Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Den replika sæt metode: En høj overførselshastighed tilgang til kvantitativt foranstaltning Caenorhabditis elegans levetid

Published: June 29, 2018 doi: 10.3791/57819

Summary

Her beskrive vi metoden replikasæt, en tilgang til kvantitativt foranstaltning C. elegans levetid/overlevelse og healthspan i en høj overførselshastighed og robust måde, således at screening af mange betingelser uden at ofre datakvalitet. Denne protokol beskriver strategien og giver et software-værktøj til analyse af replikasæt data.

Abstract

Metoden replikasættet er en metode til at måle kvantitativt levetid eller overlevelse af Caenorhabditis elegans nematoder i en høj overførselshastighed måde, således at en enkelt investigator til skærmen flere behandlinger eller betingelser over den samme mængde gang uden tab af datakvalitet. Metoden kræver fælles udstyr findes i de fleste laboratorier, der arbejder med C. elegans og er således nemt at vedtage. Tilgangen er centreret om boltpistoler uafhængige prøver af en befolkning på hver observationspunkt og ikke en enkelt prøve over tid som med traditionelle langsgående metoder. Scoring indebærer tilføjer væske brønde i en multi godt plade, som stimulerer C. elegans til at flytte og letter kvantificere ændringer i healthspan. Andre store fordele ved metoden replikasæt omfatter reduceret eksponering af agar overflader til luftbårne forurenende stoffer (fx mug eller svamp), minimal håndtering af dyr og robusthed til sporadisk mis scoring (f.eks. kræver et dyr som dødt, når det er stadig i live). Passende analysere og visualisere data fra et replikasæt stil eksperiment, blev en brugerdefineret softwareværktøj også udviklet. Nuværende funktioner af software omfatter plotning af overlevelse kurver for såvel replikasæt og traditionelle (Kaplan-Meier) eksperimenter, som statistisk analyse for replikasæt. De protokoller findes her beskrive de traditionelle eksperimenterende tilgang og metoden replikasæt, samt en oversigt over de tilsvarende dataanalyse.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En af de mest transformative teknologiske fremskridt mod forståelse det genetiske grundlag for aging var udviklingen af fodring-baserede RNAi i C. elegans1; inden det eksperimentelle brug af RNAi var mange fænotyper af befolkningens aldring ikke genetisk tractable. Fodring-baserede RNAi er opnået gennem produktionen af dsRNA inden for E. coli , der svarer til en endogene C. elegans mRNA: IPTG inducerer tovejs transskription på tværs af et indstik af enten C. elegans cDNA eller en del af en Åbn læsning ramme inden for en plasmid2. Når C. elegans foder på intakt er E. coli, dsRNA produceres af bakterier transporteret fra lumen i tarmcellerne via SID-2 transmembrane protein3, og derefter distribueres gennem resten af dyret via SID-14. Inden for hver celle, eksogene dsRNA er forarbejdet af Dicer komplekse til siRNA, som interagerer med et modent mRNA via supplerende base parring til at oprette en ny siRNA-mRNA duplex. Denne duplex er anerkendt af RISC-komplekset og kløvet, dermed forringe den endogene mRNA5. Således, ved blot at ændre plasmidet indsætte, kan en Deaktiver funktionen af næsten enhver gen inden for C. elegans genom. Denne opdagelse førte til oprettelsen af flere store fodring-baserede RNAi biblioteker-samlinger af omdannet E. coli bestande, der kan kombineres for at opnå dækning af ca. 86% af kendt C. elegans gener6, 7.

Siden fremme af fodring-baserede RNAi, har omfattende skærme i C. elegans ført til opdagelsen af mere end 900 gener, der ændrer levetid når inaktiveret (som det fremgår af RNAi-fænotype foreninger kurateret i WormBase), som vi kalder at som gerogenes. En rolle for størstedelen af gerogenes i levetiden kontrol blev opdaget gennem fodring-baserede RNAi i et par skelsættende rapporter (Se figur 1A og supplerende fil 1 for detaljer). I nogle tilfælde, har disse gerogenes identificeret baseret på måling levedygtighed på en enkelt eller et par tidspunkter, som undlader at give et kvantificerbare mål for ændringer i levetid med RNAi behandling. I andre tilfælde er disse gener vurderet kvantitativt for ændringer i levetid, samt yderligere alder-associerede fænotyper. For eksempel, identificerede vi tidligere 159 gener, der var nødvendige for både normale og øget levetid af dyr med nedsat insulin/IGF-1 signaling, og målbare ændringer i healthspan. Af disse medføre 103 gen inactivations en progeric fænotype, som tab resulterede i et eller flere tegn på for tidlig aldring8.

Mens nogle gerogenes har været forbundet med 100 eller flere undersøgelser (fx daf-16, daf-2, sir-2.1), har over 400 gerogenes 10 eller færre citater (figur 1B, og supplerende fil 2). Således, mens omfattende fodring-baserede RNAi skærme har opdaget og flygtigt karakteriseret hundredvis af formodede gerogenes, hvordan disse gener funktion i levetiden kontrol, og de genetiske indbyrdes forbindelser mellem disse genprodukter forbliver dårligt studerede. Fuld langsgående analyse for alder-associerede fænotyper er en forudsætning for at identificere genetiske interaktioner mellem gerogenes (f.eks. epistatic interaktioner, asynthetic interaktioner, etc.). At få dybere indsigt i de genetiske samspillet mellem gerogenes kræver en høj overførselshastighed kvantitativ metode, som også udnytter fordelene ved fodring-baserede RNAi.

Den mest almindelige surrogat foranstaltning af befolkningens aldring er levetid. Den traditionelle tilgang til måling af C. elegans dødelighed spor dødsfald af enkelte dyr over tid i en lille population stikprøve. Et relativt lille antal dyr, der er fulgt med tiden og med jævne mellemrum er forsigtigt prodded med enten platin tråd eller øjenvipper med bevægelse som en indikator for levedygtighed (figur 2A). Denne metode har været almindeligt anvendt, da det giver enkel, direkte målinger af gennemsnitlige og den maksimale levetid. Men denne traditionelle metode er tidskrævende og relativt lav-overførselshastighed, der begrænser antallet af dyr og betingelser, der samtidig kan måles på en kontrolleret måde. En nylig simulation undersøgelse konstateret, at mange C. elegans levetid undersøgelser ikke assay et stort nok antal dyr at pålideligt registrere små ændringer mellem betingelser9. Denne traditionelle metode indebærer desuden gentagne gange håndtering af samme kohorte af dyr over tid, hvilket igen kan introducere forurening, og kan beskadige eller dræbe stadig skrøbelige, alderen dyr.

Vi har udviklet en alternativ "replikasæt" metode til måling af C. elegans levetid. Med henblik herpå, en stor population af alder-synkroniseret, isogene dyr er opdelt i en række små populationer (eller kopier). Nok replika prøver er genereret for at dække hvert tidspunkt i det planlagte forsøg. For hver observation tidspunkt, en af replikaerne er scoret for antallet af levende døde og censureret dyr, så dyr inden for at kopiere er kasseret. Således over den forventede levetid af befolkningen som helhed, en række uafhængige delpopulationer er periodisk stikprøven (figur 2B). I ved hjælp af replikasæt er der ingen gentagne prodding af dyr og ikke gentagen udsættelse for potentielle miljømæssige forurening. Levedygtighed observeret på engangs punkt er helt uafhængig af alle andre observation, hvilket minimerer håndtering og øger gennemløb af mindst en størrelsesorden. Dette har tilladt os at kvantificere ændringer i levetiden for hundredvis af RNAi kloner samtidig8,10.

