Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

أوزة إيمبروفيسوس بالانوس "نموذج البحرية"-استزراع و "التعبير الجيني"

Published: August 8, 2018 doi: 10.3791/57825
Automatic Translation
1, 3, 2, 2, 1, 2
1Department of Marine Sciences, University of Gothenburg, 2Department of Chemistry and Molecular Biology, University of Gothenburg, 3IVL Swedish Environmental Research Institute

Summary

أوزة إيمبروفيسوس بالانوس (أمفيبالانوس) نموذج لدراسة أوسموريجوليشن والمضادة للحشف على السفن. بيد التفريخ الموسمية الطبيعية غلة عرض لا يمكن التنبؤ بها لليرقات سيبريد. هنا، هو وصف بروتوكول لاستزراع كل سنة-الجولة من إيمبروفيسوس باء ، بما في ذلك إنتاج اليرقات. ويتضح استخدام الإوز المستزرعة في دراسات التعبير الجيني.

Abstract

البرنقيل هي القشريات البحرية مع بالغ لاطئة والعوالق، وتخترق اليرقات. أوزة إيمبروفيسوس بالانوس (أمفيبالانوس) ذات أهمية خاصة كنموذج لدراسة آليات أوسموريجولاتوري بسبب التسامح الشديد للملوحة منخفضة. ويستخدم أيضا على نطاق واسع كنموذج لتسوية الأحياء، ولا سيما فيما يتعلق بالبحوث المضادة للحشف على السفن. ومع ذلك، التفريخ الموسمية الطبيعية غلة عرض لا يمكن التنبؤ بها لليرقات سيبريد للدراسات. يرد على بروتوكول لاستزراع كل سنة-الجولة من إيمبروفيسوس باء- وقد وضعت ووصف مفصل لكل الخطوات في خط الإنتاج (أي، وإنشاء ثقافات الكبار على الألواح، وجمع وتربية أوزة اليرقات، وإدارة الأعلاف للكبار واليرقات). الوصف أيضا إرشاداً بشأن استكشاف الأخطاء وإصلاحها ويناقش المعلمات حرجة (مثلإزالة التلوث، وإنتاج الأعلاف عالية الجودة، والقوى العاملة اللازمة وأهمية جودة مياه البحر). كل دفعة من النظام بتثقيف أقصى غلة النوبليوس 12,000 تقريبا، ويمكن تقديم أربع دفعات في غضون أسبوع، حيث يمكن أن تنتج ما يصل إلى اليرقات 50,000 تقريبا كل أسبوع. الطريقة المستخدمة للثقافة إيمبروفيسوس باء- ، على الأرجح، إلى حد كبير، كما ينطبق على غيرها من اللافقريات البحرية مع سويمينجلارفاي مجاناً. يتم عرض البروتوكولات لتشريح الأنسجة المختلفة من البالغين، فضلا عن إنتاج الحمض النووي الريبي عالية الجودة للدراسات المتعلقة بالتعبير الجيني. وهو أيضا وصف الكبار كيف مثقف وتربية سيبريدس يمكن أن تستخدم في طائفة واسعة من النماذج التجريبية لدراسة التعبير الجيني فيما يتعلق بالعوامل الخارجية. ويتضح استخدام الإوز المستزرعة في التعبير الجيني مع دراسات الأدوار الممكنة أوسموريجولاتوري نا+/K+ أتباسي وأقوابورينس.

Introduction

البرنقيل هي القشريات البحرية مع بالغ لاطئة والعوالق، وتخترق اليرقات. معظم الأنواع 1,200 من الإوز تعيش في المياه الضحلة وكثير كثيرا ما يتعرض للملوحة منخفضة. أحد الأنواع، أوزة خليج يرتجل بالانوس (أمفيبالانوس) (إيمبروفيسوس)، يمكن أن يتسامح مع ما يقرب من المياه العذبة، وتشارلز داروين ووصف هذا النوع من تيار صغير في مصب نهر ريو دي لابلاتا في أوروغواي1. يجعل التسامح الشديد الملوحة تولو إيمبروفيسوس باء- نموذج ذات أهمية خاصة لدراسة آليات أوسموريجولاتوري2،3. هذا أوزة تفضل ظروف الملوحة ولكن قادر على العيش في المياه مع الملوحة من حوالي 1.6 الأمير سلطان ليصل إلى 40 جامعة الأمير سلطان4. فمن الأنواع أوزة الوحيدة الموجودة في بحر البلطيق الملوحة. ويعتقد أن تنشأ من الساحل الشرقي للقارة الأمريكية إيمبروفيسوس باء- لكن اليوم وجدت في جميع أنحاء العالم بسبب تشتت الشحن5. هو كائن قاذورات رئيسية ويوجد عادة في الصخور، والأرصفة، وبدن السفينة، وذلك للمصلحة العامة لفهم آليات الآخذين في الإنشاءات في المياه البحرية والمائلة للملوحة6،7.

على غرار معظم الإوز الأخرى، إيمبروفيسوس باء- هيرمافروديتيك مع تبادل الخبرات؛ يحدث التكاثر عن طريق التزاوج بين الأفراد المجاورة استخدام القضيب ممدود والإخصاب داخلي. فترة الإنجاب أساسا من أيار/مايو إلى أيلول/سبتمبر. وقد إيمبروفيسوس سبع مراحل اليرقات البحرية (ستة النوبليوس تليها مرحلة سيبريد واحدة8). البوابات البويضة المخصبة إلى يرقة ناوبليوس التي تخترق ويغذي في عمود الماء لتصل إلى عدة أسابيع قبل الصوف إلى يرقة سيبريد غير تغذية. يستخدم إشارات متعددة إلى العثور على موقع مناسب لتسوية سيبريد ويخضع ثم تحول إلى أوزة الأحداث لاطئة9. الأنواع التي يمكن أن تكون مثقف في المختبر وعمر 1 – 2 سنة في البحر (2 – 3 سنوات في مختبر الثقافة). في المتوسط، إيمبروفيسوس باء- ينمو إلى 10 ملم في القطر (بحد أقصى يبلغ حوالي 20 ملم)، ويصل إلى أقصى ارتفاع حوالي 6 مم (على الرغم من أنه يمكن أن يزداد طولاً في ظروف مزدحمة). يمكن أن تكون الأنواع التي حددتها شل حتى كلسية السلس (أبيض أو رمادي)، قاعدة كلسية منقوشة إشعاعيا لصفيحة شل، والشكل1،لوحات تيرجال10.

أوزة إيمبروفيسوس باء- لديها العديد من الميزات مفيدة كنموذج للدراسات أوسموريجوليشن، مع تركيز على الآليات الجزيئية والفيزيولوجية وكذلك التفاعلات الإيكولوجية وعواقب التطوري. فإنه يستخدم أيضا على نطاق واسع كنموذج للتحقيقات المتعلقة بتسوية الأحياء، ولا سيما فيما يتعلق بالبحوث المضادة للحشف على السفن والآليات المشاركة7،11،،من1213. ومع ذلك، التفريخ الموسمية الطبيعية غلة عرض لا يمكن التنبؤ بها لليرقات سيبريد للدراسات. القدرة على ثقافة هذه أوزة من خلال دورة حياته كلها على مدار السنة ولذا، موردا رئيسيا لتمكين أنواع مختلفة من الدراسات الجزيئية والميكانيكية. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح وجودها في المياه البحرية/المالحة في العالم للجمع بين الميدانية والدراسات التجريبية. الإكثار يمكن أن تنتج أيضا أسر النسب المعروفة ل تثقيف طويلة الأجل14، ووقت جيل لبضعة أشهر قد يسمح تطور تجريبية على المدى الطويل. تتوفر أيضا مشروع جينوم والعديد من ترانسكريبتوميس، وقد استخدمت هذه الموارد لاستنساخ عدة جينات (مثلاً، الجينات ذات أهمية في أوسموريجوليشن)2،3.

والهدف من هذا البروتوكول لوصف كيفية إنشاء والحفاظ على ثقافة أوزة إيمبروفيسوس باء- طوال السنة من أجل إجراء دراسات التعبير الجيني على البالغين أو يرقات لهذا الكائن. ريتشوف et al. 15 وصف موجز لطريقة لاستزراع الإوز من الإفراج عن الوظيفة إلى تسوية سيبريدس للأنواع Balanus amphitrite. البروتوكول قد تم تكييفه لاستزراع كل سنة-الجولة من إيمبروفيسوس باء في Tjärnö مختبر الأبحاث البحرية (السويد)، ويرد وصف مفصل لكل الخطوات في خط الإنتاج، بما في ذلك الإنتاج وتربية أوزة اليرقات، فضلا عن إدارة الأعلاف للكبار واليرقات. لمحة عامة للإجراء الكامل، انظر الشكل 1. استخدام نظام تثقيف هو مثال مع بعض الهياكل التجريبية المشتركة ويتضح في دراسات الجينوم الوظيفي نا+/K+ ATPase وأكوابورينس، توضيح وظائفها الممكنة في، أوسموريجوليشن2 3. من الضروري في بعض الأحيان لدراسة التعبير الجيني في أنسجة محددة، وسيتم تغطية بعض أساسيات التشريح أوزة. بإمدادات جيدة من مياه عالية الجودة، استزراع أوزة إيمبروفيسوس باء، ويحتمل أن تكون العديد من الأنواع الأخرى، ينبغي أن يكون من الممكن في مختبرات البحرية في جميع أنحاء العالم.

