Summary
Barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus er en model til at studere osmoregulering og bundmaling. Men naturlig årstidens gydning udbytter en uforudsigelig forsyning af cyprid larver. Her, er en protokol for alle året rundt dyrkning af B. improvisus beskrevet, herunder produktion af larver. Brugen af dyrkede Langhalsearter i gen expression undersøgelser er illustreret.
Abstract
Barnacles er marine krebsdyr med en siddende voksen og fritsvømmende, planktoniske larver. Barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus er især relevant som en model for studier af osmoregulatory mekanismer på grund af sin ekstreme tolerance til lavt saltindhold. Det er også almindeligt anvendt som en model af afregning biologi, navnlig i forbindelse med antifouling forskning. Men naturlig årstidens gydning udbytter en uforudsigelig forsyning af cyprid larver for undersøgelser. En protokol for alle året rundt dyrkning af B. improvisus er blevet udviklet og en detaljeret beskrivelse af alle trin i produktionslinjen er skitseret (dvs., etablering af voksen kulturer på paneler, indsamling og opdræt af Barnacle larver, og administrationen af foder til voksne og larver). Beskrivelsen også giver vejledning i fejlfinding og diskuterer kritiske parametre (f.eks.fjernelse af forurening, produktion af høj kvalitet foder, den nødvendige arbejdskraft og betydningen af høj kvalitet havvand). Hvert enkelt parti fra dyrkningsbaserede systemet maksimalt udbytter ca 12.000 nauplii og kan levere fire partier i en uge, så op til næsten 50.000 larver pr. uge kan produceres. Metoden til kultur B. improvisus er sandsynligvis i vid udstrækning også gælder for andre marine hvirvelløse dyr med gratis swimminglarvae. Protokoller er præsenteret for dissektion af forskellige væv fra voksne samt produktion af høj kvalitet RNA til studier af genekspression. Det er også beskrevet hvordan kulturperler voksne og opdrættede cyprids kan udnyttes i en bred vifte af eksperimentelle design for behandlingen af genekspression i forhold til eksterne faktorer. Brugen af dyrkede Langhalsearter i genekspression er illustreret med undersøgelser af mulige osmoregulatory roller af Na+/K+ ATPase og aquaporins.
Introduction
Barnacles er marine krebsdyr med en siddende voksen og fritsvømmende, planktoniske larver. De fleste af de 1.200 arter af rurer bebor grundt vand og mange udsættes ofte for lavt saltindhold. Én art, den bay barnacle Balanus (Amphibalanus) improviserer (B. improvisus), kan tåle næsten ferskvand og Charles Darwin beskrev denne art fra en lille bæk i mundingen af Rio de la Plata i Uruguay1. Ekstrem tolerance tolow saltindhold gør B. improvisus en særlig relevant model for studier af osmoregulatory mekanismer2,3. Denne barnacle foretrækker brakvand betingelser, men er i stand til at leve i farvande med saltholdigheder fra omkring 1,6 psu så højt som 40 psu4. Det er den eneste barnacle arter fundet i brakvand Østersøen. B. improvisus menes at stamme fra østkysten af det amerikanske kontinent, men i dag er fundet over hele verden på grund af spredning af shipping5. Det er en stor begroning organisme og er almindeligt forekommende på sten, moler og båd skrog, og er derfor af almen interesse for at forstå mekanismerne af biofouling på konstruktioner i marine-og brakvand6,7.
I lighed med de fleste andre rurer, B. improvisus er tvekønnede med krydsning; reproduktion sker gennem parring mellem tilstødende enkeltpersoner ved hjælp af et aflangt penis og indre befrugtning. Den reproduktive periode er hovedsageligt fra maj til September. B. improvisus har syv pelagiske larve stadier (seks nauplii efterfulgt af en cyprid fase8). De befrugtede æg luger i en nauplius larve, som er fritsvømmende og feeds i vandsøjlen for op til flere uger før molting i en ikke-fodring cyprid larve. Cyprid bruger flere stikord til at finde et passende sted at bosætte sig og derefter undergår metamorfose i en siddende juvenile barnacle9. Arten kan blive kulturperler i laboratoriet og har en levetid på 1-2 år i havet (2 – 3 år i laboratoriet kultur). I gennemsnit, B. improvisus vokser til 10 mm i diameter (med et maksimum på omkring 20 mm) og når en maksimal højde på ca. 6 mm (selv om det kan vokse højere overfyldt betingelser). Arterne kan være identificeret ved dens glat kalkrige selv shell (hvid eller gråligt), radialt mønstrede kalkrige bunden af shell plade, og formen af tergal plader1,10.
Barnacle B. improvisus har flere fordelagtige funktioner som en model for studier af osmoregulering, med fokus på molekylære og fysiologiske mekanismer samt økologiske interaktioner og evolutionære konsekvenser. Det er også almindeligt anvendt som en model for undersøgelser af afregning biologi, navnlig i forbindelse med antifouling forskning og mekanismer involveret7,11,12,13. Men naturlig årstidens gydning udbytter en uforudsigelig forsyning af cyprid larver for undersøgelser. Evnen til at kultur denne barnacle gennem hele sin livscyklus hele året er derfor et stort aktiv aktivere forskellige typer af molekylære og Mekanistiske undersøgelser. Derudover sin tilstedeværelse i marine/brakvand på verdensplan giver mulighed for en kombination af felt og eksperimentelle undersøgelser. Kontrolleret avl kan også producere familier af kendte stamtavler for langsigtet dyrkningsbaserede14, og en generationstid af et par måneder kan tillade langsigtede eksperimentel udvikling. Der findes også et udkast til genom og flere transcriptomes, og disse midler er blevet anvendt til kloning af flere gener (fx, gener af betydning i osmoregulering)2,3.
Formålet med denne protokol er at beskrive, hvordan at etablere og vedligeholde en kultur af barnacle B. improvisus hele året for at udføre gen expression undersøgelser på voksne eller larver af denne skadegører. Rittschof et al. 15 kort beskrevet en metode til dyrkning rurer fra frigivelsen af nauplii til bilæggelse af cyprids for arter Balanus amphitrite. Protokollen er blevet tilpasset for hele året rundt dyrkning af B. improvisus ved Tjärnö Marine Research Laboratory (Sverige), og en detaljeret beskrivelse af alle trin i produktionslinjen er skitseret, herunder produktion og opdræt af barnacle larver, samt administration af foder til voksne og larver. En oversigt over den komplette procedure, se figur 1. Brugen af de dyrkningsbaserede system er eksemplificeret med nogle fælles eksperimentelle opstillinger og illustreret i funktionel genomforskning undersøgelser af Na+/K+ ATPase og aquaporins, belyse deres mulige funktioner i osmoregulering2, 3. Det er sommetider nødvendigt at undersøge genekspression i specifikke væv, og nogle af grundlæggende af barnacle dissektion vil blive dækket. Med et godt udbud af høj kvalitet havvand bør dyrkning af barnacle B. improvisusog potentielt mange andre arter, i marine laboratorier i hele verden.
Protocol
1. indsamling af voksne rurer i feltet for at starte en ny gydebestande
-
Implementere termoplastik (poly-methylmethacrylat) gennemsigtige paneler (110 x 110 x 1,5 mm3) på ≈ 1 – 3 m dybde i smult vande for at indsamle voksen rurer fra feltet. Brug rammer, der kan tage flere paneler (fig. 2A), bore 2 huller (med en diameter på 6 mm) i de øverste hjørner af hvert panel og attachthepanelstotherackusingcableties. Således thepanelswillhangverticallyin vandet.
- Når afviklingen af rurer opstod (identificeret som små hvide hårde prikker på panelerne), forlader paneler i mindst 2-3 uger for at sikre at rurer er stor nok (5 mm) skal overføres til laboratoriet uden at få tørret eller beskadiget.
- Bringe panelerne i laboratoriet, når de er dækket med udlignede B. improvisus , der har nået en størrelse på ca. 5 mm indiameter.
NOTE: Tid for voksne til at udvikle til 5 mm i feltet er stærkt afhængige af tilgængeligheden af mad og temperaturen. Normalt, dette tager cirka 3 uger på Tjärnö Marine Research Laboratory (58.87 ° N, 11.14 ° E). Mest almindeligt, er paneler til den nye gydebestande generelt indsat i slutningen af juni og indsamlet i slutningen af August. - Før at indføre ren paneler i kultur facilitet, andre organismer fra panelerne. Det er mest vigtigt at fjerne andre barnacle arter. Bemærk venligst at det er vigtigt at ofte rengør paneler til at slippe af kontaminerende arter under dyrkning, da dette vil øge chancerne for overlevelse af gydebestande.
- Placere panelerne lodret på kanten i en stand med sleben riller i en polyethylen bakke (400 x 400 x 20 mm3) (tal 2 c og 2E). Riller i standen er 15 mm fra hinanden.
- For at forberede bakkerne, gøre en indgang port i bunden og en exit port øverst på den modsatte side af hver CD-skuffe. Tilslut Indgangsåbningen i hver bakke til en 100 L reservoir der indeholder omkring 30 L vand med et indløb af åbne havvand ved 20 ° C for at tillade en gennemstrømnings med en hastighed på ca. 2 L pr. min.
Bemærk: Op til 8 skuffer var forbundet til en enkelt 100 L reservoir. - Slut 100 L reservoir til temperatur-kontrollerede havvand (20 ° C) (f.eks. fra en varmepumpe, udveksling af varme fra den indgående havvand).
Bemærk: Langhalsen B. improvisus kan vokse og reproducere på en fuld marine saltholdighed (30-35 psu); dog reducere saltholdigheden på ca. 25 psu ved at tilføje ferskvand til 100 L reservoir øger produktionen af larver fra kulturen.
2. Start nye generationer af voksne fra kulturperler Cyprids
- Konstruere terninger af termoplastisk paneler åben på toppen af tape 5 paneler sammen ved hjælp af et ikke-giftigt, vandafvisende bånd.
- Placer kuben i en lille bakke (i tilfælde af lækage) og fyld den med havvand (25 psu). Holde vandet ved stuetemperatur (ca. 20 ° C). Tilføje omkring 200 cyprids øverst i kuben.
- Foder til yngel med 100 mL Skeletonema marinoi hver anden dag (Se trin 5), mens i kuben.
Bemærk: Juvenil rurer kan have vanskeligheder med indtagelse Artemia salina (Se trin 3) da de er store og derfor svær at sluge for en nyligt udlignede barnacle. - Ændre vand 1 x om ugen.
- Efter 2 uger, når panelerne indeholder nok etablerede ungfisk af mindst 5 mm i diameter, skille terningen og flytte paneler med unge til bakker med flow-throughseawater og derefter feed rurer med A. salina nauplii.
3. kultur af Artemia salina Nauplii som foder for voksen rurer
- Oprette en dyrkningsbaserede system for A. salina ved hjælp af en 1,5 L plastflaske, hvor bottomis afskåret og flasken er placeret på hovedet i en stand og belyst fra siden. Passer flaskehalsen at en silicium rør med en klemme og knytte den til en luftning pumpe (figur 2D).
- For at klækkes æggene, tilføje ca. 15 mL tør hvilende æg af Artemia til 1 L ofseawater.
Bemærk: Artemia æggene klækker til nauplius larver efter 24-48 timer. For at forsinke rugningen af A. salina nauplii (f.eks.i weekender), kan være slukket lyset til at reducere temperaturen lidt. - For at høste Artemia nauplii, slår Beluftningen og mørkere den øverste del af flasken med aluminiumfolie (eller lignende fxen dåse)... Belyse den nederste del af flasken for 10 min. Hatched Artemia nauplii vil svømme mod lyset. Non-udklækket cyster vil synke til bunds, og cyste skaller vil flyde på overfladen.
- Åbne klemmen nederst. Indsamle de mellemliggende brøk som en tæt bestand af svømning nauplii.
Bemærk: Hver dag (undtagen i weekenden), 1 L af den tætte Artemia nauplii suspension blev føjet til 100 L reservoiret tilslutning til bakker med de voksne rurer manuelt. Undgå enhver fodring med tomme cyste skaller, da de ikke giver ernæring og hovedsagelig resultere i behov at rense kulturen mere hyppige mellemrum.
4. indsamling og opdræt af Barnacle larver
- Rengør paneler med voksen rurer ved forsigtigt at sprøjte dem med ferskvand, og om fornødent fjerne enhver tilgroning fra barnacle skaller og paneler ved hjælp af en blød tandbørste. Også, rense bakker (uden rurer) og rør i varme (75 ° C) ferskvand.
- Placere en si, lavet af en 90 µm plankton-net limet til slutningen af en cut PVC rør (16 cm i diameter, 15 cm i højden) i en polyethylen bakke (30 x 20 x 10 cm3) med et overløb port. Indsamle B. improvisus larver i sien natten over (figur 2C).
Bemærk: Sigten var placeret lige under exit porten på bakken af barnacle paneler til at modtage det outflowing vand og at bortfiltrere nauplii. Larverne forblev i sien, mens havvandet forårsagede overløb i den lille bakke. Denne lille bakke sørget for, at sien aldrig driedout. - Placer en 30 L spand i et stort vandbad hvor temperaturen holdes på 26 ° C ved hjælp af akvarium fisk tank varmeapparater (figur 2E). Beluftning og agitation er sikret af luft bobler i systemet.
- Fyld spanden med 20 L filtreret havvand (0,2 µm; 25 psu). Tilføje 1 L spand med en 60/40 blanding af 2 diatom mikroalger, S. marinoi og C. gracilis (Se trin 5). Dette vil give en indledende tæthed af ca 5 x 104 kiselalger pr. mL i spanden.
Bemærk: Barnacle nauplii larver er positivt phototactic. Spandene blev foretaget af uigennemsigtig hvid plast med låg at lade nogle lys igennem. I løbet af vinteren, var rummet oplyst i dagtimerne (8:00 – 17:00), men mørke i løbet af natten. I løbet af sommeren kom den udvendige lys ind i stuen i det meste af dagen. - Overføre de indsamlede B. improvisus nauplii til en crystallizing parabol (300 mL; 90 mm i diameter, 50 mm i højden).
- Belyse fad fra den side, som vil tiltrække larver til lyskilden. Indsamle barnacle nauplii, der samles på den indkommende lys med en pipette og overføre dem til en anden crystallizing parabol. Fjern eventuelle resterende Artemia larver.
- Overføre B. improvisus nauplii larver til et bægerglas med 1 L filtreret havvand.
- Tæl antallet af nauplii ved omrøring bægerglas forsigtigt for at få en endda suspension af larver og derefter tage fem 1 mL prøver fra forskellige steder i bægerglasset. Overføre hver prøve til en mikrotiterplade for besigtigelse med et stereomikroskop. Tæl antallet af nauplii i hver af de fem prøver og tilføje dem op.
- Multiplicere det optalte antal med 200 (1.000 mL/5 mL) til at anslå, hvor mange tusinder af larver er i hele bægerglasset. Hvis der er for mange nauplius larver i bægerglasset, fortyndes prøven indtil tætheden er højst 14.000 larver/L (normalt i rækken af 11.000 – 12.000 larver/L).
- Tilføje 1 L af B. improvisus nauplii til en spand, således at tilføje ca 11.000 – 12.000 larver pr. spand.
Bemærk: Sørg for ikke at tilføje mere nauplii, da dette vil resultere i for lidt mad i forbindelse med larver og dermed øge dødelighed. - Efter 3 dage, skal du indsamle barnacle nauplii på en 90 µm sigte. Derefter rengøre spand (med 75 ° C ferskvand), fylde det med filtreret havvand, tilføje et nyt diatom feed (det samme beløb som i starten) og endelig tilføje nauplii igen. Cyprids begynder at dukke op efter ca. 6 dage (± 1 dag).
- Indsamle cyprids først med en 90 µm sigte (designet som i punkt 4.2 ovenfor). Derefter separat ikke-moulted barnacle nauplii og cyprids med en 320 µm sigte oven på en 160 µm sigte. B. improvisus nauplii vil indsamle i 320 µm sigte og cyprids på 160 µm sigte.
Bemærk: Cyprid larver kan opbevares ved 10 ° C i en crystallizing parabol i mørket til senere brug, op til ca. 6 dage. Dog kan opbevaring påvirke kvaliteten og effektiviteten af barnacle larver, så forsøg sammenligner forskellige behandlinger bør ideelt set anvende larver fra samme parti (og lignende fillagring tid) at undgå forstyrrende virkninger16.
5. kultur af mikroalger som foder for Barnacle Nauplius larver
Bemærk: Alger blev dyrket i 3 forskellige typer af kulturer: (i) bestand kulturer, som er for den langsigtede vedligeholdelse af de stammer, der blev brugt til podning af optrapning; (ii) start kulturer, som er det første skridt i skala-up; og endelig (iii) den kultur, produktion, som er det endelige produktion omfanget af store mængder af alger som barnacle feed.
- Bestil diatom arter fra kultur samling af alger og protozoer (CCAP) anvendes som foder til barnacle nauplius larver. De 2 arter Skeletonema marinoi (CCAP stamme 1077/5) og Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP stamme 1085/3) begge give gode resultater som foder.
- Filtrere alle havvand skal anvendes i de alge kulturer, med en patron filtersystem med en nominel porestørrelse af 0,2 µm. (filtreret havvand er også anvendes til klækning af A. salina æg og dyrkning af barnacle nauplius larver.) Autoklave filtreret havvand for de alge kulturer (ved 105 ° C i 5 min).
- Forberede et medium for kultur af mikroalger, ved hjælp af autoklaveres havvand beriget med Guillard's f/2 løsning indeholdende uorganiske næringsstoffer, trace metaller og vitaminer (Se Guillard 197517 for detaljeret opskrift). Desuden fremstilles en opløsning af silikat (Na2SiO3), men holde dette adskilt fra f/2 berigelsen at forhindre en solid nedbør.
Bemærk: Koncentrationen af stamopløsningen berigelse og stamopløsningen af silikat var rede til at blive brugt som en 1 mL tilsætning af hver til 1 L af havvand. - Autoklave alt udstyr brugt i alge kultur ved 120 ° C i 20 min. autoklave skrue-udjævnede reagensglas med 1 mL f/2 berigelse og 1 mL af silikat løsning. Tilføje de berigelse og silikat løsninger til theseawater, når de autoklaveres glasvarer og væsker har kølet ned til stuetemperatur.
-
Vokse stock kulturer af mikroalger i 40 mL reagensglas med skruelåg.
- Fyld Reagensglassene med ca. 30 mL beriget havvand. Podes i kulturer med en steril Pasteur pipette med omkring 1 mL af en 2 uge gamle stamkultur. Skruelåg er derefter monteret men ikke strammes for at give nogle gasudveksling. Hvis det er tilgængeligt, bør podning foretages i en laminar flow kabinet til at reducere risikoen for forurening.
Bemærk: Formålet med de bestand kulturer er at opretholde alge kulturer på lang sigt og til at tjene som inokulat for starte kulturer. Stock kulturer var re podes hver 2 uge. - Udsæt den nye stamkultur til et hvidt lys med en intensitet på ca. 25-50 µmole m-2s-1 (med en lys-mørke cyklus af 16:8 h). Flyt de gamle bestand kulturer til en lav lysintensitet som en back-up. Kassér eventuelle 2 uger gamle lager kulturer.
- Fyld Reagensglassene med ca. 30 mL beriget havvand. Podes i kulturer med en steril Pasteur pipette med omkring 1 mL af en 2 uge gamle stamkultur. Skruelåg er derefter monteret men ikke strammes for at give nogle gasudveksling. Hvis det er tilgængeligt, bør podning foretages i en laminar flow kabinet til at reducere risikoen for forurening.
-
For optrapning til kulturen, produktion af alger, podes start kulturer fra den stamkultur og dyrke dem i 500 mL Erlenmeyerflasks.
- Autoklave 4 Erlenmeyerkolben kolber, pipetter og bomuld propper med 300 mL filtreret (0,2 µm) havvand og 4 reagensglas med 0,3 mL f/2 berigelse og 4 med silikat løsninger. Køle ned f/2 berigelse og silikat til stuetemperatur, og tilføje løsningerne til Erlenmeyerkolben kolber. Podes dem med ca. 1 mL af den 2 - uger gamle materiel kultur.
Bemærk: Forberede 2 kolber med S. marinoi og 2 med C. simplex. - Sætte kolberne på en rystende tabel i en lysintensitet af 50 µmole m-2s-1. Når start kulturer har erhvervet tætte alge populationer (gul-brun farve), er de klar til at blive brugt som inokulat for produktion kulturer, der vil give barnacle larver mad.
- Autoklave 4 Erlenmeyerkolben kolber, pipetter og bomuld propper med 300 mL filtreret (0,2 µm) havvand og 4 reagensglas med 0,3 mL f/2 berigelse og 4 med silikat løsninger. Køle ned f/2 berigelse og silikat til stuetemperatur, og tilføje løsningerne til Erlenmeyerkolben kolber. Podes dem med ca. 1 mL af den 2 - uger gamle materiel kultur.
-
Vokse produktion kulturer i 4 L polycarbonat flasker med silikone propper med 2 borede porte monteret med glasrør.
- Tilslut 1 glasrør nå til bunden af flasken til en luftpumpe via en silikone slange udstyret med en 0,2 µm luftfilter. Sørg for at den anden glasrør slutter lige under silikone proppen og er fyldt med bomuld at afgangen fra injiceres luft.
- Hver uge, flasker fyld fire 4 L med filtreret havvand og autoklave dem sammen med propperne. Derudover rør autoklave 4 test med 4 mL af f/2 berigelse og silikat løsninger.
- Efter afkøling, tilføje f/2 berigelse og silikat løsninger til flasker og derefter podes dem med halvdelen af mængden af start-up kulturer i Erlenmeyerkolben kolber.
- Placer de fire 4 L flasker ved en let intensitet af 50 – 100 µmole m-2s-1.
- Høste produktion kulturer efter ca. 1 uge; de er så tilstrækkeligt tætte skal anvendes til fodring af barnacle nauplius larver.
Bemærk: Produktion kulturer har en levetid på omkring 2 uger, hvilket betyder, at der er 8 aktive produktion flasker til enhver tid.
6. designe eksperimentelle undersøgelser rurer
-
Placer paneler med unge eller voksne rurer i kontrolleret akvarier hvor de kan dyrkes under identicalconditions. Dette kaldes en fælles-haven eksperiment, som f.eks kan bruges til at forstå lokale tilpasninger eller fænotypisk plasticitet18, eller at studere gen expression ændringer i forhold til eksterne faktorer (fx, salinitet, temperatur eller pH).
Bemærk: Det er også muligt at bruge rurer direkte indsamlet fra feltet på paneler. En fordel ved at bruge laboratorium-opdrættet individer er, at mødres effekter kan undgås ved brug af den næste generation af afkom.- Udsætter rurer til de specifikke miljøforhold under en chosentime interval, efterfulgt af høst af voksne (f.eks.til studier af genekspression)2.
-
Eksperimenter med cyprid larver at studere gen expression3, placere cyprids i kontrolleret akvarier hvor larverne kan dyrkes på identiske betingelser.
- Høst af cyprids efter angivne perioder af filtrering med sigterne (som beskrevet i trin 4.7), og uddrag RNA ifølge protokollerne nedenfor (trin 8).
7. dissektion af rurer
- Ren lab rum hvor dissektion og DNA prøveudtagning udføres, bothbefore og mellem enkeltpersoner, herunder alle dissektion værktøjer. Dette gøres ved hjælp af klor til bænk (eller 96% ethanol til pincet).
Bemærk: Mærket rør indeholdende fiksering medier (ethanol eller en RNA stabilisering løsning) er udarbejdet på forhånd. - Vælg store og kortsigtede sultet enkeltpersoner (ikke fodre dem til 2 dage før dissektion). Ren barnacle shell med en tandbørste til at minimere risikoen for forurening fra andre arter (f.eks., bakterier og alger) og skylle det ud med vand.
Bemærk: Årsagen til den kortsigtede udsultning af enkeltpersoner før dissektion er at undgå kontaminering DNA (f.eks.fra Artemia cyster i tarmen). -
Placer de enkelte rurer på en selv overflade, enten knyttet til et panel eller løs i en skål. Dissekere de respektive væv fra voksen. Der er flere måder at dissekere rurer, afhængigt af formålet med undersøgelsen.
- Dissektion metode A: fastsættelse af hele barnacle så hurtigt som muligt.