Her præsenterer vi detaljerede protokoller for udførelse af C. elegans levetid via både replikasæt og traditionelle metoder for scoring C. elegans levetid. Vi demonstrere, at lignende resultater er opnået mellem metoderne. Vi har udviklet software til at hjælpe med den grafiske analyse af levetid data genereret gennem enten tilgang, som vi frit give under GPL V3 licens (Se tabel af materialer). "WormLife" er skrevet i R11, og indeholder en grafisk brugergrænseflade (GUI) til afbilde data, som er blevet testet i Mac OS og Linux. Endelig, vi sammenligne og kontrast begrænsninger af hver metode og fremhæve andre overvejelser, når du vælger mellem tilgange til at måle kvantitative ændringer i C. elegans levetid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. traditionelle metode for Scoring C. elegans levetid

  1. Forberedelse af reagenser
    1. Identificere deaktiveres via fodring-baserede RNAi-gener. Køb transformerede bestande af HT115 E. coli2 indeholdende RNAi klon af interesse. Alternativt, subclone cDNA af gen af interesse i multicloning site af L4440 plasmid.
      Bemærk: HT115 er en RNase III-mangelfuld E. coli stamme med IPTG-inducerbar T7 polymerase aktivitet, som bruges til at forhindre forringelse af dsRNA inden for bakterier. For levetid undersøgelser, der ikke bruger fodring-baserede RNAi, kan enten HT115 eller OP50 E. coli på standard NGM plader være anvendte.
    2. Forbered 3 – 6 (eller flere) 6 cm RNAi plader pr. test tilstand (supplerende fil 3 for opskrift). Gemme RNAi plader ved 4 ° C før såning med bakterier til op til flere måneder.
    3. Vokse transformerede E. coli natten (16-20 Hansen, 37 ° C ryster inkubator ved 180-220 RPM).
      Bemærk: HT115 E. coli er vokset i LB med ampicillin (50 mg/mL). Standard OP50 E. coli ikke er antibiotika-resistente og er vokset uden ampicillin. Kultur volumen afhænger # af plader, men er typisk mellem 8 og 100 mL af LB, afhængigt af forsøgets udformning.
      1. Koncentrere bakterier ved centrifugering ved 3.000 x g i 15-20 min i en benchtop centrifuge. Opsug supernatanten, og genopslæmmes pellet ved 1/10th start volumen (dvs. 10 x) i LB med ampicillin for HT115 (eller uden ampicillin for standard OP50).
      2. Alikvot 200 µL af koncentreret 10 x bakterier til hver 6 cm plade. Forbered 3-4 gentagelser pr. test tilstand, med 2 ekstra backup plader, der skal anvendes i tilfælde af kontaminering. Når du forbereder plader, mærke dem så eksperimentatoren scoring analysen er blind for de eksperimentelle betingelser, ved hjælp af en farvekode eller lignende kodning ordningen. Sikre, at koden er registreret.
      3. Tillad åben plader til tørre i et rent miljø som en laminar flow bench, indtil alle væske er blevet absorberet eller tillade, at overdækket plader til tørre på bænken natten over. Overvåge plader mens tørring for at sikre, at agaren er tør uden over tørring.
        Bemærk: Over tørring pladerne fører til krakning af agar, der vil forårsage C. elegans til graver sig ned i agaren. Våd agar overflader også fremme gravende.
    4. Gemme tørrede plader i en orm boks natten (op til 24 timer) ved stuetemperatur til at tillade induktion af dsRNA produktion. Efter 1 dag på RT, gemme plader ved 4 ° C i op til 2 uger i en forseglet zip-lock pose (for at forhindre plader fra udtørring). Før brug, skal du returnere plader til stuetemperatur inden for zip-lock pose til at forhindre kondensation fra at indføre luftbårne svampe forureninger.
  2. Synkronisering af C. elegans med hypokloritiske behandling
    Bemærk: Se supplerende fil 3 for M9 og hypokloritiske løsning opskrifter.
    1. Indsamle fælderne voksne dyr med M9. Brug en tilsluttet glas pipette til at flytte til 2 x 15 mL rør.
    2. Spin rør til 30" på ~ 2,000 rpm. Check for en pulje af på nematoder i bunden af røret. Opsug supernatanten. Vaskes to gange med M9 løsning, gentage spin og aspiration.
    3. Genopslæmmes C. elegans i 4 mL af M9. Tilsættes 2 mL hypokloritiske. Straks vortex for ~ 3 min, med periodisk kraftig omrystning. Efter 3 min, kigge efter en sky af æg under en dissekere mikroskop. Vortex en yderligere 10-20 s hvis æg ikke er blevet frigivet efter 3 min.
      Bemærk: Timing hypokloritiske behandling er afgørende. Æg i fælderne voksne er hvad overleve behandling. Efter ~ 3 min fælderne voksne bryde åben og æggene løber ud. Men, hvis æggene er pakket i hypokloritiske løsning for længe efter udgivelsen vil de dø. Omvendt, hvis fælderne voksne ikke efterlades i hypokloritiske løsning længe nok, vil ingen æg frigivet.
    4. Hurtigt vaskes med M9 løsning to gange som i trin 2.1.2.
    5. Genopslæmmes C. elegans æg pellet i 3 mL M9 og overførsel til en ny 15 mL tube. Tillade embryoner at klække natten over i 3 mL af M9 løsning med rotation ved 20 ° C.
    6. Beregne massefylden af L1 dyr (eller embryoner) pr. µL ved at droppe 10 µL af L1 løsning 3 x 6 cm plade og tælle antallet af L1 dyr til at beregne det gennemsnitlige antal L1s/µL.
      Bemærk: L1 dyr vil bosætte sig over tid. Derfor, L1 løsninger bør sammenblandes med jævne mellemrum.
    7. Frø 50 L1 dyr pr. plade. Invertere plader og forsegle med en elastik. Placerer pladerne i en plastik orm. Seal boks i en stor zip-lock pose. Flytte til en 20 ° C inkubator.
  3. At forebygge afkom produktion ved tilsætning af 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR)
    1. Vokse dyr indtil L4 fase ved 20 ° C. Check at se, om synkroniseret dyr har udviklet til L4 ca 40 h efter såning (trin 2.1.7).
      Bemærk:C. elegans udviklingsmæssige tid vil variere ved forskellige temperaturer12 og vækst priser af mutant dyr som satser ikke er blevet karakteriseret skal afprøves empirisk.
      1. Tilføje 160 µL af 50 x FUdR til hver 6 cm plade med L4 dyr.
        Bemærk: Det er afgørende at tilføje FUdR på stadiet L4. For nemheds skyld gøre 1.000 x bestande af FUdR ved at opløse 1 g FUdR i 10 mL ultrarent H2O. Filter-sterilisere stock FUdR med et 0,2 µm filter og en 10 cc sprøjte. Alikvot ~ 1 mL af materiel i sterile 1,5 mL rør. Fryse og opbevares ved-20 ° C.
    2. Inspicere plader for tilstedeværelsen af mandlige C. elegans. Fjerne alle hanner.
      Bemærk: levetid måles typisk for hermafroditter og ikke mænd. Hermafroditter, at parre lever kortere end unmated dyr, selv i nærværelse af FUdR13. Hannerne er mindre og tyndere så hermafroditter og let kan identificeres af en karakteristisk kroget hale14.
    3. Sætte boks tilbage ind i zip-lock pose. Tilbage til 20 ° C inkubator.
  4. Scoring levedygtighed
    1. Score levedygtighed dagligt ved forsigtigt at trykke på dyret i hovedet med en platin tråd eller øjenvipper. Score dyr, der undlader at flytte som døde og fjerne dem fra pladen (figur 2A). Registrere antallet observeret døde for hver betingelse for hver observation tidspunkt.
      Bemærk: For at reducere risikoen for scoring bias, eksperimentatoren skal forblive blind til eksperimentelle betingelser og på samme måde skal ikke referere resultaterne fra tidligere tidspunkter under scoring.
    2. Censor dyr, at briste, dør af andre oplagte udvikling defekter, eller kravle op på siden af fadet: Fjern disse dyr og post nummer på hver observeret gang punkt til overvejelse i den statistiske analyse. Desuden, hvis hanner findes, fjerne dem og registrere antallet observeret.
    3. Gentag fra trin 1.4.1 dagligt indtil ingen dyr forblive i live.
      Bemærk: Bør græsplænen af E. coli mindske betydeligt eller svamp begynder at vokse på pladen, overføre alle tilbageværende dyr til en frisk plade med passende RNAi og FUdR.
  5. Data analyse - plotte og statistik
    1. Input eller åbne registrerede observation data i software støtte overlevelses analyse med ikke-parametrisk Kaplan-Meier estimator15 og log-rank test16 (Se supplerende fil 3). Sørg for at medtage censureret dyr. Ikke omfatte hanner, der blev observeret, hvis nogen.
      Bemærk: dataformater kan variere mellem software, men et fælles format er at registrere hvert enkelt dyr observeret på en separat linje. Den eksperimentelle tidspunkt hvor et dyr blev observeret som døde er "begivenhed" tid. Hvis censureret, er "begivenhed" tid det tidspunkt, hvor dyret blev censureret. Der er normalt et felt eller afkrydsningsfeltet for at angive censureret observationer.
    2. Plot Kaplan-Meier overlevelse kurver. Vælg færre end seks betingelser for en enkelt plot, hvis mange betingelser blev analyseret for at forbedre læsbarheden.
      1. Kontrollere data problemer, der er visuelt tydeligt - manglende observationer, uventede kontrolresultater, osv. — og løse disse før statistisk analyse.
    3. Brug funktionen log-rank test i din software til at udføre parvis statistiske sammenligninger. Sikre, at alle tilgængelige muligheder for behandling af censurerede resultater er indstillet korrekt til højre-censureret data.

