Summary
フジツボタテジマフジツボ (Amphibalanus) improvisusは、浸透圧調節や防汚のモデルです。ただし、季節の自然産卵と、cyprid 幼虫の予測不可能な供給が得られます。ここでは、幼虫の生産を含むb. improvisusのオールラウンド年養殖のためのプロトコル、説明します。遺伝子発現研究培養ふじつぼ類の使用を示しています。
Abstract
フジツボが付着大人海産甲殻類と自由遊泳性、浮遊性の幼生。フジツボタテジマフジツボ (Amphibalanus) improvisus低塩分の極端な耐性のため浸透圧調節機構の研究のためのモデルとして特に関連します。防汚研究に関連して特に生物学のモデルとしても広く使用されます。ただし、自然季節産卵研究 cyprid 幼虫の予測不可能な供給が得られます。B. improvisusのすべての年間養殖は開発され、生産ラインでの手順をすべての詳細な説明のためのプロトコルを説明 (すなわちパネル、コレクションとの飼育アダルト文化の確立フジツボ幼虫と成虫と幼虫の飼料の管理)。説明もトラブルシューティングに関するガイダンスを提供し、重要なパラメーター (例えば汚染の除去、高品質飼料の生産、必要な人材、高品質海水の重要性) を説明します。養殖システムから各バッチは最大限に約 12,000 給餌が得られます、毎週ほぼ 50,000 の幼虫まで作り出すことができるので、1 週間で 4 つのバッチを配信できます。B. improvisusの文化に使用する方法は、おそらく、大部分は無料 swimminglarvae とその他の海産無脊椎動物にも対応。プロトコルは、様々 な組織の郭清の遺伝子発現の研究の質の高い RNA の生産と同様、大人から掲載されています。それはまた記述されているどのように培養大人と飼育 cyprids は外部要因に関連して遺伝子発現を調べるための実験的デザインの広い配列で利用できます。遺伝子発現培養ふじつぼ類の使用、Na+の可能な浸透圧調節の役割の研究で示されて/K+ ATPase とアクアポリン。
Introduction
フジツボが付着大人海産甲殻類と自由遊泳性、浮遊性の幼生。フジツボの 1,200 の種のほとんど浅い水の多くはしばしば低塩分にさらされています。ほぼ淡水容認することは 1 つの種、タテジマフジツボ (Amphibalanus) 即席に作る(B. improvisus) 湾のフジツボとチャールズ ・ ダーウィンにウルグアイ1リオ ・ デ ・ ラ ・ プラタの河口の小さなストリームからこの種が記載されています。B. improvisus浸透圧調節機構2,3の研究の特に関連するモデルを極端な耐性の時塩分になります。このフジツボは汽水の条件を好むが約 1.6 psu から塩分と水に住んでいることに高い 40 psu4として。バルト海の汽水で生息するフジツボだけです。B. improvisusアメリカ大陸の東海岸に由来すると考えられてが今日は世界の分散のために5を同梱します。それは主要な汚損生物と岩、桟橋、ボートの船体でよく見られる、したがって海洋、塩気のある水6、7の構造の生物付着のメカニズムを理解するための一般的な関心の。
他のほとんどのフジツボと同様、 b. improvisusは受精; と雌雄同体複製は、細長いペニスと体内受精を使用して隣接個体間の交配によって発生します。生殖期間は主に 5 月から 9 月です。B. improvisusは 7 遠洋幼生 (6 給餌 1 つ cyprid ステージ8の順)。ノープリウス幼生は自由遊泳は、非給餌 cyprid 幼虫に脱皮する前に数週間までの水の列のフィードに受精卵が孵化。Cyprid は複数のキューを使用してを解決する適切なサイトを検索して付着少年フジツボ9に変身を経る。種が実験室で培養することができます、海 (実験室文化で 2-3 年) に 1-2 年の寿命。平均では、 B. improvisus (最大 20 mm 程度) が付いている直径で 10 mm に成長し、約 6 mm の高さの最大値に達すると (ただし、それは混雑した条件の下で背が伸びることができます)。種ができるシェル プレートの放射状パターンの石灰質ベースと tergal プレート1,10の形その滑らかな石灰質もシェル (白または灰色がかった) によって識別されます。
フジツボB. improvisus分子生理機構と同様、生態学的相互作用と進化の結果の焦点との浸透圧の研究のためのモデルとして有利な機能があります。防汚メカニズム関係7,11,12,13研究に関連して特に生物学の調査のためのモデルとしても広く使用されます。ただし、自然季節産卵研究 cyprid 幼虫の予測不可能な供給が得られます。したがって、そのライフ サイクル全体を通じてこのフジツボを一年中文化能力です分子および作用機構研究の様々 なタイプを有効にする主要な資産であります。また、海洋/汽水域の世界でのプレゼンスは、フィールドと実験的研究の組み合わせにできます。制御された繁殖は長期培養14について知られている家系の家族を作成することも、数ヶ月の生成時間は長期的な戦略の実験的進化できます。またドラフト ゲノムとトランスクリプトームのいくつか、ありこれらのリソースは、いくつかの遺伝子 (例えば、浸透圧に重要な遺伝子)2,3のクローニングのために使用されています。
このプロトコルの目的は、確立し、大人やこの生物の幼虫について遺伝子発現研究を行うために一年中フジツボB. improvisusの文化を維持する方法について説明することです。Rittschofら15種タテジマフジツボの cyprids の集落への給餌のリリースからフジツボを培養するための方法について説明します。プロトコルは Tjärnö 海洋研究所 (スウェーデン)、 b. improvisusのすべて年間を通して養殖に適応されているし、生産を含むとフジツボの飼育、生産ラインのすべてのステップの詳細な説明が記載されて幼虫と成虫と幼虫のフィードの管理。完全な手順の概要については、図 1を参照してください。養殖システムの使用はいくつかの一般的な実験のセットアップを例示、Na+の機能ゲノミクス研究で示されている/K+ ATPase とアクアポリン、浸透圧調節2、その機能の解明 3。それは特定の臓器における遺伝子発現を調べることが不可欠でありフジツボ解剖の基礎の一部を支給します。質の高い海水の良い供給、フジツボB. improvisus、および他の可能性のある多くの種の培養できるはず世界中の海洋研究室です。
Protocol
1. 新しい親フィールド大人ふじつぼ類のコレクション
-
フィールドから大人のフジツボを収集するために熱可塑性樹脂 (ポリ メチルメタクリ レート) 透明パネル (1.5 mm3x 110 x 110) ≈ 1-3 メートルの深さで穏やかな海を展開します。いくつかのパネル (図 2A) を取ることができる使用するフレームは、各パネルと attachthepanelstotherackusingcableties の上部の角 (直径 6 mm) と 2 の穴をあけます。したがって、thepanelswillhangverticallyin 水。
- フジツボの決済は (パネル上に小さな白いハード点として識別された) が発生したとき、フジツボが大きいかどうかを確認する最低 2-3 週間はパネルのまま乾燥または破損して得ることがなく研究室に転送するのに十分な (5 mm)。
- 彼らはカリフォルニア州のサイズに達している定住B. improvisusで覆われているときは、研究室にパネルをもたらします。5 mm 試料。
注: 5 mm のフィールドを開発する大人のための時間は食べ物や温度の可用性に大きく依存。通常、これは Tjärnö 海洋研究所で約 3 週間をかかります (58.87 ° N, 11.14 ° E)。最も一般的に、新しい親のためのパネルは一般的に 6 月下旬に展開し、8 月の終わりに収集します。 - 導入する前に、文化施設にパネルは、パネルから他の生物をクリーンアップします。最も他のフジツボの種を削除することが重要です。大幅、親魚の生存の可能性は増えますので、栽培中に種を汚染をなくすパネル頻繁にきれいにすることが重要であることに注意してください。
- ポリエチレン トレイ (20 mm3x 400 x 400) に精白溝をスタンドの端にパネルを垂直方向に配置 (数字の 2と2 e)。スタンドの溝は 15 mm 離れています。
- トレイを準備するために各トレイの反対側、基地入口ポートと上部の出口ポートを作る。各トレイの入り口ポートを含む約 30 リットルの水 20 ° C で外洋の海水の入口とcaの割合でフローを許可するように 100 L タンクに接続します。毎分 2 L。
注: 8 トレイまで、単一の 100 L タンクに接続されました。 - 100 L タンクを低温海水 (20 ° C) (例えば、着信の海水から熱交換を行う熱ポンプによって提供される) に接続します。
注: フジツボB. improvisusを育て、完全海洋塩分 (30-35 psu); で再現ただし、 caに塩分を減らすこと。100 L タンクへ淡水を追加して 25 psu 文化から幼虫の出力が増加します。
2. 培養 Cyprids から大人の新世代を開始
- 一緒に非毒性で耐水性のテープを用いたテーピング 5 パネルの熱可塑性樹脂パネル上部に開いてのキューブを構築します。
- (漏) 小さなトレイにキューブを配置し、海水 (25 psu) でそれを埋めます。室温で水を保つ (ca。 20 の ° C)。キューブの上部に約 200 cyprids を追加します。
- Skeletonema marinoi 100 mL で一日おき、稚魚をフィード (手順 5. を参照) 一方、キューブに。
注: 少年フジツボのアルテミアを摂取困難を持つことができます (手順 3. を参照) が大きいと、それゆえにはフジツボの新規入植のため飲み込むことが困難。 - 1 週間 × 1 水を変更します。
- パネルに直径 5 mm 以上の十分に確立された少年が含まれている場合、2 週間後キューブを離れて取る」と流 throughseawater とトレイに少年とパネルを移動し、その後、 A. サリナ給餌、フジツボをフィードします。
3. 大人のフジツボのフィードとしてアルテミア給餌の文化
- A. サリナの養殖システムを設定するには、1.5 L のペットボトルを切断、bottomis、ボトルは逆さまに立てと横から照らされた配置されを使用して。クランプでシリコン チューブにボトルネックを合わせて、曝気ポンプ (図 2D) に取り付けます。
- 卵を孵化するために 1 リットルの海水にアルテミアの乾燥休眠卵の約 15 mL を追加します。
注: 24-48 時間後のノープリウス幼生にアルテミアの卵のハッチ。A. サリナの給餌 (例えば週末の間に) のハッチングを遅らせるため、光は、少し温度を減らすためにオフにできます。 - アルテミアノープリウスの収穫、通気をオフにし、アルミ箔 (または同じような例えば缶) でボトルの上の部分を暗くする.点灯 10 分 Hatchedアルテミア給餌のためのびんの下の部分が光に向かって泳ぐ。非孵化嚢胞は、底に沈むだろうし、嚢胞の殻表面に浮きます。
- 下部クランプを開きます。スイミング給餌の密な人口として中間画を収集します。
注: 毎日 (週末を除く)、高密度のアルテミア給餌停止の 1 L は大人のフジツボとトレイに接続する 100 L タンクに手動で追加します。以来、彼らは栄養を提供し、より頻繁な間隔で文化をきれいに必要とは、主に空嚢胞の殻を持つ任意の授乳を避けてください。
4. コレクションとフジツボ幼生の飼育
- 優しく淡水とそれらに吹きかけるによって大人のフジツボとパネルをきれいにし、必要に応じて、削除フジツボの殻と柔らかい歯ブラシを使用してパネルから任意の汚れ。また、きれいに (フジツボ) なしトレーおよびホット (75 ° c) チューブ淡水。
- ポリエチレン トレイ (30 × 20 × 10 cm3) にオーバーフロー ポート 90 μ m のプランクトン ネット カット塩ビ管 (高さ 15 cm、直径 16 cm) の端に接着のふるいを配置します。ふるい一晩 (図 2C) B. improvisus幼虫を収集します。
注: ふるいはフジツボのパネル止水水を受けるためや、給餌を除外するトレイの出口ポートのすぐ下に配置されました。幼虫は、小さなトレイがオーバーフロー海水中にふるいに残った。この小さなトレイ確保するふるい決して driedout。 - 水族館の魚のタンク ヒーター (図 2E) を使用して 26 ° c 温度大きな水浴の 30 L のバケツを配置します。曝気・攪拌は、システムを介して空気バブリングによって保証されます。
- フィルター処理された海水 (0.2 μ m; 25 psu) の 20 L バケツを満たしなさい。2 珪藻微細藻類, S. marinoi , C. 薄(手順 5. を参照) の 60/40 ミックスのバケツに 1 L を追加します。これはバケツに mL あたり約 5 × 104珪藻の初期密度を与えます。
注: フジツボ給餌幼虫、正の走光性。バケットは、いくつかの光を通す蓋の不透明な白いプラスチックから成っていた。冬の間は、夜間に暗いが、昼間 (8:00-17:00)、部屋が照らされていた。夏の間、外の光は日のほとんどの間に部屋に入って来た。 - 収集した転送 (300 mL; 直径 90 mm、高さ 50 mm の) 結晶皿にB. improvisus給餌。
- 光源に幼虫を誘致する側から料理を照らします。ピペットと入射光に集まる、別の結晶皿に移してフジツボ給餌を収集します。任意の残りのアルテミア幼生を削除します。
- B. improvisus給餌幼虫をフィルター処理された海水 1 l ビーカーに転送します。
- 幼虫も懸濁液を得るため優しくビーカーを攪拌し、ビーカー内の異なる場所から 1 mL のサンプル 5 個を取って給餌の数をカウントします。顕微鏡での目視検査用マイクロ プレートに各サンプルを転送します。における 5 つのサンプルのそれぞれの数をカウントし、それらを追加します。
- どのように何千もの幼虫は、全体のビーカーを推定する 200 1,000 mL (5 mL) をカウント数を掛けます。ビーカーにあまりにも多くのノープリウス幼生がある場合はサンプルを希釈する密度はせいぜい 14,000 幼虫/L (通常は 11,000-12,000 幼虫/L の範囲) まで。
- 1 つのバケット、バケットあたり約 11,000-12,000 幼虫を追加するB. improvisus給餌の 1 リットルを追加します。
注: この幼虫に関連してあまりにも少ない結果し、死亡率を増加させるのでより多く給餌を追加することを確認します。 - 3 日後に、90 μ m ふるいの給餌フジツボを収集します。(75 ° C、淡水) でバケツをきれい、フィルター処理された海水を詰めて、新しい珪藻フィード (同じ量として開始時) を追加、最後にもう一度、給餌を追加します。Cyprids は約 6 日 (± 1 日) 後に表示を開始します。
- (ポイント 4.2 上記のように設計されている) 90 μ m ふるいで最初 cyprids を収集します。160 μ m ふるいの上に 320 μ m ふるいでフジツボの非退給餌と cyprids を分離します。B. improvisus給餌が 320 μ m ふるい、160 μ m ふるいで cyprids で収集されます。
注: cyprid 幼虫は、後で使用するcaまで暗闇の中で結晶皿に 10 ° C で保存されるかもしれない。6 日間。ただし、ストレージすることができます品質とパフォーマンスに影響フジツボ幼生のためさまざまな治療法を比較する実験は、理想的に交絡効果16を避けるために同じバッチ (と同様のストレージ時間) から幼虫を使用してください。
5. フジツボ ノープリウス幼生用飼料としての微細藻類の培養
注: 藻類成長した文化の 3 種類: スケール アップ; の接種のため使用されていた系統の長期的な保守は、文化をストック (i)(スケール アップ; の最初のステップは、ii) 開始の文化最後に (iii) フジツボ、藻類の大量の最終的な生産規模は、生産文化のフィードします。
- フジツボ ノープリウス幼生の餌として使用される文化コレクションの藻類や原生動物 (CCAP) から珪藻種を注文します。2 種Skeletonema marinoi (CCAP ひずみ 1077/5) とキートセラス シンプレクスと薄(CCAP ひずみ 1085/3) の両方は、飼料として良い結果を与えます。
- 公称孔径 0.2 μ m. (フィルター処理された海水は、 A. サリナ卵の孵化とフジツボ ノープリウス幼生の養殖に使用するもです) とカートリッジ フィルターを用いた藻類の文化で使用されるすべての海水中にフィルターを適用します。オートクレーブ (105 ° C 5 分) での藻類培養海水のフィルター。
- 無機栄養素、微量金属やビタミン (ギラードリックデイビス 197517詳細レシピを参照) を含むギラードリックデイビスの f/2 ソリューションで豊かにオートクレーブ処理した海水を用いた微細藻類の培養培地を準備します。また、ケイ酸塩 (Na2SiO3)、ソリューションの準備が、これを固体沈殿物を防ぐために f/2 濃縮から別々 に保管します。
注: 濃縮原液とケイ酸塩の原液の濃度は、1 リットルの海水のためにそれぞれの 1 mL 追加として使用する調製しました。 - オートクレーブ 120 ° C で藻類の培養で 1 ml の f/2 濃縮と珪酸塩溶液 1 mL 20 分オートクレーブ スクリュー キャップ チューブ使用すべての機器。オートクレーブ処理したガラス製品、液体が部屋の温度に冷却するとき、赤土が流出し、濃縮およびケイ酸塩のソリューションを追加します。
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スクリュー キャップが 40 mL 試験管に微細藻類のストックの文化を育てます。
- 濃縮海水の約 30 mL の試験管を入力します。2 週古いストックの文化の約 1 mL を使用して滅菌パスツール ピペットで文化を接種します。スクリュー キャップは装備が浮いたり、いくつかのガス交換を許可します。可能な場合、接種は層流の場合の汚染のリスクを軽減するキャビネットの実施必要があります。
注: 株式文化の目的は、藻類の文化の接種材料として機能して長期的文化を開始を維持するためにです。株式文化は、2 週間毎を再接種しました。 - Caの強度と白色光に新しい株式文化を公開します。25-50 µmole m-2の-1 (16:8 h の明暗サイクル)。古いストックの文化をバックアップとして低照度に移動します。任意の 2 週古いストックの文化を破棄します。
- 濃縮海水の約 30 mL の試験管を入力します。2 週古いストックの文化の約 1 mL を使用して滅菌パスツール ピペットで文化を接種します。スクリュー キャップは装備が浮いたり、いくつかのガス交換を許可します。可能な場合、接種は層流の場合の汚染のリスクを軽減するキャビネットの実施必要があります。
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藻の生産文化スケーリングするためストックの文化からスタート文化を接種して 500 mL Erlenmeyerflasks のそれらを育てます。
- オートクレーブ 4 エルレンマイヤー フラスコ、ピペット、フィルター処理 (0.2 μ m) 海水の 300 ml コットン ストッパー及び f/2 濃縮の 0.3 ml 4 試験管とケイ酸塩ソリューション 4F/2 濃縮と部屋の温度にケイ酸塩を冷却し、エルレンマイヤー フラスコにソリューションを追加します。Caにそれらを接種します。2 週間の古い株式文化の 1 mL は。
注: s. marinoiと 2 のフラスコとC. シンプレックス2 を準備します。 - 50 µmole m-2の-1の光強度の振動台で、フラスコを置きます。開始文化が密集する藻類 (黄色色で茶色) を取得している、彼らが食物と一緒に幼虫、フジツボを提供する生産文化の接種材料として使用する準備ができています。
- オートクレーブ 4 エルレンマイヤー フラスコ、ピペット、フィルター処理 (0.2 μ m) 海水の 300 ml コットン ストッパー及び f/2 濃縮の 0.3 ml 4 試験管とケイ酸塩ソリューション 4F/2 濃縮と部屋の温度にケイ酸塩を冷却し、エルレンマイヤー フラスコにソリューションを追加します。Caにそれらを接種します。2 週間の古い株式文化の 1 mL は。
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ガラス管が装備 2 ドリル ポートを備えたシリコーン ストッパー付き 4 L ポリカーボネート瓶の生産文化を育てます。
- 1 ガラス管、空気ポンプ経由でシリコン チューブが 0.2 μ m のエアフィルターを装備するボトルの底に手を差し伸べるに接続します。第 2 のガラス管の端だけシリコーン ストッパー下注入された空気の出口を許可するように綿でいっぱいだことを確認します。
- 毎週、塗りつぶし 4 4 L ボトル フィルター海水とオートクレーブそれら一緒にストッパー。また、オートクレーブ 4 テスト管 4 mL f/2 の濃縮およびケイ酸塩のソリューション。
- 冷却した後、ボトルに f/2 濃縮とケイ酸塩のソリューションを追加し、エルレンマイヤー フラスコのスタートアップ文化のボリュームの半分でそれらを接種します。
- 50-100 µmole m-2の-1の光強度に 4 つの 4 L ボトルを置きます。
- Ca後生産文化を収穫します。1 週間。彼らは、フジツボのノープリウス幼生を摂食するため十分に密なされます。
注: 生産文化は、いつでもアクティブな本番の 8 本があることを意味する約 2 週間の寿命を持っています。
6. 設計フジツボを用いた実験的研究
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Identicalconditions の下で育つことができる制御の水槽に青少年や成人のフジツボとパネルを配置します。これは、例えば、ローカル adaptions または表現型可塑性18を理解したり、外部要因 (例えば、塩分濃度、温度、または pH) 関連遺伝子の発現変動を研究に使用する一般的な庭の実験に呼び出されます。
注: パネルのフィールドから直接収集したフジツボを使用することが可能ですも。研究室育ちの個人を使用する利点は、次世代の子孫を使用する場合、母性効果を避けることができることです。- (例えば、遺伝子発現に関する研究の) 大人の収穫続く chosentime 間隔中に特定の環境条件にフジツボを公開2。
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実験3遺伝子発現を研究する cyprid の幼虫、幼虫が同一条件下で栽培することができます制御の水槽、cyprids を配置します。
- ふるい (4.7 のステップで説明します) と、フィルターで指定された時間期間の後、cyprids を収穫し、下のプロトコル (手順 8) によると RNA を抽出します。
7. フジツボの郭清
- ラボ スペースを郭清と DNA のサンプリングを実行する、bothbefore をきれいにし、個人間解剖のすべてのツールを含みます。これは、ベンチ (または鉗子の 96% エタノール) に塩素を使用しています。
注: 固定メディア (エタノールまたは RNA 安定化ソリューション) を含むラベルのチューブは事前に準備されます。 - 大きくて短期飢えた個人 (か餌を解剖前に 2 日間) を選択します。(例えば細菌、藻類) 他の種からの汚染のリスクを最小限にし、水で洗い流して歯ブラシでフジツボ シェルをクリーンアップします。
注: 解剖前に個人の短期的な不足の理由 (例えば、腸内でアルテミア嚢胞から)、DNA の汚染を避けるためです。 -
均一な表面、パネルに接続されているまたは皿にルーズに個々 のフジツボを配置します。大人からそれぞれの組織を解剖します。研究の目的によって、フジツボを解剖するいくつかの方法があります。
- 郭清方法 a: 全体のフジツボを可能な限り迅速に修正します。
- パネルから、フジツボ下とパネル表面の近くにそれを挿入する、メスを使用して全体のフジツボを削除します。
注: ほとんどの場合、この操作の葉基底板したがって内部フジツボを与えず、ほぼ無傷。 - 慎重に鉗子 (図 3) を挿入することによって 1 つの側面に外側の殻を割る。これは、シェルの中の注視の中の侵入を容易にするため。
注: 試験管に、フジツボを配置する前に、シェルは全然壊れていない場合、それは遅い固定プロセスと後 DNA の劣った質につながる可能性があります。 - 壊れたフジツボを RNA ストレージ ソリューションまたはエタノールを含むテスト チューブに入れてください。その固定のため、少なくとも 24 時間のためのソリューションで、フジツボを残します。とき、フジツボを固定すると、動物を固定メディアの取り出しし、郭清トレイ上に配置できます。前後、マントル、相馬 (ボディ) を互いから分離し、さらに DNA または RNA の抽出のための個別のチューブに配置できます。
注: 受精卵で卵ラメラが、フジツボの中存在するかを観察することが重要です。存在する場合は、サンプルでは複数の遺伝子型が見つからないように DNA の抽出に進む前にこれら削除必要があります。
- パネルから、フジツボ下とパネル表面の近くにそれを挿入する、メスを使用して全体のフジツボを削除します。
- 郭清方法 b: その固定する前にシェルから、フジツボを削除します。
注: このメソッドが常にされません、calcareousshell の内側への取り付けは、サンプリングされるマントル。しかし、それは個人から DNA をサンプリングするための簡単な方法をすることができます。- それらを削除する tergal や scutal 板間鉗子の先端を挿入し、鷲掴みにして、プレートの引っ張って優しく剥離鉗子、tergal と scutal のプレート (図 3) を使用して慎重に取り外します。
- グラブはまっすぐ鉗子とプル、フジツボ、前後のホールドし、96% のエタノールまたは固定のためのソリューションを安定させる RNA に直接置いて.
注: 場合によっては、マントルもサンプリングされます同時に見られるように ( B. improvisus) で暗い色素沈着の薄い上皮として。そうでなければ、マントル メスを使用してシェルの内側から削除でき、その後、エタノールまたは RNA ソリューションを安定化に置かれました。
注: tergal と scutal プレート (そのまま) の場合乾燥して保存できる10種の同定に便利ですので。一般的な勧告は、種の疑いがある場合は、解剖を初期化する前に全体のフジツボはまた、写真することです。
- 郭清方法 a: 全体のフジツボを可能な限り迅速に修正します。
8 量的な PCR 用 RNA の抽出
- ソリューションを安定させる RNA に RNA の抽出に使用する大人、4 ° C で一晩 (最大 24 時間) それらを孵化させなさいし、-80 ° C で保存
注: Cyprid 幼虫が優先的にドライ ・冷凍、-80 ° C の後で直接 RNA なし cryotubes にそれらを配置し、簡単にチューブを水没 (30 s)-80 ° C で保存する前に液体窒素で - RNA の抽出時に、氷にフジツボを解凍し、それらをそのまま使用または使用される組織を分析 (手順 7 を参照)。
注: 個人 (地域のコーディングの ≈ 3-5% の変化間の遺伝的多様性のためAlm Rosenbladら、未発表データ) poola 大人の個体数のシーケンス後の qPCR 手順における個体間変動の影響を最小にすることをお勧めです。 - RNAextraction、2.8 mm のセラミック ビーズを含む均質化管に、RNA の準備キット付属の換散バッファーの 350 μ L を追加します。
注: セラミック ビーズは、RNA 超音波 (代表結果) と比較してのよりよい収穫を提供します。 - (全体または組織) 大人フジツボを取るまたは鉗子を使用して 20 の cyprid の幼虫の最小値を収集し、均質化のチューブに入れてください。
- ビーズミルと混乱と均質化に直接進みます。
- ビーズ エンドミル ホルダーのサンプルとビーズと均質化チューブを入れてください。それらを振る 4.0 m/s の周波数を持つ 20 s. クールな氷の上の 1 分のサンプル。2 倍を繰り返します。
- 市販の RNA 分離キットのプロトコルに従って RNA を準備します。
注: リスク評価 (安全データ用紙の読み取りを含む) はヒューム フード、手袋 (は例えばを含むその他の防護服の使用を必要とする有害化学物質を識別するために RNA 抽出方法を使用する前に実行する必要があります。RNA 抽出時に添加 β-メルカプトエタノール換散バッファーの実行すべきヒューム フード)。 - RNA を定量化します。実用的なソリューションを準備し、標準とサンプルを 200 μ L の総ボリュームに追加渦 2-3 秒のためにそれらとインキュベートそれら 2 分挿入管、蛍光光度計に測定値を取る。
- 分光光度計, とすべての蛋白質の汚染のための RNA のサンプルと自動電気泳動システム (代表結果) の RNA の整合性をチェックします。
注: 質の良い準備のため RNA に勧め比 260/280 nm 2-2.2 と 1.8 程度の DNA の。蛋白質汚染し最適化する抽出プロシージャでは、低い値を示します。
9. 遺伝子発現: cDNA 合成と qPCR
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QPCR の cDNA を作る前にすべての remainingDNA を削除する得られた RNAwith DNase を扱います。
- CDNA を準備するときない逆転写酵素が RNA サンプルを追加することによって genomic DNA の汚染をチェックします。せず逆転写酵素 cDNA の選択した遺伝子の PCR 増幅、DNA、RNA の汚染があります。
注: サンプル RNA シーケンス (次世代シーケンシング技術を使用して RNA 配列) に使用する、DNase ステップは重要度の低い。特に、RNA の低レベルでのサンプル、DNase ステップは失うために省略されます過程で RNA のあまり。
- CDNA を準備するときない逆転写酵素が RNA サンプルを追加することによって genomic DNA の汚染をチェックします。せず逆転写酵素 cDNA の選択した遺伝子の PCR 増幅、DNA、RNA の汚染があります。
- 商業 cDNA 合成キットが通常、使用、少なくとも 50 ng で指定した範囲内で RNA の量を使用して DNase 処理 RNA の cDNA 合成を実行します。
- 彼らは個人間のシーケンス id が、可能な限り高い遺伝子 paralogs 間シーケンス id ができるだけ低い興味の遺伝子の部分にアニール、qPCR プライマーを設計します。特定のプライマー対 Na+の遺伝子発現研究のための対応する出版物を参照してください/K+ ATPase3とアクアポリン2 (図 5)。
注: この目的のため cyprids の何百ものまたは複数の大人からの RNA シーケンス シーケンス データを使用することができます。 - (例えばアクチン) 発現レベルの正規化に使用する遺伝子のためのプライマーを設計します。アクチンの正常に使用されるプライマーは、前方: 5'-CATCAAGATCAAGATCATCGC-3'、および逆: 5'-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'。
注: アクチンは一般的に使用される制御遺伝子であります。しかし、他の人も参照として提案およびテストされたうちフジツボ19。アクチン、ほかの参照として RPL8、36B4、EF1 は、NADHd1 の使用は、テスト3をされています。相馬、前後、大人、または cyprids の間それぞれの関連遺伝子の発現レベルに大きな差がないことが示唆されました。 - SYBR グリーン、dNTP、ポリメラーゼ、前方および逆のプライマーの 0.3 μ を含むミックス (通常は 0.25-50 ng の範囲) cDNA の増加する量を追加することによって設計されたプライマーのアニーリングの温度を最適化します。
- 異なる熱処理温度で qPCR プロトコルを次のように実行: 95 ° C、3 分、20 95 ° C の変性のステップの初期変性温度アニーリング 20 55-63 ° C の温度、s s、および 30 のための 72 ° C 伸び s。合計では、40 の PCR のサイクルを実行します。
注: プライマー効率 90-105% の範囲にある必要がありますおよび E として計算されます = (10^(-1/slope)-1) サイクルしきい値 (Ct) 値に対して cDNA 濃度のログの値をプロットするときに得られる曲線の傾きの斜面のある x 100。 - QPCR 通常 1-10 ng、見つかった最適な熱処理温度と手順 3 で説明した PCR のプロトコルを使用して cDNA の適切な量を使用してを実行します。
注: cDNA の多量は、非常に低い金額で表現される遺伝子の使用だけです。
Representative Results
B. improvisusの大人のフジツボの養殖の説明手順、ノープリウスの 4 つのバッチまで幼虫を生産する週。ほぼ毎晩、ノープリウス幼生を収集するために可能になるより多くの人々 とインフラストラクチャが必要です (、親魚に多くフジツボと文化がリリース幼虫継続的に)。幼虫用追加の制限要因は、特に珪藻Skeletonemaに関する高品質の飼料の可用性に表示されます。最大限に、養殖のシステムからそれぞれのバッチは、約 12,000 の給餌は、1 週あたりの 50,000 の給餌まで培養することができますのでで構成されます。ただし、いくつかの週間可能性があります 10 倍少ない幼虫まで。単一の大人日14、大人 1-2 名各バッチの幼虫を発表していることを意味するあたりまで 7,000 幼虫を作り出すことができます。週間以内決済試金および分子研究に使用できます (1 週あたり約 30,000 cyprids を最大限に降伏) cyprids に収集された給餌の約 70-90% がいきます。
それはバッチ、間 cyprid 機能の変化があることを強調する必要があります、一般的には、バッチ内でより大きなバッチ間のバリエーションがあります。たとえば、決済の試金でセトリング成功 30、異なるバッチ 70% 間で異なります。ほとんどの場合、これは別のサンプリング期間中に幼虫を解放する大人の特定の組の個々 の遺伝的変異によるです。もちろん、結果についてのより一般的な声明を行われる場合に繰り返し実験 (生物的複製) がバッチの数から cyprids を含める必要があることをお勧めします。バッチごとに変化は、適切なコントロールと遺伝子発現研究に正規化する必要があります適用する実験的なデザインの要求を置きます。しかし、いくつかの統計の正規化手順が実装されている後でさえもかなりバッチ間の変動を減らすこと、バッチのいくつかの効果は、通常、まだ明らか (未発表データ)。
指定されたプロトコルに従い、平均すると、500 を取得することが可能だとして 20 cyprids、フジツボ決済 (表 1) のステージに関係なくから高品質の RNA の ng。RNA の品質は通常、(2 つのピークの予想される位置は図 4に示される) 18 と 28 のピーク間の比率として測定されます。フジツボおよび他の多くの節足動物の場合 28 s rRNA (解析手法の一部) として加熱すると分解し、18 歳ピーク20と共に移行します。だからこそ、そこは原則、フジツボの分析のこのタイプの 1 つの単一 rRNA のピークです。このテスト (図 4) セラミック ビーズによる均質化が RNA は、最高の整合性とは、したがって、任意のメソッドから明らかです。RNA は、7000 万の読み込み (読み取り、数コースのシーケンス中に多重のレベルに依存) サンプルごとの平均の量と高品質シーケンス、シーケンス処理用ライブラリを生成する品質で十分です。RNA の量で多数の遺伝子の cDNA 合成と qPCR 発現解析の十分ですも。
図 5結果を示します qPCR 解析からアクアポリンと Na+/K+ ATPase (NAK1) スプライスの変形、環境手がかり2,3の変化に応えて発現変動を調べた。長いのと短いの相対的な表現の比較はスプライス NAK1 ショーの二重は短い NAK (図 5A) に関連して低塩分の長い NAK1 mRNA の増加の亜種。したがって、データは、選択的スプライシング、長い形式により低塩分条件下で優勢なを示しています。アクアポリン、場合差分式 (図 5B) を 2 つの水を運ぶ paralogs AQP1 と AQP2 に表示は明らかです。特に、マントル組織でそれは明らかですが、AQP1 低塩分で大幅にダウン規制 AQP2 を見られない。代わりに、AQP2 は、低塩分でが、相馬、わずかに増加した式を示します。これらの調査結果は、別の機能の役割の調査のための基盤を提供B. improvisusイオン輸送体とフジツボの浸透圧調節におけるアクアポリン。
図 1: プロシージャおよび成人における遺伝子発現研究の RNA の抽出を養殖全体の概要。新しい文化を開始するためパネルはフレームにアタッチ、1-3 m の深さの海に展開します。数週間後、成人/少年とパネルは研究室でトレイのラックに垂直方向に配置されます。各トレイは、大人で約 40 のパネルを保持しています。合計 ≈ パネルあたり約 100 大人とは、4,000 のアダルト個体がトレイごと培養です。大人のフジツボがアルテミアにうんざりし、保つことができる年の周り。ノープリウス幼生は、トレイを介してふるいをフィルタ リングから、週何回か収集されます。収集の給餌は、26 の ° C の水浴中で、微細藻類にうんざりのバケットに転送されます。給餌は、フィルタ リングによって集めた非給食 cyprids に脱皮するまでに飼育されています。新しいパネルを研究室で確立するの解決 cyprids パネルにどちらかを提供し、今年の新しいパネルに-文化の周りや外部の変更の条件で特定の実験のセットアップに使用します。RNA が少年/大人実験の終わりにまたは特定の時点から抽出されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 養殖のいくつかの重要な手順のイメージ。(A) このイメージ フィールドから新しい個体群を収集するためのパネルとフレームを示しています。(B) この画像は、トレイに配置されているラックにB. improvisusの大人のフジツボとパネルを示します。パネル約 2 cm 間隔で設置されます。(C) この画像は、パネルと左に飼料タンク、フジツボとトレイを示しています。各トレイからは、ノープリウス幼生のコレクションのためのふるいの配置場所のコンセントです。(D) この画像は、アルテミアの生産は大人のフジツボのフィードを示します。(E) この画像は、バケット 26 ° C に設定水浴の配置における飼育を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 大人のフジツボの初期解剖手順の説明: その殻から体を削除します。(A) 一方の開口部を通して優しく鉗子を挿入して蓋板をつかむ。プレートを削除し、動物を公開して丁寧に引き抜きます。(B) 相馬部分、前後のすぐ下を掴んで動物を引き出します。(C) このパネルは、ドングリ フジツボの全体的な構造を示しています。マントル ・ (卵巣) の可能性がある受精卵体が引っ張られるとき貝キャビティの滞在します。フジツボ解剖学に関する一考察 (より詳細なアカウント ・ アンダーソンを参照してください)9: フジツボの壁板が内側に傾斜し、一緒に、彼らは火山のような円錐形を形成します。開口部、開口部はドアや開口部を閉じるに蓋を形成する 2 つの蓋板で覆われています。ドングリ フジツボ一般; 下地にしっかりと接着されている石灰質基底板があります。フジツボのいくつかの種は、石灰質 (例えば、 S. balanoides) プレートを欠けています。フジツボは、暗色のマントル (甲) から骨格を分泌します。二層マントルの外側の表面は硬直しながらマントルの内部の表面はない石灰化、柔軟なために石灰化します。開口部の内側、前後引っ込んだ位置に存在しています。これらは懸濁液を供給するためフジツボを使用して胸部付属肢です。卵巣は、精巣が、相馬にあるフジツボ、麓近くに位置しています。この図は、Panovaらから採用されています21スプリンガーの許可を得て掲載されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: キャピラリーゲル電気泳動による rRNA 整合性の定量します。2 つの異なる均質化法により調製した RNA: 超音波処理 (A) と (B) セラミック ビーズ。フー、y 軸の単位は、蛍光ユニットの略です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 遺伝子発現の浸透圧調節に重要な遺伝子の 2 つの異なる研究から結果b. improvisus. (A) このパネルが差分式を示します/K+ ATPase NAK1さまざまな塩類および pCO2への応答でレベル3の Na+のスプライスバリアントの qPCR によって測定されました。低塩分治療長いアイソ フォーム (NAK1 L) の式はショートを基準にして増加する (分散分析, P 0.001 <)。(B) このパネルは、さまざまな塩類が2への露出の間にB. improvisusの大人のアクアポリンの発現を示しています。qPCR はアクチンに対するアクアポリンの発現レベルを決定するために使用されました。成虫 3 塩分が異なる (3、20、および 33 PSU) で 14 日間培養。RNA の準備のため、相馬、スィアライ、および大人のマントルが分離しました。両方の図には、エラーバーは標準偏差を示します。* * と * * * (ANOVA) の有意水準を示す 0.01 と 0.001、それぞれ。これらの数字は、リンドらから変更されています。2,3。 両方の数字は PLoS 1 の許可を得て公開されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 集落フェーズ | RNA (ng) の合計額 |
| フリー スイミング | 512 |
| 探査: 検索窓を閉じる | 518 |
| 添付 cyprid | 550 |
| 新しく少年変成 | 832 |
表 1: RNA の収量。このテーブルは、決済プロセス中にさまざまな段階で 20 cyprid 個体のプールからの RNA の準備キットで抽出した RNA 量を示しています。
Discussion
Tjärnö 海洋研究所 (スウェーデン) にフジツボ文化は 20 年以上されていると、多くの異なる分野で研究に使用されています。30 以上の科学論文が発行されている研究を含む防汚13,22, 流体力学23, 化学生態学24年間養殖システムを利用して、気候変動16、進化生物学5、および分子生物学2。
研究室環境 (野生の母集団を代表できない場合があります個人) により適応している特定の個人の選択を避けるためには、毎年フィールドから新しい親魚を収集するためにそれをお勧めします。さらに、通常の年の間にほぼ成人の死亡率の 50-80% があるので毎年、文化を活性化させることをお勧めではまた。しかし、目的は自殖系統実験進化の研究を設定するか、飼育の家族だけは使用されるが。
Tjärnö 海洋研究所パネルB. improvisusを収集する良い時間を当時の海で cyprid 幼虫の十分な供給があるため 6-8 月です。他を手動で削除して起動時にフジツボ決済毎週パネル解決b. improvisus (例えば、ムール貝、アステラス製薬、コケムシ、ヒドロ、nemerteans/隊、他のフジツボ種) より種をチェック、パネル (例えば歯ブラシで)。Tjärnö、周り 3 浅瀬のフジツボの種 (B. improvisus Semibalanus balanoides、タテジマフジツボ crenatus) があります。7 月-8 月に支配的な滑らかなハード面の行うことはB. improvisus です。S. balanoidesその決済期間は早いばねの間に、主に天然物 (例えば石) を好みます。B. crenatusは、夏の間にパネルの低い数字で発生します。
また、培養の cyprids、特定の特徴を持つ特定の linages が確立されている場合に必須になる、または実験進化学大人のフジツボの新しい世代を開始することが可能です。大人の新世代を開始する最も便利な方法は、研究室では、熱可塑性樹脂パネル cyprids を解決することです。新規入植 cyprids でこれらのパネルは、実験的治療またはフィールドの露出のためにも使えます。緊急の場合、1 つは、近隣のサイト (例えばTjärnö の海洋研究所の場合 Idefjorden) B. improvisusは共通から岩に大人も使用できます。これらの既に確立された大人はこのようにトレイに置かれているパネルの大人と同じように扱われを介してフローを介してシステムを供給します。フローセルは、フジツボ25パネルを確立するも使用できます。これらは、フロースルー プランクトン ネットを cyprids 我慢しないでください、幼虫の唯一の解決の表面板と側面が付いている部屋です。
すべてのライフ ステージを含む長期的な機能しているフジツボ文化を設定するために重要ないくつかの手順があります。B. improvisusの文化に使用するメソッドは、おそらく、大部分は、自由遊泳、planktotrophic 幼虫とその他の海産無脊椎動物にも対応します。養殖のいくつかの種は、すでによく手順 (例えばムール貝、カキの種)26、他の海産無脊椎動物のために彼らの一生にわたる長期的な文化の例がありますサイクル。文化フジツボ (B. アンフィトリテ) 最初の成功した試みの一つが Rittschofらによって行われていた15. 長期的な財政および個人的なリソースは、フジツボの養殖施設の設定を検討する前に場所でする必要があります。年のこの種のメンテナンス-フジツボ周り文化は少なくとも 1 人作業半分時間を必要とします。主に微細藻類27の養殖、生産ラインでいくつかの手順の将来の自動化のいくつかの可能性があります。さらに、成功するために質の高い海水の大量にアクセスを持つことが不可欠です。フジツボ、アルテミア、微細藻類の培養は、特定の安全手順を含まない。ただし、いくつかの防汚物質や有害化学物質のテストは、特別な予防策を必要があります。
パネルは、汚染のため週に数回をチェックされました。文化で使用される海水は、コスター フィヨルド Tjärnö 海洋研究所の外に 40 m の深さから汲み上げは、ラボの水システムに入る前に 2 つの砂フィルターを通して渡されました。水のフィルター処理が行われてない場合文化ではるかに多くの汚染があります。定期的にデトリタスやフィールドから海水の供給を介してシステムに入力 (例えば、匐枝建物ヒドロと捕食 nemerteans) その他の無脊椎動物からの文化でパネルをきれいにすることが欠かせません。たとえば、にもかかわらず、幼虫が生成されない文化が十分に供給しそれ以外をされているという事実は、良好な状態にするよう交尾を阻害するために表示される nemerteans の存在の問題かもしれない。当然、Tjärnö 海洋研究所文化における汚染の生物の多くは、スウェーデンの西海岸の特定、他の種類の生物を汚染が流行して他の地域での挑戦の多くであります。スウェーデンの西海岸、珍しくパネルに他のフジツボの生物に汚染を見つけること。時折、 S. balanoidesの確立が発見されているが、これは非常に限界の問題 (せいぜい、1 S の balanoides汚染 10,000 b. improvisusサンプルのため)。種を汚染することの欠如が最も可能性の高い優占 larvaefrom B. improvisusの頃、夏の間に新しい文化を確立する体制に依存していた。さらに、またあったパネルB. improvisusの明確な濃縮この種は滑らかな表面の13の選択なので。
死んでいる大人のフジツボを必ずしも削除する必要は。空のシェルは、パネルに残っている、彼らは避難所アルテミアノープリウスおよび様々 な混入種の両方になります。さらに、死亡個体隣接する分解中に有毒な化合物のリリースでおそらく個人の幸福に影響を与えることが注目されています。成人の死亡率の追加結果はいくつかの個人が (にもかかわらず、フジツボは、そのサイズに関連して動物の世界最長の陰茎を持っている) 交配を許可する他の大人から一人で、あまりにも遠くで残される、28。これらの個人は存続するが、幼虫のための生産的です。しかし、これらの孤独な大人個人ベース プレートを傷つけることがなく優しく削除できます、交尾を有効にする他の人の近くに水平方向に配置します。フジツボもそれぞれ大人 1 人とパネルを配置することで合致することができますが、受精が発生することが、十分に近い。このように、遺伝子のラインは作り出された14をすることができます。
高品質のフィードを作成してほぼ毎日文化を養うために重要です。食べ物がなくてもあっても数日は、幼虫のリリースが減少で起因できます。飼料組成の前のテストは、珪藻成長と給餌フジツボの生存に不可欠であることを示しています。いくつかの珪藻種見えるとして適切なフィード、小規模または孤独な細胞 (直径未満 10 μ m) 給餌の摂取の必要がありますが。S. marinoi c. 単信、 t. pseudonanaの種すべては適切なフィードB. improvisus給餌のためだけでなく、栽培が簡単に証明しています。さらに、飼料の品質は指数関数的に成長している藻類のため一般的に高いです。また、珪藻がB. アンフィトリテ15の生産的な文化を確立するために不可欠であることが報告されています。珪藻の重要性の理論は彼らがユニークな脂肪酸プロファイルを持っている、20:5 の高度不飽和脂肪酸29で特に豊富。それが示されてきた特定の脂肪酸がオイスター幼虫30の開発に成功のために重要です。
年間で、フジツボ文化の有害な病気の発生率がされてないです。カキとムール貝のような多くの商業無脊椎動物漁場に病気はなく一般的で、非常に有害な場合があります。ウイルスの有害な影響は、野生の個体群からも報告されています。フランスでネイティブのオイスターは、1925 年に、ポルトガル オイスターマガキ angulataと取替えられたが、この種は 1970年31周りイリドによって一掃されました。最近では、太平洋のカキ、世界中の文化で ostreid ヘルペス ウイルス 132に関連する表示されるマガキで大規模な死亡イベントがあった。フジツボにウイルスや細菌、病原体の報告は今のところ発表されていません。しかし、 b. improvisusの継続的なゲノム プロジェクト、ウイルスの配列が見つかりました (Alm Rosenbladら、未発表データ) が病気の症状に明らかなリンクがないです。抗生物質の混合物は、細菌感染症のリスクを最小化する文化に以前適用されています。ただし、この手順が放棄され現在、これまでのところ、これが汚染問題を生じない。
(前述) に海水を加熱すると、過熱と文化生産ラインで最も深刻なリスクがあるかもしれない。もちろん、センサーと適切な警報システムが使用される (例えば、責任者に電子メールまたはテキスト メッセージを送信) ありますが、過熱を防ぐためには困難です。過去にこの種の事件は文化で大人の実質的殺害しました。もちろん、壊滅するし、時間とお金の長期的な投資を台無しにするこのできます。特に、これは近交系の遺伝子のラインが確立されている場合は致命的となります。そのようなラインの寿命を確保し、彼らは偶発的な損失から保護、フジツボの凍結保存方法を開発することが望ましいこと。それは太平洋のカキから幼虫のダウン凍結および部分的な成功33で復活できることを報告されています。Cryobanking はまた、幅広い種34の遺伝資源を維持するために貴重なツールをされています。B. アンフィトリテからも給餌は凍結35、生き残るために報告され、凍結ダウン個人の 20% が正常に cyprids36に変成することがわかった。しかし、文化の長期的な持続可能性のための凍結を適用することは今のところ採用されていないが、これは確かに選択した線の維持のため必要これは強力な海洋 modelsystem にB. improvisusをしっかりと確立するための重要なステップになります。
ここでは、プロトコルは、 B. improvisus (すなわち前後、相馬、マントルピース) の大人から様々 な組織の郭清に対して贈られました。ただし、他の組織が抽出もできますそれ強調する必要があります。例えば、軟膜ベース種クロフジツボ スギついての外装と内部マントル間慎重に分離され RNA の抽出および遺伝子表現37の RNA シーケンス解析に使用します。ここで説明した最適化されたアウトラインの抽出プロトコルは、開始材料の最小量からシーケンスの高品質 RNA の十分な量を提供します。まず、均質化管に直接個々 の幼虫のコレクションは、1 つの管から別の転送中に任意の損失を最小化します。さらに、テストのさまざまな方法の中で、RNA の点で最も効率の良いをもたらすことを証明したセラミック ビーズと超音波または杵の均質化と比較して整合性が均質化。遺伝子発現やゲノム解析実験を計画するとき心に留めて、フジツボの高い遺伝的変異の挑戦、少なくともB. improvisusのあること。フジツボは、コード領域 (Alm Rosenbladら、未発表データ) でも、3-5% の範囲、遺伝的多様性。これはもちろん、qPCR 解析のためのプライマーの設計に特定の要求を置きます、領域の識別し一貫性のある表現の結果 betweenbatches を得るためにプライマーのためのテンプレートとして使用する必要があります保存より。標的遺伝子の節約された地域アクアポリンと Na のような + K + Atpase, cyprids を含む個人の何百もの集団から得られた RNA シーケンス データのこれらの遺伝子の順序の変動を研究することによって識別できます。ゲノム解析のため DNA がサンプリングされます。ただし、 B. improvisusから高品質の DNA を取得することができます挑戦する21。
結論としては、確立されたフジツボ文化は、さまざまな種類の実験的研究に尽力する証明されています。特に、すべての年周り幼虫生産は、天然の産卵期間に制限されることがなく実験を実施する私たちをことができます ( B. improvisus、これは、夏の間に)。得られた幼虫は、幅広い決済アッセイ、動作の試金、特定の遺伝子の表現研究ゲノム ・ トランスクリプトーム研究などの実験的研究を実行する使用できます。
Disclosures
著者申告するものがあります。
Acknowledgments
この研究は、アンダース ブロームベルクにスウェーデン研究評議会 (VR) および EU のサポートされているプロジェクト海岸から 2017-04559 助成金によって支えられました。特に、養殖施設の設置、年間で、支えられている補助金 r. ジョンソンあたりに次の資金調達機関から: SSF (スウェーデン戦略研究財団) プログラム海洋科学と技術と船舶用塗料・ プログラムを通じてミストラ。ケント ・ ベルントソン、culturingfacility のセットアップの初期段階に尽力しました。さらに養殖施設は海洋の進化生物学 (www.cemeb.science.gu.se) の中心部から来ている確立のための資金であるスウェーデン研究協議会 FORMAS と VR からリンネ助成します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plexiglas (poly-methyl methacrylate) panels | Plastic produkter, Bromma, Sweden | transparent glas | |
| 1.5 L PET bottle | |||
| Artemia | INVE Aquaculture, Belgium | We have tested different companies; this is really the best one | |
| Skeletonema marinoi (CCAP strain 1077/5) | CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland | strain 1077/5 | |
| Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP strain 1085/3) | CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland | strain 1085/3 | |
| Millipore cartridge filter system | Millipore | ||
| cartridge with a nominal pore size of 0.2 µm | Millipore | cartridge CWSS01S03 | High capacity for large volumes |
| polycarbonate bottle | Nalgene | autoclavable | |
| RNA later | Qiagen | 76106 | Fixation solution to preserve RNA |
| TURBO DNA-free Kit | Invitrogen/Thermofisher Scientific | AM1907 | DNAse kit to remove DNA from prepared RNA |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Biorad | 1708890 | cDNA synthesis kit |
| SYBR Green supermix | Biorad | 1708880 | Dye for QPCR |
| RNeasy minikit | Qiagen | 74104 | RNA extraction of adults or many cyprids |
| Soft tissue homogenising CK 14, 2 ml tubes | Precellys | KT03961-1-003.2 | Ceramic beads for homogenisation |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | RNA extraction of few cyprids |
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