Protocol

1-مجموعة من الإوز الكبار في الميدان لبدء من أمهات جديدة

  1. نشر لوحات شفافة (110 × 110 × 1.5 ملم3) لدن بالحرارة (بولي ميثيل ميثاكريلات) في ≈ المياه الهادئة في عمق 1 – 3 م من أجل جمع الإوز الكبار من الميدان. استخدام الإطارات التي يمكن أن تتخذ عدة أفرقة (الشكل 2ألف)، حفر ثقوب 2 (التي يبلغ قطرها 6 مم) في الزوايا العليا لكل فريق وأتتاتشثيبانيلستوثيراكوسينجكابليتييس. وهكذا، ثيبانيلسويلهانجفيرتيكاليين الماء.
    1. عندما حدث تسوية الإوز (التي تم تحديدها كالنقاط الصلبة البيضاء الصغيرة على اللوحات)، وترك الأفرقة لمالا يقل عن 2-3 أسابيع للتأكد من أن تكون كبيرة بالإوز ما يكفي (5 ملم) لنقلها إلى المعمل دون الحصول على المجففة أو أصيبت بأضرار.
  2. جلب اللوحات في المختبر عند تغطيتها مع استقر إيمبروفيسوس باء- التي بلغت حجماً من كاليفورنيا. إيندياميتير 5 ملم.
    ملاحظة: الوقت للكبار أن تتطور إلى 5 ملم في الميدان يعتمد اعتماداً كبيرا على توافر الغذاء ودرجة الحرارة. عادة، وهذا يأخذ حوالي 3 أسابيع في مختبر الأبحاث البحرية في Tjärnö (58.87 درجة شمالا، 11.14 ° E). الأكثر شيوعاً، لوحات للأمهات جديدة عموما تم نشرها في أواخر حزيران/يونيو والتي جمعت في نهاية آب/أغسطس.
  3. قبل إدخال هذه الأفرقة في المرفق الثقافة، تنظيف الكائنات الحية الأخرى من اللوحات. أنها الأكثر أهمية لإزالة الأنواع الأخرى أوزة. يرجى ملاحظة أن من المهم لتنظيف الألواح للتخلص من تلوث الأنواع خلال الزراعة منذ ذلك سيزيد إلى حد كبير فرص بقاء الأمهات كثيرا.
  4. وضع الألواح رأسياً على حافة في الوقوف مع الأخاديد المضروب في درج البولي إثيلين (400 × 400 × 20 مم3) (أرقام 2 و 2 هاء). الأخاديد في الوقوف إلى جانب 15 ملم.
  5. من أجل إعداد الصواني، جعل منفذ مدخل في القاعدة ومنفذ خروج في الأعلى الجانب المعاكس لكل علبة. قم بتوصيل منفذ المدخل لكل علبة 100 لتر خزان يحتوي على حوالي 30 لتر مياه مع مدخل مياه البحر المفتوح في 20 درجة مئوية السماح من خلال تدفق بمعدل ca. 2 لتر في الدقيقة.
    ملاحظة: ما يصل إلى 8 صواني كانت متصلة بخزان 100 لتر واحد.
  6. قم بتوصيل الخزان 100 لتر للتحكم في درجة حرارة مياه البحر (20 درجة مئوية) (مثلاً، المقدمة من مضخة الحرارة تبادل الحرارة من مياه البحر واردة).
    ملاحظة: أوزة إيمبروفيسوس باء- يمكن أن تنمو وتتكاثر في ملوحة البحرية الكاملة (30 – 35 psu)؛ ومع ذلك، خفض ملوحة إلى المرجع المصدق ca. 25 جامعة الأمير سلطان عن طريق إضافة المياه العذبة إلى خزان 100 لتر يزيد إخراج اليرقات من الثقافة.

2-ابتداء من الأجيال الجديدة من الكبار من سيبريدس مثقف

  1. فتح مكعبات بناء الألواح الحرارية أعلى من 5 لوحات تسجيل معا باستخدام شريط غير سامة، ومقاومة للماء.
  2. ضع المكعب في علبة صغيرة (في حالة التسرب) وتعبئته بمياه البحر (25 جامعة الأمير سلطان). الحفاظ على المياه في درجة حرارة الغرفة (كاليفورنيا-20 درجة مئوية). إضافة ما يقرب من 200 سيبريدس في الجزء العلوي من المكعب.
  3. تغذية الأحداث مع 100 مل من مارينوي سكيليتونيما كل يوم (راجع الخطوة 5) بينما في المكعب.
    ملاحظة: يمكن أن يكون الإوز الأحداث صعوبات مع تناول سالينا الارتيميا (راجع الخطوة 3) نظراً لأنها كبيرة، ومن ثم صعوبة في ابتلاع لاوزة استقر حديثا.
  4. تغيير الماء 1 × أسبوع.
  5. بعد أسبوعين، عندما تحتوي اللوحات على الأحداث الثابتة ما يكفي على الأقل 5 مم في القطر، اتخاذ ما عدا المكعب ونقل الألواح مع الأحداث إلى علب مع تدفق--ثروغسيواتير و، بعد ذلك، تغذية الإوز مع النوبليوس سالينا (أ) .

3-ثقافة سالينا الارتيميا النوبليوس كعلف "الإوز الكبار"

  1. إعداد نظام لتثقيف سالينا (أ) باستخدام زجاجة بلاستيكية 1.5 لتر حيث بوتوميس قطع وتوضع الزجاجة رأسا في الوقوف ومضيئة من الجانب. تناسب عنق الزجاجة لأنبوب سيليكون مع المشبك وإرفاقه بمضخة تهوية (الشكل 2د).
  2. كي يفقس البيض، إضافة حوالي 15 مل بيض يستريح الجافة من الارتيميا إلى أوفسيواتير 1 لتر.
    ملاحظة: هاتش بيض الارتيميا في اليرقات nauplius بعد 24 – 48 ساعة. لتأخير الفقس النوبليوس سالينا (أ) (مثلاً، خلال عطلة نهاية الأسبوع)، يمكن إيقاف تشغيل الضوء لتقليل درجة الحرارة قليلاً.
  3. حصاد الارتيميا النوبليوس، إيقاف التهوية وتلقى بظلالها على الجزء العلوي من الزجاجة مع رقائق الألومنيوم (أو مشابهة مثلاً، يمكن)... تضيء الجزء السفلي من الزجاجة للحد الأدنى 10 مظلل الارتيميا النوبليوس سوف تسبح نحو النور. فقست عدم الخراجات سوف تنزل إلى القاع، وقذائف كيسه سوف تطفو على السطح.
  4. فتح المشبك في الجزء السفلي. جمع الكسر وسيطة كعدد سكان كثيفة من النوبليوس السباحة.
    ملاحظة: كل يوم (ما عدا في عطلة نهاية الأسبوع)، L 1 تعليق الارتيميا النوبليوس الكثيفة كان يدوياً إضافة إلى الخزان 100 لتر الاتصال بعلب الورق مع الإوز الكبار. تجنب أي تغذية بقذائف الكيس الفارغ، نظراً لأنها لا توفر التغذية وينتج أساسا التي تحتاج إلى تنظيف الثقافة على فترات أكثر تواترا.

4-جمع وتربية يرقات أوزة

  1. تنظيف اللوحات مع الإوز الكبار بالرش لهم بلطف مع المياه العذبة، وإذا لزم الأمر، إزالة أي قاذورات من قذائف أوزة واللوحات باستخدام فرشاة ناعمة. أيضا، تنظيف الصواني (دون الإوز) والأنابيب الساخنة (75 درجة مئوية) في المياه العذبة.
  2. وضع غربال مصنوع من شبكة-90 ميكرون العوالق لصقها إلى نهاية أنبوب بولي كلوريد الفينيل قطع (16 سم، 15 سم في الطول) في علبة البولي إثيلين (30 × 20 × 10 سم3) مع منفذ تجاوز سعة. جمع اليرقات إيمبروفيسوس في غربال بين عشية وضحاها (الشكل 2-ج).
    ملاحظة: تم وضع المنخل أسفل ميناء الخروج علبة الأفرقة أوزة لتلقي المياه الفائضة وتصفية الوظيفة. وظل اليرقات في المنخل بينما فاضت مياه البحر في علبة صغيرة. يضمن هذا علبة صغيرة المنخل دريدوت ابدأ.
  3. مكان دلو ل 30 في حمام مائي كبير حيث يتم الاحتفاظ درجة الحرارة عند 26 درجة مئوية باستخدام سخانات خزان الأسماك الحوض (الشكل 2ه). تهوية والإثارة مضمونة بفقاعات الهواء عن طريق النظام.
  4. ملء الدلو مع 20 لتر من مياه البحر التي تم تصفيتها (0.2 ميكرون؛ 25 جامعة الأمير سلطان). إضافة 1 لتر إلى الدلو من مزيج 60/40 من الطحالب المجهرية دياتوم 2، س. مارينوي ، و جيم-مرهف (راجع الخطوة 5). وهذا سيعطي بكثافة أولية لحوالي 5 × 104 الدياتومات كل مل في الدلو.
    ملاحظة: يرقات النوبليوس أوزة أثناء إيجابيا. وقدمت الدلاء بلاستيكية بيضاء معتمة مع الأغطية التي تتيح من خلال بعض الضوء. خلال فصل الشتاء، الغرفة كانت مضاءة خلال النهار (08:00 – 17:00)، لكن الظلام خلال الليل. خلال فصل الصيف، حيز الضوء خارج الغرفة خلال معظم ساعات النهار.
  5. نقل جمعها النوبليوس إيمبروفيسوس باء إلى طبق المتبلور (300 مل؛ 90 ملم في القطر 50 مم في الارتفاع).
  6. إلقاء الضوء على الطبق من الجانب الذي سيؤدي إلى جذب اليرقات إلى مصدر الضوء. جمع النوبليوس أوزة الذي جمع في ضوء الواردة مع ماصة ونقلها إلى آخر طبق المتبلور. قم بإزالة أي يرقات الارتيميا المتبقية.
  7. نقل يرقات النوبليوس إيمبروفيسوس باء- كوب مع 1 لتر من مياه البحر التي تمت تصفيتها.
  8. حساب عدد النوبليوس بإثارة الكأس برفق للحصول على تعليق حتى من اليرقات وثم أخذ خمسة 1 مل عينات من أماكن مختلفة في الكأس. نقل كل عينة في ميكروسكوبية لتفتيش البصري مع ستيريوميكروسكوبي. حساب عدد النوبليوس في كل من العينات الخمس وتضيف لهم.
  9. مضاعفة عدد الأصوات التي تم فرزها من 200 (1,000 مل/5 مل) لتقدير كم من الآلاف من اليرقات هي في الكأس كله. إذا كان هناك عدد كبير جداً من nauplius اليرقات في الكأس، تخفف العينة حتى يتم الكثافة في معظم اليرقات 14,000/لتر (عادة في نطاق اليرقات 11,000 – 12,000/L).
  10. إضافة 1 لتر من إيمبروفيسوس باء- النوبليوس بدلو واحد، مما يضيف تقريبا 11,000 – 12,000 يرقات كل دلو.
    ملاحظة: تأكد من عدم إضافة الوظيفة أكثر، أن هذا سينتج الأغذية قليلة جداً بالنسبة لليرقات، وزيادة معدل الوفيات ومن ثم.
  11. وبعد 3 أيام، جمع النوبليوس أوزة في غربال 90 ميكرون. ثم تنظيف الدلو (مع 75 درجة مئوية المياه العذبة) وتعبئته بمياه البحر التي تم تصفيتها، وإضافة موجز ويب دياتوم جديد (نفس المبلغ كبداية) وأخيراً إضافة الوظيفة مرة أخرى. سيبريدس تبدأ في الظهور بعد حوالي 6 أيام (± 1 يوم).
  12. جمع سيبريدس أولاً مع غربال 90 ميكرون (مصممة كما هو الحال في النقطة 4، 2 أعلاه). ثم افصل النوبليوس أوزة غير مولتيد وسيبريدس بغربال ميكرومتر 320 على رأس غربال 160 ميكرون. سيتم جمع النوبليوس إيمبروفيسوس باء- 320 غربال ميكرومتر وسيبريدس في غربال 160 ميكرون.
    ملاحظة: اليرقات سيبريد قد تكون مخزنة في 10 درجة مئوية في صحن المتبلور في الظلام لاستخدامها في وقت لاحق، تصل إلى كاليفورنيا. 6 أيام. ومع ذلك، التخزين يمكن أن تؤثر على جودة وأداء من اليرقات أوزة، حتى تجارب مقارنة المعالجات المختلفة ينبغي من الناحية المثالية استخدام اليرقات من نفس الدفعة (ومماثلة تخزين الوقت) لتجنب آثار الخلط16.

