Summary
따개 비 (Amphibalanus) Balanus improvisus osmoregulation 및 antifouling 공부에 대 한 모델입니다. 그러나, 자연 계절 산란 cyprid 애벌레의 예측할 수 없는 공급을 생성합니다. 여기, B. improvisus 의 모든-1 년-라운드 경작에 대 한 프로토콜 설명, 애벌레의 생산을 포함 합니다. 유전자 표현 연구에 교양된 barnacles의 사용을 보여 줍니다.
Abstract
Barnacles는 고착 성인 해양 갑각류 그리고 free-swimming, planktonic 애벌레. 따개 비 Balanus (Amphibalanus) improvisus 낮은 염 분에 극단적인 관용 때문에 특히 관련 osmoregulatory 메커니즘의 연구에 대 한 모델 이다. 그것은 또한 널리 antifouling 연구에 관하여 특히 생물학, 정착의 모델로 사용 됩니다. 그러나, 자연 계절 산란 연구 cyprid 애벌레의 예측할 수 없는 공급을 생성합니다. 프로토콜 개발 되었습니다 B. improvisus 의 모든 연중 재배 및 모든 상세한 설명 단계 생산 라인에 대 한 설명입니다 (즉, 패널, 컬렉션의 양육에 성인 문화의 설립 따개 비 애벌레, 그리고 성인과 애벌레에 대 한 피드 관리). 설명 또한 문제 해결에 제공 하 고 중요 한 매개 변수 (예를 들어, 오염 제거, 양질의 사료 생산, 필요한 인력 및 높은-품질 바닷물의 중요성)에 대해 설명 합니다. 자란 시스템에서 각 일괄 처리 극대로 대략 12000 nauplii 있고 주 당 거의 50000 애벌레까지 생성 될 수 있다 그래서 일주일에 4 개의 일괄 처리를 제공할 수 있습니다. 문화 B. improvisus 에 사용 되는 방법, 아마, 대부분은 또한 무료 swimminglarvae와 다른 해양 무척 추 동물에 적용입니다. 프로토콜은 다양 한 조직의 해 부에 대 한 유전자 발현에 대 한 연구에 대 한 높은-품질 RNA의 생산 뿐만 아니라 성인에서 되 게 됩니다. 그것은 또한 설명된 어떻게 교양된 성인 그리고 reared cyprids 다양 한 외부 요인에 관하여 유전자 발현을 조사 하기 위한 실험 설계에에서 이용 될 수 있다. 유전자 발현에서 교양된 barnacles의 사용은 나+의 가능한 osmoregulatory 역할의 연구와 함께 삽화가 /K+ ATPase 그리고 aquaporins.
Introduction
Barnacles는 고착 성인 해양 갑각류 그리고 free-swimming, planktonic 애벌레. 대부분 1, 200 종의 barnacles의 얕은 물에 서식 하 고 많은 종종 낮은 염 분에 노출 되는. 1 종, (B. improvisus), Balanus (Amphibalanus) improvises 베이 따개 비 거의 민물 용납 수 고 찰스 다윈 우루과이1리오 데 라 플라타의 강어귀에서 작은 개울에서이 종 설명. 극단적인 관용 tolow 염 분은 B. improvisus osmoregulatory 메커니즘2,3의 연구에 대 한 특히 적합 모델. 이 따개 비 소금기 조건을 선호 하지만 약 1.6 psu에서 salinities와 함께 바다에 살고 있는 수 40 psu4로 높은. 그것은 소금기 있는 발트 해에서 발견 하는 유일한 따개 비 종입니다. B. improvisus 은 미국 대륙의 동해에서 발생 한 것으로 생각 하지만 오늘 발견 된다 분산으로 인해 전세계 배송5. 그것 주요 오염 유기 체와 바위, jetties와 보트 선체에 일반적으로 발견 되 고 따라서 해양 고 소금기 있는 물6,7건축에 미생물 파울 링의 메커니즘을 이해 하기 위한 일반적인 관심의.
마찬가지로 다른 대부분 barnacles, B. improvisus 는 십자가;와 자웅 동체 복제는 길쭉한 성 기 및 내부 수정을 사용 하 여 인접 개인 사이 짝짓기를 통해 발생 합니다. 생식 기간은 주로 5 월에서 9 월입니다. B. improvisus 는 7 원양 애벌레 단계 (6 nauplii 한 cyprid 단계8다음). Nauplius 애벌레 free-swimming 이며 비 먹이 cyprid 유 충으로 탈피 하기 전에 몇 주까지 물 열에 피드로 수정 란 해치. cyprid 정착에 적합 한 사이트를 찾을 수 여러 단서를 사용 하 고 무 청소년 따개 비9로 변 태를 겪 습. 종은 실험실에서 경작 될 수 있으며 바다 (실험실 문화에서 2-3 년)에 1-2 년의 수명이 있다. 평균, B. improvisus (최대 약 20 m m)로 지름 10 m m를 성장 하 고 (비록 그것은 붐비는 조건 하에서 키가 성장할 수 있는) 약 6 mm의 최대 높이 도달. 종 수 쉘 접시의 방사형 패턴된 석탄 기지와 tergal 접시1,10의 모양 부드러운 석도 껍질 (흰색 또는 회색 빛이 나)으로 식별.
따개 비 B. improvisus 를 위한 osmoregulation, 분자 및 생리 적 메커니즘 뿐 아니라 생태 상호 작용 및 진화 결과에 초점을 맞춘 연구 모델로 여러 유리한 특징 있다. 그것은 또한 널리 antifouling 연구과 메커니즘 관련된7,11,,1213특히 생물학, 정착의 조사에 대 한 모델로 사용 됩니다. 그러나, 자연 계절 산란 연구 cyprid 애벌레의 예측할 수 없는 공급을 생성합니다. 1 년 내내 그것의 전체 수명 주기를 통해이 따개 비를 문화 능력은, 그러므로, 분자와 기계 론 적인 연구의 다양 한 형식을 사용할 수 있도록 하는 주요 자산. 또한, 전세계 해양/소금기 있는 바닷물의 존재 필드와 실험 연구의 조합 수 있습니다. 제어 번 식도 장기 자란14, 알려진된 혈통의 가족을 만들 수 있습니다 그리고 몇 개월의 세대 시간 장기 실험적인 발전을 허용할 수 있습니다. 또한 있다 초안 게놈 및 여러 transcriptomes 사용할 수 있는, 그리고 이러한 리소스 여러 유전자 (예를들면, osmoregulation에 있는 중요성의 유전자)2,3의 복제에 대 한 사용 되었습니다.
이 프로토콜의 목표 고 성인 또는 애벌레의이 유기 체에 유전자 표현 연구를 수행 하기 위해 연중 따개 비 B. improvisus 의 문화를 유지 하는 방법을 설명 하는 것입니다. Rittschof 외. 15 는 짧게 barnacles nauplii의 출시에서 Balanus amphitrite종족에 대 한 cyprids의 타협을 경작 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 B. improvisus Tjärnö 해양 연구소 (스웨덴)의 모든-1 년-라운드 경작에 대 한 적응 되었습니다 및 생산 라인의 모든 단계에 대 한 자세한 설명이 나와 있는, 따개 비의 양육 및 생산을 포함 하 여 애벌레, 뿐만 아니라 성인과 애벌레에 대 한 피드 관리. 완전 한 절차의 개요 그림 1을 참조 하십시오. 자란 시스템을 사용 하 여 몇 가지 일반적인 실험 설정 함께 exemplified 이며 나+의 기능 유전체학 연구에 /K+ ATPase 그리고 aquaporins elucidating osmoregulation2, 그들의 가능한 기능 3. 그것은 때로는 필수적인 특정 조직에서 유전자 발현을 검토 하 고 따개 비 해 부의 기초의 일부 적용 됩니다. 높은-품질 바닷물의 좋은 공급, B. improvisus, 따개 비 그리고 다른 잠재적으로 많은 종의 경작 가능 해야 세계 해양 연구소.
Protocol
1. 새로운 Broodstock 시작 필드에서 성인 Barnacles의 수집
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열가 소성 플라스틱 (폴 리 메 틸 메타 크리 레이트) 투명 패널 (1.5 m m3x 110 x 110) ≈에 1-3 m 깊이 잔잔한 필드에서 성인 barnacles를 수집 하기 위해 배포 합니다. 여러 패널 (그림 2A), 걸릴 수 있습니다 사용 하 여 프레임 각 패널 및 attachthepanelstotherackusingcableties의 위쪽 모서리에 2 구멍 (직경 6 mm)을 드릴. 따라서, thepanelswillhangverticallyin는 물입니다.
- Barnacles의 정착 (패널에 작은 흰색 하드 점으로 확인 된) 발생 때, 적어도 2-3 주에 barnacles 큰 있는지 확인 패널을 두고 충분 한 (5mm) 건조 또는 손상 없이 실험실에 전송.
- 때 그들은 캘리포니아의 크기에 도달 했습니다 정착된 B. improvisus 덮여 있다 실험실에 패널을 가져. 5 mm indiameter입니다.
참고: 필드에 5mm를 개발 하는 성인을 위한 시간 높은 음식과 온도의 가용성에 따라 달라 집니다. 일반적으로,이 Tjärnö 해양 연구 실험실에서 약 3 주 소요 (58.87 ° N, 11.14 ° E). 가장 일반적으로, 새로운 broodstock 패널은 일반적으로 6 월 하순에 배포 하 고 8 월 말에서 수집. - 문화 시설에 패널을 도입 하기 전에 패널에서 다른 유기 체를 청소. 그것은 가장 다른 따개 비 종 제거 하는 것이 중요입니다. 이것은 크게는 broodstock의 생존의 기회를 증가 하는 때문에, 경작 하는 동안 종 오염 제거 패널을 자주 청소 하는 것이 중요 note 하시기 바랍니다.
- 폴 리 에틸렌 트레이 (20 m m3x 400 x 400)에서 가공 된 홈 스탠드에 가장자리에 패널을 수직으로 배치 (그림 2C 및 2E). 스탠드에 홈 15 m m 떨어져 있습니다.
- 트레이 준비 하기 위해 각 용지함의 반대 측에 기지 입구 포트와 출구 포트 상단에 확인 합니다. 포함 된 약 30 L 물 20 ° C에서 오픈 해 수의 입력부와 ca의 속도에서 흐름 통해 있도록 100 L 저수지에 각 용지함의 입구 포트를 연결 합니다. 분 당 2 L입니다.
참고: 8 쟁반까지 단일 100 L 저수지에 연결 했다. - 해 수 온도 제어 (20 ° C) (예를 들어, 들어오는 바닷물에서 열 교환 열 펌프에 의해 제공)을 100l 저수지를 연결 합니다.
참고:는 따개 비 B. improvisus 성장 하 고 전체 해양 염 분 (30-35 psu);에서 재현 그러나, ca에 염 분 감소. 100 L 저수지에 민물을 추가 하 여 25 psu 문화에서 애벌레의 출력을 증가 시킵니다.
2. 교양된 Cyprids에서 어른 들의 새로운 세대를 시작
- 열가 소성 패널 상단에 오픈 테이 핑 5 패널 함께 비 독성, 방수 테이프를 사용 하 여 큐브를 생성 합니다.
- (누설)의 경우 작은 쟁반에서 큐브를 놓고 바닷물 (25 psu)와 그것을 채우기. 실 온에서 물을 유지 (ca. 20 ° C). 큐브의 상단에 대략 200 cyprids를 추가 합니다.
- 먹이 청소년 100 mL Skeletonema marinoi 의 매일 (단계 5 참조) 큐브에 있는 동안.
참고: 청소년 barnacles Artemia 살 리 나 를 복용 함께 어려움을 가질 수 있습니다 (3 단계 참조) 그들은 크고, 따라서, 새로 정착된 따개 비에 대 한 소화 하기 어려운. - 주 x 물 1을 변경 합니다.
- 2 주 후 때 패널 포함 적어도 5 mm 직경에서의 충분히 설립된 청소년, 큐브를 분해 흐름-throughseawater와 함께 쟁반에는 청소년으로 패널을 이동 고, 그 후, A. 살 nauplii에 barnacles 피드.
3. 문화 Nauplii Artemia 살 리 나 의 Barnacles 성인에 대 한 피드
- 어디는 bottomis 고 병 서에 거꾸로 하 고 측면에서 조명 배치는 1.5 L 플라스틱 병을 사용 하 여 A. 살 리 나 에 대 한 자란 시스템을 설정 합니다. 실리콘 튜브에 병목을 클램프를 맞지 고 폭 기 펌프 (그림 2D)에 연결 합니다.
- 계란 해치, 하려면 1 L ofseawater를 Artemia 의 건조 휴식 계란의 약 15 mL를 추가 합니다.
참고: Artemia 계란 해치 후 24-48 h nauplius 애벌레로. A. 살 nauplii (예를 들어, 주말 동안)의 부 화를 지연, 빛을 약간 온도 줄이기 위해 해제 수 있습니다. - Artemia nauplii, 수확 하는 통 기 통풍을 해제 하 고 알루미늄 호 일 (또는 유사한 예를 들어수)와 함께 병의 상단 부분 어둡게... 켜 10 분 Hatched Artemia nauplii에 대 한 병의 아래 부분에 빛을 향해 수영 것입니다. 비 부 화 cysts는 하단 싱크대 것 이다 그리고 낭종 껍질 표면에 플 로트 것입니다.
- 하단에 클램프를 엽니다. 수영 nauplii의 인구 밀도로 중간 부분을 수집 합니다.
참고: 매일 (주말 제외), 조밀한 Artemia nauplii 서 스 펜 션의 1 L 성인 barnacles와 쟁반에 연결 100 L 저수지에 수동으로 추가 되었습니다. 이후 그들은 영양을 제공 하지 않습니다 주로 문화 더 자주 청소 해야 될 빈 알 껍질, 어떤 먹이 하지 마십시오.
4. 수집 및 따개 비 애벌레의 양육
- 부드럽게 민물로 그들을 분사 하 여 성인 barnacles와 패널을 청소 하 고, 필요한 경우 따개 비 조개와 부드러운 칫 솔을 사용 하 여 패널에서 모든 파울 제거. 또한, 트레이 (barnacles) 없이 뜨거운 (75 ° C)에 튜브를 청소 민물.
- 90 µ m 플랑크톤-그물 컷된 PVC 파이프 (16 cm 직경, 높이 15 cm)의 끝에 붙어 만들어진 체를 오버플로 포트와 폴 리 에틸렌 트레이 (30 x 20 x 10 cm3)에 넣으십시오. 밤새 체 (그림 2C) B. improvisus 애벌레를 수집 합니다.
참고: 체 outflowing 물을 고는 nauplii 걸러 따개 비 패널의 쟁반의 출구 포트 바로 아래 위치 했다. 애벌레는 바닷물 범람 작은 트레이 동안 체에서 남아 있었다. 이 작은 트레이 보장 하는 체 하지 driedout. - 큰 물 욕조에 30 L 물통을 장소 온도 수족관 물고기 탱크 히터 (그림 2E)를 사용 하 여 26 ° C에서 유지 됩니다. 폭 기 및 교 반 시스템을 통해 공기 버블링에 의해 보장 됩니다.
- 필터링 된 바닷물 (0.2 µ m; 25 psu)의 20 L로 양동이를 채우십시오. 2 규조류 microalgae, S. marinoi , C. gracilis (단계 5 참조)의 60/40 혼합 양동이에 1 L를 추가 합니다. 이 양동이에 mL 당 약 5 x 104 규조류의 초기 밀도 줄 것 이다.
참고: 따개 비 nauplii 애벌레는 긍정적으로 phototactic. 양동이 불투명 흰색 플라스틱 뚜껑 있는 몇 가지 빛을 통해 만들어졌다. 겨울 동안 방 야간 동안 어두운 하지만 (8시 ~ 17:00), 낮 조명 했다. 여름 동안에, 외부 빛 하루의 대부분 동안 방에 들어왔다. - 수집 전송 crystallizing 접시 (300 mL, 직경에서 90 mm, 높이 50mm) B. improvisus nauplii.
- 밝게 광원에 유 충을 끌 것 이다 측면에서 요리. 피 펫으로 들어오는 빛에 모이고 다른 crystallizing 접시에 그들을 전송 하는 따개 비 nauplii 수집 합니다. 모든 나머지 Artemia 애벌레를 제거 합니다.
- 필터링 된 바닷물의 1 L와 비 커에 B. improvisus nauplii 애벌레를 전송.
- 애벌레도 정지를 부드럽게 비 커를 교 반 하 고 다음 비 커에 다른 장소에서 5 1 mL 샘플을 복용 하 여 nauplii의 수를 계산. stereomicroscope와 시각적 검사에 대 한 미 판으로 각 샘플을 전송 합니다. 5 샘플의 각 nauplii의 수를 계산 하 고 그들을 추가.
- 200 (1000 mL/5 mL) 전체 비 커에는 애벌레의 얼마나 많은 수천을 추정 하 여 계산된 수를 곱하면. 비 커에 너무 많은 nauplius 애벌레 경우 밀도 최대 14000 애벌레/L (11000-12000 애벌레/L의 범위)에 보통 때까지 샘플을 희석.
- 따라서 추가 통 당 약 11000-12000 애벌레 한 양동이에 B. improvisus nauplii의 1 L를 추가 합니다.
참고:이 애벌레에 관하여 너무 작은 식품에 발생 되며, 따라서, 사망률을 증가 더 많은 nauplii, 추가 하지 않도록 확인 합니다. - 3 일 후, 따개 비 nauplii 90 µ m 체에 수집 합니다. 청소 (75 ° C를 가진 민물), 양동이 필터링된 해 그것을 채울, 새로운 규조류 피드 (동일한 금액으로 시작), 추가 그리고 마지막으로 다시는 nauplii 추가. Cyprids (± 1 일) 약 6 일 후 나타나는 시작 합니다.
- 먼저 90 µ m 체 (포인트 4.2 위 에서처럼 설계)와 cyprids를 수집 합니다. 다음은 160 µ m 체 위에 320 µ m 체 비 moulted 따개 비 nauplii 및 cyprids 구분 합니다. B. improvisus nauplii 320 µ m 체와 160 µ m 체에서 cyprids에서 수집 합니다.
참고: cyprid 애벌레 저장할 수 있습니다 crystallizing 접시에 10 ° C에서 캘리포니아까지 나중 사용을 위해 어둠 속에서. 6 일입니다. 그러나, 저장 수에 영향을 따개 비 애벌레의 성능과 품질 그래서 다른 처리를 비교 하는 실험 이상적으로 혼란 효과16을 피하기 위해 동일한 배치 (와 유사한 저장 시간)에서 애벌레를 사용 해야 합니다.
5. 문화 따개 비 Nauplius 애벌레에 대 한 피드로 미세
참고: 조류는 3 가지 종류의 문화에서 성장 했다: (i) 문화, 스케일-업;의 접종에 대 한 사용 되 고 긴장의 장기적인 유지 관리에 대 한 재고 (ii) 시작 문화, 스케일 업;의 첫 번째 단계는 그리고 마지막으로 (iii) 따개 비로 많은 양의 해 조류의 최종 생산 규모 생산 문화의 피드.
- 따개 비 nauplius 애벌레 먹이로 사용 되는 문화 컬렉션의 조류 및 원생 동물 (CCAP)에서 규조류 종 주문. 2 종 Skeletonema marinoi (CCAP 스트레인 1077/5) 및 Chaetoceros 단순 var. gracilis (CCAP 스트레인 1085/3) 피드로 좋은 결과 줄.
- 카트리지 필터 시스템을 사용 하 여 0.2 µ m. (필터링 된 해 수는 A. 살 리 나 계란의 부 화와 따개 비 nauplius 애벌레의 배양에 사용할 또한.) 공칭 기 공 크기와 조류 문화에 사용 되는 모든 해 수 필터링 압력솥 (5 분 동안 105 ° C)에서 조류 문화에 대 한 필터링 된 해 수.
- 미세, 무기 영양소, 추적, 금속과 비타민 (Guillard 197517 자세한 제조 법에 대 한 참조)를 포함 하는 Guillard의 f/2 솔루션과 농축 압력가 해 수를 사용 하 여 문화에 대 한 매체를 준비 합니다. 또한, 규 산 염 (Na23SiO) 솔루션을 준비 하지만이 단단한 강 수를 방지 하기 위해 f/2 농축에서 별도 유지.
참고: 농축 재고 솔루션 및 규 산 염의 재고 솔루션의 농도 바닷물의 1 l 각의 1 mL 추가로 사용할 준비 되었다. - 압력솥 모든 장비는 1 mL f/2 농축의 고 규 산 염 솔루션의 1 mL와 20 분 압력솥 나사 출장 테스트 튜브에 대 한 120 ° C에서 조류 문화에서 사용. 압력가 유리와 액체는 실내 온도 냉각 하는 때 theseawater를 농축 및 규 산 염 솔루션을 추가 합니다.
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나사 모자 40 mL 시험관에서 microalgae의 사진 문화를 성장.
- 테스트 튜브를 농축된 해 수의 약 30 mL에 채워 넣어 라. 2 주 오래 된 재고 문화의 대략 1 개 mL를 사용 하 여 살 균 파스퇴르 피 펫과 문화를 예방. 나사 모자 다음 장착 하지만 일부 가스 교환을 허용 하지 강화. 사용 가능한 경우는 접종 오염의 위험을 줄이기 위해 캐비닛 층 흐름에 밖으로 실행 되어야 한다.
참고: 재고 문화의 목적은 조류 문화 장기 기초에 대 한 inoculum을 시작 문화를 유지 하는 것입니다. 재고 문화 다시 매 2 주를 주사 했다. - Ca의 진도 하얀 빛을 새로운 사진 문화를 노출 합니다. 25-50 µmole m-2의-1 (16:8 h의 빛-어두운 주기)와. 오래 된 재고 문화 낮은 빛의 강도 백업으로 이동 합니다. 모든 2 주 오래 된 재고 문화를 삭제 합니다.
- 테스트 튜브를 농축된 해 수의 약 30 mL에 채워 넣어 라. 2 주 오래 된 재고 문화의 대략 1 개 mL를 사용 하 여 살 균 파스퇴르 피 펫과 문화를 예방. 나사 모자 다음 장착 하지만 일부 가스 교환을 허용 하지 강화. 사용 가능한 경우는 접종 오염의 위험을 줄이기 위해 캐비닛 층 흐름에 밖으로 실행 되어야 한다.
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스케일링 해 조류의 생산 문화, 주식 문화에서 시작 문화를 접종 하 고 500 mL Erlenmeyerflasks에에서 그들을 성장.
- 압력솥 4 삼각 플라스 크, 펫 필터링된 (0.2 µ m) 바닷물의 300 mL와 함께 면 stoppers 그리고 f/2 농축의 0.3 mL와 4 테스트 튜브 및 규 산 염 솔루션 4. F/2 농축 및 실내 온도에 규 산 염을 진정 하 고 삼각 플라스 크에 솔루션을 추가 합니다. Ca와 그들을 예방. 2 주 오래 된 재고 문화의 1 mL
참고: S. marinoi 와 2 플라스 크와 C. 심 플렉스2 준비 합니다. - 50 µmole m-2의-1의 빛의 강도에 떨고 테이블에는 플라스 크를 넣어. 시작 문화 조류 인구 밀집 (노란색-갈색 색상) 획득 때 그들은 제공 하는 것입니다는 따개 비 애벌레 음식 생산 문화 inoculum으로 사용할 준비가 되었습니다.
- 압력솥 4 삼각 플라스 크, 펫 필터링된 (0.2 µ m) 바닷물의 300 mL와 함께 면 stoppers 그리고 f/2 농축의 0.3 mL와 4 테스트 튜브 및 규 산 염 솔루션 4. F/2 농축 및 실내 온도에 규 산 염을 진정 하 고 삼각 플라스 크에 솔루션을 추가 합니다. Ca와 그들을 예방. 2 주 오래 된 재고 문화의 1 mL
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유리 튜브 장착 2 드릴 포트 4 L 폴 리 탄산염 병 실리콘 stoppers에서에서 생산 문화를 성장.
- 공기 펌프를 통해 실리콘 튜브 0.2 µ m에 어 필터를 장착 하는 병의 바닥에 도달 하는 1 유리 튜브를 연결 합니다. 두 번째 유리 튜브 끝 바로 아래 실리콘 스 토퍼 및 주입된 공기 출구를 허용 하는 면으로 가득 차 있는지 확인 합니다.
- 각 주, 채우기 4 4 L 병 필터링된 해 수와 압력솥 그들은 stoppers 함께. 또한, 압력솥 4 테스트 튜브 f/2 농축 및 규 산 염 솔루션 4 mL와 함께 합니다.
- 냉각 후, 병에 f/2 농축 및 규 산 염 솔루션을 추가 하 고 삼각 플라스 크에 시작 문화의 볼륨의 절반을 함께 접종 합니다.
- 50-100 µmole m-2의-1의 빛의 강도에 4 4 병을 놓습니다.
- Ca후 생산 문화를 수확. 1 주; 그들은 충분히 밀도 따개 비 nauplius 애벌레를 먹이 기를 위해 사용할 수 있습니다.
참고: 생산 문화 있다 언제 든 지 8 활성 프로덕션 병은 약 2 주의 수명.
6. 설계 Barnacles를 사용 하 여 실험 연구
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청소년 또는 성인 barnacles 패널 제어 aquaria 어디 그들은 identicalconditions에서 성장 될 수 있다 장소. 이것은, 예를 들어, 사용 될 수 있는 현지 적응 또는 phenotypic가 소성18이해 하거나 외부 요인 (예, 염 분, 온도, 또는 pH) 관련 유전자 표현 변화를 공부 하는 공통 정원 실험 이라고.
참고: 그것은 또한 barnacles 직접 패널에 현장에서 수집 된를 사용 하 여입니다. 실험실 사육 개인 사용의 장점은 자손의 다음 세대를 사용 하 여 때 모성 효과 피할 수 있습니다.- 성인 (예를 들어, 유전자 발현에 대 한 연구에 대 한)의 수확 뒤에 chosentime 간격 동안 특정 환경 조건에 barnacles 노출2.
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Cyprid 유 충 진 식3공부와 실험에 대 한 제어 aquaria 애벌레 동일한 조건 하에서 재배 하는 수 있는 곳에 cyprids를 놓습니다.
- 체 (단계 4.7에서에서와 같이)로 필터링 하 여 지정한 기간 후에 cyprids을 수확 하 고 프로토콜 아래 (8 단계)에 따라 RNA를 추출 합니다.
7입니다. Barnacles의 해 부
- 실험실 공간 어디 해 부 및 DNA 샘플링 수행 됩니다, bothbefore 청소와 개인 사이, 모든 해 부 도구를 포함 하 여. 이렇게 벤치 (또는 96% 에탄올은 겸 자에 대 한)에 대 한 염소를 사용 하 여.
참고: 이라는 튜브 고정 미디어 (에탄올 또는 RNA 안정화 솔루션)를 포함 하는 사전에 준비 된다. - 크고 단기 굶 어 개인 (먹 여 살리지 못하면 그들 2 일전 해 부에 대 한)을 선택 합니다. 따개 비 쉘 (예를 들면, 박테리아, 조류) 다른 종에서 오염 위험을 최소화 하 고 물으로 그것을 씻어에 칫 솔을 청소.
참고: 해 부 하기 전에 개인의 단기 기아에 대 한 이유 (예를 들어, Artemia cysts 용기에서에서) 어떤 DNA 오염을 방지 하는. -
개별 barnacles도 표면, 패널에 연결 된 또는 느슨한 접시에에 놓습니다. 성인에서 각각 조직 해 부. 해 부 barnacles, 연구의 목적에 따라 여러 가지가 있습니다.
- 해 부 방법 a: 전체 따개 비를 최대한 빨리 해결.
- 따개 비 아래 삽입 패널 표면 가까이, 메스를 사용 하 여 패널에서 전체 따개 비를 제거 합니다.
참고: 대부분의 경우에서이 조작 나뭇잎 기저 판 거의 그대로 따라서 하지에 영향을 미치는 내부 따개 비. - 조심 스럽게 집게 (그림 3)를 삽입 하 여 한쪽에 외피를 균열. 이 쉘 내부 fixating 매체의 침입을 용이 하 게 수행 됩니다.
참고: 경우 껍질은 하지 전혀 테스트 튜브에는 따개 비를 배치 하기 전에, 그것은 느린 고정 프로세스 품질과 열 등 DNA의 나중에 발생할 수 있습니다. - 깨진된 따개 비 RNA 스토리지 솔루션 또는 에탄올을 포함 하는 테스트 튜브에 넣어. 적어도 24 h의 고정을 위한 솔루션에는 따개 비를 둡니다. 따개 비 고정 때 동물 반출 고정 미디어 고 해 부 트레이에 배치 수 있습니다. Cirri, 맨 틀, 그리고 소마 (몸)을 서로에서 분리 하 고 추가 DNA 또는 RNA의 추출에 대 한 별도 튜브에 배치 수 있습니다.
참고: 그것은 수정 된 계란 계란 lamellae는 따개 비 안에 존재 하는 경우를 관찰 하는 것이 중요입니다. 있는 경우 이러한 샘플에 여러 genotypes을 찾는 피하려고 DNA 추출을 진행 하기 전에 제거 되어야 한다.
- 따개 비 아래 삽입 패널 표면 가까이, 메스를 사용 하 여 패널에서 전체 따개 비를 제거 합니다.
- 해 부 방법 b: 그것의 고정 하기 전에 셸에서 따개 비를 제거.
참고:이 메서드는 calcareousshell의 내부에 붙어 있기 때문에 샘플링 되는 맨 틀에서 항상 발생할 하지 않을 수 있습니다. 하지만 그것은 개인에서 DNA를 샘플링 하는 빠른 방법 될 수 있습니다.- 조심 스럽게 사용 하 해 부 집게, tergal 및 scutal 플레이트 (그림 3) 여 tergal 및 scutal 판 사이의 집게의 끝을 삽입, 접시, 잡고 잡아 당겨 부드럽게 그들을 제거 하 여 제거 합니다.
- 잡아는 cirri의 집게와 풀은 따개 비 바로 밖으로 누른 96% 에탄올 또는 고정을 위한 솔루션을 안정화 하는 RNA에 직접 배치.
참고: 때때로, 맨 틀 것입니다 또한 수 샘플링 같은 시간에 본 ( B. improvisus)에 어두운 색소와 얇은 상피로. 그렇지 않으면, 맨 틀 수 있는 메스를 사용 하 여 셸 내부에서 제거 되며, 그 후, 에탄올 또는 RNA 안정화 솔루션에 배치.
참고: tergal, scutal 접시 (그대로) 경우 건조 고 이후 그들은 종 식별10유용한 저장 될 수 있습니다. 일반 추천, 종, 어떤 의심 하는 경우 초기화 해 부 하기 전에 전체 따개 비 사진입니다.
- 해 부 방법 a: 전체 따개 비를 최대한 빨리 해결.
8. 정량 PCR 위한 RNA 추출
- RNA 추출 솔루션 안정화는 RNA로 데 성인 4 ° C에서 하룻밤 (24 h)까지 그들을 품 어 넣고-80 ° c.에서 그들을 저장합니다
참고: Cyprid 애벌레는 우선적으로 드라이-냉동, RNA-80 ° C에 직접 저장 하지 않고 cryotubes에서 그들을 배치 하 고 다음 튜브를 짧게 물속 여 (30 s)-80 ° c.에서 그들을 저장 하기 전에 액체 질소 - RNA 추출 시 barnacles 얼음에 녹여 고 그들을 그대로 사용 하거나 사용할 조직 밖으로 해 부 (7 단계 참조).
참고: 개인 (코딩 영역; ≈ 3-5% 변형 간의 높은 유전적 다양성으로 인해 Alm Rosenblad 그 외 여러분, 게시 되지 않은 데이터) 그것은 폴랜드의 수 성인 개인 정량 나중 단계에서 개인 간의 순서 변이의 영향을 최소화 하는 것이 좋습니다. - RNAextraction, 균질 튜브 세라믹 구슬의 2.8 m m를 포함 하는 RNA 준비 키트와 함께 제공 되는 세포의 용 해 버퍼의 350 µ L를 추가 합니다.
참고: 세라믹 구슬 쥡니다 (대표 결과)에 비해 RNA의 더 나은 수익률을 제공 합니다. - 성인 따개 비 (전체 또는 조직)를가지고 또는 최소 20 cyprid 애벌레 집게를 사용 하 여 수집 하 고 균질 튜브에 넣어.
- 비드 밀 중단 및 균질 화에 직접 진행.
- 비드 밀 홀더에서 샘플 및 구슬 균질 튜브를 넣어. 흔들어 그들 4.0 m/s의 주파수 20 s. 쿨 얼음에 1 분에 대 한 샘플. 2 배를 반복 합니다.
- 상업적으로 이용 가능한 RNA 격리 키트의 프로토콜에 따라 RNA를 준비 합니다.
참고: 위험 평가 (를 포함 하 여 안전 데이터 시트 읽기)는 RNA 추출 방법, 증기 두건 및 다른 보호복, (예를 들어, 장갑 등의 사용을 필요로 하는 유해 화학 물질을 식별 하기 위해 사용 하기 전에 수행 되어야 한다 RNA 추출 중 β-mercaptoethanol 세포의 용 해 버퍼를 추가 수행 되어야 한다 증기 두건에서). - RNA를 계량. 작업 솔루션을 준비 하 고 표준 및 샘플 200 µ L.의 총 볼륨을 추가 동 2-3 s에 대 한 그들 품 어 그들 2 분 삽입에 대 한 튜브를 fluorometer로 하 고 판독.
- 분 광 광도 계, 어떤 단백질 오염에 대 한 RNA 샘플 확인 하 고 자동된 전기 영동 시스템 (대표 결과)와 그들의 RNA 무결성 검사.
참고: 좋은 품질 준비, RNA는 것이 좋습니다 260/280의 비율을 2-2.2와 약 1.8의 DNA의 nm. 낮은 값 단백질 오염 및 추출 절차 최적화는 나타냅니다.
9. 유전자 발현: cDNA 합성 및 정량
-
정량에 대 한 cDNA를 하기 전에 어떤 remainingDNA를 제거 하려면 취득된 RNAwith DNase를 처리 합니다.
- 게놈 DNA를 cDNA를 준비할 때 RNA 샘플 하지만 아무 역전사를 추가 하 여 오염에 대 한 확인 합니다. 역전사 없이 cDNA에 선택 된 유전자의 PCR 증폭 경우에, RNA에서 DNA 오염이입니다.
참고: RNA-seq (RNA 시퀀싱 차세대 시퀀싱 기술을 사용 하 여)에 사용 될 샘플, DNase 단계는 덜 중요 한. 특히, RNA의 낮은 수준 샘플, DNase 단계 수도에서 생략할 수 잃기 위하여 과정에서 RNA의 너무 많이.
- 게놈 DNA를 cDNA를 준비할 때 RNA 샘플 하지만 아무 역전사를 추가 하 여 오염에 대 한 확인 합니다. 역전사 없이 cDNA에 선택 된 유전자의 PCR 증폭 경우에, RNA에서 DNA 오염이입니다.
- 상업 cDNA 합성 키트, 하지만 일반적으로, 사용 적어도 50 ng에 지정 된 범위 내에서 RNA의 금액을 사용 하 여 DNase 취급 RNA에 cDNA 합성을 수행 합니다.
- 그들은 개인 간의 시퀀스 id는 최대한 높은 하지만 유전자 paralogs 사이 시퀀스 id 가능한 관심사의 유전자의 anneal 정량 Pcr 뇌관 디자인. 특정 뇌관 쌍 진 식 연구 나+의 사용에 대 한 해당 간행물을 보십시오 /K+ ATPase3 및 aquaporins2 (그림 5).
참고:이 목적을 위해 cyprids의 수백 또는 여러 성인에서 RNA-seq 시퀀스 데이터 사용할 수 있습니다. - 식 수준 (예를 들어, 말라)의 정규화에 사용할 유전자를 위한 뇌관 디자인. 말라에 성공적으로 사용 하는 뇌관은, 앞으로: 5'-CATCAAGATCAAGATCATCGC-3'와 역: 5'-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'.
참고: 말라 통용 제어 유전자 이다. 그러나, 다른 사람 또한 되었습니다 기준으로 제안 있고 barnacles19에 밖으로 테스트. 말라, 외 기준으로 RPL8, 36B4, EF1, 및 NADHd1의 사용은 테스트3되었습니다. 그것은 soma, cirri, 성인, 또는 cyprids 각각 참조 유전자의 표현 수준에 큰 차이가 있다 체결 했다. - (일반적으로 0.25-50 ng의 범위)에서 cDNA의 증가 금액 SYBR 녹색, dNTP, 중 합 효소, 그리고 0.3 µ M 각 정방향 및 역방향 뇌관의 혼합에 추가 하 여 설계 된 뇌관의 어 닐 링 온도 최적화 합니다.
- 다른 어 닐 링 온도에서 정량 Pcr 프로토콜을 다음과 같이 실행: 3 분 동안 95 ° C, 20 ° c에서 95 변성 단계의 초기 변성 온도 20 55-63 ° C의 온도 어 닐 링 s, s, 및 30에 대 한 72 ° C에서 신장 s. 총에서 40 PCR 주기를 실행 합니다.
참고: 뇌관 효율성 90-105%의 범위에 거짓말을 해야 하 고 E로 계산 = (10^(-1/slope)-1) x 100 기울기가 그들의 주기 (Ct) 임계값에 대 한 cDNA 농도의 로그 값을 플롯할 때 얻은 곡선의 기울기. - 정량 Pcr cDNA, 발견 하는 최적의 어 닐 링 온도와 3 단계에 설명 된 PCR 프로토콜을 사용 하 여 일반적으로 1-10 ng의 적절 한 금액을 사용 하 여 수행 합니다.
참고: cDNA의 더 높은 양은 매우 낮은 금액에 표현 되는 유전자에만 사용 됩니다.
Representative Results
B. improvisus의 성인 barnacles의 경작에 대 한 설명 절차 nauplius의 4 개의 일괄까지 애벌레 생산 수 있습니다 주당. 그것은 거의 매일 밤 nauplius 애벌레를 수집 가능한 것 하지만이 더 많은 사람과 인프라 필요 (는 broodstock에 많은 barnacles, 문화 것입니다 릴리스 애벌레 지속적으로). 애벌레 생산에 대 한 추가 제한 요소가 특히 규조류 Skeletonema에 관한 높은 품질의 공급 여부를 것 처럼 보인다. 극대, 자란 시스템에서 각 일괄 처리 약 12000 nauplii, 주 당 50000 nauplii까지 경작 될 수 있도록 구성 되어 있습니다. 그러나, 몇 주 수 있습니다 생산 10 배 적은 애벌레까지. 단일 성인 하루14, 1-2 성인 애벌레 각 일괄 처리에 대 한 발표는 즉 당 최대 7000 애벌레를 생성할 수 있습니다. 일주일, 내 수집된 nauplii의 약 70-90% 정착 분석 및 분자 연구에 사용할 수 있는 cyprids (극대로 대략 30000 cyprids / 주, 저조한)으로 개발할 것입니다.
그것은 배치, 사이 cyprid 기능에 변화가 있다는 것을 강조 했다 한다 그리고 일반적으로, 더 큰 변이 사이 일괄 처리 내에서 일괄 처리 보다 있다. 예를 들어 정착 성공 정착 분석 실험에서 30와 다른 일괄 처리에 대 한 70% 사이 다릅니다. 대부분, 이것은 다른 샘플링 기간 동안 애벌레를 방출 하는 성인의 특정 쌍 사이의 개별 유전자 변이 의해 발생 합니다. 그것은, 물론, 반복된 실험 (생물 복제) 결과 대 한 보다 일반적인 진술을 만들 수 있다면 다양 한 일괄 처리에서에서 cyprids를 포함 해야 것이 좋습니다. 일괄 배치 변화 적절 한 컨트롤과 유전자 표현 연구에 정규화를 적용 한다 실험적인 디자인에 요구를 넣습니다. 그러나, 몇 가지 통계 표준화 절차 구현 된 후에는 상당히 배치 사이 변이 감소, 일괄 처리의 일부 효과 일반적으로 여전히 명백한 (되지 않은 데이터).
제공 된 프로토콜에 따라 그것은, 평균, 500을 얻을 수 따개 비 (표 1)의 단계에 관계 없이 작은 20 cyprids에서 높은-품질 RNA의 ng. RNA의 품질은 일반적으로 (두 봉우리의 예상된 위치는 그림 4에 표시 된) 18와 28S 봉우리 사이의 비로 측정 됩니다. 그러나, barnacles 및 다른 많은 절지동물, 28S rRNA (분석 방법의 일환)으로 열 하면 분해 하 고 18 피크20함께 마이그레이션합니다. 이 때문에 거기에, 원칙, 하나 하나의 rRNA 피크 barnacles에 대 한 분석의이 종류에서. 이 테스트 (그림 4) 세라믹 구슬에 의해 균질 높은 무결성으로 RNA를 제공 하 고는, 따라서, 방법의 선택에서에서 분명 하다. RNA 샘플 (읽기, 수가,는 시퀀싱 하는 동안 멀티플렉싱의 수준에 따라) 당 70 백만 읽기의 평균 발생 금액 및 시퀀싱에 대 한 높은-품질 시퀀싱 라이브러리를 생성 하는 품질에 충분 하다. RNA의 금액 또한 많은 유전자의 cDNA 합성 및 정량 식 분석을 위해 충분 하다.
그림 5 에서는 aquaporins 나+의 정량 분석에서 결과 /K+ ATPase (NAK1) 결합 이체, 식 변화 변화 환경 단서2,3에 대 한 응답에서 조사 되었다. 긴 및 짧은 상대 식의 비교는 두 가지 짧은 NAK (그림 5A)에 관하여 낮은 염 분에 긴 NAK1 mRNA에 대 한 증가 하는 NAK1 쇼의 변종 결합. 따라서, 데이터 대체 접합는 긴 양식 낮은 염 분 조건에서 우위를 나타냅니다. Aquaporins, 경우 그것은 명백한 두 물 수송 paralogs AQP1 및 AQP2 차동 식 (그림 5B) 표시. 특히, 맨 틀 직물에서 그것은 명백한는 AQP1는 실질적으로 다운 낮은 salinities에 통제는 AQP2에 나타나지 않습니다. 대신, AQP2는 낮은 salinities, 그러나 soma에 약간 증가 식을 보여 줍니다. 이러한 결과 다른의 기능 역할의 조사에 대 한 기반을 제공 B. improvisus 이온 운송업 자 및 aquaporins 따개 비 osmoregulation에.
그림 1 : 전체 절차 및 성인 유전자 표현 연구에 대 한 RNA 추출 배양의 개요. 시작 하려면 새로운 문화, 위원회는 프레임에 연결 하 고 1-3 m 깊이에서 바다에 배포. 몇 주 후, 성인/청소년 패널 실험실에 쟁반에서 선반에 수직으로 배치 됩니다. 각 트레이 성인 약 40 패널을 보유 하고있다. 패널 당 약 100 성인, 총 ≈에 4000 성인 개인은 트레이 당 경작. 성인 barnacles Artemia 를 품고 고 지켜질 수 년-주위. Nauplius 애벌레는은 쟁반 을 통해 체질 필터링에서 일주일에 여러 번 수집. 수집 된 nauplii 양동이 물 욕조에 26 ° C에서 보관 하 고 먹이 microalgae로 전송 됩니다. 그들이 먹이 비 cyprids, 필터링 의해 수집으로 털 갈이 때까지 nauplii reared 있습니다. 새로운 패널의 정착 cyprids 패널, 중 년에 대 한 새로운 패널을 제공 하 여 실험실에서 설정할 수 있습니다-주변 문화 또는 변경 된 외부 조건 특정 실험 설정에 대 한 사용 될. RNA는 청소년/성인 실험의 끝에 또는 특정 시간 시점에서 다음 추출 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 이미지의 자란 절차에서 몇 가지 중요 한 단계. (A)이이 이미지 패널 분야에서 새로운 인구를 수집 하기 위한 프레임을 보여 줍니다. (B)이이 이미지 랙 트레이에 배치 됩니다에 B. improvisus 의 성인 barnacles와 패널을 보여 줍니다. 패널 약 2 cm 떨어져 배치 됩니다. (C)이이 이미지 패널과 왼쪽 먹이 탱크는 따개 비와 쟁반을 보여 줍니다. 각 트레이 체 nauplius 애벌레의 컬렉션에 대 한 배치는 콘센트가입니다. (D)이이 이미지 Artemia 생산 피드 성인 barnacles를 보여줍니다. (E)이 화면은 nauplii에 26 ° c 설정 물 욕조에 배치 하는 양동이의 양육 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 성인 barnacles의 해 부에 초기 단계의 설명: 그것의 포탄에서 시체를 제거. 부드럽게 조리개를 통해 포 셉을 삽입 하 여 opercular 접시 중 하나는 (A) 잡아. 접시를 제거 하 고 동물을 노출 부드럽게 당겨. (B) 바로 아래는 cirri 소마 부분을 잡아서 동물 밖으로 당겨. (C)이이 패널 도토리 barnacles의 전반적인 구조를 보여 줍니다. 시체를 꺼내은 맨 틀 및 (난소)에서 잠재적으로 수정된 계란 포탄 구멍에 있어. 따개 비 해부학에 대 한 참고 (자세한 계정 참조 앤더슨)9: 벽 격판덮개는 따개 비의 안쪽, 경사와 함께, 그들은 형성 한다 화산 모양의 원추형. 개방, 조리개, 문, 또는 operculum, 조리개를 형성 두 opercular 판으로 덮여 있다. 도토리 barnacles 일반적으로 있다 층;에 단단히 붙어 석 기저 판 그러나, 일부 종의 barnacles이 석 플레이트 (예를 들면, S. balanoides) 부족합니다. Barnacles 음울 안료 맨 틀 (등 딱지)에서 외 골격을 분 비. 두 계층 맨 틀의 외부 표면은 석 회 질 맨 틀의 안쪽 표면은 하지 석 회화 되며 따라서 유연 하면서 엄격한 될. 조리개, 내부는 cirri은 끌어 넣어진된 위치에 존재 한다. 이들은 흉부 부속 barnacles 정지 먹이 기를 위해 사용 하는. 난소는 testes soma에 거짓말을 하는 동안에 따개 비의 기지에 가깝습니다. 이 수치는 Panova 그 외 여러분 에서 채택 되었습니다. 21 스프링 거에서 허가 함께 게시 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 모 세관 젤 전기 이동 법에 의해 rRNA 무결성의 결정. RNA는 두 개의 서로 다른 균질 화 방법에 의해 준비 되었다: (A) 쥡니다 및 (B) 세라믹 구슬. 푸, y 축에 단위 형광 단위를 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 유전자 발현에서 osmoregulation에 대 한 중요 한 유전자의 2 개의 다른 연구에서 결과 B. improvisus. (A)이이 패널 표시 차동 식 나+의 결합 이체의 정량에 의해 측정으로 /K+ ATPase NAK1 다양 한 salinities 및 pCO2 레벨3. 낮은 염 분 치료에 긴 isoform (NAK1 L)의 식 짧은 상대적인 증가 (ANOVA, P < 0.001). (B)이이 패널 B. improvisus 의 성인 다양 한 salinities2에 그들의 노출 동안 aquaporins의 식을 보여줍니다. 정량은 말라 상대적인 aquaporin 식 수준을 결정 하 사용 되었다. 성인 개인 14 일 동안 3 다른 salinities (3, 20, 및 33 PSU)에서 인 큐베이 팅 했다. RNA 준비에 대 한 소마, cirri, 및 성인의 분리 되었다. 두 인물에서 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. * *과 * * * 표시 레벨의 중요성 (ANOVA), 0.01, 0.001, 각각. 이러한 수치 린드 외 에서 수정 된 2 , 3. 두 인물 PLoS 하나에서 허가 함께 게시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 정착 단계 | RNA (ng)의 총 금액 |
| 자유 수영 | 512 |
| 탐색: 주변 검색 | 518 |
| 연결 된 cyprid | 550 |
| 새로 metamorphosed 청소년 | 832 |
표 1: RNA의 생산량. 이 표에서 RNA 준비 키트 20 cyprid 개인 합의 과정 중 여러 단계에서 수집 된의 풀에서 추출한 RNA 수량을 보여줍니다.
Discussion
Tjärnö 해양 연구소 (스웨덴)에서 따개 비 문화 20 년 이상를 실행 하 고 많은 다른 연구 분야에서 연구를 위해 사용 되었습니다. 30 과학 논문 출판 되었습니다 antifouling13,22, 유체역학23, 화학 생태학24연구를 포함 하 여 지난 년 동안 자란 시스템을 활용, 기후 변화16 ,5, 진화 생물학 및 분자 생물학2.
실험실 환경 (개인 야생 인구를 대표 하지 않을 수 있습니다)에 더 적응은 특정 개인의 선택을 방지 하려면 필드에서 매년 새로운 broodstock를 수집 하는 것이 좋습니다. 또한, 정상적인 년 동안 성인 사망률의 50-80%는 대략 이후 매년, 문화를 젊 어지게 하는 좋은 연습 이기도 합니다. 그러나, 목표는 타고 난된 라인 하거나 실험 진화의 연구를 설정 하 여, 실험실 reared 가족만 사용할 수 있습니다.
Tjärnö 해양 연구소에서 패널 B. improvisus 를 수집 하는 좋은 시간은 그 당시에 바다에서 cyprid 애벌레의 좋은 공급 6 월-8 월입니다. 따개 비 정착이 시작 될 때 참조를 수동으로 제거 하는 다른 패널 주간 정착 B. improvisus (예를 들어, 홍합, tunicates, 이끼, 또, nemerteans/tubeworms, 및 다른 따개 비 종) 보다 종에서 확인 된 패널 (예를들면, 칫 솔로). Tjärnö, 주위 3 얕은-물 따개 비 종 존재 (B. improvisus, Semibalanus balanoides, Balanus crenatus)이 있다. 그러나, B. improvisus 7 월-8 월 동안 지배적인 부드러운 하드 표면 fouler 이다. S. balanoides 의 정착 기간 이른 봄 동안 있으며 주로 자연 기판 (예:, 돌)을 좋아한다. B. crenatus 패널에 낮은 숫자는 여름 동안 발생할 수 있습니다.
그것은 또한 특정 특성으로 특정 linages를 설립 하는 경우에 필수적인 것입니다, 교양된 cyprids에서 또는 실험 진화의 연구에 새로운 성인 따개 비 세대 시작 가능. 어른 들의 새로운 세대를 시작 하는 가장 편리한 방법은 실험실에서 열가 소성 패널에 cyprids 정착 하는 것입니다. 실험적 치료 또는 노출 필드에 새로 정착된 cyprids이이 패널을 사용할 수 또한. 비상의 경우, 하나는 근처 사이트에서 (예를 들어, Tjärnö 해양 연구소의 경우 Idefjorden) B. improvisus 는 일반적인 바위에 성인을 사용할 수도 있습니다. 이러한 이미 설정 된 성인 따라서 쟁반에 배치 되는 패널에 성인으로 서 동일한 방식에서으로 처리 되며 시스템을 통해 흐름 통해 먹이. 흐름 세포 barnacles25패널 설정 또한 사용할 수 있습니다. 이들은 플랑크톤에는 cyprids 정착 하지 않는, 애벌레에 대 한 유일한 타협 표면으로 패널 측에 그물과 흐름을 통해 챔버.
장기적인 작동 따개 비 문화 등 모든 생활 단계를 설정 하기 위한 중요 한 몇 가지 단계가 있습니다. 문화 B. improvisus 에 사용 되는 메서드는, 훌륭한 정도, 또한 free-swimming, planktotrophic 애벌레와 다른 해양 무척 추 동물에 적용. 자란 절차 일부 종족은 이미 잘 설명 되어 있습니다 (예를 들면, 파란 홍합, 굴의 다른 종에 대 한)26, 다른 해양 무척 추 동물에는 그들의 일생에 걸친 장기 문화의 몇 가지 예만 주기. 문화 barnacles (B. amphitrite)를 최초의 성공적인 시도의 하나 Rittschof 그 외 여러분 에 의해 수행 됐다 15. 장기 재정 및 개인 자원 시설 재배는 따개 비를 설정 하기 전에 장소에 있어야 한다. 올해의이 종류의 유지 관리-따개 비의 주위 문화 적어도 한 사람 작업 하프 타임 필요 합니다. 미래 자동화 미세27의 경작 주로 생산 라인에 몇 가지 단계에 대 한 몇 가지 가능성이 있을 수 있습니다. 또한, 성공 하기 위해서는, 높은-품질 바닷물의 다량에 접근이 필수적입니다. Microalgae, Artemia, barnacles의 경작 어떤 특정 안전 절차는 포함 되지 않습니다. 그러나, 일부 antifouling 물질 또는 독성 화학 물질의 특별 한 조치를 할 수 있습니다.
패널은 오염에 대 한 주에 여러 번 체크 했다. 문화에서 사용 하는 해 수 Tjärnö 해양 연구소 밖에 서 요금 피에 40 m 깊이에서 펌핑 하 고 실험실 물 시스템에 들어가기 전에 2 개의 모래 필터를 통해 전달 했다. 경우 물 필터링 했다, 문화에 더 많은 오염 될 수 있습니다. 암 및 다른 무척 추 동물 (예를 들어, stolon 건물 또과 육 식 nemerteans)는 필드에서 바닷물의 공급을 통해 시스템을 입력 하는에서 문화에 패널을 정기적으로 청소 필수적 이다. 예를 들어 아무 애벌레도 불구 하 고 생산 하는 경우 잘 먹이 달리 문화 되었습니다 사실 있을 것 양호한 상태로, 짝짓기를 억제 하기 위해 표시 되는 nemerteans의 문제일 수 있습니다. 당연히, 많은 Tjärnö 해양 연구소에서 문화에 오염 생물의 스웨덴 서해안에 대 한 특정 되었고 오염 생물의 유행 되며 다른 지역에서 도전의 더 많은 것. 스웨덴의 서해안에는 패널에 다른 따개 비 종에 의해 오염 데 보통 아니다. 때때로, S. balanoides 의 설립 발견 되었습니다, 하지만 이것은 매우 한계 문제 (가장, 한 S. balanoides 오염 물질 10000 B. improvisus 샘플에 대 한). 종 오염의 부족 대부분 여름 동안 때 larvaefrom B. improvisus 매우 지배 했다 새로운 문화를 확립 하 정권에 의존 했다. 또한, 또한 있었다 패널에 B. improvisus 의 맑은 농축 이기 때문에이 종 부드러운 표면13에 대 한 선택적.
죽은 성인 barnacles 제거에 필수적 이다입니다. 빈 껍질 패널에 남아 있습니다, 그들은 모두 Artemia nauplii 뿐만 아니라 다양 한 오염 종족에 대 한 대피 소 될 수 있습니다. 또한, 그것은 죽은 개인 개인, 아마 분해 동안 독성 화합물의 출시와 함께 이웃의 영향을 발견 되었습니다. 성인 사망률의 추가적인 결과 일부 개인 남아 있을 것입니다 혼자와 너무 멀리 떨어져 (비록 barnacles의 크기에 관하여 동물의 세계에서 가장 긴 성 기를가지고) 짝짓기 있도록 다른 성인에서 이다28. 이러한 개인 생존 하지만 애벌레에 대 한 비 생산적 이다. 그러나, 이러한 고독한 성인 개인 베이스 플레이트를 해치지 않고 부드럽게 제거 될 수 있다 고 짝짓기 수 있도록 다른 사람에 가까이 수평으로 배치. Barnacles 또한 각 성인 한 패널을 배치 하 여 성관계 수 있습니다 하지만 십자가 발생할 수 있도록 충분히 가까이. 이 방법에서는, 유전 라인 생산된14될 수 있습니다.
그것은 높은 품질의 사료를 생산 하 고 피드 문화 거의 매일 중요입니다. 심지어 며칠 음식 없이 애벌레의 감소 릴리스에서 발생할 수 있습니다. 식단 구성의 이전 테스트 규조류는 성장과 따개 비 nauplii의 생존을 위해 필수적으로 나타났습니다. 몇몇 규조류 종으로 적절 한 것을 먹이, 비록 작은 또는 독방 셀 (직경에서 10 μ m) nauplii의 섭취 할 수 있습니다. S. marinoi, C. 단순, T. pseudonana 종 모두 B. improvisus nauplii, 물론 육성 하기 쉬운 적절 한 피드 수를 입증 해야 합니다. 또한, 피드 품질은 기 하 급수적으로 성장 하는 조류에 대 한 일반적으로 더 높은. 그것은 또한 알려졌다 규조류 B. amphitrite15의 생산적인 문화 구축을 위한 필수적입니다. 규조류의 중요성의 이론은 그들은 독특한 지방산 프로필 있고 특히 높은 불포화 20:5 지방산29풍부 이다. 그것은 보였다 그 특정 지방산 굴 애벌레30의 성공적인 개발을 위해 중요 하다.
년 동안, 따개 비 문화에 해로운 질병의 아무 incidences 되었습니다. 굴과 홍합, 같은 많은 상업적인 무척 추 동물 강포한에서 질병 보다 일반적 이며 매우 해로울 수 있습니다. 바이러스의 해로운 효과 또한 강포한 인구에서 보고 되었습니다. 프랑스에서 네이티브 굴 포르투갈 굴 Crassostrea angulata 1925 년에 대체 되었다 그러나이 종 197031주위는 iridovirus에 의해 전 멸 했다. 더 최근에, 태평양 굴 Crassostrea giga 문화, 전세계에 ostreid herpesvirus 132연관 될 것으로 보인다에서 대규모 사망 이벤트 되었습니다. 병원 균, 박테리아, 또는 바이러스 barnacles에 보고 지금까지 출판 되었습니다. 그러나, B. improvisus에 지속적인 게놈 프로젝트, 바이러스 시퀀스에 발견 했다 (Alm Rosenblad 그 외 여러분, 게시 되지 않은 데이터) 하지만 질병의 증 후에 아무 명백한 링크와 함께. 항생제의 혼합물; 세균 감염의 위험을 최소화 하기 위해 문화에 적용 된 이전 그러나,이 절차는 현재 중단 하 고 지금까지,이 모든 오염 문제를 발생 했습니다.
해 수 (위에서 설명한)로 열을 하는 경우 과열 문화 생산 라인에서 가장 심각한 위험이 있을 수 있습니다. 그것은, 물론, 센서 및 적절 한 경고 시스템 사용 (예를 들어, 책임 있는 사람에 게 전자 메일 이나 텍스트 메시지를 보내는) 될 수 있지만, 과열에 대하여 보호 어렵다. 과거에 이런이 종류의 성인 문화에 상당한 살인에 이어지고 있다. 이 과정의 엄청난 하 고 시간과 비용의 장기 투자를 망칠 수 있습니다. 특히, 타고 난된 유전자 라인 설립 되었습니다 경우 치명적인 것입니다. 같은 라인의 장 수를 보장, 실수로 손실 로부터 그들을 보호 하는 barnacles cryopreservation 방법론을 개발 하는 것이 좋습니다 것입니다. 그것은 태평양 굴에서 애벌레 아래로 고정 하 고 부분적인 성공33으로 부활 수 있습니다 보고 되었습니다. Cryobanking 다양 한 종34의 유전 자원 보존에 유용한 도구가 되었습니다. B. amphitrite 에서 심지어 nauplii 냉동35, 생존을 위해 보고 하 고 냉동 다운 개인의 20% 성공적으로 cyprids36로 metamorphosed 발견 됐다. 그러나, 문화의 장기적인 지속 가능성에 대 한 동결을 적용 지금까지 채택 되지 않았습니다, 하지만이 실제로 선택 된 라인;의 유지 관리를 위해 필요한 것 이 강력한 해양 modelsystem에 B. improvisus 를 단단히 구축 하는 중요 한 단계 것입니다.
여기, 프로토콜 B. improvisus (즉, cirri, 소마, 및 벽난로)의 성인에서 다양 한 조직에의 해 부에 대 한 제시 했다. 그러나, 그것은 다른 조직 또한 추출 될 수 있다 강조 한다. 예를 들어, 막 베이스 종 Tetraclita japonica formosana 의 외부 및 내부 맨 틀 사이의 부드러운 조직 되어 신중 하 게 절연과 RNA 추출 및 유전자 식37의 RNA seq 분석에 사용. 여기에 설명 된 개요 최적화 된 추출 프로토콜 시작 물자의 최소한의 금액에서 시퀀싱에 대 한 높은-품질 RNA의 충분 한 양을 제공 한다. 첫째, 균질 튜브에 직접 개별 애벌레의 컬렉션 1 개의 관에서 다른 쪽으로 전송 하는 동안 손실을 최소화합니다. 또한, 여러 가지 방법 중 테스트, RNA의 측면에서 가장 효율적인 얻을 것을 입증 하는 세라믹 구슬 및 무결성, 쥡니다 또는 유 봉 균질에 비해 균질. 유전자 발현 또는 게놈 실험 계획, 하나는 명심 barnacles에 높은 유전 변이의 도전 이상 B. improvisus에 대 한 있다. 따개 비 범위에서 3-5%, 지역 (Alm Rosenblad 그 외 여러분, 게시 되지 않은 데이터) 코딩에 유전적 다양성이 있다. 이것, 물론, 정량 분석에 대 한 프라이 머의 디자인에 특정 요구를 두고, 지역을 식별 및 사용 뇌관에 대 한 일관 된 식 결과 betweenbatches를 얻기 위하여 어디에 더 보존. 대상 유전자에 대 한 보존된 지역 처럼 aquaporins Na + K + ATPases, 개인의 수백을 포함 하는 cyprids의 인구에서 가져온 RNA-seq 데이터에서이 유전자의 순서 가변성을 공부 하 여 확인할 수 있습니다. 게놈 분석 DNA 샘플링 됩니다. 그러나, B. improvisus 에서 양질의 DNA를 얻는 전하실 수 있습니다21.
결론적으로, 설립된 따개 비 문화 다양 한 실험 연구에에서 도움이 될 입증 되었습니다. 특히, 모든 년 주위 애벌레 생산 수를 자연스럽 게 발생 산란 기간에 제한 되지 않고 실험을 실시 ( B. improvisus, 이것은 여름 동안). 취득된 애벌레는 실험 연구, 게놈 전체 transcriptome 연구 뿐만 아니라 정착 분석, 동작 분석, 특정 유전자에 대 한 표현 연구 등의 다양 한 세트를 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 선언할 수 없다.
Acknowledgments
이 연구는 그랜트 2017-04559 스웨덴 연구 위원회 (VR)과 EU 지원된 프로젝트 해안가에서 앤 더 스 Blomberg에 의해 지원 되었다. 특히, 자란 시설의 설립, 년간, 지원 되었습니다 교부 금에 의해 R. 존슨은 당을 다음 자금 지원 기관에서: SSF (스웨덴 전략 연구 재단) 해양 과학 프로그램 및 기술 및 MISTRA 해양 페인트 프로그램을 통해입니다. 켄트 Berntsson는 culturingfacility를 설정 하는 초기 단계에서 쓸모 있었다. 추가 해양 진화 생물학 (www.cemeb.science.gu.se)에서 왔다 자란 시설 설립을 위한 자금, 스웨덴 연구 위원회 FORMAS와 VR에서 Linnaeus 교부 금에 의해 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plexiglas (poly-methyl methacrylate) panels | Plastic produkter, Bromma, Sweden | transparent glas | |
| 1.5 L PET bottle | |||
| Artemia | INVE Aquaculture, Belgium | We have tested different companies; this is really the best one | |
| Skeletonema marinoi (CCAP strain 1077/5) | CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland | strain 1077/5 | |
| Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP strain 1085/3) | CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland | strain 1085/3 | |
| Millipore cartridge filter system | Millipore | ||
| cartridge with a nominal pore size of 0.2 µm | Millipore | cartridge CWSS01S03 | High capacity for large volumes |
| polycarbonate bottle | Nalgene | autoclavable | |
| RNA later | Qiagen | 76106 | Fixation solution to preserve RNA |
| TURBO DNA-free Kit | Invitrogen/Thermofisher Scientific | AM1907 | DNAse kit to remove DNA from prepared RNA |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Biorad | 1708890 | cDNA synthesis kit |
| SYBR Green supermix | Biorad | 1708880 | Dye for QPCR |
| RNeasy minikit | Qiagen | 74104 | RNA extraction of adults or many cyprids |
| Soft tissue homogenising CK 14, 2 ml tubes | Precellys | KT03961-1-003.2 | Ceramic beads for homogenisation |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | RNA extraction of few cyprids |
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