- Fjerne den hele barnacle fra panelet ved hjælp af en skalpel, indsætte det under langhalsen og tæt på panelets overflade.
Bemærk: I de fleste tilfælde, denne manipulation efterlader den basale plade næsten intakt, hvilket ikke påvirker barnacle inde. - Omhyggeligt knæk yderstof på den ene side ved at indsætte pincet (figur 3). Dette er gjort for at lette indtrængning af en fiksere medium indeni skallen.
Bemærk: Hvis skallen ikke er brudt på alle før du placerer langhalsen i et reagensglas, kan det føre til en langsommere proces, fiksering og en ringere kvalitet af DNA senere. - Sætte den brudte barnacle i reagensglasset indeholder enten en RNA lagringsløsning eller ethanol. Forlade langhalsen i opløsningen i mindst 24 timer for sin fiksering. Når langhalsen er fast, kan dyret tages ud af fiksering medier og placeres på en dissektion bakke. Cirri, kappe og soma (kroppen) kan være adskilt fra hinanden og placeret i separate rør for yderligere udvindinger af DNA eller RNA.
Bemærk: Det er vigtigt at observere, hvis æg lamellae med befrugtede æg er til stede inde langhalsen. Hvis til stede, skal disse fjernes, før du fortsætter med DNA ekstraktioner at undgå at finde flere genotyper i prøven.
- Fjerne den hele barnacle fra panelet ved hjælp af en skalpel, indsætte det under langhalsen og tæt på panelets overflade.
- Dissektion metode B: fjernelse langhalsen fra shell før dens fiksering.
Bemærk: Denne metode kan ikke altid resultere i kappen er stikprøven, da det er fastgjort på indersiden af calcareousshell. Men det kan være en hurtig metode for prøveudtagning DNA fra en enkeltperson.- Fjern forsigtigt, ved hjælp af dissektion pincet, tergal og scutal plader (figur 3) ved at indsætte spidsen af pincet mellem tergal og scutal plader, greb fat i en plade, og trækker forsigtigt fjerne dem.
- Grab fat i cirri med pincet og pull langhalsen lige ud og placere det direkte i 96% ethanol eller RNA stabiliserende løsning til fiksation...
Bemærk: Nogle gange kappen vil også udtages på samme tid, som det ses som en tynd epitel med mørke pigmentering (i B. improvisus). Ellers, kappen kan være fjernet fra indersiden af skallen ved hjælp af en skalpel og derefter placeret i ethanol eller RNA stabiliserende løsning.
Bemærk: Tergal og scutal plader (hvis intakt) kan tørres og gemt, siden de er nyttige for artens identifikation10. En generel anbefaling, hvis der er nogen tvivl om arter, er at også fotografere den hele barnacle før initialisering af dissektion.
- Dissektion metode A: fastsættelse af hele barnacle så hurtigt som muligt.
8. RNA udvinding for kvantitativ PCR
- Sætte voksne skal bruges til RNA ekstraktioner i en RNA stabiliserende løsning, inkuberes dem natten over (op til 24 timer) ved 4 ° C, og derefter gemme dem ved-80 ° C.
Bemærk: Cyprid larver er fortrinsvis tør frosset, uden RNA senere direkte i-80 ° C, ved at placere dem i cryotubes og derefter sænkes ned i rørene kort (30 s) i flydende nitrogen før gemme dem ved-80 ° C. - På tidspunktet for RNA udvinding, tø rurer på is og bruge dem intakt eller dissekere ud væv skal anvendes (Se trin 7).
Bemærk: på grund af høj genetisk variation mellem individer (≈ 3 – 5% variation i kodende regioner; Alm Rosenblad et al., upublicerede data) det er tilrådeligt at poola antal voksne individer, som minimerer effekten af sekvens variation mellem individer i den senere qPCR trin. - RNAextraction, tilføje 350 µL af lysisbuffer forsynet med en RNA forberedelse kit til homogenisering rør indeholdende 2,8 mm af keramiske perler.
Bemærk: Keramiske perler giver et bedre udbytte af RNA sammenlignet med ultralydbehandling (Repræsentant resultater). - Tage en voksen barnacle (hele eller væv) eller indsamle mindst 20 cyprid larver med pincet og læg dem i homogenisering rør.
- Gå direkte til forstyrrelser og homogenisering med en perle mill.
- Sætte homogenisering rørene med prøve- og perler i perle mølle indehaveren. Ryst dem med en frekvens på 4,0 m/s for 20 s. Cool prøve i 1 minut på isen. Gentag 2 x.
- Forberede RNA i henhold til protokollen af kommercielt tilgængelige RNA isolering kit.
Bemærk: En risikovurdering (herunder en læsning af sikkerhedsdatabladene) bør udføres før ved hjælp af RNA udvindingsmetoder, til at identificere farlige kemikalier, som kræver brug af et stinkskab og anden beskyttelsesbeklædning, herunder handsker (f.eks., tilsætning af β-mercaptoethanol til lysisbuffer under RNA udvinding bør udføres i et stinkskab). - Kvantificering af RNA. Forberede en brugsopløsning og tilsæt en standard og prøver til en samlet maengde paa 200 µL. Vortex dem for 2-3 s og Inkuber dem i 2 min. Indsæt rør ind i en fluorometer og tage behandlinger.
- Check RNA prøver for kontaminering protein med et spektrofotometer, og kontrollere deres RNA integritet med en automatiseret elektroforese system (Repræsentant resultater).
Bemærk: For god kvalitet præparater, RNA er anbefalede hen til nyde en forhold i 260/280 nm 2-2.2 og en DNA på omkring 1,8. Lavere værdier angiver protein forureninger og ekstraktionsmetode der skal optimeres.
9. gen Expression: cDNA syntese og qPCR
-
Behandle den fremkomne RNAwith DNase for at fjerne eventuelle remainingDNA før gøre cDNA for qPCR.
- Check for kontaminerende genomisk DNA ved at tilføje en RNA prøve men ikke reverse transkriptase ved udarbejdelsen af cDNA. Hvis der er en PCR-amplifikation af det valgte gen på cDNA uden reverse transkriptase, er der DNA forurening i RNA.
Bemærk: For prøver, der skal bruges til RNA-seq (RNA-sekventering ved hjælp af næste generation sequencing technology), DNase trin er mindre kritiske. Specielt for prøver med lave niveauer af RNA, DNase trin kan udelades for ikke at miste for meget af RNA i processen.
- Check for kontaminerende genomisk DNA ved at tilføje en RNA prøve men ikke reverse transkriptase ved udarbejdelsen af cDNA. Hvis der er en PCR-amplifikation af det valgte gen på cDNA uden reverse transkriptase, er der DNA forurening i RNA.
- Udføre cDNA syntese på DNase-behandlede RNA ved hjælp af en mængde af RNA specificeret i kommercielle cDNA syntese kit, men normalt brug mindst 50 ng.
- Designe qPCR primere, så de anneal til dele af gen interesse hvor sekvens identitet mellem individer er så højt som muligt, men sekvensen identitet mellem gen paralogs er så lav som muligt. Se venligst de tilsvarende publikationer for de specifikke primer-par bruges til gen expression undersøgelser af Na+/K+ ATPase3 og aquaporins2 (figur 5).
Bemærk: Til dette formål, RNA-seq sekvens data fra hundredvis af cyprids eller flere voksne kan bruges. - Design primere for et gen anvendes til normalisering af udtryk niveauer (f.eks., aktin). Primere anvendt med succes af actin er frem: 5'-CATCAAGATCAAGATCATCGC-3 ", og omvendt: 5'-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'.
Bemærk: Actin er et almindeligt anvendt kontrol gen. Andre har imidlertid også blevet foreslået som en reference og afprøvet på barnacles19. Udover actin, brug af RPL8, 36B4, EF1 og NADHd1 som reference har været testet3. Det blev konkluderet, at der er ingen store forskelle i udtryk niveauer af de respektive reference gener mellem soma, cirri, voksen eller cyprids. - Optimere den udgloedning temperatur for de designede primere ved at tilføje stigende mængder af cDNA (typisk i intervallet 0,25-50 ng) til en blanding indeholdende SYBR Green, dNTP, polymerase og 0,3 µM frem og bak primer.
- Køre qPCR protokoller ved forskellige temperaturer, udglødning som følger: en indledende denaturering temperatur på 95 ° C i 3 min, en denaturering trin ved 95 ° C i 20 s, udglødning temperaturer på 55-63 ° C til 20 s, og en strækning på mindst 72 ° C til 30 s. I alt, køre 40 PCR cyklusser.
Bemærk: Primer effektivitetsgevinster skal ligge i intervallet på 90-105% og beregnes som E = (10^(-1/slope)-1) x 100 hvor hældningen er hældningen af kurven opnås, når plotte værdien log af cDNA koncentrationer mod deres cyklus-tærskelværdier (Ct). - Udføre qPCR ved hjælp af en passende mængde af cDNA, normalt 1-10 ng, ved hjælp af PCR-protokol med optimal udgloedning temperaturen fundet er beskrevet i trin 3.
Bemærk: Højere mængden af cDNA bruges kun til gener, der udtrykkes i meget små mængder.
Representative Results
Larverne produceres pr. uge med den beskrevne procedure for dyrkning af voksen rurer af B. improvisus, op til fire partier af nauplius. Det ville være muligt at indsamle nauplius larver næsten hver aften, men det kræver flere mennesker og infrastruktur (med mange rurer i gydebestande, en kultur vil frigive larver kontinuerligt). En yderligere begrænsende faktor for larver produktion synes at være tilgængeligheden af foder af høj kvalitet, især hvad angår diatom Skeletonema. Maksimalt, består hvert parti fra dyrkningsbaserede systemet af omkring 12.000 nauplii, så op til 50.000 nauplii pr. uge kan være kulturperler. Men, nogle uger der kan være op til ti gange færre larverne produceres. En enkelt voksen kan producere op til 7.000 larver pr. dag14, hvilket betyder, at 1-2 voksne frigiver larver for hvert parti. Inden for en uge, vil omkring 70 – 90% af de indsamlede nauplii udvikle sig til cyprids (giver ca 30.000 cyprids om ugen, maksimalt), der kan bruges til udligning assays og molekylære undersøgelser.
Det skal understreges, at der er variationer i cyprid funktioner mellem partier, og der er generelt større variationer mellem partier end inden for batchnumre. For eksempel, varierer bilægge succes i forliget assays mellem 30 og 70% for forskellige partier. Sandsynligvis, dette er forårsaget af den individuelle genetiske variation mellem de specifikke par af voksne frigive larver perioder forskellige stikprøver. Det anbefales naturligvis at gentagne eksperimenter (biologiske replikater) bør omfatte cyprids fra en række partier, hvis mere generelle udtalelser om resultaterne skal foretages. Batch til batch variationer stiller krav på det eksperimentelle design, hvor ordentlig kontrol og normalizations i gen expression undersøgelser bør anvendes. Men selv efter flere statistiske normalisering procedurer er blevet gennemført, betydeligt reducere mellem batch variation, nogle effekter af partiet er normalt stadig synlige (ikke-offentliggjorte data).
Efter den angivne protokol, er det muligt at få i gennemsnit 500 ng af høj kvalitet RNA fra så lidt som 20 cyprids, uanset fase af barnacle afvikling (tabel 1). Kvaliteten af RNA er normalt måles som forholdet mellem de 18S og 28S toppe (den forventede position af de to toppe er angivet i figur 4). Dog rurer og mange andre leddyr, 28S rRNA bryder ned, når det opvarmes (som en del af den analysemetode, der) og trækker sammen med 18S top20. Dette er hvorfor der er i princippet én enkelt rRNA peak i denne type analyse for rurer. Det fremgår af denne test (figur 4) at en homogenisering af keramiske perler giver RNA med den højeste integritet og derfor er den foretrukne metode. RNA er tilstrækkelig mængde og kvalitet til at skabe høj kvalitet sekventering biblioteker til sekvensering, hvilket resulterer i et gennemsnit på 70 millioner læser per prøve (antallet af læser, naturligvis, afhænger af niveauet for multiplexing under Sekventeringen). RNA er også tilstrækkeligt, cDNA syntese og qPCR udtryk analyse af et stort antal gener.
Figur 5 viser resultatet fra qPCR analyser af aquaporins og af Na+/K+ ATPase (NAK1) splejse varianter, hvor udtrykket ændringer blev undersøgt som svar på ændringer i miljøet stikord2,3. En sammenligning af den relative udtryk af langt og korte splejse varianter af NAK1 viser en dobbelt stigning for de lange NAK1 mRNA i lavt saltindhold i forbindelse med den korte NAK (figur 5A). Dataene viser således, at alternativ splicing gør den lange form fremherskende lavt saltindhold betingelser. For aquaporins er det tydeligt, at de to vand-transport paralogs AQP1 og AQP2 vise differential udtryk (figur 5B). Især i kappen væv er det klart, at AQP1 er væsentligt nedreguleret på lavere saltholdigheder, som ikke er set i AQP2. I stedet viser AQP2 et let øget udtryk ved lavere saltholdigheder, men i soma. Disse resultater giver en base for efterforskning af de funktionelle roller de forskellige B. improvisus ion transportvirksomheder og aquaporins i barnacle osmoregulering.
Figur 1 : Oversigt over hele dyrkning procedure og RNA udvinding for gen expression undersøgelser på voksne. For at indlede en ny kultur, er paneler knyttet til en ramme og indsat i havet på 1-3 m dybde. Efter flere uger anbringes paneler med voksne/unge lodret i stativer i bakker i laboratoriet. Hver bakke besidder omkring 40 paneler med voksne. Med omtrent 100 voksne pr. panel, i samlede ≈ er 4.000 voksne individer kulturperler pr. bakke. De voksne rurer fodres med Artemia og kan holdes året-rundt. Nauplius larver er indsamlet flere gange om ugen fra bakker via en filtrering gennem en sigte. De indsamlede nauplii er overført til spande holdt ved 26 ° C i et vandbad og fodret med mikroalger. Nauplii opdrættes, indtil de molt ind i ikke-fodring cyprids, som er indsamlet af filtrering. Nye paneler kan etableres i laboratoriet ved afregningen af cyprids på paneler, enten for at give nye paneler for år-omkring kultur eller skal anvendes til specifikke eksperimentelle opstillinger med ændrede ydre forhold. RNA er derefter udvundet fra unge/voksne i slutningen af forsøget eller på bestemte tidspunkter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Billeder af nogle vigtige trin i proceduren dyrkningsbaserede. (A) dette billede viser rammer med paneler til at indsamle nye befolkninger fra feltet. (B) dette billede viser paneler med voksen rurer af B. improvisus i stativer, der er placeret i bakker. Panelerne er placeret ca. 2 cm fra hinanden. (C) dette billede viser bakker med langhalsen paneler og fodring tanken til venstre. Fra hver bakke er der en outlet, hvor sigterne placeres for indsamling af nauplius larver. (D) dette billede viser produktionen af Artemia foder til de voksne rurer. (E) dette billede viser opdræt af nauplii i spande placeret i vandbad indstillet til 26 ° C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Beskrivelse af trinene indledende dissektion af voksen rurer: fjernelse af kroppen fra sin råtanken. (A) Grab en af opercular pladerne ved at indsætte pincet forsigtigt gennem blænde. Træk forsigtigt for at fjerne pladen og udsætte dyret. (B) trække dyret ved at snuppe soma del lige under cirri. (C) dette panel viser den samlede anatomi af agern rurer. Kappe og potentielt befrugtede æg (i æggestokkene) ophold i shell hulrum, når kroppen er trukket ud. En note på barnacle anatomi (for en mere dybdegående konto, se Anderson)9: væg plader af en barnacle skråner indad, og de udgør tilsammen en vulkan-lignende kegle. En åbning, blænden, er omfattet af de to opercular plader, der udgør en dør, eller laag, at lukke blænde. Acorn rurer har generelt en kalkholdig basal plade, der er limet fast til undergrundens; Men, nogle arter af rurer mangler denne kalkholdige plade (f.eks. S. balanoides). Barnacles udskiller exoskeleton fra mørkt pigmenteret kappen (skjoldet). Den ydre overflade af dobbelt-lags kappen er forkalket for at blive stift, mens den indvendige overflade af kappen ikke er forkalket og derfor er fleksibel. Inde i aperture er cirri til stede i en tilbagetrukken stilling. Disse er de thorax vedhæng, som rurer bruger til suspension fodring. Æggestokkene er placeret tæt på bunden af barnacle, mens testiklerne ligger i soma. Dette tal er vedtaget fra Panova et al. 21 og er blevet offentliggjort med tilladelse fra Springer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Bestemmelse af rRNA integritet af kapillar gelelektroforese. RNA er udarbejdet af to forskellige homogenisering metoder: (A) ultralydbehandling og (B) keramiske perler. Enheden på y-aksen, FU, står for fluorescens enheder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Genekspression resultater fra to forskellige undersøgelser af gener, der er vigtige for osmoregulering i B. improvisus. (A) dette panel viser det differentierede udtryk som målt ved qPCR splice varianter af Na+/K+ ATPase NAK1 svar på forskellige saltholdigheder og pCO2 niveauer3. I den lave saltholdighed behandling, udtryk for den lange isoform (NAK1-L) er steget i forhold til kort (ANOVA, P < 0,001). (B) dette panel viser udtryk for aquaporins i voksne af B. improvisus under deres eksponering for forskellige saltholdigheder2. qPCR blev brugt til at bestemme aquaporin udtryk niveauer i forhold til aktin. Voksne individer blev inkuberet ved 3 forskellige saltholdigheder (3, 20 og 33 PSU) i 14 dage. Forberedelsen RNA blev soma, cirri og kappe af voksne adskilt. I begge tal angiver fejllinjer standardafvigelsen. Den ** og *** angiver niveauet af betydning (ANOVA), 0,01 og 0,001, henholdsvis. Disse tal er blevet ændret fra Lind et al. 2 , 3. begge tal er offentliggjort med tilladelse fra PLoS ONE. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Afregning fase | Samlede antal RNA (ng) |
| Fri svømning | 512 |
| Udforskning: Luk søgning | 518 |
| Vedlagte cyprid | 550 |
| Nyligt forvandlede juvenile | 832 |
Tabel 1: udbytter af RNA. Denne tabel viser de RNA antal ekstraheres med en RNA forberedelse kit fra puljer af 20 cyprid individer indsamlet på forskellige stadier under udligningsprocessen.
Discussion
Barnacle kultur på Tjärnö Marine Research Laboratory (Sverige) har kørt over 20 år og har været anvendt til undersøgelser i mange forskellige forskningsområder. Over 30 videnskabelige papirer er blevet offentliggjort, har udnyttet de dyrkningsbaserede system i de seneste år, herunder undersøgelser i antibegroningsmidler13,22, hydrodynamik23, kemiske økologi24, klimaændringer16 , evolutionær biologi5og molekylærbiologi2.
For at undgå udvælgelsen af visse personer, der er mere tilpasset til laboratoriemiljø (enkeltpersoner, som ikke måske er repræsentativ for befolkningens vilde), anbefales det at indsamle en ny gydebestande fra feltet hvert år. Det er derudover også god praksis til at forynge kulturen årligt, da der er ca 50-80% af dødeligheden hos voksne under et normalt år. Men hvis målet er at producere indavlede linjer eller til at oprette undersøgelser af eksperimentel udvikling, kun laboratorium-opdrættet familier er skal anvendes.
En god tid at indsamle B. improvisus på paneler på Tjärnö Marine Research Laboratory er i juni-August, fordi på tidspunktet, der er et godt udbud af cyprid larver i havet. Kontrollere panelerne ugentligt at se Hvornår barnacle afvikling starter og manuelt fjerne andre afgjort arter end B. improvisus (f.eks.muslinger, sækdyr, bryozoans, hydroids, nemerteans/rørorme og andre barnacle arter) fra den paneler (f.eks.med en tandbørste). Omkring Tjärnö er der tre lavt vand barnacle arter til stede (B. improvisus, Semibalanus balanoidesog Balanus crenatus). B. improvisus er dog den dominerende fouler af glatte hårde overflader i løbet af juli – August. S. balanoides har sin afregningsperiode i tidlige forår og foretrækker primært naturlige substrater (f.eks., sten). B. crenatus kan forekomme ved lave numre på panelerne i løbet af sommeren.
Det er også muligt at starte nye voksen barnacle generationer fra kulturperler cyprids, som vil være afgørende, hvis bestemte linages med bestemte egenskaber er blevet etableret, eller i undersøgelser af eksperimentel udvikling. Den mest bekvemme måde at starte nye generationer af voksne er at udligne cyprids på termoplastisk paneler i laboratoriet. Disse paneler med nyligt udlignede cyprids kunne også anvendes, i eksperimentelle behandlinger eller for eksponering i feltet. I nødstilfælde, kan man også bruge voksne på kampesten fra et nærliggende sted (f.eks.Idefjorden ved Tjärnö Marine Research Laboratory) hvor B. improvisus er fælles. Disse allerede etablerede voksne behandles på samme måde som voksne på paneler, således at blive placeret i bakker og fodret via gennemstrømnings-system. Flow celler kan også bruges til at etablere paneler med rurer25. Disse er gennemstrømning kamre med plankton net i siderne, som cyprids ikke at nøjes, med paneler som den eneste løsning overflade for larverne.
Der er flere trin, som er kritiske for at konfigurere en langsigtet fungerende barnacle kultur herunder alle livsstadier. Metoderne til kultur B. improvisus er nok, for en stor dels vedkommende også gælder for andre marine hvirvelløse dyr med fritsvømmende, planktotrophic larver. Dyrkningsbaserede procedurer for nogle arter er allerede godt beskrevet (f.eks.for blåmuslinger og forskellige arter af østers)26, mens det for andre marine hvirvelløse dyr, der er kun et par eksempler på langsigtede kulturer der spænder over hele deres liv cyklus. En af de første vellykkede forsøg på at kultur rurer (B. amphitrite) blev udført af Rittschof et al. 15. langsigtede økonomiske og personlige ressourcer bør være på plads før man overvejer at oprette en barnacle dyrkning facilitet. Vedligeholdelse af denne form for år-omkring barnacle kultur kræver mindst én person arbejder halv tid. Der kan være nogle muligheder for den fremtidige automatisering af nogle trin i produktionslinje, især dyrkning af mikroalger27. Derudover for at lykkes, er det vigtigt at have adgang til store mængder af høj kvalitet havvand. Dyrkning af mikroalger, Artemia, og rurer indebærer ikke nogen særlige sikkerhedsprocedurer. Test af nogle antifouling stoffer eller giftige kemikalier skal dog kan særlige forholdsregler.
Panelerne var tjekket flere gange om ugen for forureninger. Havvandet bruges i kultur blev pumpet fra en 40 m dybde i Koster fjorden udenfor Tjärnö Marine Research Laboratory og var gået gennem to sandfiltre før indtastning af lab vandsystem. Hvis ingen filtrering af vandet havde gjort, ville der være meget mere forurening i kulturen. Det er vigtigt regelmæssigt rengøre paneler i kultur fra efterladenskaber og andre hvirvelløse dyr (f.eks.udloeber-bygning hydroids og aggressiv nemerteans) der ind i systemet gennem levering af havvand fra feltet. For eksempel, hvis ingen larver er produceret på trods af, at kulturen har været velnærede og ellers synes at være i god stand, opgave måtte være tilstedeværelsen af nemerteans, der synes at hæmme parring. Selvfølgelig, mange af de forurenende organismer i kultur på Tjärnö Marine Research Laboratory var specifikke for den svenske vestkyst, og andre typer af kontaminerende organismer vil være fremherskende og være mere af en udfordring i andre geografiske områder. På vestkysten af Sverige er det usædvanligt at finde kontaminering af andre barnacle arter på panelerne. Lejlighedsvis, etablering af S. balanoides er blevet fundet, men dette er en meget marginal problem (højst én S. balanoides forurenende for 10.000 B. improvisus prøver). Manglen på forurener arter var sandsynligvis afhængig af regimet til at etablere nye kulturer i løbet af sommeren, når larvaefrom B. improvisus var stærkt dominerende. Derudover var der også en klar berigelse af B. improvisus på panelerne da denne art er selektiv for glatte overflader13.
Det er vigtigt at fjerne døde voksne rurer. Hvis de tomme skaller er tilbage på paneler, kan de blive en læ både for Artemia nauplii og for forskellige forurenende arter. Derudover er det blevet bemærket, at døde personer indflydelse på trivsel i nabolandet personer, sandsynligvis med udgivelsen af giftige forbindelser under nedbrydning. En yderligere konsekvens af voksen dødelighed er, at nogle personer vil stå alene og for langt væk fra alle andre voksne at tillade parring (selvom rurer har den længste penis i dyrenes verden i forhold til dens størrelse)28. Disse individer vil overleve, men er ikke-produktive for larver. Men disse ensomme voksne individer kan forsigtigt fjernes uden at skade base-pladen og placeres vandret tæt på andre til parring. Barnacles kan også være parret ved at placere paneler med en voksen på hver men tæt nok, så krydsning kan forekomme. På denne måde, kan genetiske linjer være produceret14.
Det er afgørende at producere et foder af høj kvalitet og at fodre kulturer næsten hver dag. Selv et par dage uden mad kan resultere i en faldende frigivelse af larver. Tidligere undersøgelser af kost sammensætning har vist, at kiselalger er afgørende for vækst og overlevelse af barnacle nauplii. Flere diatom arter synes passende som foder, selv om små eller ensomme celler (mindre end 10 µm i diameter) kan være nødvendige for den nauplii indtagelse. Arterne, S. marinoi, C. simplexog T. pseudonana har alle vist sig for at være tilstrækkelig foder til B. improvisus nauplii, og nem at dyrke. Derudover er den foderkvalitet generelt højere for eksponentielt voksende alger. Det er også blevet rapporteret, at kiselalger er afgørende for oprettelse af produktive kulturer af B. amphitrite15. En teori om betydningen af kiselalger er at de har en unik fedtsyre profil og er særligt rige på meget flerumættede 20:5 fedtsyre29. Det har vist sig at visse fedtsyrer er vigtige for en vellykket udvikling af østers larver30.
I år, har der været ingen forekomst af skadelige sygdomme i barnacle kultur. I mange kommercielle hvirvelløse aquakulturer, som østers og muslinger, sygdomme er ret almindelige og kan være meget skadeligt. Skadelige virkninger af virus er også blevet rapporteret fra vilde populationer. De indfødte østers i Frankrig blev erstattet af den portugisiske østers Crassostrea angulata i 1925, men denne art blev udslettet ved en iridovirus omkring 197031. For nylig har der været massive dødelighed begivenheder i stillehavsøsters Crassostrea gigas i kulturer over hele verden, der synes at være forbundet med ostreid herpesvirus 132. Ingen rapporter om patogener, bakterier eller virus på barnacles er blevet offentliggjort hidtil. Men i det igangværende genom-projektet på B. improvisus, virus sekvenser blev fundet (Alm Rosenblad et al., upublicerede data), men med nogen åbenlys forbindelse til symptomer på sygdomme. Blandinger af antibiotika har tidligere været anvendt kulturer at minimere risikoen for bakterielle infektioner; men denne fremgangsmåde er i øjeblikket opgivet og hidtil har det ikke forårsaget forurening problemer.
Hvis havvand er opvarmet (som beskrevet ovenfor), kan overophedning være den mest alvorlige risiko i kultur produktionslinje. Det er naturligvis vanskeligt at beskytte mod overophedning, selvom sensorer og passende alarmsystemer kan være brugt (f.eks.at sende e-mail eller SMS-beskeder til ansvarlige personer). Forekomster af denne slags i fortiden har resulteret i betydelige drabet af voksne i kulturen. Dette kan selvfølgelig være ødelæggende og ødelægge langsigtede investeringer i tid og penge. Dette ville især være katastrofale hvis genetiske indavlede har været etableret. For at sikre levetid af disse linjer og sikre dem mod hændeligt tab, ville det være ønskeligt at udvikle en kryopræservering metodologi til rurer. Det er blevet rapporteret, at larver fra den stillehavsøsters kan være frosset ned og genoplivet med delvis succes33. Cryobanking har også været et værdifuldt redskab til at bevare de genetiske ressourcer i en lang række arter34. Selv nauplii fra B. amphitrite er rapporteret at overleve frysning35, og det konstateredes, at 20% af de personer, frosset ned med succes forvandlet til cyprids36. Imidlertid anvende frysning for den langsigtede bæredygtighed af kulturer er hidtil ikke blevet vedtaget, men det ville faktisk være behov for vedligeholdelse af valgte linjer; Dette ville være et vigtigt skridt til at fast etablering af B. improvisus til en potent marine modelsystem.
Her, blev en protokol, der præsenteret for dissektion af forskellige væv fra voksne af B. improvisus (dvs., cirri, soma og mantel). Det skal dog understreges, at andre væv også kan udvindes. For eksempel er bløddelsvæv mellem ydre og indre kappen af membranøs-base arter Tetraclita japonica formosana omhyggeligt isoleret og bruges til en RNA udvinding og RNA-seq analyse af gen expression37. Den skitserede optimeret udvinding protokollen beskrevet her giver tilstrækkelige mængder af høj kvalitet RNA til sekvensering fra en minimal mængde af starter materiale. Første minimerer samling af enkelte larver direkte til homogenisering rør tab under overførslen fra et rør til et andet. Desuden afprøves blandt de forskellige metoder, homogenisering med keramiske perler viste sig for at være den mest effektive med hensyn til RNA afkast og integritet, i forhold til sonikering eller pistil homogenisering. Når du planlægger for genekspression eller genomforskning eksperimenter, har man til at huske udfordringen af høj genetisk variation i rurer, mindst for B. improvisus. Barnacle har en genetisk diversitet i størrelsesordenen 3-5%, selv i kodende regioner (Alm Rosenblad et al., upublicerede data). Dette, selvfølgelig, sætter specifikke krav om udformningen af primere for qPCR analyse, hvor mere bevaret regioner bør identificeres og bruges som skabeloner til primere for at få konsekvent udtryk resultater betweenbatches. Bevarede regioner for target gener, som aquaporins og Na +/ K + ATPases, kan identificeres ved at studere sekvens variation af disse gener i RNA-seq data indhentet fra populationer af cyprids der indeholder hundredvis af enkeltpersoner. DNA vil udtages prøver til en analyse af genom. Men, at opnå høj kvalitet DNA fra B. improvisus kan være udfordrende21.
Afslutningsvis, etablerede barnacle kultur har vist sig for at være medvirkende til forskellige slags eksperimentelle undersøgelser. Især all-året-rundt larve produktionen tillader os at udføre eksperimenter uden at være begrænset til de naturligt forekommende gydeperioden ( B. improvisus, er det om sommeren). Fremkomne larver kan bruges til at udføre en lang række eksperimentelle undersøgelser, herunder afregning assays, opførsel assays, udtryk undersøgelser af specifikke gener, samt genome-wide transkriptom undersøgelser.
Disclosures
Forfatterne har intet at erklære.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af tilskud 2017-04559 fra svenske forsknings Rådet (VR) og EU støttede projekt STRANDPROMENADEN til Anders Blomberg. Især oprettelsen af de dyrkningsbaserede facilitet, gennem årene, blev støttet af tilskud til Per R. Jonsson fra de følgende finansielle organer: SSF (svenske Foundation for strategisk forskning) gennem programmet havforskning og -teknologi og MISTRA gennem programmet Marine Paint. Kent Berntsson var medvirkende i de tidlige faser af opsætning af culturingfacility. Yderligere finansiering til oprettelse af de dyrkningsbaserede facilitet er kommet fra centrum for Marine evolutionær biologi (www.cemeb.science.gu.se), som er støttet af Linnaeus tilskud fra svensk forskning råd form og VR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plexiglas (poly-methyl methacrylate) panels | Plastic produkter, Bromma, Sweden | transparent glas | |
| 1.5 L PET bottle | |||
| Artemia | INVE Aquaculture, Belgium | We have tested different companies; this is really the best one | |
| Skeletonema marinoi (CCAP strain 1077/5) | CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland | strain 1077/5 | |
| Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP strain 1085/3) | CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland | strain 1085/3 | |
| Millipore cartridge filter system | Millipore | ||
| cartridge with a nominal pore size of 0.2 µm | Millipore | cartridge CWSS01S03 | High capacity for large volumes |
| polycarbonate bottle | Nalgene | autoclavable | |
| RNA later | Qiagen | 76106 | Fixation solution to preserve RNA |
| TURBO DNA-free Kit | Invitrogen/Thermofisher Scientific | AM1907 | DNAse kit to remove DNA from prepared RNA |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Biorad | 1708890 | cDNA synthesis kit |
| SYBR Green supermix | Biorad | 1708880 | Dye for QPCR |
| RNeasy minikit | Qiagen | 74104 | RNA extraction of adults or many cyprids |
| Soft tissue homogenising CK 14, 2 ml tubes | Precellys | KT03961-1-003.2 | Ceramic beads for homogenisation |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | RNA extraction of few cyprids |
References
- Darwin, C. A monograph of the sub-class Cirripedia, with figures of all species. The Balanidae (or sessile cirripedes); the Verrucidae, etc., etc., etc. , Ray Society. London, UK. (1854).