5-الثقافة من الطحالب المجهرية كعلف لليرقات Nauplius أوزة

ملاحظة: قد نمت الطحالب في 3 أنواع مختلفة من الثقافات: (ط) الأسهم الثقافات التي للصيانة الطويلة الأجل من السلالات التي كانت تستخدم لتطعيم مضاعفة؛ (ثانيا) بداية الثقافات، وهي الخطوة الأولى في الارتقاء؛ وأخيراً (ثالثا) ثقافة الإنتاج، وهو حجم الإنتاج النهائي لكميات كبيرة من الطحالب أوزة آر.

  1. ترتيب الأنواع دياتوم من "مجموعة الطحالب الثقافة" والبروتوزوا (خطة العمل) لاستخدامها كعلف لليرقات nauplius أوزة. الأنواع 2 مارينوي سكيليتونيما (سلالة 1077/5 من خطة العمل) و البسيط تشايتوسيروس var. مرهف (سلالة 1085/3 من خطة العمل) تعطي نتائج جيدة كعلف.
  2. تصفية جميع مياه البحر لاستخدامها في ثقافات الطحالب، باستخدام نظام تصفية خرطوشة مع حجم مسام اسمية 0.2 ميكرون. (مياه البحر التي تم تصفيتها أيضا لاستخدامها لتفقيس بيض سالينا (أ) ، واستزراع اليرقات nauplius أوزة). اﻷوتوكﻻف مياه البحر التي تمت تصفيتها لثقافات الطحالب (عند 105 درجة مئوية لمدة 5 دقائق).
  3. تعد وسيلة للثقافة من الطحالب المجهرية، باستخدام مياه البحر يعقم المخصب مع جايلارد لحل f/2 التي تحتوي على المغذيات غير العضوية والمعادن النزرة، والفيتامينات (انظر 1975 جايلارد17 لوصفه مفصلة). وبالإضافة إلى ذلك، تعد حلاً سيليكات (نا2SiO3)، ولكن الحفاظ على هذا منفصلة من تخصيب f/2 لمنع من هطول الأمطار صلبة.
    ملاحظة: تركيزات الحل إثراء المخزون والمخزون حل سيليكات أعدت لاستخدامها كإضافة 1 مل لكل 1 لتر من مياه البحر.
  4. اﻷوتوكﻻف جميع المعدات المستخدمة في ثقافة الطحالب في 120 درجة مئوية لأنابيب الاختبار اﻷوتوكﻻف توج المسمار 20 دقيقة مع 1 مل من تخصيب f/2 و 1 مل من محلول سيليكات. إضافة الحلول الإثراء وسيليكات إلى ثيسيواتير عند الأواني يعقم والسوائل يكون تبريده إلى درجة حرارة الغرفة.
  5. تنمو الثقافات الأسهم من الطحالب المجهرية في أنابيب الاختبار 40 مل مع الأغطية اللولبية.
    1. ملء أنابيب الاختبار مع حوالي 30 مل من مياه البحر العالي التخصيب. تلقيح الثقافات مع ماصة باستور عقيمة استخدام حوالي 1 مل ثقافة الأسهم 2 أسبوع من العمر. ثم تركيبها سداده ملولبة ولكن لا تشديد، للسماح بتبادل بعض الغاز. إذا كانت متوفرة، ينبغي أن تنفذ التلقيح في تدفق الصفحي مجلس الوزراء الحد من مخاطر التلوث.
      ملاحظة: ثقافات الأسهم يهدف إلى الحفاظ على الثقافات الطحالب على أساس طويل الأجل، وأن تكون بمثابة العدوى للبدء في الثقافات. تم تلقيح ثقافات الأسهم إعادة كل أسبوعين.
    2. يعرض ثقافة الأسهم الجديدة إلى ضوء أبيض مع كثافة من كاليفورنيا. 25 – 50 µmole m-2s-1 (مع دورة الضوء الظلام من ح 16:8). نقل الثقافات الأسهم القديمة إلى شدة ضوء منخفض كنسخة احتياطية. تجاهل أي الثقافات الأسهم 2 أسبوع من العمر.
  6. لرفع مستوى ثقافة إنتاج الطحالب، تطعيم ثقافات ابدأ من ثقافة الأسهم وتنمو لهم في 500 مل ارلينميييرفلاسكس.
    1. اﻷوتوكﻻف 4 قوارير Erlenmeyer الماصات وسدادات القطن مع 300 مل من مياه البحر (0.2 ميكرومتر) التي تمت تصفيتها وأنابيب الاختبار 4 مع 0.3 مل تخصيب f/2 و 4 مع حلول سيليكات. تهدئة في إثراء f/2 والسيليكات إلى درجة حرارة الغرفة، وإضافة الحلول إلى قوارير ارلينمييير. تطعيم لهم مع المرجع المصدق. 1 مل ثقافة الأسهم 2-الأسبوع القديمة.
      ملاحظة: تعد قوارير 2 مع س. مارينوي و 2 مع جيم-البسيط.
    2. وضعت في قوارير على طاولة تهتز شدة ضوء من µmole 50 م-2s-1. عندما اكتسبوا ثقافات ابدأ كثيفة السكان الطحالب (الأصفر-البنى اللون)، أنهم مستعدون لاستخدامها كالعدوى للثقافات الإنتاج التي ستوفر أوزة اليرقات بالغذاء.
  7. تنمو الثقافات الإنتاج في زجاجات البولي 4 لتر مع سدادات سيليكون مع منافذ حفر 2 مزودة بأنابيب زجاجية.
    1. ربط أنبوب الزجاج 1 الوصول إلى الجزء السفلي من الزجاجة إلى ضخ الهواء عبر أنبوب سيليكون مزودة بمرشح هواء 0.2 ميكرون. تأكد من الأنبوب الزجاج الثاني ينتهي أسفل السدادة السيليكون ومليئة بالقطن للسماح بخروج الهواء المحقون.
    2. كل أسبوع، ملء أربع 4 لتر زجاجات مع مياه البحر التي تمت تصفيتها والاوتوكلاف لهم جنبا إلى جنب مع السدادات. وباﻹضافة إلى ذلك، أنابيب الاختبار اﻷوتوكﻻف 4 مع 4 مل حلول الإثراء وسيليكات f/2.
    3. بعد التبريد، إضافة إلى إثراء f/2 وحلول سيليكات الزجاجات وثم تطعيم لهم مع نصف حجم ثقافات البدء في قوارير Erlenmeyer.
    4. وضع أربع زجاجات ل 4 في شدة ضوء من 50 – 100 µmole m s-2-1.
    5. حصاد ثقافات الإنتاج بعد كاليفورنيا. أسبوع واحد؛ ثم أنها كثيفة بما فيه الكفاية لاستخدامها لتغذية اليرقات nauplius أوزة.
      ملاحظة: إنتاج الثقافات قد عمر حوالي 2 أسابيع، مما يعني أن هناك 8 نشط إنتاج الزجاجات في أي وقت.

6-تصميم الدراسات التجريبية باستخدام الإوز

  1. وضع لوحات مع الإوز الأحداث أو الكبار في الأحواض المائية التي تسيطر عليها حيث أنها يمكن أن تزرع تحت إيدينتيكالكونديتيونس. وهذا ما يسمى بتجربة مشتركة-الحديقة، التي، على سبيل المثال، يمكن استخدامها لفهم أدابتيونس المحلية أو اللدونة المظهرية18، أو لدراسة التغييرات التعبير الجيني فيما يتعلق بالعوامل الخارجية (مثلاً، الملوحة، ودرجة الحرارة، أو الأس الهيدروجيني).
    ملاحظة: من الممكن أيضا استخدام الإوز جمعها مباشرة من الميدان على الألواح. استفادة من استخدام الأفراد تربيتها في المختبر أن آثار الأم يمكن تجنبها عند استخدام الجيل التالي من الأبناء.
    1. كشف الإوز للشروط البيئية المحددة خلال فترة تشوسينتيمي، متبوعاً بحصاد الكبار (مثلاً، لإجراء دراسات عن التعبير الجيني)2.
  2. للتجارب مع اليرقات سيبريد لدراسة التعبير الجيني3، وضع في سيبريدس في الأحواض المائية الخاضعة للمراقبة حيث يمكن أن تزرع اليرقات في ظروف مماثلة.
    1. الحصاد في سيبريدس بعد فترات زمنية محددة عن طريق تصفية مع ثقب سيتا (كما هو موضح في الخطوة 4، 7)، واستخراج الحمض النووي الريبي وفقا للبروتوكولات أدناه (الخطوة 8).

