재단 새로운 학자 funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) Gold Bio 12481C100
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) Alfa Aesar L16497
24 Well Culture Plates Greiner Bio-One #662102
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm Thermo-Fisher 242811
600 µL 96-well plates Greiner Bio-One #786261
2mL 96-well plates Greiner Bio-One #780286
Air-permeable plate seal VWR 60941-086
96-pin plate replicator Nunc 250520
bacto-peptone VWR 90000-368
bacteriological agar Affymetrix/USB 10906
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer Source Bioscience C. elegans RNAi Collection (Ahringer) See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal Source Bioscience C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis Samuelson Lab N/A https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife
L4440 Empty Vector Plasmid Addgene 1654 https://www.addgene.org/1654/
Wormbase http://www.wormbase.org/ 
OASIS https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ 
Graphpad Prism https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 

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복제 설정된 방법: 양적 측정 <em>꼬마 선 충</em> 수명에 접근 높은 처리량
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Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. J. Vis. Exp. (136), e57819, doi:10.3791/57819 (2018).More

Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. J. Vis. Exp. (136), e57819, doi:10.3791/57819 (2018).

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