2. replika sæt metode for Scoring C. elegans levetid

Bemærk: mens den traditionelle metode kræver 3 – 6 plader pr. betingelse (Se 1.1.2. ovenfor), metoden replikasæt kræver mange flere (Se trin 2.2.2 nedenfor). Den traditionelle metode følger dyr på den samme plade i hele et eksperiment (figur 2A). Derimod med replikasæt dyr er kun scorede en gang: mange identiske replikater er oprettet i begyndelsen af eksperimentet, således at én replikat er scoret på hvert tidspunkt (pr. retssag) (figur 2B).

  1. Konfiguration af mediebibliotek.
    Bemærk: Yderligere detaljer om aflevering RNAi kloner er dækket her, som replikasættet protokol er indstillet til den samtidige scoring af mange RNAi kloner, og kan skaleres til langt over 100 kloner ad gangen. Samlinger af RNAi kloner bevares som glycerol bestande opretholdes i en 96-brønds format plade. Replika sæt eksperimenter bruger 24-godt plader. Hver er godt betingelsen forskellige test, som kan svare til en samling af RNAi kloner, forskellige kemiske behandlinger, animalske stammer, og så videre.
    1. Samle opstillingen af sublibrary for samlinger af RNAi kloner, således at følgende betingelser er opfyldt:
      1. Sikre, at inden for en 96-brønd samling, godt A1 er en tom vektor negativ kontrol.
      2. Indsætte en ekstra tomme vektor kontrol tilfældigt inden for hver 24 brønde.
      3. Opdele 96-brønd plade i blokke af 24 brønde, sådan at hver 24-godt plade har på et tilfældigt indsat negativ kontrol (figur 2 c).
      4. Indsæt en positiv kontrol tilfældigt inden for hver gruppe af 24-brønde (figur 2 c).
        Bemærk: Den positive kontrol er afhængig af den eksperimentelle spørgsmål. For eksempel, når man ser på en samling af RNAi kloner at øge levetiden, er daf-2(RNAi) ofte inkluderet. Omvendt, når man ser på forkortet levetid, daf-16(RNAi) ofte anvendes.
  2. Forberedelse af replikasæt
    Bemærk: antallet flergangsbestemmelser behov er lig med det mindste antal tidspunkter (figur 2B). Man skal vide a posteriori hvor lang tid til at måle levetiden forud for starten af forsøget, samt scoring frekvens (f.eks. en replika sæt eksperiment kører 40 dage med hver anden dag scoring kræver forberede mindst 20 replikasæt for hver tilstand i begyndelsen af eksperimentet). Det er tilrådeligt at gøre ~ 5 ekstra backup sæt (Se 2.2.2 og 2.2.2.3 nedenfor).
    1. Hvis du vil oprette en frisk stempel af RNAi sublibrary, podes 200 µL LB + Amp pr. brønd i en 96-brønds format (600 µL plader) ved hjælp af en 96-pin plade replicator af følgende trin:
      1. Sterilisere 96 pin plade replicator af sekventielt fordybe til benene i 50% blegemiddel, laves H2O og ethanol. Holde benene nedsænket til mindst 30 s til skridt, blegemiddel og ethanol.  Efter neddykning i ethanol, flamme tips kort. Gentag.
        Bemærk: Sørg for at skylle alle blegemiddel, og lad ikke benene er udsat for blegemiddel i længere perioder, som blegemiddel kan ætse rustfrit stål pins.
      2. Fjern forsigtigt selvklæbende folie dækning fra frosne 96-brønd glycerol stock bibliotek plade og forsigtigt men fast male tips af steriliseret plade replicator til wells af de stadig frosne glycerol bestande. Podes 200 µL LB + Amp kulturer og forsegle den podede plade med en gennemtrængelig membran. Tillad kulturer at vokse natten på benchtop.
      3. Sterilisere plade replicator som i trin 2.1.1, omhyggeligt Fjern forseglingen fra flydende kultur plade efter natten vækst og fordybe tips replicator Pins. Anvende tips med jævnt Tryk på en rektangulær LB amp + tet agar plade og overføre bakterier fra knappenåle til pladen forsigtigt med en lille cirkulær bevægelse, at sikre, at passende plads der er tilbage mellem tilstødende steder. Tillad kolonier til at vokse natten på agar plade ved 37 ° C. Se supplerende fil 3 for forberedelse af LB + Amp/Tet plader.
      4. Før brug, gemme agar plade ved 4 ° C inverteret (låg side ned), indpakket i paraffin film.
        Bemærk: Lagring kolonier låg side vil tillade kondens cross-forurene RNAi kloner! Kolonier af E. coli kan lagres i 2-8 uger ved 4 ° C, afhængig af særlige RNAi kloner, som RNAi kloner bevare effektiviteten i overtalelse dsRNA efter IPTG induktion til varierende længder af tid. For små samlinger af RNAi kloner, bør RNAi effektivitet være empirisk bestemt af RT-qPCR at bekræfte knockdown.
    2. Beregne det mindste antal 24-godt plader nødvendig for en prøveversion af eksperimentet: (# plader pr. replikasættet) x (forventede # tid point). Sikre, at et par ekstra replikasæt er medtaget for at håndtere problemer som forurening (figur 2B).
      Bemærk: Det samlede antal RNAi kloner bestemmer antallet af 24-godt plader til at gøre et sæt af replikaer for hvert tidspunkt (figur 2 c).
      1. Forberede 24-godt plader, som trin 1.1.2 (supplerende fil 3 for opskrift). Label plader, når du forbereder dem så eksperimentatoren scoring analysen vil være blinde for de eksperimentelle betingelser, ved hjælp af en farvekode eller lignende kodning ordningen.
      2. Podes ét sæt af 1,5 mL LB + Amp kulturer for hvert 10 kopier (Se 2.2.2). Podes kulturer i 96 godt dybt-godt plader ved hjælp af plade replicator (som i 2.1.3) og bakteriel kolonier fra 2.1.4 (figur 2 c, venstre). Forsegle med åndbar membran, vokse 20 h (37 ° C) under omrystning.
      3. Seed 120 µL af en overnight kultur til hver plade ved hjælp af en 6-godt multikanalpipette med justerbar tip afstand (figur 2 c, højre). Tørre plader afdækket i en laminar flow hætte, indtil alle væske er blevet absorberet. Over tør ikke. Gemme plader natten over ved stuetemperatur.
  3. Synkronisering af C. elegans ved hjælp af hypokloritiske behandling
    1. Beregne det mindste antal dyr behov for eksperimentet: minimum # af L1s behov = (15-20 dyr/brønd) (24 brønde/plade) (X plader/replika sæt)(Y replica sets).
      Bemærk: metoden replikasæt kræver flere dyr end den traditionelle metode. En 10 cm plade fuld af fælderne orme kan give 20.000-50.000 L1 dyr afhængigt af tætheden af fælderne voksne. På samme måde, tyve 6 cm plader give omkring ~ 30.000 L1 dyr. Planlæg at forberede et æg forberedelse, der fordobler Mindsteantallet af dyr behov. Hvis befolkningen i forberedelse har sultet, re feed eller luns til en ny plade og tillade mindst tre generationer på mad før partition17,18. Sørg for at fryse tilbage sidesten L1s.
    2. Følg trin 1.2 til 1.2.6 som i den traditionelle metode at få synkroniseret L1 dyr. Seed 15 – 20 L1 dyr i hver brønd med en 6-godt justerbar linjeafstand pipette og reagens reservoir, svarende til 1.2.7. Periodisk Bland L1 løsning forhindrer afvikling af dyr.
  4. Forebyggelse af afkom produktion ved tilsætning af 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR)
    1. Følg trin 1.3.1.  Forberede sterile 50 x FUdR lager (Se trin 1.3.1.1).
    2. Når dyr reach L4, tilsæt 25 µL af 50 x FUDR til hver brønd med en 24-godt plade ved hjælp af en 6-kanal justerbar linjeafstand pipette.
  5. Score levedygtighed
    1. Fjerne en række Repliker plader og oversvømme brønde med M9 løsning, optage samlede dyr pr. brønd, og tryk forsigtigt på ikke-bevægelige dyr på hovedet med en orm pick (figur 2B). Dyr ikke at flytte er scorede som døde. Kassér scorede plader. Optag levedygtighed dagligt.
      Bemærk: Er at blive censureret ved at udelukke dem fra de samlede værdier, døde dyr, brud, Vis brutto morfologiske defekter, undladt at udvikle eller kravlede op på siden af brønden.
      1. Registrere antallet af dyr, der er censureret i hver brønd ved hvert tidspunkt adskilt fra de andre værdier.
      2. Ikke score brønde, der ikke har mad eller forurenet (fx svamp eller slim); sådanne brønde betragtes censureret. Også censurere et godt, hvis alle dyr viser morfologiske eller udviklingsmæssige defekter. Registrere hændelsen censurerende for denne RNAi klon/godt for dette tidspunkt.
      3. Efter scoring en Repliker plade, kassere den. Fortsætte scoring en ny replikat indstille hver dag, indtil alle dyr på tværs af alle brønde er døde. For at mindske risikoen for scoring bias, eksperimentatoren skal forblive blind til eksperimentelle betingelser og på samme måde skal ikke referere resultaterne fra tidligere tidspunkter under scoring.
      4. Hvis alle dyr inden for en brønd var død på et givet tidspunkt, så efter dagens scoring, undersøge, om alle dyr er blevet scoret som døde for to på hinanden følgende tidspunkter for et givet godt. Hvis ja, er scoring levedygtighed ikke længere nødvendig for at nå i senere tid point.
      5. Gennemføre yderligere uafhængigt eksperiment forsøg. Spore resultaterne af efterfølgende forsøg separat fra de tidligere forsøg, med den retssag nummer noteret.