7-تشريح الإوز

  1. تنظيف مختبر الفضاء حيث يتم إجراء التشريح، وأخذ عينات الحمض النووي، بوثبيفوري، وبين الأفراد، بما في ذلك جميع أدوات التشريح. ويتم ذلك باستخدام الكلور لمقاعد البدلاء (أو الإيثانول 96% الملقط).
    ملاحظة: يتم إعداد أنابيب تلصق عليها بطاقات تحتوي على وسائط التثبيت (الإيثانول أو حلاً استقرار رنا) مقدما.
  2. حدد الأفراد المتعطشة كبيرة وقصيرة الأجل (لا اطعامهم لمدة يومين قبل تسلخ). تنظيف وعاء أوزة مع فرشاة أسنان للتقليل من خطر التلوث من الأنواع الأخرى (مثلالبكتريا والطحالب) وشطف بالماء.
    ملاحظة: السبب في تجويع قصيرة الأجل للأفراد قبل التشريح لتجنب أي تلوث الحمض النووي (مثلاً، من الخراجات الارتيميا في القناة الهضمية).
  3. ضع الإوز الفردية على سطح حتى، مرفقة بلوحة أو فضفاضة في طبق. تشريح وأنسجة كل من الكبار. هناك عدة طرق لتشريح الإوز، تبعاً لغرض الدراسة.
    1. تشريح الطريقة ج: تحديد أوزة كله، في أسرع وقت ممكن.
      1. إزالة أوزة كله من الفريق باستخدام مشرط، إدراجه تحت أوزة وعلى مقربة من سطح لوحة.
        ملاحظة: في معظم الحالات، هذا التلاعب يترك لوحة القاعدية تقريبا سليمة، وبالتالي لا تؤثر على أوزة داخل.
      2. الكراك الغلاف الخارجي على جانب واحد بعناية عن طريق إدراج الملقط (الشكل 3). ويتم ذلك لتسهيل اقتحام متوسطة فيكساتينج داخل الصهريج.
        ملاحظة: إذا لم مكسورة shell على الإطلاق قبل أن يضع في أوزة في أنبوب اختبار، فإنه قد يؤدي إلى عملية تثبيت أبطأ ونوعية رديئة من الحمض النووي في وقت لاحق.
      3. وضع أوزة مكسورة في أنبوبة الاختبار التي تحتوي على الحمض النووي الريبي حل تخزين أو الإيثانول. ترك أوزة في الحل لمالا يقل عن 24 ساعة تثبيت. عندما يتم إصلاحها أوزة، يمكن اتخاذها للخروج من وسائط التثبيت الحيوان ويوضع على صينية تشريح. يمكن فصلها عن بعضها البعض ووضعها في أنابيب منفصلة لمزيد من عمليات الاستخراج من الحمض النووي الريبي أو سيري وعباءة سوما (الهيئة).
        ملاحظة: من المهم مراقبة إذا lamellae البيض بالبيض المخصب موجودة داخل أوزة. إذا كانت موجودة، يجب إزالة هذه قبل الشروع في استخراج الحمض النووي لتجنب إيجاد الأنماط الجينية متعددة في النموذج.
    2. تشريح الأسلوب ب: إزالة أوزة من شل قبل أن التثبيت.
      ملاحظة: هذا الأسلوب لا دائماً ينتج في عباءة يتم أخذ عينات نظراً لتعلق داخل كالكاريوسشيل. ولكن يمكن أن يكون وسيلة سريعة لأخذ عينات من الحمض النووي من أي فرد.
      1. إزالة بعناية، باستخدام الملقط التشريح، لوحات تيرجال وسكوتال (الشكل 3) بإدراج تلميح الملقط بين لوحات تيرجال وسكوتال والاستيلاء على عقد صفيحة، وسحب بلطف لإزالتها.
      2. الاستيلاء على عقد من سيري بالملقط وسحب أوزة مباشرة إلى الخارج ووضعه مباشرة في الإيثانول 96% أو الحمض النووي الريبي استقرار الحل لتثبيت...
        ملاحظة: في بعض الأحيان، عباءة سوف أيضا أخذ عينات في نفس الوقت، كما ينظر إليه ظهارة رقيقة مع تصبغ الظلام (في إيمبروفيسوس (ب)). وبخلاف ذلك، عباءة يمكن إزالتها من داخل shell استخدام مشرط و، بعد ذلك، توضع في الإيثانول أو الحمض النووي الريبي تثبيت الحل.
        ملاحظة: يمكن المجففة لوحات تيرجال وسكوتال (إذا كانت سليمة) وحفظها لأنها مفيدة ل تحديد الأنواع10. توصية عامة، إذا لم يكن هناك أي مجال للشك في الأنواع، وأيضا صورة أوزة كله قبل تهيئة التشريح.

8-الجيش الملكي النيبالي استخراج PCR الكمي

  1. وضع الكبار لاستخدامها لاستخراج الحمض النووي الريبي في الجيش الملكي النيبالي تثبيت الحل واحتضانها لهم بين عشية وضحاها (تصل إلى 24 ساعة) في 4 درجات مئوية، وثم تخزينها في-80 درجة مئوية.
    ملاحظة: سيبريد يرقات تفضيلي الجاف-المجمدة، دون الجيش الملكي النيبالي في-80 درجة مئوية، وبعد ذلك مباشرة بوضعها في كريوتوبيس وثم غمر الأنابيب بإيجاز (30 ثانية) في النتروجين السائل قبل تخزينها في-80 درجة مئوية.
  2. في الوقت لاستخراج الحمض النووي الريبي، ذوبان الجليد الإوز على الجليد واستخدامها سليمة أو تشريح خارج أنسجة لاستخدامها (راجع الخطوة 7).
    ملاحظة: بسبب ارتفاع التنوع الوراثي بين الأفراد (≈ 3 – 5% تباين في ترميز المناطق؛ ألم روسينبلاد et al.، معطيات غير منشورة) فمن المستحسن إلى بولا عدد الأفراد الكبار، مما يقلل من تأثير تسلسل التباين بين الأفراد في الخطوة qPCR لاحقاً.
  3. رنايكستراكشن، إضافة 350 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت المقدمة مع مجموعة إعداد الجيش الملكي النيبالي في أنابيب التجانس الذي يتضمن مم 2.8 من حبات السيراميك.
    ملاحظة: حبات السيراميك توفير عائد أفضل من الجيش الملكي النيبالي سونيكيشن (نتائج الممثل) بالمقارنة.
  4. تأخذ أوزة الكبار (الجامعة أو الأنسجة) أو جمع الحد أدنى من 20 اليرقات سيبريد استخدام الملقط ووضعها في أنابيب التجانس.
  5. الانتقال مباشرة إلى اضطراب وتجانس مع طاحونة حبة.
  6. وضع أنابيب تجانس العينة والخرز صاحب طاحونة حبة. اهتز لهم مع تردد 4.0 m/s لتبريد س. 20 العينة لمدة 1 دقيقة على الجليد. كرر 2 x.
  7. إعداد الجيش الملكي النيبالي وفقا لبروتوكول عدة عزل الحمض النووي الريبي المتاحة تجارياً.
    ملاحظة: ينبغي إجراء تقييم لمخاطر (بما في ذلك قراءة كشوف بيانات السلامة) قبل استخدام أساليب استخراج الحمض النووي الريبي، للتعرف على المواد الكيميائية الخطرة التي تتطلب استخدام غطاء دخان وغيرها من الملابس الواقية، بما في ذلك القفازات (مثلاً، ينبغي إجراء إضافة β-mercaptoethanol إلى المخزن المؤقت تحلل أثناء استخراج الحمض النووي الريبي في غطاء دخان).
  8. التحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي. يعد إيجاد حل عملي وإضافة معيار وعينات لإجمالي حجم 200 ميليلتر. دوامة منهم ل s 2 – 3 واحتضانها لهم للحد الأدنى 2 إدراج الأنابيب في فلوروميتير وأخذ قراءات.
  9. فحص عينات الحمض النووي الريبي لأي تلوث من البروتين مع جهاز المطياف الضوئي، والتحقق من سلامتها بالجيش الملكي النيبالي مع نظام التفريد الآلي (نتائج الممثل).
    ملاحظة: للأعمال التحضيرية ذات نوعية جيدة، ينصح الحمض النووي الريبي لدى نسبة قدرها 260/280 nm 2-2.2 والحمض النووي لحوالي 1.8. القيم المنخفضة تشير إلى التلوث البروتين، وأن إجراءات استخراج الأمثل.

9-الجينات: كدنا التوليف وقبكر

  1. علاج الدناز رناويث التي تم الحصول عليها لإزالة أي ريمينينجدنا قبل إجراء كدنا ل qPCR.
    1. تحقق من تلويث الحمض النووي عن طريق إضافة عينة من الحمض النووي الريبي ولكن لا المنتسخة العكسية عند إعداد كدنا. إذا كان هناك [بكر] تضخيم الجين المحدد على كدنا دون المنتسخة العكسية، هناك تلوث الحمض النووي في الجيش الملكي النيبالي.
      ملاحظة: للعينات التي ستستخدم للجيش الملكي النيبالي-seq (الحمض النووي الريبي-التسلسل باستخدام تكنولوجيا الجيل التالي التسلسل)، خطوة الدناز أقل أهمية. على وجه الخصوص، لعينات ذات المستويات المنخفضة من الجيش الملكي النيبالي، قد أغفل هذه الخطوة الدناز كي لا تفقد الكثير من الجيش الملكي النيبالي في العملية.
  2. إجراء توليف كدنا في الجيش الملكي النيبالي تعامل الدناز استخدام كمية من الحمض النووي الريبي ضمن النطاق المحدد في كدنا التجاري توليف عدة، ولكن عادة، استخدام على الأقل 50 نانوغرام.
  3. تصميم كبسولة تفجير قبكر بحيث أنهم يصلب لأجزاء من الجينات للاهتمام حيث هوية التسلسل بين الأفراد على أعلى مستوى ممكن، ولكن هوية التسلسل بين الجينات بارالوجس منخفضة قدر الإمكان. يرجى الاطلاع على المنشورات المقابلة لأزواج التمهيدي معينة استخدمت دراسات التعبير الجيني نا+/K+ أتباسي3 وأكوابورينس2 (الشكل 5).
    ملاحظة: لهذا الغرض، يمكن استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي تسلسل البيانات من مئات سيبريدس أو من عدة أشخاص بالغين.
  4. تصميم كبسولة تفجير لجينات التي ستستخدم لتطبيع مستويات التعبير (مثلاً، أكتين). الإشعال المستخدمة بنجاح أكتين، إلى الأمام:-كاتكاجاتكاجاتكاتكجك 5 '-3'، وعكس:-أتكتجكتجاجتجاك 5 '-3'.
    ملاحظة: أكتين جين تحكم المستخدمة بشكل شائع. ومع ذلك، آخرون أيضا اقترح كمرجع واختبار في19من الإوز. وإلى جانب أكتين، تم استخدام RPL8، 36B4، EF1، و NADHd1 كمرجع اختبار3. واستنتج أن هناك لا اختلافات كبيرة في مستويات تعبير الجينات مرجع كل منهما بين سوما، سيري، والكبار، أو سيبريدس.
  5. تحسين درجة الحرارة انلينغ للإشعال مصممة بإضافة كميات متزايدة من كدنا (عادة في نطاق 0.25 – 50 نانوغرام) إلى مزيج يحتوي على "الأخضر سيبر"، دنتب، بوليميراز و 0.3 ميكرومتر في كل من الأمام وعكس التمهيدي.
  6. تشغيل بروتوكولات qPCR في درجات حرارة انلينغ مختلفة على النحو التالي: درجة حرارة تمسخ أولى 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، وخطوة تمسخ عند 95 درجة مئوية 20 s، الصلب درجات حرارة 55-63 درجة مئوية 20 s، واستطالة عند 72 درجة مئوية لمدة 30 s. وفي المجموع، تشغيل 40 بكر دورات.
    ملاحظة: الكفاءة التمهيدي ينبغي أن تقع في نطاق 90 – 105% وتحسب ك E = (10^(-1/slope)-1) x 100 حيث المنحدر هو انحدار منحنى الحصول عليها عندما رسم قيمة سجل تركيزات كدنا ضد قيمها عتبة (Ct) دورة.
  7. أداء قبكر باستخدام مبلغ مناسب لكدنا، عادة 1-10 نانوغرام، استخدام بروتوكول PCR الموضحة في الخطوة 3 مع درجة الحرارة المثلى انلينغ وجدت.
    ملاحظة: يستخدم المبلغ الأعلى لكدنا فقط للجينات التي يتم التعبير عنها بكميات منخفضة للغاية.