- Lind, U., et al. Analysis of aquaporins from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals differential expression in response to changes in salinity. PLoS ONE. 12 (7), 0181192 (2017).
- Lind, U., et al. Molecular characterization of the alpha-subunit of Na+/K+ ATPase from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals multiple genes and differential expression of alternative splice variants. PLoS ONE. 8, 77069 (2013).
- Fyhn, H. J. Holeuryhalinity and its mechanisms in a cirriped crustacean, Balanus improvisus. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 53 (1), 19-30 (1976).
- Wrange, A. L., et al. The story of a hitchhiker: population genetic patterns in the invasive barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus Darwin 1854. PLoS ONE. 11 (1), 0147082 (2016).
- Berntsson, K. M., Jonsson, P. R. Temporal and spatial patterns in recruitment and succession of a temperate marine fouling assemblage: a comparison of static panels and boat hulls during the boating season. Biofouling. 19 (3), 187-195 (2003).
- Lind, U., et al. Octopamine receptors from the barnacle Balanus improvisus. are activated by the alpha2-adrenoceptor agonist medetomidine. Molecular Pharmacology. 78 (2), 237-248 (2010).
- Semmler, H., Hoeg, J. T., Scholtz, G., Wanninger, A. Three-dimensional reconstruction of the naupliar musculature and a scanning electron microscopy atlas of nauplius development of Balanus improvisus (Crustacea: Cirripedia: Thoracica). Arthropod Structure & Development. 38 (2), 135-145 (2009).
- Anderson, D. T. Barnacles - structure, function, development and evolution. , Chapman & Hall. London, UK. (1994).
- Kennedy, V. S., DiCosimo, J. Subtidal distribution of barnacles in Chesapeake Bay, Maryland. Estuaries. 6, 95-101 (1983).
- Dreanno, C., Kirby, R. R., Clare, A. S. Locating the barnacle settlement pheromone: spatial and ontogenetic expression of the settlement-inducing protein complex of Balanus amphitrite. Proceedings of the National Academy of Sciences. 273, 2721-2728 (2006).
- Rittschoff, D., et al. Cues and context: larval responses to physical and chemical cues. Biofouling. 12 (1-3), 31-44 (1998).
- Berntsson, K. M., Jonsson, P. R., Lejhall, M., Gatenholm, P. Analysis of behavioural rejection of micro-textured surfaces and implications for recruitment by the barnacle Balanus improvisus. Journal of Experimental Marine BIology and Ecology. 251 (1), 59-83 (2000).
- Gamfeldt, L., Wallén, J., Jonsson, P. R., Berntsson, K. M., Havenhand, J. N. Increasing intraspecific diversity enhances settling success in a marine invertebrate. Ecology. 86, 3219-3224 (2005).
- Rittschof, D., Clare, A. S., Gerhart, D. J., Sister Avelin, M., Bonaventura, J. Barnacle in vitro assays for biologically active substances: toxicity and settlement inhibition assays using mass cultured Balanus amphitrite amphitrite Darwin. Biofouling. 6 (2), 115-122 (1992).
- Pansch, C., Schaub, I., Havenhand, J., Wahl, M. Habitat traits and food availability determine the response of marine invertebrates to ocean acidification. Global Change Biology. 20 (3), 765-777 (2014).
- Guillard, R. R. L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. Culture of marine invertebrate animals. Smith, W. L., Chanley, M. H. , Springer. Boston, MA. 22-60 (1975).
- Wrange, A. L., et al. Importance of plasticity and local adaptation for coping with changing salinity in coastal areas: a test case with barnacles in the Baltic Sea. BMC Evolutionary Biology. 14, 156 (2014).
- Bacchetti De Gregoris, T., et al. Construction of an adult barnacle (Balanus amphitrite) cDNA library and selection of reference genes for quantitative RT-PCR studies. BMC Molecular Biology. 10, 62 (2009).
- Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10, 159 (2010).
- Panova, M., et al. DNA extraction protocols for whole-genome sequencing in marine organisms. Methods in Molecular BIology. 1452, 13-44 (2016).
- Berglin, M., Larsson, A., Jonsson, P., Paul Gatenholm, P. The adhesion of the barnacle, Balanus improvisus, to poly(dimethylsiloxane) fouling-release coatings and poly(methyl methacrylate) panels: the effect of barnacle size on strength and failure mode. Journal of Adhesion Science and Technology. 15, 1485-1502 (2001).
- Larsson, A. I., Granhag, L. M., Jonsson, P. R. Instantaneous flow structures and opportunities for larval settlement: barnacle larvae swim to settle. PLoS ONE. 11, 0158957 (2016).
- Toth, G. B., Lindeborg, M. Water-soluble compounds from the breadcrumb sponge Halichondria panicea. deter attachment of the barnacle Balanus improvisus. Marine Ecology Progress Series. 354, 125-132 (2008).
- Pansch, C., Jonsson, P. R., Berglin, M., Pinori, E., Wrange, A. L. A new flow-through bioassay for testing low-emission antifouling coatings. Biofouling. 33 (8), 613-623 (2017).
- Walne, P. Observation of food value of 7 species of algae to larvae of Ostrea edulis 1. Feeding experiments. Journal of the Marine Biological Associateion of the UK. 43, 767-784 (1963).
- Sandnes, J. M., et al. Real-time monitoring and automatic density control of large-scale microalgal cultures using near infrared (NIR) optical density sensors. Journal of Biotechnology. 122 (2), 209-215 (2006).
- Neufeldt, C. J., Palmer, A. R. Precisely proportioned: intertidal barnacles alter penis form to suit coastal wave action. Proceedings of the Royal Society B Biological Sciences. 275, 1081-1087 (2008).
- Dunstan, G., Volkman, J., Barrett, S., Leroi, J., Jeffrey, S. Essential polyunsaturated fatty acids from 14 species of diatom (Bacillariophyceae). Phytochemistry. 35, 155-161 (1994).
- Jonsson, P. R., Berntsson, K., André, C., Wängberg, S. -Å Larval growth and settlement of the European oyster (Ostrea edulis) as a function of food quality measured as fatty acid composition. Marine Biology. 134 (3), 559-570 (1999).
- Comps, M., Bonami, J. R., Vago, C. Virus-disease of Portuguese oyster (Crassostrea angulata. lmk). Comptes rendus hebdomadaires des séances de l'Académie des Sciences. Série D, Sciences naturelles. 282, 1991-1993 (1976).
- Segarra, A., et al. Detection and description of a particular Ostreid herpesvirus. 1 genotype associated with massive mortality outbreaks of Pacific oysters, Crassostrea gigas, in France in 2008. Virus Research. 153 (1), 92-99 (2010).
- Suquet, M., et al. Survival, growth and reproduction of cryopreserved larvae from a marine invertebrate, the Pacific oyster (Crassostrea gigas). PLoS ONE. 9 (4), 93486 (2014).
- Martínez-Páramo, S., et al.
- Anil, A. C., Tulaskar, A. S., Khandeparkar, D. C., Wagh, A. B. Cryopreservation of Balanus amphitrite nauplii. Cryobiology. 34, 131-140 (1997).
- Oo, K., et al. Cryopreservation of nauplius larvae of the barnacle, Balanus amphitrite Darwin. Fisheries Science. 64, 857-860 (1998).
- Lin, H. C., et al. First study on gene expression of cement proteins and potential adhesion-related genes of a membranous-based barnacle as revealed from next-generation sequencing technology. Biofouling. 30 (2), 169-181 (2014).
