طريقة تعيين النسخة متماثلة: نهج الفائق "قياس كمي" ايليجانس كاينورهابديتيس عمر
Summary
هنا يصف لنا طريقة “مجموعة النسخ المتماثلة”، ونهج لقياس كمي C. ايليجانس عمر/البقاء وهيلثسبان بطريقة الفائق وقوية، مما يتيح فحص ظروف كثيرة دون التضحية بجودة البيانات. هذا البروتوكول تفاصيل الاستراتيجية ويوفر أداة حاسوبية لتحليل البيانات “مجموعة النسخ المتماثلة”.
Abstract
الأسلوب “مجموعة النسخ المتماثلة” نهج لقياس عمر أو البقاء على قيد الحياة من الديدان الخيطية ايليجانس كاينورهابديتيس كمياً بطريقة الفائق، مما يسمح لمحقق واحد الشاشة أكثر العلاجات أو شروط على نفس القدر من الوقت دون فقدان جودة البيانات. الأسلوب يتطلب المعدات المشتركة التي وجدت في معظم المختبرات العاملة مع C. ايليجانس وهكذا بسيط لاعتماد. مراكز النهج على فحص عينات مستقلة من عدد السكان في كل نقطة مراقبة، بدلاً من عينة واحدة على مر الزمن مع الطرق الطولية التقليدية. سجل يستلزم إضافة السائل إلى الآبار للوحة متعددة جيدا، الذي يحفز C. ايليجانس للانتقال ويسهل تحديد التغيرات في هيلثسبان. وتشمل الفوائد الأخرى الرئيسية أسلوب “مجموعة النسخ المتماثلة” خفض التعرض للأسطح أجار للملوثات المحمولة جوا (مثل العفن أو الفطريات)، الحد الأدنى من التعامل مع الحيوانات، ومتانة لسوء التهديف متفرقة (مثل استدعاء حيوان كالميت عند فإنه لا يزال على قيد الحياة). بشكل مناسب تحليل ووضع تصور للبيانات من تجربة نمط “مجموعة النسخ المتماثلة”، وضعت أيضا أداة برمجية مخصصة. وتشمل القدرات الحالية للبرنامج رسم منحنيات البقاء على قيد الحياة لكل “مجموعة النسخ المتماثلة” والتقليدية (كابلان-ماير) تجارب،، فضلا عن التحليل الإحصائي “مجموعة النسخ المتماثلة”. البروتوكولات المقدمة هنا وصف النهج التجريبي التقليدي والأسلوب “مجموعة النسخ المتماثلة”، فضلا عن لمحة عامة عن تحليل بيانات المقابلة.
Introduction
كان من بين التقدم التكنولوجي معظم التحويلية نحو فهم الأساس الجيني للشيخوخة تطوير القائم على تغذية [رني] في ايليجانس جيم-1؛ قبل استخدام تجريبي [رني]، لم تكن تعمل العديد من الشيخوخة وراثيا أصعب. [رني] على أساس التغذية ويتحقق من خلال إنتاج دسرنا داخل كولاي التي تطابق الذاتية مرناً C. ايليجانس : إيبتج يدفع النسخ ثنائي الاتجاه عبر إدراج كدنا C. ايليجانس أما أو جزء من فتح إطار القراءة داخل بلازميد2. عندما C. ايليجانس آر عند سليمة دسرنا كولاي، التي تنتجها البكتيريا المنقولة من التجويف داخل الخلايا المعوية عن طريق البروتين transmembrane SID-23، وثم توزع من خلال ما تبقى من هذا الحيوان عن طريق سيد-14. داخل كل خلية، دسرنا خارجية تتم معالجتها بواسطة ديسير المعقدة في siRNA، التي تتفاعل مع مرناً ناضجة عن طريق إقران قاعدة مكملة لإنشاء جديد مزدوج siRNA مرناً. هذا الاتجاه هو الاعتراف بالمجمع RISC والمشقوق، وبالتالي اللاإنسانية مرناً الذاتية5. وهكذا، بمجرد تغيير إدراج بلازميد، أحد يمكن إلغاء تنشيط وظيفة تقريبا أي الجينات داخل الجينوم C. ايليجانس . هذا الاكتشاف أدى إلى خلق عدة كبيرة على أساس التغذية [رني] مجموعات المكتبات لتحويل الأرصدة كولاي التي يمكن دمجها لتحقيق تغطية حوالي 86 في المائة من المعروف، C. ايليجانس الجينات6 7.
منذ النهوض [رني] على أساس التغذية، شاشات شاملة في C. ايليجانس أدت إلى اكتشاف الجينات أكثر من 900 أن يغير عمر عند إبطال (كما يتضح من رابطات النمط الظاهري [رني] رعاية في وورمباسي)، الذي نشير إليه إلى كما جرجنس. تم اكتشاف دور لأغلبية جرجنس في السيطرة على طول العمر من خلال [رني] على أساس التغذية في عدد قليل من التقارير المنوي (انظر الشكل 1A و تكميلية الملف 1 لمزيد من التفاصيل). وقد حددت هذه جرجنس في بعض الحالات، استناداً إلى قياس الجدوى في واحدة أو عدد قليل من النقاط الزمنية، التي لا توفر مقياسا قابلة للقياس الكمي للتغيير في عمر مع العلاج [رني]. وفي حالات أخرى، احتسبت هذه الجينات كمياً للتغييرات في عمر، فضلا عن تعمل الإضافية المرتبطة بالعمر. على سبيل المثال، حددنا سابقا 159 الجينات التي كانت ضرورية لعمر الحيوانات مع انخفاض الأنسولين/منتدى إدارة الإنترنت-1 الإشارات العادية وزيادة، وقياس التغيرات في هيلثسبان. هذه، تسفر 103 الجينات إيناكتيفيشنز النمط الظاهري بروجيريك، كما أدى إلى خسارة في واحد أو أكثر من علامات الشيخوخة المبكرة8.
وبينما ارتبطت بعض جيروجينيس مع الدراسات 100 أو أكثر (مثل daf-16، داف-2، سيدي-2.1)، قد جيروجينيس ما يزيد على 400 الاستشهادات 10 أو أقل (الشكل 1B، و تكميلية ملف 2). وهكذا، حين اكتشف شاشات [رني] على أساس التغذية الشاملة واتفاقيتا تتميز مئات جرجنس المفترضة، كيف هذه وظيفة الجينات في السيطرة على طول العمر، والعلاقات الوراثية بين هذه المنتجات الجينات تظل سيئة درس. التحليل الكامل الطولي لتعمل المرتبطة بالعمر شرط أساسي لتحديد التفاعلات الجينية بين جرجنس (مثلاً epistatic التفاعلات، التفاعلات أسينثيتيك، إلخ.). اكتساب نظرة ثاقبة أعمق العلاقات الوراثية بين جرجنس يتطلب أسلوب كمي الفائق، الذي كما وروافع المزايا [رني] على أساس التغذية.
هذا الإجراء البديل الأكثر شيوعاً للشيخوخة عمر. النهج التقليدي لقياس معدل وفيات C. ايليجانس المسارات وفاة الحيوانات الفردية على مر الزمن داخل عينة صغيرة من سكان. ويلي على مر الزمن عدد صغير نسبيا من الحيوانات ودوريا بلطف محثوث بسلك البلاتين أو جفن، مع الحركة كمؤشر للبقاء (الشكل 2A). هذا الأسلوب قد استخدمت على نطاق واسع، كما أنها توفر قياسات مباشرة، مباشرة من المتوسط وعمر الحد الأقصى. ومع ذلك، هذا الأسلوب التقليدي مضيعة للوقت ونسبيا منخفضة الإنتاجية، مما يحد من عدد الحيوانات والظروف التي يمكن أن يقاس في نفس الوقت بطريقة الخاضعة للرقابة. ووجدت دراسة محاكاة مؤخرا أن العديد من الدراسات عمر C. ايليجانس الاعتداء ليس عددا كبيرا بدرجة كافية من الحيوانات لتكون قادرة على كشف التغيرات الصغيرة بين ظروف9موثوق. وعلاوة على ذلك، يتضمن هذا الأسلوب التقليدي مرارا وتكرارا التعامل مع نفس مجموعة الحيوانات على مر الزمن، والتي بدورها يمكن أن يعرض التلوث، ويمكن أن الضرر أو قتل الحيوانات تزداد ضعفا، الذين تتراوح أعمارهم بين.
قمنا بتطوير منهجية بديلة “مجموعة النسخ المتماثلة” لقياس عمر C. ايليجانس . تحقيقا لهذه الغاية، وعدد كبير من الحيوانات مزامنة العصر، وأسوي تنقسم إلى عدد السكان صغيرة (أو النسخ المتماثلة). يتم إنشاء عينات متماثلة ما يكفي لتغطية كل نقطة الوقت في التجربة المزمعة. على كل نقطة مراقبة الوقت، هو أحد النسخ المتماثلة وسجل عدد من الحي الميت ويتم التخلص من الحيوانات الخاضعة للرقابة، ثم الحيوانات داخل تكرار ذلك. وهكذا، أكثر من العمر المتوقع للسكان ككل، سلسلة من الفئات السكانية الفرعية المستقلة يتم دورياً عينات (الشكل 2). باستخدام مجموعات النسخ المتماثلة هناك لا الحث المتكرر للحيوانات ولا التعرض المتكرر للتلوث البيئي المحتمل. صلاحية ولاحظ عند نقطة مرة واحدة مستقلة تماما عن كل المراقبة الأخرى، مما يقلل من مناولة ويزيد الإنتاجية بضخامة على الأقل. وهذا أتاح لنا أن كوانتيتاتي التغيرات في عمر لاستنساخ مئات من [رني] في نفس الوقت8،10.
نقدم هنا بروتوكولات مفصلة لإجراء عمر C. ايليجانس عبر “مجموعة النسخ المتماثلة” والأساليب التقليدية للتهديف C. ايليجانس طول العمر. علينا أن نظهر أن يتم الحصول على نتائج مماثلة بين الأساليب. لدينا البرامج المتقدمة للمساعدة في تحليل رسومي لعمر البيانات التي تم إنشاؤها عن طريق أما النهج الذي نقدم بحرية تحت ترخيص GPL V3 (انظر الجدول للمواد). “وورمليفي” هو مكتوب في ص11، ويتضمن واجهة مستخدم رسومية (GUI) لرسم البيانات، التي تم اختبارها في نظام التشغيل Mac OS و Linux. وأخيراً، نحن مقارنة وعلى النقيض من القيود المفروضة على كل أسلوب وتسليط الضوء على الاعتبارات الأخرى عند اختيار بين نهج لقياس التغيرات الكمية في عمر C. ايليجانس .
Protocol
Representative Results
Discussion
أساليب تعيين التقليدية والنسخة المتماثلة تتطلب مزامنة الحيوانات زمنياً عاماً. نحن تتضمن أسلوب يقوم بمزامنة استخدام العلاج تحت كلوريت جرابيد من الكبار، حيث البقاء فقط من البيض المخصب مع الكبار جرابيد معاملة الحيوانات. هذه الأجنة هاتش في التعليق السائل واعتقال تنمويا في مرحلة اليرقات الأ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
التمويل اللازم لهذا العمل الموصوف في هذه المخطوطة وقدم: مكتب جامعة روتشستر “قائد الشرطة العسكرية” وكلية الطب وطب الأسنان عميد مكتب عبر مركز العلوم الصحية للابتكار الحسابية (هسكسي)؛ أليسون الطبية مؤسسة جديدة العلماء في “زمالة الشيخوخة” (AG-NS-0681-10) الممولين بأي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.
Materials
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 2mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis | Samuelson Lab | N/A | https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife |
| L4440 Empty Vector Plasmid | Addgene | 1654 | https://www.addgene.org/1654/ |
| Wormbase | http://www.wormbase.org/ | ||
| OASIS | https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ | ||
| Graphpad Prism | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
References
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA [10]. Nature. 395 (6705), 854 (1998).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2000).
- Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10565-10570 (2007).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295 (5564), 2456-2459 (2002).
- Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS letters. 579 (26), 5932-5939 (2005).
- Ceron, J., et al. Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library. Genome Research. 14 (14), 2162-2168 (2004).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility. Frontiers in Genetics. 8 (June), (2017).
- Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).
- . R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: https://www.r-project.org/ (2018)
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
- Shi, C., Murphy, C. T. Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers. Science. 343 (6170), 536-540 (2014).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 5318910 (282), 457-481 (1958).
- Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
- Rechavi, O., et al. Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans. Cell. , (2014).
- Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (7), 1989-2001 (2015).
- Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A (6), B393-B403 (1998).
- Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals. PLoS Genetics. 10 (4), e1004278 (2014).
- Ogg, S., et al. The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 0119-0128 (2005).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of ageing and development. 132 (10), 519-521 (2011).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PloS one. 9 (1), e85964 (2014).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of ageing and development. 131 (5), 364-365 (2010).
- Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
- Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139 (4), 1567-1583 (1995).
- Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling. Current biology. 17 (19), 1635-1645 (2007).
- Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. Worming pathways to and from DAF-16/FOXO. Experimental Gerontology. 41 (10), 928-934 (2006).
- Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).
- Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of ageing and development. 12 (2), 137-150 (1980).
- Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental gerontology. 13 (5), 369-373 (1978).
- Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).
- Anderson, E. N., et al. C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mechanisms of ageing and development. , 30-42 (2016).
- Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161 (3), 1101-1112 (2002).
- Yu, S., Driscoll, M. EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans. Experimental Gerontology. 46 (2-3), 129-134 (2011).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. , (2012).
- Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