Representative Results

وصف الإجراء لاستزراع الإوز الكبار من إيمبروفيسوس باء، ما يصل إلى أربع دفعات من ناوبليوس يمكن إنتاج اليرقات في الأسبوع. فإنه سيكون من الممكن جمع اليرقات nauplius تقريبا كل ليلة، ولكن هذا يتطلب المزيد من الناس والبنية التحتية (مع كثير من الإوز في الأمهات، ثقافة سوف الإفراج اليرقات بشكل مستمر). يظهر عامل تحد إضافي لإنتاج اليرقات على توافر الأعلاف عالية الجودة، لا سيما فيما يتعلق دياتوم Skeletonema. أقصى، يتألف كل دفعة من نظام تثقيف النوبليوس 12,000 تقريبا، حتى تصل إلى الوظيفة 50,000 في الأسبوع يمكن أن يكون مثقف. ومع ذلك، قد يكون بضعة أسابيع هناك ما يصل إلى عشرة إضعاف اليرقات أقل أنتجت. بالغ واحد يمكن أن تنتج اليرقات 7,000 تصل إلى كل يوم14، مما يعني أن البالغين 1-2 يتم الإفراج اليرقات لكل دفعة. في غضون أسبوع، سوف تتطور حوالي 70 – 90% للوظيفة التي تم جمعها إلى سيبريدس (الغلة تقريبا 30,000 سيبريدس في الأسبوع، الحد الأقصى) التي يمكن استخدامها للدراسات الجزيئية وفحوصات التسوية.

وينبغي التشديد على أن هناك اختلافات في ميزات سيبريد بين دفعات، وعموما، هناك الاختلافات الكبيرة بين دفعات من ضمن مجموعات. على سبيل المثال، يختلف نجاح تسوية في فحوصات التسوية بين 30 و 70 في المائة لدفعات مختلفة. على الأرجح، يحدث هذا بسبب التباينات الوراثية الفردية بين أزواج معينة من البالغين الإفراج اليرقات أثناء فترات أخذ العينات المختلفة. وبطبيعة الحال، من المستحسن أن التجارب المتكررة (replicates البيولوجية) ينبغي أن تشمل سيبريدس من عدد من دفعات إذا كانت بيانات عامة أكثر حول النتائج بذل. يضع التباين دفعة لدفعة المطالب على التصميم التجريبي، حيث ينبغي أن يطبق ضوابط سليمة ونورماليزيشنز في دراسات التعبير الجيني. لكن حتى بعد أن تم تنفيذ العديد من الإجراءات الإحصائية التطبيع التي تقلل إلى حد كبير من التباين بين الدفعات، بعض الآثار المترتبة على الدفعة عادة ما زال واضحا (بيانات غير منشورة).

بعد البروتوكول المتوفرة، فمن الممكن الحصول على، في المتوسط، 500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي عالية الجودة من سيبريدس 20 قدر ضئيل، بغض النظر عن مرحلة التسوية أوزة (الجدول 1). عادة ما يتم قياس نوعية الجيش الملكي النيبالي كالنسبة بين قمم 18S و 28S (الموضع المتوقع من قمم اثنين ترد في الشكل 4). ومع ذلك، في حالة الإوز وكثير من المفصليات الأخرى، الرنا الريباسي 28S ينهار عند تسخينها (كجزء من أسلوب التحليل) وترحيل جنبا إلى جنب مع ذروة 18S20. وهذا السبب هناك، من حيث المبدأ، ذروة الرنا الريباسي واحدة واحدة في هذا النوع من التحليل للاوز. فمن الواضح من هذا الاختبار (الشكل 4) أن تجانس واسطة حبات السيراميك يوفر الجيش الملكي النيبالي بأعلى درجات النزاهة وهو، لذلك، طريقة الاختيار. الجيش الملكي النيبالي كافية في كمية ونوعية لإنشاء مكتبات تسلسل عالية الجودة للتسلسل، وينتج في متوسط 70 مليون على ما يلي كل عينة (عدد القراءات، بالطبع، يعتمد على مستوى الإرسال المتعدد أثناء التسلسل). كمية الحمض النووي الريبي أيضا كافية لتحليل التعبير توليف و qPCR كدنا لعدد كبير من الجينات.

يبين الشكل 5 النتيجة من تحليلات قبكر من أكوابورينس ومن غ+/K+ أتباسي (NAK1) لصق المتغيرات، حيث تم التحقيق في التعبير التغييرات استجابة للتغيرات في البيئة العظة2،3. مقارنة التعبير النسبي منذ فترة طويلة وقصيرة لصق المتغيرات ليظهر NAK1 شقين سيزيد مرناً NAK1 طويلة في الملوحة منخفضة بالنسبة NAK قصيرة (الشكل 5ألف). وهكذا، تشير البيانات إلى أن الربط بديلة يجعل النموذج الطويل السائد تحت ظروف الملوحة منخفضة. وفي حالة أكوابورينس، فمن الواضح أن بارالوجس نقل المياه هما AQP1 و AQP2 عرض التعبير التفاضلية (الشكل 5ب). على وجه الخصوص، في النسيج عباءة، فإنه من الواضح أن AQP1 أسفل ينظم إلى حد كبير في انخفاض الملوحة، الذي لا ينظر ل AQP2. بدلاً من ذلك، يظهر AQP2 تعبير زيادة طفيفة في مستويات أقل، ولكن في سوما. هذه النتائج توفر قاعدة للتحقيقات للأدوار الوظيفية لمختلف الناقلين أيون إيمبروفيسوس (ب) وأكوابورينس في أوسموريجوليشن أوزة.