3. diagramdata

Bemærk: Med replikasættet metode passer til en kurve kan anvendes for at tilnærme den gennemsnitlige og maksimale levetid. Parametre til vurdering af C. elegans dødelighed passer en logit kurve19.  Som de fleste overlevelse værktøj ikke understøtter logit kurve montering, blev et nyt program udviklet til plotning logit kurver (for replikasæt); Kaplan-Meier kurver (for den traditionelle metode) understøttes også.

  1. Komme i gang med softwaren. Download udgivelse zip-filen til den aktuelle version (Se Materialer afsnit). Uddrag zipfil hen til en omslag. Se "readme" fil i den uddraget omslag for yderligere installationsinstruktioner.
  1. Start den plotting grænseflade. Find placeringen af mappen "kode" i mappen udvindes af zip-filen (f.eks.  "/ Brugere/UserName /Desktop/WormLife/kode").
    1. Skriv følgende kommandoer i konsollen Rasmussen, erstatte mappestien bare identificeret. Tryk på Angiv eller vende tilbage efter hver linje: 1) setwd("/Users/UserName/Desktop/WormLife/code"), 2) source("plotGUI.R"), 3) openMain().
    2. Give tid til grænseflade til at indlæse i et nyt vindue, opdrage standardskærmbilledet, som vist i figur 3A. Lad R kører i baggrunden.
  2. Formatere data som kommaseparerede værdier (CSV) eller filer med tabulatorseparerede værdier (TSV). Angiv kolonner og navne, afhængig af hvilken type analyse. Se supplerende fil 4 (replikasæt) og supplerende fil 5 (traditionelle/Kaplan-Meier) for præ-formateret eksempeldata.
    Bemærk: Data skal angives i en "lang" format, dvs. én række pr. stamme/behandling pr. tidspunkt pr. forsøg. CSV-filer er anbefalet for bedste kompatibilitet mellem platforme.
    1. Fjerne rækker svarer til observationer, som blev sprunget over eller censureret. Kontrollere, om manglen mangler eller er ikke-numeriske værdier, da det kan resultere i en fejl, når dataene er importeret.
    2. For traditionelle Kaplan-Meier stil analyse, ikke pool data fra uafhængige forsøg-plot dem separat. For replikasæt analyse, samle data fra flere forsøg og derefter undersøge ved hjælp af funktionen "TrialView" (Se 6.3.3.4).
  3. Ved hjælp af plotting interface
    1. Indlæse en datafil ("import" under menuen "Filer") ved hjælp af dialogboksen. For at åbne ".csv" filer, ændre filtypen i drop ned til ".csv" (standard er ".txt/.tsv"), navigere til mappen med datafilen. Her er fil replikasæt example data (supplerende fil 4).
      Bemærk: Importere en fil, når et datasæt er allerede åben vil erstatte det aktuelle datasæt.
    2. Vælg en fil til at importere for at starte importguiden, som går gennem identificerer kolonnerne i den markerede fil (Figur S1A for replikasæt). Hvis input-data svarer til et replikasæt eksperiment, skal du vælge "Logit" for undersøgelse type.
      Bemærk: Import workflow er forskellige mellem replikasæt (Figur S1A) og traditionelle (Kaplan-Meier) (Figur S1B).
    3. "Afbilde data". Vælg "Tilføj linjen" at begynde at afbilde data. (En linje svarer til et sæt af betingelser. Der er funktioner, der hjælper med eksperimenter hvor mange betingelser blev testet).
      1. Plot kontrol betingelser-for eksempeldata N2 (WT) med L4440 (Tom vektor) RNAi er passende. Vælg "Tilføj linjen" under menuen "Grafer" for at starte guiden Tilføj linjen: Vælg betingelsen til plot og de grafiske parametre til at repræsentere linjen.
        1. For at tilføje en kurve til en anden tilstand manuelt, skal du gentage trin i 3.3.3.1
        2. Du kan ændre farve eller plot symbol for en linje, skal du vælge "Rediger linjen" under menuen"graf".
        3. Hvis du vil fjerne en linje uden at rydde alle linjer, skal du vælge "Slet linje" under menuen"graf".
        4. Du kan rydde alle linjer i det aktuelle plot, skal du vælge "Klar linje" under menuen"graf".
        5. Hvis du vil tilsidesætte værdien automatisk valgte maksimale x-aksen (tid), bruge "Sæt X skala" under menuen"graf".
          Bemærk: y-aksen (overlevende brøkdel) viser altid 100% (øverst) til 0% (nederst) i trin på 20%. X-aksen vises altid i intervaller af 5. Akseetiketter afbildes ikke aktivere fleksibilitet i mærkning efter gemning plot billeder.
      2. For at gemme billeder i JPEG-format for den aktuelt viste plot, skal du bruge indstillingen "Gem Plot" i "File menuen"; kun den aktuelle plot er gemt.
      3. For at oprette individuelle grunde til mange forskellige betingelser i et eksperiment, tillader softwaren udformningen og plotte en "serie".
        Bemærk: Gennemførelse af begrebet serien forbedrer effektivitet, når du arbejder med store eksperimenter.
        1. Hvis starter med en tom plot arbejdsområde, tilføje linjer svarer til kontrol betingelser, der er at være konsekvent på tværs af alle parceller i serien (Se 3.3.3.1).
        2. Angive serie med "Definere serie" i menuen grafer. Vælg en tilstand svarer til linjen skal vises først i serien; kun én kan vælges. Vælg grafiske parametre (linje farve og plot symbol) for linjen, som i 3.3.3.1.
        3. Anmeld parceller i forhold til de forskellige test. Skifte visningen af linjen"serie" mellem tilstande ved hjælp af knapperne venstre/højre pil findes på siderne af vinduet hovedhandlingen samt i den øverste menu bar (figur 3A-C).
          Bemærk: Hvis den valgte serie er den samme betingelse som en af de tidligere tilføjede kontrol/referencelinjer, den nye linje kan forekomme overlejres.
        4. Definere serien for at gøre visse andre funktioner tilgængelige (gemme serien Plots og Trialview-Se 3.3.3.4 for den sidstnævnte). Efter definerer en serie, skal du bruge indstillingen "Gem serie grunde" fra menuen "Filer" til at gemme individuelle plot billedfiler for hvert enkelt observationsområde i serien i en ny mappe.
      4. Trialview — visualisering af resultaterne fra uafhængige forsøg med et replikasæt eksperiment. Hvis flere forsøg blev kørt til en eller flere af grupperne prøve, afbilde data fra de enkelte forsøg og de poolede data fra alle forsøg separat til at vurdere sammenhængen mellem uafhængige forsøg (Se figur 3D).
        1. Oprette en serie, som beskrevet i 3.3.3.3. Forskellige undersøgelser afbildes for hver af grupperne "varierende" prøven i et andet billede over de respektive forsøg de angivne Henvisningsobjektet prøver.
        2. Hvis du vil gemme TrialView billederne, gå til "Udskriv TrialViews" i menuen Data. et JPEG-billede vil være output for hvert enkelt observationsområde i serien.
          Bemærk: Eksempel resultaterne i figur 3D er for en sag med to forsøg.
    4. Median levetiden oversigtstabel for replikasæt data. Visuelt inspicere kurver for at sikre rimelige fit af data, så vælg "oversigtstabel" indstillingen i menuen Data til at gemme en tabel med median levetiden værdier (tid på 50% overlevelse på logit kurve) for hver prøvetype.
  4. Statistisk vurdering af data genereret via metoden replikasæt
    1. Statistisk analyse mellem to grupper fra et replikasæt eksperiment, ændre og køre en R script, forudsat i release zipfil (Se "WormLife statistiske analyse skabelon script. R").
      Bemærk: Færdigheder i R er ikke forpligtet til at køre scriptet. Yderligere dokumentation er i kommentarer i filen. Scriptet er klar til analyse af eksempel replikasæt data. Bruger-genereret data i det korrekte format kan (Se supplerende fil 4) også analyseres.
      1. Åbn scriptfilen i Rasmussen (R GUI eller RStudio).
        Bemærk: Dette viser scriptet uden at køre det.
      2. Ændre placeringen af nødvendige filer til at matche placeringen på computeren.
        Bemærk: Disse filstier skal "udlært" (dvs. bør omfatte komplet filplaceringen, herunder mapper).
        1. Ændre stier (filen/mappen lokaliteter) for "wlDir" (placeringen af mappen), "dataFile" (replikasæt datafilen til at analysere), "compFile" (specifikation af sammenligninger til at køre, hvis det er relevant) og "outputPath" (placering hvor resultatet filer vil blive skrevet til).
      3. Sæt kolonnenavne i afsnittet "Angiv kolonner i datafilen", hvis kolonnenavnene i den fil der skal analyseres er forskellig fra eksempelfil. Angive en kolonne for hver parameter. Hvis en undersøgelse har flere stammer, men ingen RNAi (eller anden behandling) omfatter en kolonne i datafilen med tomme poster eller det samme for alle rækker (f.eks. "no_treatment", osv.).
      4. Indstil parameteren "compFile". Hvis parameteren "compFile" er indstillet til NA, køres alle mulige parvise sammenligninger af grupper.
        Bemærk: En gruppe er defineret ved en kombination af stamme/genotype og behandling, som er sammenføjet og vises som "strain_treatment". For større undersøgelser med mange grupper, kan en CSV-fil angiver sammenligninger tilvejebringes. Se eksempel filen "comps_rsm_example.csv".
      5. Angive antallet af gentagelser til Monte Carlo resampling ("k.resamp", standarden er 1.000).
        Bemærk: P-værdierne 0 kan returneres når for få gentagelser er udført; i sådanne tilfælde er det hensigtsmæssigt at betænkningen "p < 0,01" (hvis k.resamp = 100), eller "p < 0,001" (hvis k.resamp = 1.000), osv.
      6. Kør scriptet: "" kildeknappen i RStudio (øverst til højre i vinduet edit) eller "kildedokument" i menuen "Rediger" i R GUI. (Udførelse kan tage lidt tid.)
      7. Når indikatoren R "optaget" ikke længere vises, åbne output directory-der vil være en tabel med resultaterne for hver sammenligning (median overlevelse, p-værdier, % median levetiden ændring).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I udviklingen af en ny metode er det bydende nødvendigt, at den nye metode sammenfatter accepteret resultaterne fra tidligere tilgange og opfylder standarden inden for et felt. Vi har tidligere vist empirisk at replikasæt og traditionelle metoder til paavisning C. elegans levetid producere lignende resultater20. Wild-type C. elegans (N2) vedligeholdes ved 20 ° C typisk lever mellem 20 og 25 dage, som vi observeret med både traditionelle (figur 4A, sort linje) og replikasæt tilgang (figur 4B, sort). Således tilnærme begge metoder med rimelighed vildtype levetid. Det er også vigtigt, at en ny metode har opløsning til nøjagtigt kvantificere ændringer mellem prøvningsbetingelser og statistiske beføjelse til at opdage væsentlige ændringer. I vores tidligere undersøgelse opdagede vi, at familien Myc af transkriptionsfaktorer er determinanter for C. elegans levetid. MML-1 og mxl-2 indkode C. elegans homologs af pattedyr Mondo A / kulhydrat svar element bindende protein (ChREBP) og Mlx, henholdsvis. I både C. elegans og pattedyr, disse Myc-familie medlemmer heterodimerize at regulere transskription. Vi fandt, at tabet af enten mml-1 eller mxl-2 betydeligt reducerer normale levetid, som målt ved enten en traditionel levetid assay eller replikasæt (figur 4A-B, gule og rødbrune). I modsætning til MML-1::MXL-2-komplekset fandt vi, at tab af enten mdl-1 (homologe til pattedyr Mad) eller mxl-1 (Max) betydeligt øget C. elegans levetid målt som enten metode (figur 4 lilla og blå, henholdsvis i begge paneler).

En alvorlig begrænsning til den traditionelle metode til at måle levetiden er overførselshastighed. Begge metoder er afhængige af bevægelse til at ringe om et dyr er levende eller døde, som bliver stadig mere vanskeligt at vurdere. Unge dyr vil flytte rundt i en plade i mangel af stimuli og er dermed let at score. Aging C. elegans bliver stadig mere stillesiddende men vil reagere på en let berøring til hovedet af en tilbageførsel bevægelse på en tallerken. Men som dyrene bliver ældre evne til at flytte bagud mindskes og bliver stadig mere ukoordinerede. I sidste ende dyr bliver lammet, en fænotype, der stærkt ligner sarcopenia, og når scoring via den traditionelle metode levedygtighed kan kun afgøres ved at observere subtile spjæt på den ekstreme forreste spids af dyret. Derimod når scoring levedygtighed via metoden replikasæt, er væsken føjet til den godt, der fungerer som en stimulans, der genererer en prygl svar, der kan kvantificeres som en udlæsning af healthspan8. Bevægelse i væsken er lettere at observere endnu ældre dyr: kronologisk alder-matchede affældig dyr producere subtile hoved bevægelser på tørre plader men en mere udtalt (omend langsom) kroppen bøje i væske. Endelig, når scoring replikasæt, hele brønden er inden for synsfelt (~1.1 cm i diameter) og alle dyr er i suspension - tillader observation af alle dyr samtidigt. Derimod når scoring en 6 cm plade via den traditionelle metode, skal en scanner på tværs af hele plade - søgning gennem den bakterielle græsplæne og langs kanterne for dyr. Den netto følge af disse forskelle er, at hastigheden når du bruger metoden replikasæt mindst en størrelsesorden større end den traditionelle tilgang, som gør det muligt at kvantificere samtidig ændringer i levetid på tværs af mere end 100 betingelserne i en enkelt eksperiment med en investigator. For eksempel, fra en genome-wide fodring-baserede RNAi skærm vi tidligere identificerede 159 gener, der var nødvendige for øget levetid, som faldt daf-2 /insulin-lignende signalering8. I denne analyse, vi målbare ændringer i levetid i wild-type, en langlivede daf-2(e1370) mutant og kortlivede daf-2(e1370);daf-16(mgDf47) dobbelt mutant dyr (figur 5A), der tillod os at dechifrere den genetiske relationer mellem insulin-lignende signalering og over 100 progeric gen inactivations. Yderligere, vi vurderet, hvordan disse progeric gen inactivations ændret healthspan (dengang kaldet "activespan") ved at observere nedgangen i C. elegans prygl på tværs af flergangsbestemmelser over tid (figur 5B).

Figure 1
Figur 1: fremkomsten af fodring baseret RNAi føre til en æra af genet opdagelse inden for aldring forskning, men de fleste gerogenes forbliver dårligt undersøgt. (A) mange gerogenes blev oprindeligt opdaget fra store skala funktionelle genomisk skærme. De mere end 900 C. elegans gerogenes opdagede til dato, var mange identificeret ved hjælp af fodring-baserede RNAi, fremhæve værdien af funktionelle genomforskningsmetoder i gen opdagelse. Grafen viser antallet af gerogenes opdagede per manuskript ved hjælp af RNAi, baseret på fænotype annotation (Se tabel over materialer) for fænotype ontologi vilkår udvidet levetid, forkortet levetid, og liv span variant. Se supplerende fil 1 for den fulde liste af undersøgelser, der opdagede gerogenes. (B) de fleste gerogenes forbliver dårligt undersøgt. I modsætning til velundersøgte gerogenes ligesom daf-16/FOXO (pil), som har mere end 800 referencer, fleste af gerogenes har færre end 10 henvisninger (generel reference-ikke nødvendigvis fokuseret på levetid). Pålidelig høj overførselshastighed metoder vil være afgørende for at opnå dybere indsigt i de genetiske indbyrdes relationer mellem gerogenes. Grafen er baseret på tilknytninger mellem publikationer i PubMed og C.elegans gerogenes opdagede fra RNAi fænotyper. Se supplerende fil 2 for den fulde liste over gerogenes og række undersøgelser forbundet med hver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Traditionelt og den replika sæt metode til at score C.elegans levetid (A). Den traditionelle metode til scoring C. elegans levetid. Flere små synkroniserede populationer af isogene dyr pr. betingelse er fulgt med tiden. Den samme population af dyr er fulgt under hele undersøgelsen. Levedygtighed er vurderet af bevægelse, som kan stimuleres af blid prodding. Dyr, der undlader at flytte er scorede som død og er fjernet (aspiration vist) indtil ingen levedygtig dyr tilbage. (B). The replika sæt metode til scoring C. elegans levetid. En stor population af alder-synkroniseret isogene dyr er fordelt på en række identiske Repliker plader. På hvert tidspunkt, en enkelt replikat er scoret: en mild bufferopløsning (M9) er tilføjet, som stimulerer bevægelse. Dyr, der undlader at flytte spontant efter oversvømmelse wells er også vurderet touch stimulus. Den scoring varighed for eksperimentet bestemmes før start. Hvert dyr er scorede kun én gang og levetiden for den større befolkning er afledt af mange uafhængige observationer. (C). det replikasæt tilgang er en høj overførselshastighed metode til at måle kvantitativt C. elegans levetid. 100 eller flere uafhængige RNAi kloner kan spores samtidigt. HT115 E. coli udtryk for dsRNA for en given RNAi klon er vist. Praktisk, er hver 24 prøver fra 96-brønd plade opdelt i en enkelt 24-godt plade. Hver resulterende 24-godt plade har en negativ (dvs. Tom vektor, red godt) og positiv kontrol (grøn godt) fordelt tilfældigt inden for en samling af RNAi kloner (gul wells). Typisk, den første brønd (A1) i en samling indeholder en tom vektor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: den grafiske brugergrænseflade (GUI). (A). grænsefladen hovedhandlingen vindue viser den standard Velkommen raster. Dette er, hvad der vises på åbning af softwaren. Forskelle i udseende mellem platforme skal være minimal anvendelse af en platform-uafhængig windowing toolkit. (B). oversigt over menuindstillinger til drop-down menuer tilgængelige fra vinduet hovedhandlingen. (C). eksempel plot output for begge replikasæt stil (venstre) og traditionelle Kaplan-Meier stil (højre) data. De viste data blev indsamlet i uafhængige forsøg. Eksporterede parceller omfatter ikke pre plottet akseetiketter, for maksimal fleksibilitet i at tilføje sådanne etiketter. For at gøre dette lettere er akserne altid opdelt i intervaller på 20% for y-aksen og intervaller af 5 for x-aksen. I dette eksempel blev akse og linje etiketter (stamme/behandling) tilføjet til de gemte parceller, ved hjælp af en meget enkel og fælles billedredigering værktøj. (D). et eksempel på output fra funktionen "TrialView", gør det muligt for den visuelle sammenligning mellem resultaterne af uafhængige forsøg for replikasæt stil datasæt. Dette plot viser resultatet mellem to forskellige forsøg og de tilsvarende poolede resultater for daf-2 EV(RNAi) (blå, lukkede cirkler), N2 EV (RNAi) (sort, lukkede cirkler) og daf-2 med daf-16 (RNAi) (rød, åben diamanter). TrialView giver mulighed for hurtigt indskrivning nemlig retssag-specifikke data problemer, der kan påvirke kvaliteten af anfald af det fælles datasæt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: den traditionelle og replikasæt metoder producerer lignende resultater. Tab af enten komponent af MDL-1(Mad)::MXL-1(Max) heterodimer øger levetiden. I kontrast, tab af enten komponent af MML-1 (Mondo/ChREBP)::MXL-2(Mlx) nedsætter levetiden denne figur er genoptrykt fra reference20 med tilladelse via en Creative Commons Attribution (CC af) licens (Se materialer). (A). Kaplan-Meier resultater med den traditionelle metode. (B). Logit curve fit ved hjælp af metoden replikasæt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Replikasættet metode kan dechifrere genetiske interaktioner baseret på ændringer i levetid (A) og ændringer i healthspan (B) for over 100 RNAi kloner samtidigt. Dette tal er genoptrykt fra8 med tilladelse under Creative Commons Navngivelse-ikke-kommerciel 4.0 International licens (CC-af-NC) (Se materialer). (A) genetiske levetid analyse af progeric gen inactivations i forbindelse med nedsat insulin-lignende signalering (ILS) (daf-2, x-aksen) og i mangel af daf-16/FoxO (y-aksen), en central transcriptional effektor af ILS21 . Gen inactivations med lignende funktioner som daf-16 forkorte ikke yderligere levetid i mangel af daf-16 (sorte prikker). Gen inactivations med funktioner helt uafhængigt af daf-16 forkorte både genetiske baggrund ligeledes (grå). Gen inactivations hvor negativt virkning på levetid i daf-2 > daf-2; daf-16, tyder funktion parallelt (hvid). (B) ændringer i prygl priser over tid kan udlede den gennemsnitlige healthspan for mange genetiske forstyrrelser (x-aksen) mens vurdering af ændringer i levetiden (y-aksen). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur S1: arbejdsprocesser i WormLife. Illustration af trinene i nogle guidede arbejdsprocesser (nogle gange kaldt "guider"). I hvert af disse tilfælde, efter det sidste trin i arbejdsgangen, returneres fokus tilbage til vinduet hovedhandlingen. (A) dataene import workflow for replikasæt stil datasæt (B) dataene importeres arbejdsgang for traditionelle Kaplan-Meier stil datasæt. (C) arbejdsprocessen for at føje linjer til et plot for replikasæt stil datasæt. (D) arbejdsprocessen for at føje linjer til et plot for traditionelle Kaplan-Meier stil datasæt. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 1: undersøgelser, der har identificeret gerogenes. Fremkomsten af fodring-baserede RNAi førte til en æra af genet discovery for fænotyper, der ikke var tractable af fremad genetik, herunder ældning. Anført, er i rækkefølge efter antallet gerogenes opdaget, uafhængige undersøgelser, der identificeret gener hvis aktivitet ændret levetid. Bemærk, at den undersøgelse, som identificeret de mest gerogenes udnyttede Repliker sæt metode8. Arten af hvordan genet inactivations ændret levetid er også indiceret: lang levetid og progeric gener er dem, der undergår levetid når inaktiveret, henholdsvis. "Levetid variant" henviser til sager, hvor direktionalitet ændringer (dvs. forhøjes eller nedsættes levetid) blev ikke angivet eller ikke kurateret. Data fra WormBase WS262 (januar 2018) (Se materialer), med tilføjelse af RNAi-behandling levetid resultater fra reference10, som endnu ikke er medtaget i den kurateret samling af WormBase RNAi fænotyper. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: antallet af undersøgelser er forbundet med hver gerogene. De fleste gerogenes er dårligt undersøgt. Mens nogle gener, ligesom daf-16/FoxO, har været genstand for megen forskning opmærksomhed, har mere end 400 gerogenes færre end 10 tilknyttede publikationer. Data fra WormBase WS262 (januar 2018), med tilføjelse af RNAi-behandling levetid resultater fra10 , som endnu ikke er medtaget i den kurateret samling af WormBase RNAi fænotyper. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: forberedelse af fælles reagenser til C. elegans eksperimenter. (A). opskrift på standard NGM og RNAi plader. (B). opskrift på M9 buffer og hypokloritiske løsning. (C). forberedelse af LB + Amp/Tet plader. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 4: replikasæt eksempeldata. Et eksempel datasæt fra et replikasæt levetid eksperiment. Dette datasæt er allerede formateret til at være egnet til import/analyse. Omfatter to forsøg pr. betingelse (kombination af stamme/genotype og RNAi). Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 5: traditionelle langsgående eksempeldata. Et eksempel datasæt fra en traditionel langsgående levetid eksperiment med højre-censur, formateret til klar import/analyse ved hjælp af Kaplan-Meier overlevelse plot funktionalitet. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Både de traditionelle og replika sæt metoder kræver synkronisering af kronologisk alderen dyr. Vi inkluderer en metode, der synkroniserer dyr ved hjælp af hypokloritiske behandling af fælderne voksne, hvor kun befrugtede æg med den fælderne voksne overleve behandling. Disse embryoner klækkes i flydende suspension og udviklingshæmmede anholdt på den første larve stadie (L1). Efter såning L1 dyr på mad (fx E. coli udtrykker dsRNA et gen af interesse), genoptage dyr udvikling. Synkronisering L1 dyr af hypokloritiske behandling af fælderne voksne har den fordel, at sidesten unseeded L1 dyrene kan nedfryses og opbevares på ubestemt tid i flydende nitrogen eller et-80 ° C fryser. På denne måde bevares en prøve af hver stamme samtidig med opsætningen af eksperimenterende, skabe en værdifuld ressource for fremtidige studier og forbedre reproducerbarhed. Men mens hypokloritiske behandling af fælderne voksne dyr er en almindelig måde at få synkroniseret dyr for aldring forskning22, L1 anholdelse er en sult svar. Dermed, nogle laboratorier foretrækker enten at tillade rugeæg at forekomme på plader, eller til at give afkald på hypokloritiske behandling helt og tillade et par fælderne voksne at lægge æg i flere timer (dvs. en æg lå). I sidstnævnte tilfælde forældre er fjernet og afkom levetid er fulgt. Til bedste af vores viden, er blevet rapporteret nogen åbenlyse forskelle i levetid mellem dyr, der blev synkroniseret i M9, udklækket på plader, eller afkom fra et æg lay. Men eftersom ændringer i næringsstoftilgængelighed er tæt knyttet til ændringer i levetiden, der er forud for at specifikke genetiske baggrunde kan producere forskellige udfald mellem disse synkronisering tilgange. En mere omhyggelig analyse er forpligtet til at løse denne teoretiske bekymring.

Uanset hvilken metode, der bruges til at synkronisere den begyndende befolkning, skal der træffes foranstaltninger til enten forhindre afkom produktion eller adskille synkroniseret start befolkningen fra fremtidige afkom. I vores protokol, vi redegøre for hvordan man kan bruge FUdR til at forhindre afkom produktion, som adskiller dyr er ikke en farbar vej for replikasæt metode. Det er også muligt at forhindre afkom produktion genetisk ved hjælp af en feminiserede genetiske baggrund (f.eks. fer-15(b26);fem-1(hc17), som er en temperatur-afhængige sterile stamme23). Dog hverken er uden mangler: brug af genetiske baggrunde kan komplicere efterfølgende analyse, og i nogle genetiske baggrunde FUdR kan ændre levetiden24,25,26.

Som et alternativ til at forhindre afkom betyder produktion gennem kemiske eller genetiske, voksne dyr kan flyttes med jævne mellemrum at friske RNAi plader til at isolere dem fra deres afkom. Dette simplificerer baggrund overvejelser på bekostning af gennemløb. Med jævne mellemrum flytte dyrene til friske fødevarer har de yderligere fordele for at forebygge mulige sult og forny eksponering for dsRNA. Men nogle genetiske interaktioner, der påvirker levetid blev kun opdaget Hvornår afkom produktion blev hæmmet: tidlige analyser af TGFβ vej for en levetid fænotype fejlagtigt konkluderede, at faldende TGFβ signalerer påvirket C. elegans dauer dannelse men ikke aging27,28. En opfølgende undersøgelse, som brugte FUdR afslørede dog, som faldt TGFβ signalerer øget holdbarhed gennem insulin signalering29. Hvorfor har tidligere undersøgelser ikke at se øget levetid i TGFβ mutant dyr? TGFβ pathway mutationer producere en lille æglægning defekt (egl) og udvide reproduktiv levetid, som forårsager indre klækning af afkom senere i livet, der dræber forælderen. Det er sandsynligt, at de langlivede TGFβ mutant dyr syntes at have en normal levetid på grund af egl fænotype aflivede dyr omkring tid når wild-type dyr normalt dør. Dette kunne være relevante for andre genetiske veje knyttet til DR, som sultet wild-type dyr også manifestere en egl fænotype, måske som en adaptiv overlevelsesfordel til afkom betingelser, lave mad. Dette understreger den underliggende kompleksitet i adaptive responser dyr underkastes under stressforhold og behovet for omhyggelig analyse og overvejelse, når designe levetid eksperimenter.

I designe og gennemføre levetid eksperimenter af enten metoden er det afgørende at undgå bias. Eksperimenter skal være udført i en dobbelt-blind måde: hvordan prøver blev tidligere scoret på tidligere tidspunkter og identiteten af en test tilstand skal være ukendt for eksperimentatoren. Desuden er det altid nødvendigt at medtage både positive og negative kontroller; i forbindelse med metoden replika sæt indsættes disse tilfældigt i en 24-godt plade. E. coli udtrykker et plasmid, der ikke indeholder et indstik med sekvensen er svarende til C. elegans genom Tom vektor negativ kontrol (dvs. "L4440"-Se materialer). Positive kontroller er afhængige af den særlige karakter af et eksperiment. For eksempel, daf-2 koder C. elegans insulin/IGF-1 receptoren, og daf-2 inaktivering via fodring-baserede RNAi øger håndfast levetid mindst to gange i wild-type dyr27. Således kan daf-2(RNAi) tjene som positiv kontrol når udkig genet inactivations, der øger levetiden. Omvendt, daf-16 koder FOXO transskription faktor orthologue30. DAF-16 er en væsentlig bestanddel af mange levetiden paradigmer og wild-type dyr (N2) behandlet med daf-16(RNAi) er kort sagt levede og viser tegn på progeria31.

De primære fordele ved den traditionelle langsgående levetid tilgang er at det er meget veletableret, og eksperimenter er nem at sætte op. Relativt få dyr er nødvendige på blot et par plader for hver test betingelse. Således kan stammer, der vokser dårligt eller kræve balancers at udbrede testes nemt. Den traditionelle tilgang er meget fleksibel og kan bruges med en af de tilgængelige metoder til håndtering af afkom produktion, herunder behandling med FUdR, krydser grænsen til en feminiserede genetiske baggrund eller med jævne mellemrum flytte voksne dyr til nye plader under perioden æglægning. Mens flytter dyr betydeligt reducerer overførselshastighed, arbejde med en mutant baggrund er aldrig ideel, og selv om FUdR ikke ændrer vildtype levetid32,33,34, det kan påvirke levetid og alder relaterede fænotyper i nogle genetiske baggrunde35,25,26. Bemærk at tilstedeværelse af mænd, selv med brug af FUdR, bliver væsentligt forkorte hermafrodit levetid13, en plade, der indeholdt hanner efter hermafroditter nået L4 er således ubrugelig. Ligeledes er analyse gennem Kaplan-Meier estimator og tilknyttede kurver og log-rank test, veletableret til dødelighed data. Der er dog flere ulemper den traditionelle levetid analyse. Gentagen håndtering af plader (dvs. udsætter plader til luft) letter indførelsen af luftbårne svampe forurening. Desuden gentog poking kan beskadige eller dræbe dyr, især som befolkningen forskud i alder og bliver skrøbeligt. Ældre dyr bliver i vid udstrækning lammet og nedsunket i E. coli, mens E. coli bliver en opportunistisk patogen (koloniserer lumen og pakning svælget)36. Meget gamle levende dyr kan kun identificeres af subtile hoved bevægelser. Således, det er let at klassificere en affældig levende dyr som døde. Endelig, den traditionelle tilgang er begrænset af gennemløb.

Metoden replikasættet er høj overførselshastighed og kvantitative. Ulempen ved denne metode er imidlertid en større investering af tid og ressourcer i den oprindelige oprettet. En moderat store eksperiment for at undersøge 100 RNAi kloner over 20 tidspunkter kræver 30.000 L1 dyr (hvor ca 15 dyr behandles pr. RNAi klon pr. tidspunkt), som selv let for de fleste stammer, kan være problematisk i nogle tilfælde. For eksempel, uden en stor-partikel sidesorteringen ("ormen sorteringsanlæg") stammer, der skal opretholdes med balancers eller transgene linjer bærer kan ikke et dårligt overførte ekstra kromosomale array nemt undersøges ved denne metode. En anden ulempe er, at afkommet produktion skal hæmmede, som kræver brug af FUdR eller en feminiserede genetiske baggrund. Endelig må man vide hvor lang tid analysen vil køre, som man skal udarbejde et replikasæt for hvert tidspunkt i begyndelsen af eksperimentet. Fordelene ved denne metode er dog talrige. Fremmest scoring levedygtighed er meget hurtigere og man kan nemt følge dyr over 100 prøvningsbetingelser samtidig (dvs. RNAi kloner). Da et replikasæt er kun scorede en gang så kasseret, der er ingen gentagne håndtering af plader eller stikke af dyr, hvilket minimerer sandsynligheden for svampe forurening og eliminerer dødelighed forårsaget af den lejlighedsvise ru prodding med en orm pick. Derudover tilsætning af væske til brønden i høj grad letter scoring. Frigørelse af gamle dyr fra pladen og de omkringliggende bakterier hjælper i at tillade subtile hoved bevægelser til at være mere let scorede. Tilsætning af væske giver også mulighed for at måle gennemdrøfte priser som en foranstaltning af fitness (f.eks. healthspan8,37).

Aldring er et komplekst fænomen, der involverer flere kausale mekanismer, som kræver brugen af systemer biologiske metoder at trævle. Disse tilgange ofte indarbejde datastyret modellering, ved hjælp af store mængder af genomisk/transkriptom data, og kræve supplerende robust og høj overførselshastighed metoder til at måle levetiden og healthspan. Høj overførselshastighed replikasæt metode vil tillade sammenligning af mange RNAi kloner på langs, samtidig minimere batch effekter og tekniske fejl, således at lette udviklingen af dynamiske modeller, der kan udlede interaktioner mellem kausale veje i en kvantitativ måde. Desuden er integration af flere genome-wide genomforskning tilgange med metoden replikasættet muligt, fordi en stor population af alder-synkroniseret dyr er opdelt i en række små populationer.

Andre metoder har udviklet tidligere for at forbedre overførselshastigheden af C. elegans levetid eksperimenter, ofte med fokus på at tilpasse de traditionelle langsgående tilgang (dvs. efter det samme sæt af dyr over tid) til automatiserede observation og optagelse ved hjælp af fælles flatbed scannere38,39, eller mere specialiseret udstyr såsom mikrofluid plader40. De scanner-baserede tilgange bruger lys som en stimulus og sammenligne sekventielt optagne billeder til at bestemme i live/døde status baseret på bevægelsen for flere plader på én gang; mens sådanne tilgange ikke kræver proprietære videnskabelige hardware, kan tid involveret i oprettelse af arbejdsprocesser være betydeligt afhængigt af den ønskede omfang. Alternativt, levetid eksperimenter i brugerdefinerede mikrofluid enheder mulighed for dybdegående fænotypiske karakterisering af enkelt dyr over tid, og uden behandling for at forhindre afkom, men nødvendiggør fabrikation af mikrofluid plader og erhvervelse tilknyttede mikrofluid pumper og imaging udstyr. Derimod kan metoden replikasæt i kombination med den software, der er beskrevet her, stærkt forbedret overførselshastighed ved hjælp af værktøjer, der er allerede almindelige i laboratorier, der arbejder med C. elegans.

WormLife software vil blive forbedret i fremtiden for at give lettere adgang til statistisk sammenligning og kompatibilitet med flere platforme. Den mest up-to-date dokumentation for software kan findes på siden GitHub, herunder installationsvejledning til platforme som softwaren er blevet testet. En web-baseret version vil også blive udviklet for at muliggøre nem adgang uden at skulle installere noget software.

I Resumé giver kombinationen af metoden replikasæt og frit tilgængelig software detaljeret her en kraftfuld platform for at forbedre dataoverførsel og robusthed af levetid eksperimenter og en bred vifte af overlevelse-baserede assays (f.eks. stress tolerance, toksikologiske undersøgelser, healthspan, osv.). Især når den kombineres med funktionel genomforskning, udnytter denne tilgang de mange fordele ved ordningen metazoan model C. elegans for decifrere utal af genetiske interaktioner, der bidrager til udviklingen af aldring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Finansieringen af dette arbejde, der er beskrevet i dette manuskript blev leveret af: University of Rochester Office af The Provst og School of Medicine og tandpleje Dekansekretariatet via Health Sciences Center for Computational Innovation (HSCCI); de Ellison medicinsk Foundation nye lærde i Aging Fellowship (AG-NS-0681-10) finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) Gold Bio 12481C100
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) Alfa Aesar L16497
24 Well Culture Plates Greiner Bio-One #662102
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm Thermo-Fisher 242811
600 µL 96-well plates Greiner Bio-One #786261
2mL 96-well plates Greiner Bio-One #780286
Air-permeable plate seal VWR 60941-086
96-pin plate replicator Nunc 250520
bacto-peptone VWR 90000-368
bacteriological agar Affymetrix/USB 10906
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer Source Bioscience C. elegans RNAi Collection (Ahringer) See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal Source Bioscience C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis Samuelson Lab N/A https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife
L4440 Empty Vector Plasmid Addgene 1654 https://www.addgene.org/1654/
Wormbase http://www.wormbase.org/ 
OASIS https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ 
Graphpad Prism https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA [10]. Nature. 395, (6705), 854 (1998).
  2. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2, (1), (2000).
  3. Winston, W. M., Sutherlin, M., Wright, A. J., Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Caenorhabditis elegans SID-2 is required for environmental RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, (25), 10565-10570 (2007).
  4. Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295, (5564), 2456-2459 (2002).
  5. Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS letters. 579, (26), 5932-5939 (2005).
  6. Ceron, J., et al. Toward Improving Caenorhabditis elegans Phenome Mapping With an ORFeome-Based RNAi Library. Genome Research. 14, (14), 2162-2168 (2004).
  7. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, (6920), 231-237 (2003).
  8. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21, (22), 2976-2994 (2007).
  9. Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational Analysis of Lifespan Experiment Reproducibility. Frontiers in Genetics. 8, (June), (2017).
  10. Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans Genes Regulating Longevity Using Enhanced RNAi-sensitive Strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. LXXII, 489-497 (2007).
  11. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. Available from: https://www.r-project.org/ (2018).
  12. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 51, (1), 23-33 (1976).
  13. Shi, C., Murphy, C. T. Mating Induces Shrinking and Death in Caenorhabditis Mothers. Science. 343, (6170), 536-540 (2014).
  14. Hodgkin, J. Male Phenotypes and Mating Efficiency in CAENORHABDITIS ELEGANS. Genetics. 103, (1), Available from: http://europepmc.org/articles/PMC1202023/?report=abstract 43-64 (1983).
  15. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. Journal of the American Statistical Association. 5318910, (282), 457-481 (1958).
  16. Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50, (3), 163-170 (1966).
  17. Rechavi, O., et al. Starvation-induced transgenerational inheritance of small RNAs in C. elegans. Cell. (2014).
  18. Larance, M., et al. Global Proteomics Analysis of the Response to Starvation in C. elegans. Molecular & Cellular Proteomics. 14, (7), 1989-2001 (2015).
  19. Vanfleteren, J. R., De Vreese, A., Braeckman, B. P. Two-Parameter Logistic and Weibull Equations Provide Better Fits to Survival Data From Isogenic Populations of Caenorhabditis elegans in Axenic Culture Than Does the Gompertz Model. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A, (6), B393-B403 (1998).
  20. Johnson, D. W., Llop, J. R., Farrell, S. F., Yuan, J., Stolzenburg, L. R., Samuelson, A. V. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad Complexes Integrate Diverse Longevity Signals. PLoS Genetics. 10, (4), e1004278 (2014).
  21. Ogg, S., et al. The fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389, (6654), 994-999 (1997).
  22. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. Journal of Visualized Experiments. (64), 1-9 (2012).
  23. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1, (1), 0119-0128 (2005).
  24. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of ageing and development. 132, (10), 519-521 (2011).
  25. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PloS one. 9, (1), e85964 (2014).
  26. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of ageing and development. 131, (5), 364-365 (2010).
  27. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366, (6454), 461-464 (1993).
  28. Larsen, P. L., Albert, P. S., Riddle, D. L. Genes that regulate both development and longevity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139, (4), 1567-1583 (1995).
  29. Shaw, W. M., Luo, S., Landis, J., Ashraf, J., Murphy, C. T. The C. elegans TGF-beta Dauer pathway regulates longevity via insulin signaling. Current biology. 17, (19), 1635-1645 (2007).
  30. Mukhopadhyay, A., Oh, S. W., Tissenbaum, H. A. Worming pathways to and from DAF-16/FOXO. Experimental Gerontology. 41, (10), 928-934 (2006).
  31. Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278, (5341), 1319-1322 (1997).
  32. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of ageing and development. 12, (2), 137-150 (1980).
  33. Hosono, R. Sterilization and growth inhibition of Caenorhabditis elegans by 5-fluorodeoxyuridine. Experimental gerontology. 13, (5), 369-373 (1978).
  34. Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine. Journal of gerontology. 34, (1), 28-36 (1979).
  35. Anderson, E. N., et al. C. elegans lifespan extension by osmotic stress requires FUdR, base excision repair, FOXO, and sirtuins. Mechanisms of ageing and development. 30-42 (2016).
  36. Garigan, D., Hsu, A. L., Fraser, A. G., Kamath, R. S., Abringet, J., Kenyon, C. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161, (3), 1101-1112 (2002).
  37. Yu, S., Driscoll, M. EGF signaling comes of age: Promotion of healthy aging in C. elegans. Experimental Gerontology. 46, (2-3), 129-134 (2011).
  38. Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: A technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. (2012).
  39. Stroustrup, N., Ulmschneider, B. E., Nash, Z. M., López-Moyado, I. F., Apfeld, J., Fontana, W. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10, (7), 665-670 (2013).
  40. Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12, (3), 398-409 (2013).
Den replika sæt metode: En høj overførselshastighed tilgang til kvantitativt foranstaltning <em>Caenorhabditis elegans</em> levetid
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. J. Vis. Exp. (136), e57819, doi:10.3791/57819 (2018).More

Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. J. Vis. Exp. (136), e57819, doi:10.3791/57819 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter