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balane Balanus improvisus comme modèle Marine - culture et l’Expression des gènes

Published: August 8, 2018 doi: 10.3791/57825
Automatic Translation
1, 3, 2, 2, 1, 2
1Department of Marine Sciences, University of Gothenburg, 2Department of Chemistry and Molecular Biology, University of Gothenburg, 3IVL Swedish Environmental Research Institute

Summary

La balane Balanus (Amphibalanus) improvisus est un modèle pour étudier l’osmorégulation et antifouling. Cependant, la reproduction saisonnière naturelle donne un approvisionnement imprévisible de la larve cypris. Ici, un protocole pour la cultiver tout au long de l’année des b. improvisus est décrite, y compris la production de larves. L’utilisation de bernacles cultivées dans des études d’expression génique est illustrée.

Abstract

Balanes sont des crustacés marins accompagné d’un adulte sessile et larves nageuses, planctoniques. La balane Balanus (Amphibalanus) improvisus est particulièrement pertinente comme un modèle pour l’étude des mécanismes de l’osmorégulation en raison de son extrême tolérance à la salinité faible. Il est aussi largement utilisé comme un modèle de décantation de biologie, en particulier en ce qui concerne la recherche d’antifouling. Cependant, la reproduction saisonnière naturelle donne un approvisionnement imprévisible de larve cypris pour études. Un protocole pour la culture tout au long de l’année des b. improvisus a été développé et une description détaillée de toutes les étapes de la chaîne de production est décrit (p. ex., la mise en place de cultures adultes sur les panneaux, la collecte et l’élevage du larves de balanes et l’administration d’aliments pour les adultes et les larves). Aussi, la description fournit des conseils sur le dépannage et discute des paramètres critiques (par exemple, l’élimination de la contamination, la production d’aliments de qualité, les effectifs nécessaires et l’importance de la qualité d’eau de mer). Chaque lot du système de culture au maximum donne environ 12 000 nauplies et peut livrer quatre lots dans une semaine, donc jusqu'à presque 50 000 larves par semaine peuvent être produites. La méthode utilisée pour la culture b. improvisus est, probablement, dans une large mesure également applicable à d’autres invertébrés marins avec libre-swimminglarvae. Protocoles sont présentés pour la dissection des tissus différents pour adultes ainsi que la production d’ARN de haute qualité pour les études sur l’expression génique. Il est également décrits comment des adultes et cypris élevés peuvent être utilisées dans un large éventail de conceptions expérimentales pour étudier l’expression des gènes en fonction de facteurs externes. L’utilisation de bernacles cultivées dans l’expression des gènes est illustrée avec des études de rôles osmorégulateurs possibles de Na+/k+ ATPase et aquaporines.

Introduction

Balanes sont des crustacés marins accompagné d’un adulte sessile et larves nageuses, planctoniques. La plupart des 1 200 espèces de Bernaches vivent dans des eaux peu profondes et beaucoup sont souvent exposés à faible salinité. Une seule espèce, la baie balane Balanus (Amphibalanus) improvise (b. improvisus), peut tolérer presque d’eau douce et Charles Darwin décrit cette espèce d’un petit ruisseau dans l’estuaire du Rio de la Plata en Uruguay1. La salinité de tolow tolérance extrême rend improvisus b. , un modèle particulièrement pertinent pour l’étude des mécanismes osmorégulateur2,3. Ce barnacle préfère des conditions saumâtres, mais est capable de vivre dans les eaux des salinités de psu environ 1,6 à aussi haut que 40 bloc d’alimentation4. C’est l’espèce de barnacle seulement trouvée dans l’eaux saumâtres de la Baltique. B. improvisus est censé provenir de la côte est du continent américain mais aujourd'hui se trouve dans le monde entier en raison de la dispersion par expédition5. C’est un important organisme salissants et trouve couramment sur les rochers, jetées et les coques de bateau et est donc d’intérêt général pour la compréhension des mécanismes de l’encrassement biologique sur les constructions dans les eaux marines et saumâtres6,7.

Comme pour la plupart des autres Bernaches, b. improvisus est hermaphrodite avec multiples métissages ; la reproduction se fait par le biais de l’accouplement entre individus voisins utilisant un pénis allongé et la fécondation interne. La période de reproduction est principalement de mai à septembre. B. improvisus a sept stades larvaire pélagiques (six nauplii suivies d’un cypris étape8). Les écoutilles d’ovule fécondé en une larve nauplius qui est nageant librement et se nourrit dans la colonne d’eau pour jusqu'à plusieurs semaines avant la mue en une larve cypris sans alimentation. Les cypris utilise plusieurs indices pour trouver un emplacement convenable pour régler et puis subit une métamorphose dans une balane juvénile sessiles9. Les espèces peuvent être cultivées en laboratoire et ont une durée de vie de 1 à 2 ans dans la mer (2 à 3 ans en culture en laboratoire). En moyenne, b. improvisus jusqu'à 10 mm de diamètre (avec un maximum d’environ 20 mm) et atteint une hauteur maximale d’environ 6 mm (même si elle peut grandir dans des conditions surpeuplées). L’espèce peut être identifié par son enveloppe même calcaire lisse (blanc ou gris), la base de calcaire radialement à motifs de la plaque de la coquille et la forme des plaques tergal1,10.

La nonnette b. improvisus a plusieurs caractéristiques avantageuses comme un modèle pour les études d’osmorégulation, en mettant l’accent sur les mécanismes moléculaires et physiologiques ainsi que des interactions écologiques et des conséquences évolutives. Il est aussi largement utilisé comme modèle pour les enquêtes de régler la biologie, en particulier en ce qui concerne la recherche d’antifouling et les mécanismes impliqués7,11,12,13. Cependant, la reproduction saisonnière naturelle donne un approvisionnement imprévisible de larve cypris pour études. La capacité à la culture ce barnacle à travers son cycle de vie entier tout au long de l’année est, par conséquent, un atout majeur pour permettre à différents types d’études moléculaires et mécanistes. En outre, sa présence dans les eaux saumâtres/marine dans le monde entier permet une combinaison de terrain et les études expérimentales. Reproduction contrôlée peut également produire des familles des pedigrees connues pour la culture à long terme14, et un temps de génération de quelques mois peut permettre une évolution expérimentale à long terme. Il existe aussi un génome de projet et plusieurs transcriptions, et ces ressources ont été utilisées pour le clonage de plusieurs gènes (par exemple, les gènes d’importance dans l’osmorégulation)2,3.

Ce protocole vise à décrire comment établir et maintenir une culture de la nonnette b. improvisus tout au long de l’année afin d’effectuer des études d’expression génique sur adultes ou larves de cet organisme. Rittschof et al. 15 a brièvement décrit une méthode pour la culture des Bernaches de la libération de nauplies au règlement des cypris pour les espèces Balanus amphitrite. Le protocole a été adapté pour la culture tout au long de l’année des b. improvisus au laboratoire de recherche Marine Tjärnö (Suède), et une description détaillée de toutes les étapes de la chaîne de production est exposée, y compris la production et l’élevage de barnacle les larves, ainsi que l’administration d’aliments pour les adultes et les larves. Pour un aperçu de l’ensemble de la procédure, voir la Figure 1. L’utilisation du système de culture est illustrée avec certaines configurations expérimentales communes et illustrée dans des études de génomique fonctionnelle de Na+/k+ ATPase et aquaporines, élucider leurs fonctions possibles à l’osmorégulation2, 3. Il est parfois essentiel d’étudier l’expression des gènes dans des tissus spécifiques, et quelques-unes des bases de la dissection barnacle seront couverts. Un bon approvisionnement en eau de mer de haute qualité, la mise en culture de la nonnette b. improvisuset potentiellement beaucoup d’autres espèces, devrait être possible dans les laboratoires marins dans le monde entier.

Protocol

1. collection de balanes adultes dans le domaine de commencer un nouveau stock de géniteurs

  1. Déployer des panneaux transparents en thermoplastique (poly-méthacrylate de méthyle) (110 x 110 x 1,5 mm3) à ≈ 1 – 3 m de profondeur en eaux calmes afin de recueillir les balanes adultes du champ. Cadres d’utilisation qui peuvent prendre plusieurs panneaux (Figure 2A), percer 2 trous (d’un diamètre de 6 mm) dans les coins supérieurs de chaque panneau et attachthepanelstotherackusingcableties. Ainsi, thepanelswillhangverticallyin l’eau.
    1. Lorsque la colonie de bernaches s’est produite (définis comme des petits points blancs de durs sur les panneaux), laisser les panneaux pendant au moins 2 à 3 semaines pour s’assurer que les balanes sont grandes suffisamment (5 mm) pour être transféré au laboratoire sans avoir séché ou endommagé.
  2. Mettre les panneaux en laboratoire lorsqu’elles sont couvertes de sédentaire improvisus b. qui ont atteint une taille de ca. indiameter de 5 mm.
    NOTE : Le temps pour les adultes à développer à 5 mm dans le champ est fortement tributaire de la disponibilité de nourriture et la température. Normalement, cela prend environ 3 semaines au laboratoire de recherche Marine Tjärnö (58.87 ° N, 11.14 ° E). Le plus souvent, les panneaux pour les nouveaux géniteurs sont généralement déployés à la fin juin et encaissés à la fin du mois d’août.
  3. Avant d’introduire les panneaux dans la facilité de culture, nettoyez les autres organismes des panneaux. Il est très important d’enlever les autres espèces de barnacle. Veuillez noter qu’il est important de nettoyer régulièrement les panneaux pour se débarrasser de contamination des espèces au cours de la culture puisque cela augmentera considérablement les chances de survie des géniteurs.
  4. Placer les panneaux verticalement sur le bord dans un peuplement avec rainures blanchis dans un plateau en polyéthylène (400 x 400 x 20 mm3) (Figures 2 et 2E). Les rainures dans le peuplement sont distants de 15 mm.
  5. Afin de préparer les plateaux, faire un port d’entrée à la base et un port de sortie en haut du côté opposé de chaque plateau. Connectez le port d’entrée de chaque plateau à un réservoir de 100 L, contenant environ 30 L d’eau avec une entrée d’eau de mer ouvert à 20 ° C afin de permettre un cheminement à un taux de ca. 2 L / min.
    NOTE : Jusqu'à 8 plateaux étaient reliés à un seul réservoir de 100 L.
  6. Relier le réservoir de 100 L d’eau de mer à température contrôlée (20 ° C) (p. ex., fournie par une pompe à chaleur échangeant de la chaleur de l’eau de mer entrant).
    Remarque : La balane improvisus b. peut croître et se reproduire à une salinité de pleine mer (30 à 35 psu) ; Toutefois, réduire la salinité à ca. psu 25 par adjonction d’eau douce dans le réservoir de 100 L augmente la production de larves de la culture.

2. à partir de nouvelles générations d’adultes de cypris cultivées

  1. Construire des cubes de panneaux thermoplastiques ouvert sur le dessus de taping 5 panneaux ensemble en utilisant une bande non toxique, résistant à l’eau.
  2. Placez le cube dans un petit plateau (en cas de fuite) et remplissez-le avec l’eau de mer (25 psu). Garder l’eau à température ambiante (ca. 20 ° C). Ajouter environ 200 cypris dans la partie supérieure du cube.
  3. Nourrir les alevins avec 100 mL de Skeletonema marinoi tous les deux jours (voir étape 5) tandis que dans le cube.
    NOTE : Balanes juvéniles peuvent avoir des difficultés avec l’ingestion de Artemia salina (voir étape 3) car ils sont gros et, par conséquent, difficiles à avaler pour une balane nouvellement établi.
  4. Changer l’eau 1 x par semaine.
  5. Après 2 semaines, quand les panneaux contiennent suffisamment établies juvéniles d’au moins 5 mm de diamètre, démonter le cube et déplacez-le avec les juvéniles à plateaux avec écoulement-throughseawater et, par la suite, nourrir les bernaches avec a. salina nauplii.

3. culture de Nauplii d’Artemia salina comme apport pour les balanes adultes

  1. Mettre en place un système de culture pour a. salina en utilisant une bouteille en plastique de 1,5 L où le bottomis coupé et la bouteille est placée à l’envers dans un peuplement et éclairée du côté. Monter le goulot d’étranglement dans un tube de silicone avec une pince et l’attacher à une pompe à air (Figure 2D).
  2. Afin d’éclore les œufs, ajouter environ 15 mL de sec au repos oeufs d’Artemia à 1 L ofseawater.
    NOTE : Artemia œufs éclosent en larves nauplius après 24 à 48 h. Pour retarder l’éclosion des nauplies d’a. salina (par exemple, pendant les week-ends), la lumière peut être désactivée pour réduire la température légèrement.
  3. Pour récolter les nauplies d’artémias , éteindre l’aération et obscurcir la partie supérieure de la bouteille avec le papier d’aluminium (ou similaires par exemple, une canette)... Allumer que la partie inférieure de la bouteille pour 10 min. Hatched Artemia nauplii nagera vers la lumière. Kystes non éclos vont couler vers le bas, et coquilles de kyste flotteront à la surface.
  4. Ouvrez la pince en bas. Recueillir la fraction intermédiaire comme une population dense des natation nauplius.
    Remarque : Tous les jours (sauf le week-end), 1 L de la suspension de nauplies Artemia dense a été ajouté manuellement dans le réservoir de 100 L connexion aux plateaux avec les balanes adultes. Évitez de nourrir avec les coquilles vides de kyste, car ils ne pas fournir une alimentation et entraîner principalement besoin de nettoyer la culture à intervalles plus fréquents.

4. la collecte et l’élevage de larves Barnacle

  1. Nettoyer les panneaux avec balanes adultes par doucement vaporisant d’eau douce et, le cas échéant, retirer tout encrassement de la balane obus et des panneaux à l’aide d’une brosse douce. En outre, nettoyez les plateaux (sans les balanes) et les tubes à chaud (75 ° C) d’eau douce.
  2. Placez un tamis constitué d’un plancton-filet 90 µm collé à l’extrémité d’un tuyau de PVC coupé (16 cm de diamètre, 15 cm de haut) dans un bac en polyéthylène (30 x 20 x 10 cm3) doté d’un port de dépassement de capacité. Recueillir les larves de b. improvisus dans le tamis du jour au lendemain (Figure 2C).
    Remarque : Le tamis était placé juste en dessous de l’orifice de sortie du bac des panneaux barnacle pour recevoir l’eau sortant et de filtrer les nauplies. Les larves sont restés dans le tamis, tandis que l’eau de mer a débordé le petit plateau. Ce petit plateau a assuré que la passoire jamais driedout.
  3. Placer un seau de 30 L dans un bain d’eau où la température est maintenue à 26 ° C à l’aide d’appareils de chauffage aquarium poisson réservoir (Figure 2E). Aération et agitation sont assurées par propagation d’air à travers le système.
  4. Remplissez le seau de 20 L d’eau de mer filtrée (0,2 µm ; 25 psu). Ajouter 1 L dans le seau d’un mélange 60/40 des microalgues 2 diatomées, S. marinoi et c. gracilis (voir étape 5). Cela vous donnera une densité initiale de diatomées4 environ 5 x 10 / mL dans le seau.
    Remarque : Les larves nauplius Barnacle sont positivement phototactiques. Les seaux sont faites de plastique blanc opaque avec couvercles qui laissent passer la lumière. Au cours de l’hiver, la pièce était éclairée pendant la journée (08:00 – 17:00), mais sombre pendant la nuit. Au cours de l’été, la lumière extérieure est entré dans la pièce pendant la majeure partie de la journée.
  5. Transférer la collecte nauplies d’improvisus b. dans un plat de cristallisation (300 mL ; 90 mm de diamètre 50 mm de hauteur).
  6. Illuminer le plat de côté, qui attirera les larves de la source lumineuse. Recueillir les nauplies barnacle qui se rassemblent à la lumière entrante avec une pipette et les transférer sur un autre plat de cristallisation. Supprimer toutes les larves Artemia restants.
  7. Transvaser les larves nauplius de b. improvisus dans un bécher avec 1 L d’eau de mer filtrée.
  8. Compter le nombre de nauplies en remuant le bécher doucement pour obtenir une suspension même des larves et puis en prenant cinq échantillons de 1 mL de différents endroits dans le bécher. Transférer chaque échantillon dans une microplaque pour une inspection visuelle avec un stéréomicroscope. Compter le nombre de nauplies dans chacun des cinq échantillons et les additionner.
  9. Multipliez le nombre compté par 200 (1 000 mL/5 mL) d’estimer combien de milliers de larves est dans le bécher ensemble. S’il y a trop de larves nauplius dans le bécher, diluer l’échantillon jusqu'à ce que la densité est d’au plus 14 000 larves/L (généralement de l’ordre de 11 000 – 12 000 larves/L).
  10. Ajouter 1 L de b. improvisus nauplies dans un seau, ajoutant ainsi à peu près 11 000 – 12 000 larves par seau.
    Remarque : Veillez à ne pas ajouter plus de nauplies, puisque cela sera trop peu de nourriture pour les larves et, par conséquent, augmenter la mortalité.
  11. Après 3 jours, recueillir les nauplii barnacle sur un tamis 90 µm. Puis nettoyer le seau (avec 75 ° C d’eau douce), remplissez-le d’eau de mer filtrée, ajouter un nouveau flux de diatomées (le même montant comme au début) et enfin rajouter les nauplies. Cypris commencent à apparaître après 6 jours environ (± 1 jour).
  12. Recueillir les cypris tout d’abord avec un tamis 90 µm (conçu comme point 4.2 ci-dessus). Séparer ensuite les nauplies barnacle non mué et cypris avec un tamis de 320 µm sur le dessus de tamis 160 µm. B. improvisus nauplius recueillera dans les 320 µm tamis et cypris dans le tamis de 160 µm.
    Remarque : La larve cypris peut-être être conservée à 10 ° C dans un plat de cristallisation dans l’obscurité pour un usage ultérieur, jusqu'à ca. 6 jours. Cependant, le stockage peut affecter la qualité et la performance des larves barnacle, donc expériences comparant différents traitements devraient idéalement utiliser des larves du même lot (et les durées de conservation semblables) pour éviter la confusion des effets16.

5. culture de micro-algues comme nourriture pour les larves Nauplius Barnacle

Remarque : Les algues ont été cultivés dans 3 différents types de cultures : (i) stock de cultures, qui sont pour le maintien à long terme des souches qui ont été utilisés pour l’inoculation du scaling-up ; (ii) début des cultures, qui constituent la première étape dans l’intensification ; et enfin (iii) la culture de la production, qui est l’échelle de la production finale de grandes quantités d’algues comme barnacle se nourrissent.

  1. Espèces de diatomées d’ordre de la Culture Collection of Algae and Protozoa (CCAP) pour servir de nourriture pour les larves nauplius de barnacle. Les 2 espèces Skeletonema marinoi (souche CCAP 1077/5) et Chaetoceros simplex var. gracilis (souche CCAP 1085/3) tous les deux donnent de bons résultats comme aliment pour animaux.
  2. Filtrer l’eau de mer tous à utiliser dans les cultures d’algues, en utilisant un système de filtre de cartouche avec une taille de pore nominale de 0,2 µm. (l’eau de mer filtrée est également à utiliser pour l’éclosion des oeufs a. salina et la mise en culture des larves nauplius barnacle.) Stériliser l’eau de mer filtrée pour les cultures d’algues (à 105 ° C pendant 5 min).
  3. Préparer un support pour la culture de micro-algues, à l’aide d’autoclavés eau de mer enrichie avec une solution f/2 de Guillard contenant des nutriments inorganiques, oligo-éléments et vitamines (voir Guillard 197517 pour la recette détaillée). En outre, préparer une solution de silicate (Na2SiO3), mais ce séparer de l’enrichissement de f/2 afin d’éviter une précipitation solide.
    Remarque : Les concentrations de la solution mère de l’enrichissement et la solution de silicate étaient prêts à être utilisés comme une addition de 1 mL de chaque à 1 L d’eau de mer.
  4. Autoclave, tout l’équipement utilisé dans la culture d’algues à 120 ° C pour 20 min. Autoclave visse tubes à essai 1 ml d’enrichissement f/2 et 1 mL de solution de silicate. Ajoutez les solutions d’enrichissement et de silicate à theseawater lorsque les verres stérilisés à l’autoclave et les liquides ont refroidi à la température ambiante.
  5. Cultiver des cultures mères de microalgues dans des éprouvettes de 40 mL avec bouchons à vis.
    1. Remplir les tubes à essai avec environ 30 mL de l’eau de mer enrichie. Ensemencer les cultures avec une pipette Pasteur stérile à l’aide d’environ 1 mL d’une culture de réserve âge de 2 semaine. La capsule à vis est ensuite montée mais pas serrée, afin de permettre des échanges gazeux. Le cas échéant, l’inoculation doit effectuer dans une enceinte à flux laminaire pour réduire le risque de contamination.
      Remarque : Les cultures mères vise à maintenir les cultures algales sur une base à long terme et pour servir d’inoculum pour démarrer les cultures. Cultures mères ont été re-inoculés toutes les 2 semaines.
    2. Exposer la nouvelle culture de réserve à une lumière blanche avec une intensité de ca. 25 – 50 µmol m-2s-1 (avec un cycle lumière-obscurité de 16:8 h). Déplacer les anciennes cultures de stock à une faible intensité lumineuse comme un back-up. Jeter toute cultures mères âgés de 2 semaines.
  6. Pour l’intensification de la culture de la production d’algues, ensemencer les cultures de début de la culture de réserve et cultivez-les dans 500 mL Erlenmeyerflasks.
    1. Les erlenmeyers autoclave 4, pipettes et bouchons en coton avec 300 mL d’eau de mer filtrée (0,2 µm) et 4 tubes à essai avec 0,3 mL d’enrichissement f/2 et 4 avec des solutions de silicate. Refroidir l’enrichissement de la f/2 et le silicate à température ambiante et ajouter les solutions pour les erlenmeyers. Les inoculer avec ca. 1 mL de la culture 2 - semaine vieux stock.
      NOTE : Préparez 2 flacons avec S. marinoi et 2 c.simplex.
    2. Placer les fioles sur une table vibrante dans une intensité de 50 µmol m-2s-1. Lorsque les cultures de départ ont acquis des populations denses d’algues (brun-jaune en couleur), ils sont prêts à être utilisés comme inoculum pour les cultures de production qui fourniront la balane larves avec de la nourriture.
  7. Poussent les cultures de production dans des bouteilles en polycarbonate 4 L avec bouchons en silicone avec 2 port percés et munie de tubes de verre.
    1. Se connecter 1 tube en verre pour atteindre jusqu’au fond de la bouteille pour une pompe à air via un tube de silicone équipé d’un filtre à air de 0,2 µm. Assurez-vous que le deuxième tube de verre se termine juste en dessous le bouchon silicone et est rempli avec du coton pour permettre la sortie de l’air injecté.
    2. Chaque semaine, remplissage quatre 4 L bouteilles avec autoclave et l’eau de mer filtrée eux ainsi que les bouchons. En outre, le test autoclave 4 tubes avec 4 mL de solutions d’enrichissement et de silicate de f/2.
    3. Après refroidissement, ajouter l’enrichissement de f/2 et de la solutions de silicate pour les bouteilles et les ensemencer ensuite avec la moitié du volume des cultures dans les flacons d’Erlenmeyer start-up.
    4. Placez les quatre bouteilles de 4 L à une intensité de 50 à 100 µmol m-2s-1.
    5. Récolter les cultures de production après ca. 1 semaine ; ils sont alors suffisamment denses pour être utilisée pour alimenter la balane larves nauplius.
      Remarque : Les cultures de Production ont une durée de vie d’environ 2 semaines, ce qui signifie qu’il y a 8 bouteilles de production active à tout moment.

6. la conception des études expérimentales utilisant des balanes

  1. Placer des panneaux avec des balanes adultes ou juvéniles dans les aquariums contrôlés où ils peuvent être cultivés sous identicalconditions. C’est ce qu’on appelle une expérience de jardin, qui, par exemple, peut être utilisée pour comprendre les adaptations locales ou plasticité phénotypique18, ou d’étudier les modifications de l’expression génique par rapport à des facteurs externes (p. ex., salinité, température et pH).
    Remarque : Il est également possible d’utiliser les balanes directement prélevés sur le terrain sur les panneaux. Un avantage d’utiliser des individus reproducteurs de laboratoire est que les effets maternels pourraient être évités lors de l’utilisation de la prochaine génération de descendants.
    1. Exposer les balanes aux conditions environnementales spécifiques pendant un intervalle de chosentime, suivi de la récolte des adultes (par exemple, pour les études sur l’expression génique)2.
  2. Pour les expériences larve cypris pour étudier l' expression de gène3, placez les cypris dans des aquariums contrôlés où des larves peuvent être cultivées dans des conditions identiques.
    1. Récolter les cypris après une période de temps spécifiée en filtrant avec des tamis (comme indiqué au point 4.7) et extrayez RNA selon les protocoles ci-dessous (étape 8).

7. dissection des balanes

  1. Nettoyer l’espace de laboratoire où la dissection et l’échantillonnage de l’ADN sont exécutées, bothbefore et entre les individus, y compris tous les outils de dissection. Cela se fait à l’aide de chlore pour le banc (ou éthanol à 96 % pour le forceps).
    NOTE : Les tubes étiquetés contenant des supports de fixation (éthanol ou une solution de stabilisation RNA) sont préparées à l’avance.
  2. Sélectionner des personnes affamées grands et à court terme (ne se nourrissent pas eux pendant 2 jours avant la dissection). Nettoyer la coquille de Bernache avec une brosse à dents pour minimiser le risque de contamination des autres espèces (p. ex., bactéries, algues) et rincer avec de l’eau.
    NOTE : La raison de la famine à court terme des individus avant la dissection consiste à éviter toute contamination de l’ADN (par exemple, d’artémias dans le tube digestif ).
  3. Placez les balanes individuels sur une surface plane, soit attachée à un panneau ou en vrac dans un plat. Disséquer les tissus respectifs de l’adulte. Il y a plusieurs façons de disséquer les balanes, selon le but de l’étude.
    1. Méthode de dissection A: fixant la balane toute aussi rapidement que possible.
      1. Retirez la balane entière du panneau à l’aide d’un scalpel, insérant sous la balane et à proximité de la surface du panneau.
        Remarque : Dans la plupart des cas, cette manipulation laisse la plaque basale presque intact, n’enlèvent la balane à l’intérieur.
      2. Crack soigneusement la coque extérieure d’un côté en insérant des pinces (Figure 3). Ceci est fait pour faciliter l’intrusion d’un support de fixation à l’intérieur de la coquille.
        Remarque : Si la coquille est cassée pas du tout avant de placer la balane dans un tube à essai, il peut conduire à un processus de fixation plus lent et d’une qualité inférieure de l’ADN par la suite.
      3. Mettre la balane cassée dans le tube à essai contenant une solution de stockage de RNA ou l’éthanol. Laissez la balane dans la solution pendant au moins 24 h pour sa fixation. Quand la balane est fixée, l’animal peut être retiré le support de fixation et placé sur un plateau de dissection. Les cirres, manteau et soma (corps) peuvent être séparés les uns des autres et placés dans des tubes distincts pour davantage d’extractions d’ADN ou d’ARN.
        Remarque : Il est important d’observer si oeuf lamelles avec les œufs fécondés sont présents à l’intérieur de la nonnette. S’il est présent, il doivent être retirés avant de procéder avec les extractions d’ADN pour éviter de trouver plusieurs génotypes dans l’échantillon.
    2. Méthode de dissection B: supprimant la balane depuis le shell avant sa fixation.
      Remarque : Cette méthode peut entraîner pas toujours dans le manteau à échantillonner depuis qu’il est attaché à l’intérieur de la calcareousshell. Mais il peut être une méthode rapide pour prélever l’ADN d’un individu.
      1. Retirez soigneusement, en utilisant des pinces de dissection, le tergal et chez les plaques (Figure 3) en insérant la pointe de la pince entre les plaques de tergal et chez, saisissant la main sur une plaque et en tirant doucement pour les supprimer.
      2. Grab tenez des cirres avec la pince et tirer la balane directement vers l’extérieur et placez-le directement dans l’éthanol à 96 % ou ARN stabilisant de solution pour la fixation...
        Remarque : Parfois, le manteau est également échantillonné dans le même temps, comme on le voit comme un épithélium mince avec une pigmentation foncée (en b. improvisus). Sinon, le manteau soit retiré de l’intérieur de la coquille à l’aide d’un scalpel et, par la suite, placé dans l’éthanol ou l’ARN stabilisant de solution.
        Remarque : Les plaques tergal et chez (si elle est intacte) peuvent être séchés et sauvés car ils sont utiles pour l' identification de l’espèce10. Une recommandation générale, si il n’y a aucun doute de l’espèce, est aussi photographier la balane entier avant l’initialisation de la dissection.

8. RNA Extraction pour PCR Quantitative

  1. Mettre les adultes à utiliser pour les extractions de RNA en un ARN stabilisant de solution, incuber les pendant la nuit (jusqu'à 24h) à 4 ° C et puis les stocker à-80 ° C.
    NOTE : Larve cypris est préférentiellement sec-congelés, sans RNA plus tard directement à-80 ° C, en les plaçant dans des cryotubes et puis plonger les tubes brièvement (30 s) dans l’azote liquide avant leur stockage à-80 ° C.
  2. Au moment de l’extraction de l’ARN, décongeler les balanes sur glace et utilisez-les intact ou disséquer sur les tissus à utiliser (voir étape 7).
    Remarque : en raison de la forte diversité génétique entre individus (≈ 3 à 5 % de variation dans le codage des régions ; Rosenblad Alm et al., données non publiées), il est conseillé de poola nombre de personnes adultes, ce qui minimise les effets des variations de séquence entre les individus dans l’étape ultérieure de qPCR.
  3. Pour la RNAextraction, ajouter 350 µL de tampon de lyse fourni avec un kit de préparation d’ARN dans des tubes d’homogénéisation contenant 2,8 mm de perles en céramique.
    Nota : Les perles en céramique donnent un meilleur rendement de l’ARN par rapport à sonication (Représentant résultats).
  4. Prendre une balane adulte (entières ou en tissus) ou recueillir un minimum de 20 larves cypris avec une pincette et les mettre dans des tubes de l’homogénéisation.
  5. Passez directement à la perturbation et l’homogénéisation avec un moulin à billes.
  6. Mettre les tubes d’homogénéisation de l’échantillon et de perles dans le porte-Moulin de perle. Agiter les avec une fréquence de 4,0 m/s pendant 20 s. Cool l’échantillon pendant 1 min sur la glace. Répéter 2 x.
  7. Préparer l’ARN selon le protocole du kit isolation RNA disponible dans le commerce.
    NOTE : Une évaluation des risques (y compris une lecture de la fiche de données de sécurité) doit être effectuée avant d’utiliser les méthodes d’extraction d’ARN, d’identifier les substances chimiques dangereuses qui nécessitent l’utilisation d’une hotte aspirante et autres vêtements de protection, y compris les gants (par exemple, l’ajout de β-mercaptoéthanol vers le tampon de lyse pendant l’extraction de l’ARN doit être effectuée sous une hotte).
  8. Quantifier l’ARN. Préparer une solution de travail et ajouter une norme et des échantillons à un volume total de 200 µL. Vortex pour 2-3 s et les incuber pendant 2 min. Insérer les tubes dans un fluorimètre et prendre des lectures.
  9. Vérifier les échantillons d’ARN pour toute contamination de protéine avec un spectrophotomètre et leur intégrité RNA avec un système d’électrophorèse automatisée (Représentant des résultats).
    Remarque : Pour les préparations de bonne qualité, RNA est recommandé d’avoir un ratio de 260/280 nm de 2 à 2,2 et un ADN d’environ 1,8. Des valeurs inférieures indiquent des contaminations de protéine et que la procédure d’extraction doit être optimisé.

9. Gene Expression : synthèse de cDNA et qPCR

  1. Traiter la RNAwith DNase obtenus pour supprimer toute remainingDNA avant d’effectuer l’ADNc pour qPCR.
    1. Vérifiez pour contaminer l’ADN génomique en ajoutant un échantillon de RNA mais aucun transcriptase inverse lors de la préparation de l’ADNc. S’il y a une amplification par PCR du gène sélectionné sur le cDNA fait sans la transcriptase inverse, il y a contamination d’ADN à l’ARN.
      Remarque : Pour les échantillons à utiliser pour RNA-seq (RNA-ordonnancement à l’aide de la technologie de séquençage de nouvelle génération), l’étape de DNase est moins critique. En particulier, pour les échantillons ayant un faible niveau de l’ARN, l’étape de DNase peut être omise pour ne pas perdre trop de l’ARN dans le processus.
  2. Effectuer la synthèse de cDNA sur RNA DNase traités à l’aide d’un montant de l’ARN dans la plage spécifiée dans le kit de synthèse de cDNA commerciale, mais généralement, utilisation au moins 50 ng.
  3. Concevoir des amorces de qPCR afin qu’ils recuisent aux parties du gène d’intérêt où l’identité de séquence entre les individus est aussi haute que possible, mais l’identité de séquence entre les gènes paralogues est aussi basses que possible. Veuillez consulter les publications correspondantes pour les paires d’amorces spécifiques utilisées pour les études d’expression de gène de Na+/k+ ATPase3 et aquaporines2 (Figure 5).
    NOTE : À cette fin, RNA-seq séquence données de centaines de cypris ou plusieurs adultes peuvent être utilisées.
  4. Conception des amorces pour un gène à être utilisé pour normaliser les niveaux d’expression (par exemple, l’actine). Les amorces utilisées avec succès pour l’actine sont, vers l’avant : 5'-CATCAAGATCAAGATCATCGC-3' et vers l’arrière : 5'-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'.
    NOTE : Actine est un gène contrôle couramment utilisés. Cependant, d’autres ont été suggérés comme une référence et testés les balanes19. En plus de l’actine, l’utilisation de RPL8, 36B4, EF1 et NADHd1 comme une référence a été testé3. Il a été conclu qu’il n’y a pas de grandes différences dans les niveaux d’expression des gènes de référence respectifs entre soma, cirres, adulte ou cypris.
  5. Optimiser la température de recuit pour les amorces en ajoutant des quantités croissantes d’ADNc (typiquement de l’ordre de 0,25 à 50 ng) à un mélange contenant du SYBR Green, dNTP, polymérase et 0,3 µM de chaque d’apprêt avant et arrière.
  6. Exécuter des protocoles de qPCR à différentes températures recuits comme suit : une température de dénaturation initiale de 95 ° C pendant 3 min, une étape de dénaturation à 95 ° C pendant 20 s, recuit des températures de 55 à 63 ° C pendant 20 s et un allongement à 72 ° C pendant 30 s. Au total, effectuez des 40 cycles de PCR.
    NOTE : Primer efficacité devrait se situer dans une fourchette de 90 à 105 % et sont calculées comme E = (10^(-1/slope)-1) x 100 où la pente est la pente de la courbe obtenue lors du traçage de la valeur de log des concentrations cDNA contre leurs valeurs de seuil (Ct) du cycle.
  7. Effectuer qPCR en utilisant une quantité appropriée de l’ADNc, habituellement de 1 à 10 ng, utilisant le protocole PCR décrit à l’étape 3 avec la température de recuit optimale trouvée.
    Remarque : Le montant le plus élevé de l’ADNc est réservé aux gènes qui sont exprimés en quantités extrêmement faibles.

Representative Results

Avec la procédure décrite pour la mise en culture des balanes adultes de b. improvisus, jusqu'à quatre lots de nauplius larves peuvent être produits par semaine. Il serait possible de recueillir les larves nauplius presque tous les soirs, mais cela requiert plus de personnes et d’infrastructures (avec beaucoup de bernacles dans le stock de géniteurs, une culture publiera les larves en continu). Un autre facteur limitant pour la production de larves semble être la disponibilité des aliments de haute qualité, en particulier au sujet de la diatomée Skeletonema. Au maximum, chaque lot provenant du système de culture se compose d’environ 12 000 nauplius, jusqu'à 50 000 nauplius par semaine peut donc être cultivé. Cependant, quelques semaines, il peut y avoir jusqu'à dix fois moins les larves produites. Un seul adulte peut produire jusqu'à 7 000 larves par jour14, ce qui signifie que 1-2 adultes libèrent des larves pour chaque lot. Moins d’une semaine, environ 70 à 90 % des nauplies recueillies deviendra cypris (produisant environ 30 000 cypris par semaine, au maximum) qui peut être utilisé pour les essais de colonisation et les études moléculaires.

Il convient de souligner qu’il existe des variations dans les caractéristiques de cypris entre les lots, et en général, il y a des grandes variations entre les lots que dans les lots. Par exemple, le succès de décantation dans les essais de colonisation varie entre 30 et 70 % pour les différents lots. Probablement, cela est dû à la variation génétique individuelle entre les paires spécifiques des adultes libérant des larves pendant les périodes d’échantillonnage différentes. Il est, bien sûr, recommandé que les expériences répétées (réplique biologique) devraient inclure cypris d’un certain nombre de lots si les déclarations plus générales concernant les résultats doivent être effectués. La variation de lot met exigences sur le plan expérimental, où les contrôles appropriés et les normalisations en études d’expression de gène doivent être appliquées. Cependant, même après que plusieurs procédures de normalisation statistique ont été mises en œuvre qui réduisent considérablement la variation entre les lots, certains effets du lot sont habituellement toujours apparentes (données non publiées).

Suivant le protocole fourni, il est possible d’obtenir, en moyenne, 500 ng d’ARN de haute qualité de cypris aussi peu que 20, quel que soit le stade de l’établissement barnacle (tableau 1). La qualité de l’ARN est habituellement mesurée par le ratio entre les pics de 18 s et 28 (la position attendue des deux sommets sont indiqués à la Figure 4). Toutefois, dans le cas de balanes et beaucoup d’autres arthropodes, l’ARNr 28 s tombe en panne lorsqu’il est chauffé (dans le cadre de la méthode d’analyse) et migre avec le pic de 18 s20. C’est pourquoi il est, en principe, un seul pic de rRNA dans ce type d’analyse pour les balanes. Il ressort de ce test (Figure 4) qu’une homogénéisation de perles en céramique donne l’ARN la plus haute intégrité et qu’il est, par conséquent, la méthode de choix. L’ARN est suffisante en quantité et en qualité pour générer des bibliothèques de séquençage de haute qualité pour le séquençage, aboutissant à une moyenne de 70 millions de lectures par échantillon (le nombre de lectures, dépend bien sûr, le niveau du multiplexage au cours de la séquence). La quantité d’ARN est également suffisante pour l’ARNC synthèse et qPCR expression analyse d’un grand nombre de gènes.

La figure 5 illustre le résultat des analyses de qPCR d’aquaporines et de Na+/k+ ATPase (NAK1) splice variantes, où les modifications de l’expression ont été étudiées pour répondre aux changements dans les signaux environnementaux2,3. Une comparaison de l’expression relative de la longue et courte splice variantes de NAK1 montre une double augmentation pour l’ARNm NAK1 long faible salinité en ce qui concerne le court NAK (Figure 5A). Par conséquent, les données indiquent que l’épissage alternatif rend la forme longue prédominant dans des conditions de faible salinité. Dans le cas des aquaporines, il est évident que les deux paralogues transport de l’eau de AQP1 et AQP2 affichent l’expression différentielle (Figure 5B). En particulier, dans le tissu du manteau, il est évident que la AQP1 est nettement diminuées à des salinités inférieures, qui n’est pas considéré pour AQP2. Au lieu de cela, AQP2 affiche une expression légèrement accrue à des salinités inférieures, mais dans le soma. Ces résultats fournissent une base pour enquêtes des rôles fonctionnels des différents transporteurs ioniques b. improvisus et des aquaporines dans l’osmorégulation barnacle.

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble de toute culture de procédure et l’extraction de l’ARN pour les études sur l’expression génique chez les adultes. Pour initier une nouvelle culture, les panneaux sont attachées à un cadre et déployé dans la mer à 1-3 m de profondeur. Après plusieurs semaines, les panneaux avec les adultes/adolescents sont placés verticalement dans les racks dans les bacs en laboratoire. Chaque plateau contient environ 40 panneaux avec des adultes. Avec environ 100 adultes par panneau, en total ≈ 4 000 individus adultes sont cultivées par plateau. Les balanes adultes sont nourris avec des artémias et peut être gardés an-autour. Les larves nauplius sont prélevés plusieurs fois par semaine depuis les plateaux via un filtrage à travers un tamis. Les nauplies collectées sont transférées à godets maintenue à 26 ° C dans un bain d’eau et nourris avec des microalgues. Nauplii sont élevés jusqu'à ce qu’ils muent dans cypris sans alimentation, qui sont perçus par le filtrage. Nouveaux panneaux peut être établi en laboratoire par la décantation des cypris sur panneaux, soit pour fournir de nouveaux panneaux pour l’année-autour de la culture, ou d’être utilisée pour spécifiques montages expérimentaux avec des conditions extérieures altérées. ARN est ensuite extrait de mineurs / d’adultes à la fin de l’expérience ou à des moments spécifiques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Images de quelques étapes importantes dans la procédure culture. (A), cette image montre les images avec des panneaux de collecte de nouvelles populations sur le terrain. (B) cette image montre les panneaux avec des balanes adultes de b. improvisus dans les paniers qui sont placés dans des plateaux. Les panneaux sont placés environ 2 cm de distance. (C), cette image montre les plateaux avec la balane, panneaux et le réservoir d’alimentation à gauche. De chaque plateau, il y a une prise où les tamis sont placées pour la collecte des larves nauplius. (D) cette image montre que la production d’artémia d’alimentation pour les balanes adultes. (E) cette image montre l’élevage de nauplies en seaux placés dans un bain d’eau réglé à 26 ° C. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Description des étapes initiales de la dissection des balanes adultes : retirer le corps de sa coquille. Grab (A) une des plaques operculaires en insérant les pinces doucement à travers l’ouverture. Tirer doucement pour enlever la plaque et exposer l’animal. (B) retirer l’animal en saisissant la partie soma juste en dessous les cirres. (C), ce tableau montre l’anatomie générale de balanes acorn. Le manteau et potentiellement fécondés (dans l’ovaire) restent dans la cavité de la coquille lorsque le corps est tiré. Une note sur l’anatomie des balanes (pour un exposé plus approfondi, voir Anderson)9: les plaques murales d’une balane pente vers l’intérieur, et ensemble, elles forment un cône du volcan-like. Une ouverture, l’ouverture, est couverte par les deux plaques operculaires, qui forment une porte, ou l’opercule, pour fermer l’ouverture. Balanes Acorn ont généralement une plaque basale calcaire qui est collée fermement au substrat ; Cependant, certaines espèces de balanes n’ont pas ce plateau calcaire (p. ex., S. balanoides). Balanes sécrètent l’exosquelette du manteau fortement pigmenté (la carapace). La surface extérieure de la double couche du manteau est calcifiée pour devenir rigide, tandis que la surface intérieure du manteau n’est pas calcifiée et est donc flexible. À l’intérieur de l’ouverture, les cirres sont présentes en position rétractée. Ce sont les appendices thoraciques qui balanes utilisent pour l’alimentation de la suspension. Les ovaires sont situés à proximité de la base de la balane, tandis que les testicules se trouvent dans le soma. Ce chiffre a été adopté de Panova et al. 21 a été publié avec la permission de Springer. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Détermination de l’intégrité des ARNr par électrophorèse capillaire. RNA a été préparé par deux méthodes différentes d’homogénéisation : la sonication (A) et (B) les perles en céramique. L’unité sur l’axe des ordonnées, FU, est synonyme d’unités de fluorescence. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Expression génétique résulte de deux études différentes de gènes importants pour l’osmorégulation chez b. improvisus. (A), ce panneau indique l’expression différentielle telle que mesurée par qPCR de variants d’épissage de la Na+/k+ ATPase NAK1 en réponse à différentes salinités et BCP2 niveaux3. Dans le traitement de faible salinité, l’expression de l’isoforme longue (NAK1-L) est augmentée par rapport au court (ANOVA, P < 0,001). (B), ce panneau indique l’expression des aquaporines chez les adultes de b. improvisus lors de leur exposition aux différentes salinités2. qPCR a servi à déterminer les niveaux d’expression aquaporin relativement à l’actine. Les individus adultes ont été incubés à 3 différentes salinités (PSU 3, 20 et 33) pendant 14 jours. Pour la préparation d’ARN, le soma, les cirres et manteau des adultes ont été séparés. Dans les deux figures, barres d’erreur indiquent l’écart-type. Le ** et *** indiquent le niveau de signification (ANOVA), 0,01 à 0,001, respectivement. Ces chiffres ont été modifiés de Lind et al. 2 , 3. les deux chiffres sont publiés avec la permission de PLoS ONE. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Phase de colonisation Montant total de l’ARN (ng)
Nage libre 512
Exploration : Recherche étroite 518
Cypris ci-joint 550
Nouvellement métamorphosés juvénile 832

Tableau 1 : rendements d’ARN. Ce tableau indique la quantité de RNA extraite avec un kit de préparation d’ARN de piscines de 20 individus de cypris recueillis à différentes étapes au cours du processus de règlement.

Discussion

La culture de barnacle au laboratoire de recherche Marine Tjärnö (Suède) a fonctionné plus de 20 ans et a été utilisée pour des études dans de nombreux domaines de recherche différents. Plus de 30 articles scientifiques ont été publiés qui ont utilisé le système de culture au cours des dernières années, y compris les études en antifouling13,22, hydrodynamique,23, écologie chimique24, le changement climatique16 , Biologie Evolutive5et2de la biologie moléculaire.

Pour éviter la sélection de certaines personnes qui sont plus adaptées à l’environnement de laboratoire (individus qui pourrait ne pas être représentatif de la population sauvage), il est recommandé de recueillir un nouveau stock de géniteurs du champ chaque année. En outre, il est également conseillé de rajeunir la culture chaque année, puisqu’il n’y a à peu près 50-80 % de la mortalité chez les adultes au cours d’une année normale. Toutefois, si le but est de produire des lignées autofécondées ou de mettre en place des études de l’évolution expérimentale, seules les familles élevées en laboratoire doivent être utilisées.

Un bon moment pour recueillir des b. improvisus sur les panneaux au laboratoire de recherche Marine Tjärnö est en juin – août parce qu’à ce moment-là, il y a une bonne provision d’une larve cypris la mer. Vérifiez les panneaux chaque semaine pour voir quand la colonie barnacle commence et supprimer manuellement des autres se sont installés d’espèces b. improvisus (p. ex., les moules, tuniciers, bryozoaires, hydres, némertiens/vers tubicoles et autres espèces de barnacle) de la panneaux (par exemple, avec une brosse à dents). Autour de Tjärnö, il y a trois eaux peu profondes barnacle espèces présentes (b. improvisus, Semibalanus balanoideset Balanus crenatus). Cependant, b. improvisus est le principal fouler de surfaces dures lisses en juillet – août. S. balanoides a sa période de règlement au début du printemps et préfère principalement sur les substrats naturels (p. ex., pierres). B. crenatus peut survenir à faibles effectifs sur les panneaux au cours de l’été.

Il est également possible de démarrer de nouvelles générations balane adulte de cypris cultivées, ce qui serait essentiel si certains Chehalis avec des traits spécifiques ont été établies, ou dans l’étude de l’évolution expérimentale. Pour démarrer de nouvelles générations d’adultes, la plus commode consiste à régler cypris sur panneaux thermoplastiques en laboratoire. Ces panneaux avec cypris nouvellement établis pourrait également être utilisé dans les traitements expérimentaux ou pour exposition sur le terrain. En cas d’urgence, on peut aussi utiliser des adultes sur les rochers d’un site à proximité (par exemple, Idefjorden dans le cas du laboratoire de recherche Marine de Tjärnö) où b. improvisus est fréquente. Ces adultes déjà établies sont traités de la même manière que les adultes sur les panneaux, donc être placés dans des plateaux et alimentés par l’intermédiaire de système. Cellules d’écoulement permet également de créer des panneaux avec balanes25. Voici les accréditifs chambres avec filet sur les côtés où les cypris ne vous contentez pas, avec des panneaux sous la surface du seul établissement pour les larves à plancton.

Il y a plusieurs étapes qui sont essentielles pour mettre en place une culture barnacle fonctionnement à long terme, y compris toutes les étapes de la vie. Les méthodes utilisées pour la culture b. improvisus sont probablement, dans une large mesure, également applicable à d’autres invertébrés marins pélagiques, larves planctoniques. Procédures de culture de certaines espèces sont déjà bien décrites (par exemple, pour les différentes espèces d’huîtres et de moules bleues)26, tandis que pour d’autres invertébrés marins, il y a seulement quelques exemples des cultures à long terme couvrant toute leur vie cycle. Une des premières tentatives réussies de balanes (B. amphitrite) de la culture a été réalisée par Rittschof et al. 15. les ressources financières et personnelles à long terme devraient être en place avant d’envisager la mise en place d’une balane facilité de culture. L’entretien de ce type d’année-autour de barnacle culture nécessite au moins une personne travail mi-temps. Il peut y avoir quelque potentiel pour l’automatisation future de certaines étapes de la chaîne de production, principalement la culture de micro-algues27. En outre, pour réussir, il est essentiel d’avoir accès à de grandes quantités d’eau de mer de haute qualité. La culture de microalgues, Artemia et balanes n’implique pas des procédures particulières de sécurité. Cependant, les essais de certains antifouling substances ou produits chimiques toxiques peuvent devoir des précautions spéciales.

Les panneaux ont été vérifiés plusieurs fois par semaine pour des contaminations. L’eau de mer utilisée dans la culture a été pompé vers le haut d’une profondeur de 40 m dans le Fjord de Koster en dehors du laboratoire de recherche Marine de Tjärnö et était passé à travers deux filtres à sable avant d’entrer dans le circuit d’eau de laboratoire. Si aucun filtrage de l’eau n’avait été faite, il y aurait beaucoup plus de contamination dans la culture. Il est essentiel de nettoyer régulièrement les panneaux dans la culture de détritus et d’autres invertébrés (par exemple, renforcement des stolons hydroïdes et prédateurs némertiens) qui entrent dans le système par le biais de l’approvisionnement en eau de mer sur le terrain. Par exemple, si aucune larve n’est produites malgré le fait que la culture a été bien nourris et autrement semble être en bon état, le problème pourrait être la présence des némertiens qui semblent inhiber l’accouplement. Naturellement, bon nombre des organismes contaminants dans la culture au laboratoire de recherche Marine Tjärnö étaient spécifiques à la côte ouest suédoise, et autres types de contamination des organismes seront répandues et être plus difficile à d’autres endroits. Sur la côte ouest de la Suède, il est rare de trouver de la contamination par d’autres espèces de balanes sur les panneaux. Parfois, la mise en place de S. balanoides a été trouvé, mais il s’agit d’un problème très marginal (tout au plus, un art. balanoides contaminant pour 10 000 échantillons de b. improvisus ). L’absence de contamination des espèces dépendait probablement le régime pour établir de nouvelles cultures durant l’été, quand les larvaefrom b. improvisus ont été très dominante. En outre, il y avait aussi un enrichissement clair de b. improvisus sur les panneaux puisque cette espèce est sélective pour les surfaces lisses,13.

Il est indispensable d’éliminer les balanes adultes morts. Si les coquilles vides sont laissées sur les panneaux, ils peuvent devenir un refuge pour nauplies d’artémias et diverses espèces de contaminants. En outre, il a été remarqué que les individus morts influent sur le bien-être des individus, probablement avec la libération de composés toxiques lors de la décomposition de voisins. Une autre conséquence de la mortalité adulte est que certaines personnes seront laissés seul et loin de tout autres adultes afin de permettre l’accouplement (même si les balanes ont le pénis plus longs dans le monde animal par rapport à sa taille)28. Ces personnes vont survivre mais sont non productives pour les larves. Toutefois, ces individus adultes solitaires doucement peuvent être enlevés sans endommager la plaque de base et être placés horizontalement à proximité d’autres pour permettre l’accouplement. Balanes peuvent également être utilisées en plaçant des panneaux avec un adulte sur chacun, mais assez proche pour que la fécondation croisée peut survenir. De cette façon, les lignées génétiques peuvent être produite14.

Il est essentiel pour produire un flux de haute qualité et nourrir des cultures presque tous les jours. Encore quelques jours sans nourriture peuvent entraîner une libération décroissante des larves. Des essais antérieurs de la composition du régime alimentaire ont montré que les diatomées sont essentielles pour la croissance et la survie des nauplius de barnacle. Plusieurs espèces de diatomées semblent suffisantes comme se nourrir, bien que les cellules petites ou solitaires (moins de 10 µm de diamètre) peuvent être nécessaires pour l’ingestion de la nauplius. L’espèce S. marinoi, c. simplexet T. pseudonana ont tous s’est avérée l’alimentation adéquate pour nauplies de b. improvisus , ainsi que facile à cultiver. En outre, la qualité fourragère est généralement plus élevée en croissance exponentielle des algues. Il a également été signalé que les diatomées sont essentielles pour établir les cultures productives d’amphitrite B.15. Une théorie de l’importance des diatomées est qu’ils ont un profil d’acide gras unique et sont particulièrement riches en acides gras très polyinsaturés 20:529. Il a été démontré que certains acides gras sont importants pour le succès du développement des larves d’oyster30.

Au cours des années, il n’y a eu aucune incidence de maladies nuisibles dans la culture de barnacle. Dans beaucoup de commercial aquaculture d’invertébrés, comme les huîtres et les moules, les maladies sont assez communs et peuvent être très nocifs. Les effets néfastes des virus ont également des populations sauvages. L’huître indigène en France a été remplacé par l’huître portugaise Crassostrea angulata en 1925, mais cette espèce a été anéantie par un iridovirus autour de 1970,31. Plus récemment, il y a eu épisodes de mortalité massive dans l’huître Crassostrea gigas dans les cultures dans le monde entier, ce qui semble être associée à l' herpèsvirus de type 1 d’ostreid32. Aucun rapport sur les agents pathogènes, bactéries ou les virus sur les bernaches n’ont été publiés jusqu'à présent. Cependant, ont observe des séquences du virus dans le génome-projet en cours sur improvisus b., (Alm Rosenblad et al., données non publiées) mais sans aucun lien apparent aux symptômes des maladies. Mélanges d’antibiotiques ont précédemment été appliqués aux cultures afin de minimiser le risque d’infections bactériennes ; Toutefois, cette procédure est actuellement abandonnée et jusqu’ici, cela n’a pas causé des problèmes de contamination.

Si l’eau de mer est chauffée (comme décrit ci-dessus), la surchauffe peut être le risque le plus grave dans la ligne de production de la culture. Bien sûr, il est difficile de protéger contre la surchauffe, même si les capteurs et systèmes d’alerte appropriés peuvent être utilisés (par exemple, envoyer des messages e-mail ou texte à personnes responsables). L’incidence de ce type dans le passé ont entraîné la mort importante d’adultes dans la culture. Ceci peut, bien sûr, être dévastateur et ruiner les investissements à long terme de temps et d’argent. En particulier, ce serait catastrophique si les lignées génétiques ont été établies. Pour assurer la longévité de ces lignes et fixez-les à perte accidentelle, il serait souhaitable d’élaborer une méthodologie de cryoconservation des balanes. Il a été signalé que les larves de l’huître du Pacifique peuvent être congelés vers le bas et relancés avec succès partiel33. Cryobanking a également été un outil précieux pour préserver les ressources génétiques d’un large éventail d’espèces34. Même les nauplii de B. amphitrite sont censés survivre congélation35, et il a été constaté que 20 % des individus congelés en bas avec succès métamorphosé en cypris36. Toutefois, appliquant le gel pour assurer la durabilité à long terme des cultures n’a jusqu'à présent pas été adoptée, mais cela serait en effet nécessaire pour l’entretien des lignes sélectionnées ; ce serait une étape essentielle pour établir fermement b. improvisus dans un modelsystem puissant de marine.

Ici, un protocole a été présenté pour la dissection des tissus différents des adultes b. improvisus (c.-à-d., cirres, soma et manteau). Toutefois, il convient de souligner que les autres tissus peuvent également être extraits. Par exemple, les tissus mous entre le manteau extérieur et intérieur de l’espèce membraneux-base Tetraclita japonica formosana a été soigneusement isolé et utilisé pour une extraction de l’ARN et l’analyse de la RNA-seq de gene expression37. Le protocole d’extraction optimisée décrit décrit ici fournit des quantités suffisantes d’ARN de haute qualité pour le séquençage d’une quantité minimale de matière première. Tout d’abord, la collection de larves individuels directement dans les tubes d’homogénéisation minimise toute perte lors du transfert d’un tube à l’autre. En outre, parmi les différentes méthodes testées, l’homogénéisation avec perles en céramique s’est avérés pour être le rendement le plus efficace en termes de RNA et intégrité, par rapport à l’homogénéisation de sonication ou un pilon. Lors de la planification pour l’expression des gènes ou des expériences de génomique, il faut garder à l’esprit le défi de la variation génétique élevé de balanes, au moins pour b. improvisus. Barnacle présente une diversité génétique dans la gamme de 3 à 5 %, même dans les régions (Alm Rosenblad et al., données inédites) de codage. Ceci, bien sûr, met les demandes spécifiques sur la conception d’amorces pour l’analyse de qPCR, où plus conservé les régions devraient être identifiées et utilisées comme modèles pour les amorces afin d’obtenir l’expression cohérente des résultats betweenbatches. Des régions conservées de gènes cibles, comme les aquaporines et Na + / K + ATPases, peuvent être identifiés par l’étude de la variabilité de la séquence de ces gènes dans RNA-seq données obtenues à partir des populations de cypris contenant des centaines de personnes. Pour une analyse du génome, ADN est échantillonné. Cependant, obtenir l’ADN de haute qualité de b. improvisus peut être difficile de21.

En conclusion, la culture établie barnacle s’est avéré pour être instrumental dans différents types d’études expérimentales. En particulier, la production de larves tous-an-environ nous permet de réaliser des expériences sans être limité à la période de frai naturelle (pour b. improvisus, c’est au cours de l’été). Les larves obtenues peuvent être utilisés pour effectuer un large ensemble d’études expérimentales, y compris les essais de colonisation, tests de comportement, études sur l’expression des gènes spécifiques, ainsi que génome transcriptome études.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à déclarer.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par grant 2017-04559 par le Conseil de recherche suédois (VR) et le projet pris en charge front de mer de l’UE à Anders Blomberg. En particulier, la création de la facilité de culture, au cours des années, bénéficie de subventions à par R. Jonsson auprès des agences de financement suivantes : SSF (Fondation suédoise pour la recherche stratégique) grâce au programme de sciences de la mer et la technologie et MISTRA grâce au programme de peinture Marine. Kent Berntsson a joué un rôle dans les premières phases de mise en place de la culturingfacility. Financement supplémentaire pour établir la facilité de culture est venu du Centre pour la biologie Marine de l’évolution (www.cemeb.science.gu.se), qui est financée par une subvention de Linné du suédois recherche conseils FORMAS et VR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plexiglas (poly-methyl methacrylate) panels Plastic produkter, Bromma, Sweden transparent glas
1.5 L PET bottle
Artemia INVE Aquaculture, Belgium We have tested different companies; this is really the best one
Skeletonema marinoi (CCAP strain 1077/5) CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland  strain 1077/5
Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP strain 1085/3) CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland  strain 1085/3
Millipore cartridge filter system Millipore 
cartridge with a nominal pore size of 0.2 µm Millipore  cartridge CWSS01S03 High capacity for large volumes
polycarbonate bottle Nalgene autoclavable
RNA later Qiagen 76106  Fixation solution to preserve RNA
TURBO DNA-free Kit Invitrogen/Thermofisher Scientific   AM1907 DNAse kit to remove DNA from prepared RNA
iScript cDNA Synthesis Kit Biorad 1708890 cDNA synthesis kit
SYBR Green supermix Biorad 1708880 Dye for QPCR
RNeasy minikit Qiagen 74104 RNA extraction of adults or many cyprids
Soft tissue homogenising CK 14, 2 ml tubes Precellys KT03961-1-003.2 Ceramic beads for homogenisation
RNeasy micro kit Qiagen 74004 RNA extraction of few cyprids

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References

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Sciences de l’environnement question 138 balane crustacé Balanus (Amphibalanus) improvisus culture Nauplii cypris la dissection des tissus extraction de l’ARN PCR quantitative l’expression des gènes
balane <em>Balanus improvisus</em> comme modèle Marine - culture et l’Expression des gènes
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Jonsson, P. R., Wrange, A. L., Lind, U., Abramova, A., Ogemark, M., Blomberg, A. The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression. J. Vis. Exp. (138), e57825, doi:10.3791/57825 (2018).

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