Figure 1
الشكل 1 : لمحة عامة عن الجامع استزراع الداخلي واستخراج الحمض النووي الريبي لدراسات التعبير الجيني في البالغين- الشروع في نشر ثقافة جديدة، يعلق على إطار اللوحات والمنتشرة في البحر في 1-عمق 3 م. بعد عدة أسابيع، توضع اللوحات مع الكبار/الأحداث عمودياً في رفوف في علب في المختبر. كل علبة تحمل لوحات حوالي 40 مع البالغين. مع ما يقرب من 100 من الكبار كل فريق في ≈ مجموع الأفراد البالغين 4,000 تربى كل علبة. البرنقيل الكبار هي التي تتغذى على الارتيميا ويمكن الاحتفاظ بالسنة-حولها. وتتجمع اليرقات nauplius عدة مرات في الأسبوع من الصواني عبر الترشيح من خلال غربال. يتم نقل الوظيفة التي تم جمعها إلى دلاء تبقى عند 26 درجة مئوية في حمام مائي وتتغذى على الطحالب المجهرية. النوبليوس وتربى حتى أنهم تساقط في سيبريدس غير التغذية، التي يتم جمعها من قبل التصفية. يمكن إنشاء أفرقة جديدة في المختبر بتسوية سيبريدس في الألواح، أما لتوفير لوحات جديدة للسنة-حول الثقافة، أو لاستخدامها لمجموعة عمليات تجريبية محددة مع الظروف الخارجية المتغيرة. ثم يتم استخراج الحمض النووي الريبي من الأحداث/الكبار في نهاية التجربة أو في نقاط زمنية محددة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : صور لبعض الخطوات الهامة في عملية تثقيف. (أ) هذه الصورة يظهر الإطارات مع الأفرقة المعنية بجمع السكان الجدد من الميدان. (ب) هذه الصورة يبين الأفرقة مع الإوز الكبار من إيمبروفيسوس باء في الرفوف التي توضع في الصواني. وتوضع اللوحات حوالي 2 سم عن بعضها البعض. (ج) هذه الصورة يظهر الصواني مع أوزة لوحات وخزان التغذية إلى اليسار. من كل علبة، وهناك منفذ حيث توضع في ثقب سيتا لجمع اليرقات ناوبليوس. (د) يوضح هذه الصورة إنتاج الارتيميا لإطعام الإوز الكبار. (ﻫ) هذه الصورة يبين تربية النوبليوس في دلاء توضع في حمام مائي بتعيين إلى 26 درجة مئوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : وصفاً للخطوات الأولية تسلخ من الإوز الكبار: إزالة الجسم من شل به. (أ) الاستيلاء على إحدى لوحات أوبيركولار عن طريق إدراج الملقط بلطف من خلال الفتحة. سحب بلطف لإزالة اللوحة وفضح الحيوان. (ب) سحب الحيوان بالاستيلاء على الجزء سوما فقط أدناه سيري. (ج) هذا الفريق يوضح تشريح الإوز بلوط عموما. عباءة والبويضات المخصبة المحتملة (في المبيض) البقاء في تجويف قذيفة عندما يتم سحب الجسم. مذكرة بشأن تشريح أوزة (لحساب أكثر تعمقاً، انظر أندرسون)9: لوحات الحائط من أوزة منحدر إلى الداخل، ومعا، تشكل مخروط مثل بركان. فتحه، الفتحة، مغطى بلوحات أوبيركولار اثنين، والتي تشكل الباب، أو أوبيركولوم، لإغلاق الفتحة. بلوط الإوز عموما قد طبق القاعدية كلسية ملتصق بشدة التحتية؛ ومع ذلك، تفتقر بعض الأنواع من الإوز هذه اللوحة الجيرية (مثلاً، بالانويديس س.). تفرز الإوز الهيكل الخارجي من عباءة حزن المصطبغة (حسب). على السطح الخارجي لعباءة مزدوج الطبقات هو متكلسة لتصبح جامدة، بينما هو لا متكلسة السطح الداخلي لعباءة وهو بالتالي مرنة. داخل الفتحة، موجودة سيري في موقف تراجع. هذه هي الملاحق الصدر الإوز استخدامها لتغذية تعليق. المبايض يقع بالقرب من القاعدة لاوزة، بينما الخصيتين تكمن في سوما. وقد تم اعتماد هذا الرقم من بانوفا et al. 21 وتم نشرة بإذن من سبرينغر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : تصميم السلامة الرنا الريباسي بالتفريد جل الشعرية. أعد الجيش الملكي النيبالي بطريقتين مختلفة التجانس: sonication (A) و (ب) حبات السيراميك. يقف وحدة على المحور الصادي، فو، لوحدات الأسفار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : نتائج التعبير الجيني من دراستين مختلفتين من المورثات الهامة أوسموريجوليشن في إيمبروفيسوس. (أ) هذا الفريق يظهر التعبير التفاضلية قياسا قبكر متغيرات لصق نا+المستويات/K+ أتباسي NAK1 في الاستجابة لمختلف الملوحة و pCO2 3. في علاج الملوحة منخفضة، يتم زيادة التعبير عن isoform طويلة (NAK1-L) بالنسبة للمدى القصير (ANOVA، ف < 0.001). (ب) هذا الفريق يظهر التعبير عن أكوابورينس في البالغين من إيمبروفيسوس باء- أثناء تعرضهم لشتى الملوحة2. واستخدمت لتحديد مستويات التعبير أكوابورين بالنسبة إلى أكتين qPCR. كانت المحتضنة الأفراد الكبار في الملوحة مختلفة 3 (الأمير سلطان 3 و 20 و 33) لمدة 14 يوما. لإعداد الجيش الملكي النيبالي، تم فصل سوما وسيرى، وعباءة الكبار. تبين أشرطة الخطأ في كلا الرقمين، الانحراف المعياري. * * و * * * تشير إلى مستوى من الأهمية (ANOVA)، 0.01 و 0.001، على التوالي. وقد تم تعديل هذه الأرقام من ليند et al. 2 , 3-تنشر أرقام سواء بإذن من "أحد بلوس". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

مرحلة التسوية المبلغ الإجمالي للحمض النووي الريبي (الحرس الوطني)
السباحة الحرة 512
الاستكشاف: البحث عن وثيقة 518
سيبريد المرفقة 550
حديثا ومغيرة الأحداث 832

الجدول 1: غلة من الحمض النووي الريبي. هذا الجدول يوضح كمية الحمض النووي الريبي المستخرج مع مجموعة إعداد الجيش الملكي النيبالي من تجمعات الأفراد سيبريد 20 التي تم جمعها في مراحل مختلفة أثناء عملية التسوية.

Discussion

ثقافة أوزة في Tjärnö مختبر الأبحاث البحرية (السويد) وقد تم تشغيل أكثر من 20 عاماً، وقد استخدمت للدراسات التي أجريت في العديد من المجالات البحثية المختلفة. تم نشر ما يزيد على 30 ورقة علمية التي استخدمت نظام تثقيف خلال السنوات الماضية، بما في ذلك دراسات في13،المضادة للحشف على السفن22، الهيدروناميكا23، الإيكولوجيا الكيميائية24، وتغير المناخ16 ، علم الأحياء التطوري5، والبيولوجيا الجزيئية2.

تجنب اختيار بعض الأفراد التي أكثر تكيفاً مع البيئة مختبر (الأفراد التي قد لا تكون ممثلة للسكان البرية)، يوصي بجمع من أمهات جديدة من الميدان كل سنة. وباﻹضافة إلى ذلك، كما أنها ممارسة جيدة لتجديد الثقافة سنوياً، حيث يوجد حوالي 50-80% وفيات لدى البالغين خلال سنة عادية. ومع ذلك، إذا كان الهدف هو إنتاج خطوط الفطرية أو لإعداد الدراسات المتعلقة بتطور تجريبية، الأسر التي تمت تربيتها في المختبر فقط لاستخدامها.

وقتاً طيبا لجمع إيمبروفيسوس على لوحات في مختبر الأبحاث البحرية في Tjärnö في حزيران/يونيه – آب/أغسطس لأنه في ذلك الوقت، هناك إمدادات جيدة من اليرقات سيبريد في البحر. تحقق من الأفرقة أسبوعيا معرفة متى يبدأ تسوية أوزة ويدويًا إزالة الآخر استقر الأنواع من إيمبروفيسوس باء (مثلبلح البحر، تونيكاتيس، بريوزوانس، وانيمونات، نيميرتينس/اﻷنبوبية وغيرها من الأنواع أوزة) من لوحات (مثلاً، مع فرشاة أسنان). حول Tjärnö، هناك ثلاثة أنواع المياه الضحلة أوزة الحالية (باء-إيمبروفيسوس، بالانويديس سيميبالانوس، و كريناتوس بالانوس). ومع ذلك، هو إيمبروفيسوس باء- المهيمنة فولر من الأسطح الملساء الصلبة خلال تموز/يوليه – آب/أغسطس. س. بالانويديس في فترة التسوية خلال أوائل الربيع ويفضل أساسا الطبيعية ركائز (مثلاً، الحجارة). باء-كريناتوس يمكن أن تحدث في الأرقام منخفضة على اللوحات خلال فصل الصيف.

من الممكن أيضا أن تبدأ أوزة الكبار الأجيال الجديدة من المثقفين سيبريدس، الذي سيكون ضروريا إذا تم إنشاء بعض ليناجيس بسمات محددة، أو في الدراسات المتعلقة بتطور تجريبية. الطريقة الأكثر ملاءمة لبدء الأجيال الجديدة من البالغين لتسوية سيبريدس على الألواح الحرارية في المختبر. يمكن استخدام هذه اللوحات مع سيبريدس حديثا تمت تسويتها أيضا في علاجات تجريبية أو للتعرض في الميدان. في الحالات الطارئة، واحدة أيضا استخدام البالغين على الصخور من موقع قريب (مثلاً، إيديفجوردين في حالة مختبر الأبحاث البحرية Tjärnö) التي يشيع فيها إيمبروفيسوس (ب) . هؤلاء الكبار المنشأة بالفعل تعامل بنفس الطريقة كالكبار على الألواح، ومن ثم يتم وضعها في علب وتتغذى عن طريق التدفق عبر النظام. يمكن أيضا استخدام تدفق الخلايا ﻹنشاء أفرقة مع الإوز25. هذه هي الدوائر من خلال تدفق مع العوالق الصافي على الجانبين التي سيبريدس عدم تسوية، مع لوحات كسطح المستوطنة الوحيدة لليرقات.

وهناك العديد من الخطوات الحاسمة لإقامة ثقافة أوزة أداء الطويل الأجل بما في ذلك جميع مراحل الحياة. الطرق المستخدمة للثقافة إيمبروفيسوس باء- على الأرجح، إلى حد كبير، كما ينطبق على غيرها من اللافقريات البحرية مع تخترق، بلانكتوتروفيك اليرقات. وصف الإجراءات تثقيف لبعض الأنواع بالفعل جيدا (مثلاً، لأنواع مختلفة من المحار وبلح البحر الأزرق)26، بينما بالنسبة لغيرها من اللافقريات البحرية، وهناك فقط بضعة أمثلة من الثقافات طويلة الأجل تمتد حياتهم كلها دورة. واحدة من أولى محاولات ناجحة للثقافة الإوز (amphitrite باء) فعل ريتشوف et al. 15-ينبغي أن تكون الموارد المالية والشخصية الطويلة الأمد في المكان قبل النظر في إعداد أوزة استزراع مرفق. الحفاظ على هذا النوع من السنة--حول أوزة يتطلب ثقافة شخص واحد على الأقل العمل نصف الوقت. قد يكون هناك بعض الإمكانات لأتمتة بعض الخطوات في خط الإنتاج، أساسا استزراع الطحالب المجهرية27مستقبلا. وباﻹضافة إلى ذلك، ولكي تنجح، من الضروري للوصول إلى كميات كبيرة من مياه عالية الجودة. استزراع الطحالب المجهرية، الارتيميا، والإوز لا تنطوي على أي إجراءات السلامة الخاصة. ومع ذلك، قد تحتاج إلى اختبارات لبعض المواد المضادة للحشف على السفن أو المواد الكيميائية السامة احتياطات خاصة.

تم فحص اللوحات عدة مرات في أسبوع للتلوث. تم ضخ ما يصل من عمق 40 مترا في "المضيق كوستر" خارج مختبر الأبحاث البحرية في Tjärnö مياه البحر المستخدمة في الثقافة وتم تمرير من خلال اثنين من المرشحات الرملية قبل إدخال نظام المياه في المختبر. إذا جرى لا تصفية المياه، سيكون هناك أكثر بكثير من التلوث في الثقافة. من الضروري تنظيف بانتظام على لوحات في الثقافة من البقايا واللافقاريات الأخرى (مثلاً، بناء رئد وانيمونات ونيميرتينس المفترسة) الذي أدخل النظام عن طريق الإمداد بمياه البحر من الميدان. على سبيل المثال، إذا كان يتم إنتاج لا اليرقات على الرغم من حقيقة أن الثقافة كان جيدا تغذية وخلاف ذلك يبدو أن تكون في حالة جيدة، قد تكون المشكلة وجود نيميرتينس التي يبدو أنها تمنع التزاوج. وبطبيعة الحال، العديد من الكائنات الحية ملوثة في الثقافة في مختبر الأبحاث البحرية Tjärnö كانت محددة للساحل الغربي السويدي، وأنواع أخرى من تلوث الكائنات الحية سوف تكون سائدة وتكون أكثر من تحد في المناطق الجغرافية الأخرى. على الساحل الغربي للسويد، غير عادية البحث عن التلوث بالأنواع الأخرى أوزة على الألواح. في بعض الأحيان، تم العثور على إنشاء بالانويديس س. ، ولكن هذه مشكلة هامشية جداً (على الأكثر، واحد س. بالانويديس الملوث لعينات إيمبروفيسوس باء- 10,000). وكان عدم تلويث الأنواع يعتمد على الأرجح على النظام لإنشاء ثقافات جديدة خلال فصل الصيف، عندما كانت لارفايفروم إيمبروفيسوس باء- الغاية المهيمنة. وبالإضافة إلى ذلك، هناك أيضا إثراء إيمبروفيسوس باء- واضحة على الألواح منذ هذه الأنواع انتقائية للأسطح الملساء13.

من الضروري إزالة الإوز الميت الكبار. إذا تركت هذه القذائف الفارغة على الألواح، يمكن أن تصبح مأوى الارتيميا النوبليوس وكذلك لمختلف الأنواع ملوثة. وباﻹضافة إلى ذلك، وقد لوحظ أن الأفراد الميت تؤثر على رفاه المجاورة الأفراد، ربما مع الإفراج عن المركبات السامة أثناء التحلل. وثمة نتيجة إضافية لوفيات البالغين أن بعض الأفراد سوف تترك وحدها وبعيدا جداً من غيرهم من الكبار للسماح بالتزاوج (على الرغم من أن الإوز يكون القضيب أطول في عالم الحيوان بالنسبة لحجمها)28. هؤلاء الأفراد سوف البقاء على قيد الحياة ولكن غير منتجة لليرقات. بيد أن هؤلاء الأفراد البالغين الانفرادي يمكن إزالتها بلطف دون الأضرار بالقاعدة اللوحة ويوضع أفقياً قريبة من الآخرين لتمكين التزاوج. يمكن أيضا أن يكون تزاوج بوضع لوحات مع شخص بالغ واحد على كل الإوز لكن إغلاق ما يكفي بحيث يمكن أن يحدث تلاقح. وبهذه الطريقة، يمكن أن تكون خطوط الوراثية المنتجة14.

من الأهمية بمكان لإنتاج أعلاف عالية الجودة وتغذية الثقافات تقريبا كل يوم. يمكن أن يؤدي إصدار متناقصة من اليرقات حتى بضعة أيام دون طعام. وأظهرت الاختبارات السابقة لتكوين نظام غذائي أن الدياتومات ضروريان للنمو والبقاء على قيد الحياة من النوبليوس أوزة. العديد من الأنواع دياتوم تبدو كافية كتغذية، على الرغم من أن خلايا صغيرة أو الانفرادي (أقل من 10 ميكرون في القطر) قد يكون من الضروري لابتلاع الوظيفة. الأنواع S. مارينويو البسيط C. بسيودونانا ت. كافة أثبتت أن تكون تغذية كافية للوظيفة إيمبروفيسوس باء ، وكذلك سهل لزراعة. وبالإضافة إلى ذلك، جودة الأعلاف أعلى عموما لاطراد نمو الطحالب. وأفيد أيضا أن الدياتومات تعتبر أساسية لإنشاء الثقافات المنتجة amphitrite ب15. نظرية لأهمية الدياتومات هو أن لديهم ملف تعريف فريد من الأحماض الدهنية وخاصة غنية ب الأحماض الدهنية غير المشبعة عالية 20:529. قد ثبت أن بعض الأحماض الدهنية هامة للتنمية الناجحة للمحار يرقات30.

على مر السنوات، كانت هناك لا حالات الأمراض الضارة في ثقافة أوزة. في aquacultures اللافقارية تجارية كثيرة، مثل المحار وبلح البحر، أمراض شائعة بل وقد تكون ضارة جداً. كما أبلغ عن الآثار الضارة للفيروسات من السكان البرية. حلت محلها المحار أصلي في فرنسا المحار البرتغالي Crassostrea angulata في عام 1925، ولكن هذه الأنواع كانت تمحى من قبل إيريدوفيروس حول عام 197031. في الآونة الأخيرة، كانت هناك أحداث وفيات هائلة في محار المحيط الهادي Crassostrea gigas في الثقافات في جميع أنحاء العالم، التي يبدو أن تترافق مع هربس 1 أستريد32. وقد نشرت حتى الآن لا تقارير بشأن مسببات الأمراض، والبكتيريا، أو الفيروسات على الإوز. ومع ذلك، في مشروع الجينوم الجارية على إيمبروفيسوس باء، عثر على تسلسلات فيروس (Alm روسينبلاد et al., بيانات غير منشورة) ولكن مع أي صلة واضحة بأعراض الأمراض. طبقت سابقا خليط من المضادات الحيوية للثقافات للتقليل من خطر الإصابة بالالتهابات البكتيرية؛ ومع ذلك، يتم حاليا التخلي عن هذا الإجراء وحتى الآن، وهذا لم يسبب أي مشاكل التلوث.

إذا كان يتم تسخين مياه البحر (كما هو موضح أعلاه)، الانهاك قد يكون أشد خطر في خط إنتاج الثقافة. وبطبيعة الحال، من الصعب حماية ضد ارتفاع درجة الحرارة، على الرغم من أن أجهزة الاستشعار ونظم مناسبة للتنبيه قد يكون المستخدمة (مثلإرسال رسائل البريد الإلكتروني أو النص إلى الأشخاص المسؤولين). حوادث من هذا النوع في الماضي قد أسفر عن مقتل كبير من الكبار في الثقافة. هذا، بطبيعة الحال، تكون مدمرة والخراب استثمارات طويلة الأجل في الوقت والمال. على وجه الخصوص، ستكون هذه كارثة إذا أنشئت خطوط الوراثية الفطرية. لضمان طول العمر لهذه الخطوط، وأمن لهم من الفقدان بطريق الخطأ، سيكون من المستصوب وضع منهجية نعد للاوز. وأفيد أن اليرقات من محار المحيط الهادي يمكن تجميدها لأسفل وإحياء مع نجاح جزئي33. وكان كريوبانكينج أيضا أداة قيمة للحفاظ على الموارد الجينية في طائفة واسعة من الأنواع34. الوظيفة حتى من amphitrite باء البقاء على قيد الحياة تجميد35، ووجد أن 20% الأفراد مجمدة إلى أسفل مغيرة بنجاح إلى سيبريدس36. ولكن تطبيق تجميد الاستدامة طويلة الأجل للثقافات وحتى الآن لم يعتمد، بل هذا الفعل اللازم للحفاظ على البنود التي تم تحديدها؛ وهذا سيكون خطوة أساسية لترسيخ إيمبروفيسوس في موديلسيستيم البحرية قوية.

هنا، قدم بروتوكول لتشريح الأنسجة المختلفة من الكبار من إيمبروفيسوس باء (أي، سيري، سوما، ورف). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه يمكن أيضا استخراج الأنسجة الأخرى. على سبيل المثال، الأنسجة اللينة بين عباءة الأنواع الغشائي قاعدة فورموزي يم تيتراكليتا الخارجية والداخلية تم بعناية معزولة واستخدامه لاستخراج الحمض النووي الريبي وتحليل الحمض النووي الريبي seq ل التعبير الجيني37. وينص البروتوكول الاستخراج المحسن المبين الموصوفة هنا كميات كافية من الحمض النووي الريبي عالية الجودة للتسلسل من الحد أدنى من ابتداء من المواد. أولاً، جمع اليرقات فردية مباشرة في أنابيب التجانس يقلل أي خسارة أثناء النقل من أنبوب واحد إلى آخر. وعلاوة على ذلك، بين أساليب مختلفة اختبار، التجانس مع حبات السيراميك ثبت أن تسفر عن الأكثر كفاءة من حيث الجيش الملكي النيبالي والنزاهة، مقارنة بتجانس sonication أو مدقة. عند التخطيط للتعبير الجيني أو تجارب علم الجينوم، يتعين على المرء أن نأخذ في الاعتبار التحدي المتمثل في عالية التباين الوراثي في الإوز، على الأقل إيمبروفيسوس (ب). وقد أوزة تنوع الوراثي في النطاق 3 – 5%، حتى في ترميز المناطق (Alm روسينبلاد et al., بيانات غير منشورة). وهذا، بطبيعة الحال، يضع مطالب محددة على تصميم كبسولة تفجير لتحليل قبكر، حيث أكثر حفظت مناطق ينبغي تحديدها واستخدامها كقوالب للإشعال من أجل الحصول على بيتوينباتشيس نتائج التعبير متسقا. المناطق المصانة للجينات المستهدفة، مثل أكوابورينس و Na +/K + ATPases، يمكن التعرف عن طريق دراسة مدى تغير تسلسل هذه الجينات في تسلسل الحمض النووي الريبي البيانات المتحصل عليها من سكان سيبريدس التي تحتوي على مئات أفراد. تحليل جينوم، سيتم أخذ عينات الحمض النووي. ومع ذلك، الحصول على الحمض النووي عالي الجودة من إيمبروفيسوس (ب) يمكن أن يكون تحديا21.

وفي الختام، أثبت ثقافة أوزة أنشئت لتكون أداة فعالة في أنواع مختلفة من الدراسات التجريبية. على وجه الخصوص، كل سنة حول إنتاج اليرقات يسمح لنا بإجراء تجارب دون أن تقتصر على فترة التفريخ طبيعيا ( إيمبروفيسوس باء، هذا خلال فصل الصيف). يمكن استخدام اليرقات التي تم الحصول عليها لتنفيذ مجموعة واسعة من الدراسات التجريبية، بما في ذلك فحوصات التسوية، فحوصات السلوك، ودراسات التعبير عن جينات محددة، فضلا عن دراسات على نطاق الجينوم الترنسكربيتوم.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بإعلان.

Acknowledgments

وأيد هذا البحث منحة عام 2017-04559 من مجلس البحوث السويدية (VR) ومشروع الاتحاد الأوروبي دعم الواجهة البحرية إلى بلومبرغ أندرس. على وجه الخصوص، إنشاء مرفق تثقيف، على مر السنوات، حظي بدعم من المنح لكل جونسون R. من وكالات التمويل التالية: صندوق الضمان الاجتماعي (المؤسسة السويدية للبحوث الاستراتيجية) من خلال برنامج "العلوم البحرية" والتكنولوجيا و MISTRA من خلال برنامج "الرسام البحرية". برنتسون كينت بدور فعال في المراحل الأولى من إعداد كولتورينجفاسيليتي. مزيد من التمويل لإنشاء مرفق تثقيف قد تأتي من المركز "علم الأحياء التطوري البحرية" (www.cemeb.science.gu.se)، وهو يؤيد بمنحه لينيوس من FORMAS مجالس الأبحاث السويدية والواقع الافتراضي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plexiglas (poly-methyl methacrylate) panels Plastic produkter, Bromma, Sweden transparent glas
1.5 L PET bottle
Artemia INVE Aquaculture, Belgium We have tested different companies; this is really the best one
Skeletonema marinoi (CCAP strain 1077/5) CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland  strain 1077/5
Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP strain 1085/3) CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland  strain 1085/3
Millipore cartridge filter system Millipore 
cartridge with a nominal pore size of 0.2 µm Millipore  cartridge CWSS01S03 High capacity for large volumes
polycarbonate bottle Nalgene autoclavable
RNA later Qiagen 76106  Fixation solution to preserve RNA
TURBO DNA-free Kit Invitrogen/Thermofisher Scientific   AM1907 DNAse kit to remove DNA from prepared RNA
iScript cDNA Synthesis Kit Biorad 1708890 cDNA synthesis kit
SYBR Green supermix Biorad 1708880 Dye for QPCR
RNeasy minikit Qiagen 74104 RNA extraction of adults or many cyprids
Soft tissue homogenising CK 14, 2 ml tubes Precellys KT03961-1-003.2 Ceramic beads for homogenisation
RNeasy micro kit Qiagen 74004 RNA extraction of few cyprids

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Darwin, C. A monograph of the sub-class Cirripedia, with figures of all species. The Balanidae (or sessile cirripedes); the Verrucidae, etc., etc., etc. , Ray Society. London, UK. (1854).
  2. Lind, U., et al. Analysis of aquaporins from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals differential expression in response to changes in salinity. PLoS ONE. 12 (7), 0181192 (2017).
  3. Lind, U., et al. Molecular characterization of the alpha-subunit of Na+/K+ ATPase from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals multiple genes and differential expression of alternative splice variants. PLoS ONE. 8, 77069 (2013).
  4. Fyhn, H. J. Holeuryhalinity and its mechanisms in a cirriped crustacean, Balanus improvisus. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 53 (1), 19-30 (1976).
  5. Wrange, A. L., et al. The story of a hitchhiker: population genetic patterns in the invasive barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus Darwin 1854. PLoS ONE. 11 (1), 0147082 (2016).
  6. Berntsson, K. M., Jonsson, P. R. Temporal and spatial patterns in recruitment and succession of a temperate marine fouling assemblage: a comparison of static panels and boat hulls during the boating season. Biofouling. 19 (3), 187-195 (2003).
  7. Lind, U., et al. Octopamine receptors from the barnacle Balanus improvisus. are activated by the alpha2-adrenoceptor agonist medetomidine. Molecular Pharmacology. 78 (2), 237-248 (2010).
  8. Semmler, H., Hoeg, J. T., Scholtz, G., Wanninger, A. Three-dimensional reconstruction of the naupliar musculature and a scanning electron microscopy atlas of nauplius development of Balanus improvisus (Crustacea: Cirripedia: Thoracica). Arthropod Structure & Development. 38 (2), 135-145 (2009).
  9. Anderson, D. T. Barnacles - structure, function, development and evolution. , Chapman & Hall. London, UK. (1994).
  10. Kennedy, V. S., DiCosimo, J. Subtidal distribution of barnacles in Chesapeake Bay, Maryland. Estuaries. 6, 95-101 (1983).
  11. Dreanno, C., Kirby, R. R., Clare, A. S. Locating the barnacle settlement pheromone: spatial and ontogenetic expression of the settlement-inducing protein complex of Balanus amphitrite. Proceedings of the National Academy of Sciences. 273, 2721-2728 (2006).
  12. Rittschoff, D., et al. Cues and context: larval responses to physical and chemical cues. Biofouling. 12 (1-3), 31-44 (1998).
  13. Berntsson, K. M., Jonsson, P. R., Lejhall, M., Gatenholm, P. Analysis of behavioural rejection of micro-textured surfaces and implications for recruitment by the barnacle Balanus improvisus. Journal of Experimental Marine BIology and Ecology. 251 (1), 59-83 (2000).
  14. Gamfeldt, L., Wallén, J., Jonsson, P. R., Berntsson, K. M., Havenhand, J. N. Increasing intraspecific diversity enhances settling success in a marine invertebrate. Ecology. 86, 3219-3224 (2005).
  15. Rittschof, D., Clare, A. S., Gerhart, D. J., Sister Avelin, M., Bonaventura, J. Barnacle in vitro assays for biologically active substances: toxicity and settlement inhibition assays using mass cultured Balanus amphitrite amphitrite Darwin. Biofouling. 6 (2), 115-122 (1992).
  16. Pansch, C., Schaub, I., Havenhand, J., Wahl, M. Habitat traits and food availability determine the response of marine invertebrates to ocean acidification. Global Change Biology. 20 (3), 765-777 (2014).
  17. Guillard, R. R. L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. Culture of marine invertebrate animals. Smith, W. L., Chanley, M. H. , Springer. Boston, MA. 22-60 (1975).
  18. Wrange, A. L., et al. Importance of plasticity and local adaptation for coping with changing salinity in coastal areas: a test case with barnacles in the Baltic Sea. BMC Evolutionary Biology. 14, 156 (2014).
  19. Bacchetti De Gregoris, T., et al. Construction of an adult barnacle (Balanus amphitrite) cDNA library and selection of reference genes for quantitative RT-PCR studies. BMC Molecular Biology. 10, 62 (2009).
  20. Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10, 159 (2010).
  21. Panova, M., et al. DNA extraction protocols for whole-genome sequencing in marine organisms. Methods in Molecular BIology. 1452, 13-44 (2016).
  22. Berglin, M., Larsson, A., Jonsson, P., Paul Gatenholm, P. The adhesion of the barnacle, Balanus improvisus, to poly(dimethylsiloxane) fouling-release coatings and poly(methyl methacrylate) panels: the effect of barnacle size on strength and failure mode. Journal of Adhesion Science and Technology. 15, 1485-1502 (2001).
  23. Larsson, A. I., Granhag, L. M., Jonsson, P. R. Instantaneous flow structures and opportunities for larval settlement: barnacle larvae swim to settle. PLoS ONE. 11, 0158957 (2016).
  24. Toth, G. B., Lindeborg, M. Water-soluble compounds from the breadcrumb sponge Halichondria panicea. deter attachment of the barnacle Balanus improvisus. Marine Ecology Progress Series. 354, 125-132 (2008).
  25. Pansch, C., Jonsson, P. R., Berglin, M., Pinori, E., Wrange, A. L. A new flow-through bioassay for testing low-emission antifouling coatings. Biofouling. 33 (8), 613-623 (2017).
  26. Walne, P. Observation of food value of 7 species of algae to larvae of Ostrea edulis 1. Feeding experiments. Journal of the Marine Biological Associateion of the UK. 43, 767-784 (1963).
  27. Sandnes, J. M., et al. Real-time monitoring and automatic density control of large-scale microalgal cultures using near infrared (NIR) optical density sensors. Journal of Biotechnology. 122 (2), 209-215 (2006).
  28. Neufeldt, C. J., Palmer, A. R. Precisely proportioned: intertidal barnacles alter penis form to suit coastal wave action. Proceedings of the Royal Society B Biological Sciences. 275, 1081-1087 (2008).
  29. Dunstan, G., Volkman, J., Barrett, S., Leroi, J., Jeffrey, S. Essential polyunsaturated fatty acids from 14 species of diatom (Bacillariophyceae). Phytochemistry. 35, 155-161 (1994).
  30. Jonsson, P. R., Berntsson, K., André, C., Wängberg, S. -Å Larval growth and settlement of the European oyster (Ostrea edulis) as a function of food quality measured as fatty acid composition. Marine Biology. 134 (3), 559-570 (1999).
  31. Comps, M., Bonami, J. R., Vago, C. Virus-disease of Portuguese oyster (Crassostrea angulata. lmk). Comptes rendus hebdomadaires des séances de l'Académie des Sciences. Série D, Sciences naturelles. 282, 1991-1993 (1976).
  32. Segarra, A., et al. Detection and description of a particular Ostreid herpesvirus. 1 genotype associated with massive mortality outbreaks of Pacific oysters, Crassostrea gigas, in France in 2008. Virus Research. 153 (1), 92-99 (2010).
  33. Suquet, M., et al. Survival, growth and reproduction of cryopreserved larvae from a marine invertebrate, the Pacific oyster (Crassostrea gigas). PLoS ONE. 9 (4), 93486 (2014).
  34. Martínez-Páramo, S., et al. Cryobanking of aquatic species. Aquaculture. 472, 156-177 (2017).
  35. Anil, A. C., Tulaskar, A. S., Khandeparkar, D. C., Wagh, A. B. Cryopreservation of Balanus amphitrite nauplii. Cryobiology. 34, 131-140 (1997).
  36. Oo, K., et al. Cryopreservation of nauplius larvae of the barnacle, Balanus amphitrite Darwin. Fisheries Science. 64, 857-860 (1998).
  37. Lin, H. C., et al. First study on gene expression of cement proteins and potential adhesion-related genes of a membranous-based barnacle as revealed from next-generation sequencing technology. Biofouling. 30 (2), 169-181 (2014).

Tags

العلوم البيئية، 138 قضية، أوزة، والقشريات، إيمبروفيسوس بالانوس (أمفيبالانوس)، الثقافة، النوبليوس، سيبريدس، تشريح الأنسجة، واستخراج الحمض النووي الريبي، PCR الكمي، التعبير الجيني
أوزة <em>إيمبروفيسوس بالانوس</em> "نموذج البحرية"-استزراع و "التعبير الجيني"
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jonsson, P. R., Wrange, A. L., Lind, … More

Jonsson, P. R., Wrange, A. L., Lind, U., Abramova, A., Ogemark, M., Blomberg, A. The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression. J. Vis. Exp. (138), e57825, doi:10.3791/57825 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter