Summary
De rankpootkreeften improvisus Balanus (Amphibalanus) is een model voor het bestuderen van osmoregulatie en antifouling. Echter levert natuurlijke seizoensgebonden kuitschieten een onvoorspelbare aanbod van cyprid larven. Hier, wordt een protocol voor het hele jaar door kweken van B. improvisus beschreven, met inbegrip van de productie van larven. Het gebruik van gekweekte zeepokken gen expressie studies wordt geïllustreerd.
Abstract
Zeepokken zijn mariene kreeftachtigen met een sessiele volwassene en vrijzwemmende, planktonische larven. De rankpootkreeften Balanus (Amphibalanus) improvisus is met name relevant als een model voor de studies van osmoregulatory mechanismen vanwege zijn extreme tolerantie te laag zoutgehalte. Het wordt ook op grote schaal gebruikt als een model voor de afwikkeling van de biologie, met name in verband met antifouling onderzoek. Echter levert natuurlijke seizoensgebonden kuitschieten een onvoorspelbare aanbod van cyprid larven voor studies. Een protocol voor het hele jaar door kweken van B. improvisus heeft ontwikkeld en een gedetailleerde beschrijving van alle in de productielijn stappen wordt beschreven (dat wil zeggen, de oprichting van volwassen culturen op panelen, de collectie en het grootbrengen van Rankpootkreeften larven en het beheer van diervoeders voor volwassenen en larven). De beschrijving ook geeft advies over het oplossen van problemen en bespreekt kritische parameters (bijvoorbeeld, de verwijdering van verontreiniging, de productie van hoogwaardige diervoeders, de mankracht nodig en het belang van kwalitatief hoogwaardige zeewater). Elke batch van het kweken systeem maximaal levert ongeveer 12.000 Nauplia en vier partijen kan leveren in een week, dus tot bijna 50.000 larven per week kan worden geproduceerd. De methode gebruikt om cultuur B. improvisus is, waarschijnlijk voor een groot deel ook van toepassing op de andere mariene ongewervelden met vrije-swimminglarvae. Protocollen worden uitgereikt aan de dissectie van verschillende weefsels van volwassenen, alsmede de productie van kwalitatief hoogwaardige RNA voor onderzoek naar genexpressie. Het is ook beschreven hoe gekweekte volwassenen en gefokte cyprids kan worden gebruikt in een breed scala aan experimentele designs voor de behandeling van genexpressie in verband met externe factoren. Het gebruik van gekweekte zeepokken in genexpressie is geïllustreerd met studies van mogelijke osmoregulatory rollen van nb++ ATPase /K en Zweden.
Introduction
Zeepokken zijn mariene kreeftachtigen met een sessiele volwassene en vrijzwemmende, planktonische larven. Allermeest naar de 1200 soorten zeepokken bewonen ondiep water en velen zijn vaak blootgesteld aan lage zoutgehalte. Één soort, de baai rankpootkreeften Balanus (Amphibalanus) improviseert (B. improvisus), kan bijna zoetwater tolereren en Charles Darwin dit soort uit een klein riviertje in het estuarium van Rio de la Plata in Uruguay1beschreven. Het zoutgehalte van de tolow extreme tolerantie maakt B. improvisus een bijzonder relevant model voor de studies van osmoregulatory mechanismen2,3. Deze rankpootkreeften verkiest brak voorwaarden maar is in staat van het leven in wateren met Zoutgehaltes van ongeveer 1.6 psu tot maar liefst 40 psu4. Het is de enige rankpootkreeften soort gevonden in de Brakke Oostzee. B. improvisus wordt verondersteld te zijn afkomstig uit de kust van het oosten van het Amerikaanse continent, maar vandaag is wereldwijd gevonden als gevolg van de versnippering door verzending van5. Het is een grote aangroei organisme wordt vaak gevonden op rotsen, steigers en boot vletten en daarom van algemeen belang voor het begrijpen van de mechanismen van antifouling op constructies in mariene en brakke wateren6,7.
B. improvisus -is vergelijkbaar met de meeste andere zeepokken, hermafrodiete met kruisbestuiving; Voortplanting gebeurt door de paring tussen naburige individuen met behulp van een verlengde penis en interne bevruchting. De reproductieve periode is voornamelijk van mei tot September. B. improvisus heeft zeven pelagische larvale stadia (zes naupliën gevolgd door een cyprid stadium8). De luiken van de bevruchte eicel in een nauplius larve die is vrijzwemmende en feeds in de waterkolom voor tot enkele weken vóór de Rui in een niet-voeding cyprid larve. De cyprid gebruikt meerdere aanwijzingen te vinden van een geschikte plaats om af te wikkelen en dan ondergaat metamorfose in een sessiele jonge rankpootkreeften9. De soorten kunnen worden gekweekt in het laboratorium en heeft een levensduur van 1 – 2 jaar in de zee (2 – 3 jaar in de laboratoriumcultuur). Gemiddeld, B. improvisus groeit tot 10 mm in doorsnede (met een maximum van ongeveer 20 mm) en bereikt een maximale hoogte van ongeveer 6 mm (hoewel het groter drukke omstandigheden groeien kan). De soort kan worden geïdentificeerd door zijn gladde kalkhoudende ook shell (wit of grijsachtig), de radiaal patroon kalkhoudende base van de shell-plaat en de vorm van de tergal platen1,10.
De rankpootkreeften B. improvisus heeft een aantal voordelige functies als een model voor studies van osmoregulatie, met een focus op moleculaire en fysiologische mechanismen, evenals de ecologische interacties en de evolutionaire gevolgen. Het wordt ook op grote schaal gebruikt als een model voor het onderzoek van de afwikkeling van de biologie, met name met betrekking tot onderzoek van de antifouling en de mechanismen betrokken7,11,12,13. Echter levert natuurlijke seizoensgebonden kuitschieten een onvoorspelbare aanbod van cyprid larven voor studies. De mogelijkheid om gedurende het hele jaar cultuur van deze rankpootkreeften door zijn hele levenscyclus is daarom een belangrijke troef om verschillende soorten moleculaire en mechanistische studies. Haar aanwezigheid in marine/brakke wateren wereldwijd voorziet bovendien in een combinatie van veld en experimentele studies. Gecontroleerde fokkerij kan ook produceren families van bekende stambomen voor lange termijn kweken14, en een tijd voor het genereren van een paar maanden kunnen op lange termijn experimentele evolutie. Er is ook een ontwerp-genoom en verschillende transcriptomes beschikbaar, en deze middelen zijn gebruikt voor het klonen van meerdere genen (bijvoorbeeld, genen van belang in osmoregulatie)2,3.
Het doel van dit protocol is te beschrijven hoe te stellen en onderhouden een cultuur van de rankpootkreeften B. improvisus gedurende het hele jaar teneinde gen expressie studies uitvoeren op volwassenen of larven van dit organisme. Rittschof et al. 15 in het kort beschreven een methode voor het kweken van zeepokken vanaf de release van naupliën aan de afhandeling van cyprids voor de soorten Balanus amphitrite. Het protocol is aangepast voor het hele jaar door kweken van B. improvisus bij Tjärnö Marine Research Laboratory (Zweden), en een gedetailleerde beschrijving van alle stappen in de productielijn is uiteengezet, met inbegrip van de productie en het grootbrengen van de rankpootkreeften larven, alsmede het beheer van diervoeders voor volwassenen en larven. Voor een overzicht van de volledige procedure, Zie Figuur 1. Het gebruik van het kweken systeem is geïllustreerd met enkele gemeenschappelijke experimentele opstellingen en geïllustreerd in functionele genomica studies van nb++ ATPase /K en Zweden, ophelderen van hun mogelijke functies in osmoregulatie2, 3. Soms is het essentieel om te onderzoeken van de genexpressie in specifieke weefsels, en enkele van de basisprincipes van rankpootkreeften dissectie zullen worden gedekt. Met een goed aanbod van kwalitatief hoogwaardige zeewater, moet het kweken van de rankpootkreeften B. improvisus, en mogelijk vele andere soorten, mogelijk in mariene laboratoria over de hele wereld.
Protocol
1. verzameling van volwassen zeepokken in het veld om te beginnen een nieuwe Broodstock
-
Implementeren thermoplast (poly-methylmethacrylaat) transparante panelen (110 x 110 x 1,5 mm3) op ≈ 1 – 3 m diepte in kalme wateren om te verzamelen van volwassen zeepokken uit het veld. Gebruik frames die kunnen verschillende panelen (Figuur 2), boorgaten 2 (met een diameter van 6 mm) in de bovenste hoeken van elk paneel en attachthepanelstotherackusingcableties. Dus thepanelswillhangverticallyin het water.
- Wanneer de regeling van de zeepokken (geïdentificeerd als kleine witte harde puntjes op de panelen) heeft plaatsgevonden, laat de panelen gedurende ten minste 2 – 3 weken om ervoor te zorgen dat de zeepokken groot zijn genoeg (5 mm) worden overgeheveld naar het lab zonder getting gedroogd of beschadigd.
- De panelen in het laboratorium brengen wanneer ze zijn bedekt met vaste B. improvisus die hebben bereikt een omvang van ca. 5 mm indiameter.
Opmerking: De tijd voor volwassenen om te ontwikkelen tot 5 mm in het gebied is sterk afhankelijk van de beschikbaarheid van voedsel en de temperatuur. Normaal, dit duurt ongeveer 3 weken bij de Tjärnö Marine Research Laboratory (58.87 ° noorderbreedte, 11.14 ° E). Meestal zijn panelen voor de nieuwe broodstock in het algemeen geïmplementeerd in eind juni en eind augustus verzameld. - Vóór de invoering van de panelen in de cultuur-faciliteit, reinigen van andere organismen van de panelen. Het is voor het verwijderen van andere barnacle soorten het belangrijkst. Houd er rekening mee dat het belangrijk is te vaak schoonmaken van de panelen om zich te ontdoen van soorten tijdens de teelt besmetten omdat dit aanzienlijk de kans op overleving van de broodstock verhogen zal.
- Leg de panelen verticaal op rand in een stand met gefreesde gleuven in een polyethyleen lade (400 x 400 x 20 mm-3) (cijfers 2C en 2E). De groeven in de stand zijn 15 mm uit elkaar.
- Ter voorbereiding van de schaaltjes, een poort van de ingang aan de voet en een uitlaatopening boven aan de andere kant van elke lade te maken. De inlaatopening van elke lade verbinden met een reservoir van de 100 L met ongeveer 30 L water met een inham van de open zeewater bij 20 ° C met een snelheid van cazodat een doorstroomtest. 2 L per min.
Opmerking: Maximaal 8 lades waren verbonden met een enkele 100 L reservoir. - Het 100 L reservoir verbinden met verwarmd zeewater (20 ° C) (bijvoorbeeld geboden door een warmtepomp die warmte uit het binnenkomende zeewater uitwisselen).
Opmerking: De rankpootkreeften B. improvisus kunnen groeien en reproduceren op een volledige mariene zoutgehalte (30 – 35 psu); echter, het verminderen van het zoutgehalte tot ca. 25 psu door toevoeging van zoet water naar het reservoir 100 L verhoogt de productie van larven uit de cultuur.
2. vanaf nieuwe generaties van volwassenen door gekweekte Cyprids
- Construct kubussen van kunststof panelen open aan de bovenkant door tape 5 panelen samen met behulp van een niet-giftig, waterafstotende tape.
- Plaats van de kubus in een kleine lade (in geval van lekkage) en vul deze met zeewater (25 psu). Houd het water op kamertemperatuur (ca. 20 ° C). Ongeveer 200 cyprids op de bovenkant van de kubus toevoegen.
- Voeden de jonge exemplaren met 100 mL Skeletonema marinoi om de andere dag (zie stap 5) terwijl in de kubus.
Opmerking: Juvenile zeepokken kunnen hebben problemen met inname van Artemia salina (zie stap 3) omdat ze groot en dus moeilijk te slikken voor een nieuw gevestigde rankpootkreeften. - Wijzig het water 1 x per week.
- Na 2 weken, wanneer de panelen genoeg gevestigde juvenielen van ten minste 5 mm in diameter bevatten, de kubus uit elkaar te halen en naar de panelen met de jonge trays met stroom-throughseawater en, daarna, het voeden van de zeepokken met A. salina naupliën.
3. cultuur van Artemia salina naupliën als diervoeder voor volwassen zeepokken
- Opzetten van een kweken systeem voor A. salina met behulp van een plastic fles van 1,5 L waar de bottomis afgesneden en de fles ondersteboven in een stand en verlichte vanaf de zijkant wordt geplaatst. Past het knelpunt op een buis van silicium met een klem en bevestig het aan een beluchting pomp (Figuur 2D).
- Om het uitkomen van de eieren, voeg toe ongeveer 15 mL droge rust eieren van Artemia aan 1 L ofseawater.
Opmerking: Artemia eieren hatch in nauplius-larven na 24-48 uur. Om te vertragen de broedeieren van A. salina naupliën (bvin het weekend), kan het licht worden uitgeschakeld om de temperatuur iets. - Verkrijgen van Artemia naupliën, uitschakelen van de beluchting en donker het bovenste deel van de fles met aluminiumfolie (of soortgelijke bijvoorbeeldeen blikje)... Verlichten die het onderste deel van de fles voor 10 min. Hatched Artemia naupliën naar het licht zwemmen zal. Niet-gearceerde cysten zal zinken naar de bodem, en schelpen van de cyste wordt een zwevende werkbalk aan de oppervlakte.
- Open de klem aan de onderkant. Verzamel de tussenliggende breuk als een dichte bevolking van het zwemmen-naupliën.
Opmerking: Elke dag (behalve in het weekend), 1 L van de dichte Artemia naupliën ophanging was handmatig toegevoegd aan het reservoir van de 100 L verbinden met de schaaltjes met de volwassen zeepokken. Vermijd elke voeding met lege cyste shells, aangezien ze geen voeding verstrekken en vooral zijndoelserver opnieuw hoeft te reinigen van de cultuur meer korte tussenpozen.
4. verzameling en het grootbrengen van Barnacle larven
- De panelen met volwassen zeepokken schoon door ze voorzichtig spuiten met zoetwater en, indien nodig verwijderen elke aangroei van de rankpootkreeften schelpen en panelen met een zachte tandenborstel. Ook de trays (zonder zeepokken) en buizen in warm (75 ° C) schoon zoet water.
- Plaats een zeef gemaakt van een 90 µm plankton-net vastgelijmd aan het eind van een gesneden PVC pijp (16 cm diameter, hoogte 15 cm) in een polyethyleen lade (30 x 20 x 10 cm3) met een overloop-poort. Verzamel de B. improvisus larven in de zeef 's nachts (Figuur 2C).
Opmerking: De zeef was net onder de uitlaatopening van de lade van de rankpootkreeften panelen te ontvangen van het uitstromende water en uitfilteren van de naupliën gepositioneerd. De larven bleef in de zeef, terwijl het zeewater overstroomd de kleine lade. Deze kleine lade ervoor gezorgd dat de zeef nooit driedout. - Een 30 L emmer in een grote waterbad plaatsen, waar de temperatuur bij 26 ° C met behulp van aquarium fish tank kachels(Figuur 2). Beluchting en agitatie zijn verzekerd door lucht-borrelt via het systeem.
- Vul de emmer met 20 L van gefilterde zeewater (0,2 µm; 25 psu). 1 L toevoegen aan de emmer van een 60/40-mix van de 2 Diatomee microalgen, S. marinoi en C. gracilis (zie stap 5). Dit geeft een eerste dichtheid van ongeveer 5 x 104 diatomeeën per mL in de emmer.
Opmerking: Barnacle naupliën larven zijn positief phototactic. De emmers werden gemaakt van ondoorzichtig wit plastic met deksels die enig licht doorlaten. Tijdens de winter, werd de kamer aangestoken overdag (8:00 – 17:00), maar donker tijdens de nacht. Tijdens de zomer kwam het buiten licht in de kamer tijdens het grootste deel van de dag. - Overdracht van de verzamelde B. improvisus naupliën naar een crystallizing schotel (300 mL; 90 mm diameter 50 mm in hoogte).
- Verlicht de schotel vanaf de kant, dat de larven naar de lichtbron trekken zal. Het verzamelen van de rankpootkreeften naupliën die bij het binnenkomende licht met een pipet verzamelen en overbrengen naar een andere crystallizing schotel. Verwijder eventuele resterende Artemia larven.
- De larven van de naupliën B. improvisus overbrengen in een bekerglas met 1 L van gefilterde zeewater.
- Het aantal naupliën door te roeren het bekerglas zachtjes om een zelfs opschorting van larven en vervolgens vijf monsters van 1 mL vanop verschillende plaatsen in het bekerglas. Pipetteer elk monster in een microplate voor een visuele inspectie met een stereomicroscoop. Tel het aantal naupliën in elk van de vijf monsters en ze kloppen.
- Vermenigvuldig het getelde aantal met 200 (1000 mL/5 mL) in te schatten hoeveel duizenden larven zijn in het hele bekerglas. Als er teveel nauplius-larven in het bekerglas, Verdun het monster, totdat de dichtheid hooguit 14.000 larven/L (meestal in het bereik van 11.000 – 12.000 larven/L is).
- 1 L van B. improvisus naupliën toevoegen aan een emmer, waardoor ongeveer 11.000 – 12.000 larven per emmer.
Opmerking: Zorg ervoor dat niet toe te voegen meer naupliën, aangezien dit zal in te weinig voedsel ten opzichte van de larven resulteren en, vandaar, het verhogen van sterfte. - Na 3 dagen, rankpootkreeften naupliën te verzamelen op een zeef 90 µm. Vervolgens schoon de emmer (met 75 ° C zoetwater), vul het met gefilterde zeewater, voeg een nieuwe Diatomee feed (evenveel als aan het begin), en ten slotte de naupliën opnieuw toe te voegen. Cyprids beginnen te verschijnen na ongeveer 6 dagen (± 1 dag).
- Verzamelen cyprids eerst met een 90 µm zeef (ontworpen overeenkomstig punt 4.2 hierboven). Weer niet-moulted rankpootkreeften Nauplia en cyprids worden gescheiden met een 320 µm zeef bovenop een 160 µm zeef. B. improvisus naupliën zal verzamelen in de 320 µm zeef en cyprids in de zeef 160 µm.
Opmerking: De cyprid larven kunnen worden opgeslagen bij 10 ° C in een crystallizing schotel in duisternis voor later gebruik, tot ca. 6 dagen. Echter, de opslag kan invloed hebben op de kwaliteit en prestaties van de rankpootkreeften larven, zodat experimenten vergelijken verschillende behandelingen moeten idealiter larven uit de dezelfde partij (en soortgelijke opslagtijd) om te voorkomen dat storende effecten16gebruiken.
5. cultuur van microalgen als voeder voor Barnacle Nauplius-larven
Opmerking: Algen zijn geteeld in 3 verschillende soorten culturen: (i) voorraad culturen, die zijn voor het onderhoud op lange termijn van de spanningen die voor de inoculatie van de schaalvergroting gebruikt werden; (ii) start culturen, die de eerste stap in het opschalen; en tot slot (iii) de productie-cultuur, die de omvang van de definitieve productie van grote hoeveelheden algen als rankpootkreeften is voeden.
- Diatomee soorten bestellen op de cultuur collectie van algen en Protozoa (CCAP) moet worden gebruikt als diervoeder voor de rankpootkreeften nauplius-larven. De 2 soorten Skeletonema marinoi (CCAP stam 1077/5) en Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP stam 1085/3) beide geven goede resultaten als diervoeder.
- Filteren van alle zeewater worden gebruikt in de algenculturen, met behulp van een cartridge filtersysteem met een nominale poriegrootte van 0,2 µm. (de gefilterde zeewater moet ook worden gebruikt voor het uitbroeden van eieren van A. salina , en het kweken van rankpootkreeften nauplius-larven.) Autoclaaf de gefilterde zeewater voor de algenculturen (bij 105 ° C gedurende 5 minuten).
- Bereiden een medium voor de cultuur van microalgen, met behulp van gesteriliseerde met autoclaaf zeewater verrijkt met Guillard de f/2 oplossing met anorganische voedingsstoffen, metaalsporen en vitaminen (Zie Guillard 197517 voor de gedetailleerde recept). Daarnaast bereiden een oplossing van silicaat (nb2van SiO3), maar houden dit los van de verrijking van de f/2 om te voorkomen dat een solide neerslag.
Opmerking: De concentratie van de stockoplossing van de verrijking en de stockoplossing van silicaat bereid waren om te worden gebruikt als een toevoeging van 1 mL van elk 1 L van zeewater. - Autoclaaf alle apparatuur gebruikt in de algencultuur bij 120 ° C voor 20 min. autoclaaf schroef-afgetopte reageerbuisjes met 1 mL f/2 verrijking en 1 mL silicaat oplossing. Voeg de verrijking en silicaat oplossingen aan theseawater als de gesteriliseerde met autoclaaf glaswerk en vloeistoffen hebben afgekoeld tot kamertemperatuur.
-
Stamculturen van microalgen in proefbuizen 40 mL met schroefdoppen groeien.
- Vul de reageerbuisjes met ongeveer 30 mL van de verrijkte zeewater. De culturen met een steriele Pasteur Pipetteer met behulp van ongeveer 1 mL van een 2 week oud voorraadculturen worden geënt. De schroefdop is vervolgens gemonteerd maar niet aangescherpt, zodat sommige Gaswisseling. Indien beschikbaar, moet de inenting worden uitgevoerd in een laminaire flow kabinet om het risico van besmetting.
Opmerking: De stamculturen beoogt te handhaven algenculturen op lange termijn en om te dienen als entmateriaal voor start culturen. Stamculturen werden opnieuw geënt elke 2 weken. - Bloot de nieuwe voorraadculturen aan een wit licht met een intensiteit van ca. 25-50 µmole m-2s-1 (met een licht-donker cyclus van 16:8 h). Verplaats de oude stamculturen naar een lage lichtintensiteit als back-up. Elke 2 weken oude stamculturen negeren.
- Vul de reageerbuisjes met ongeveer 30 mL van de verrijkte zeewater. De culturen met een steriele Pasteur Pipetteer met behulp van ongeveer 1 mL van een 2 week oud voorraadculturen worden geënt. De schroefdop is vervolgens gemonteerd maar niet aangescherpt, zodat sommige Gaswisseling. Indien beschikbaar, moet de inenting worden uitgevoerd in een laminaire flow kabinet om het risico van besmetting.
-
Voor de schaalvergroting aan de cultuur van de productie van algen, de culturen van de start van de voorraadculturen worden geënt en groeien ze in 500 mL Erlenmeyerflasks.
- Autoclaaf 4 conische kolven, pipetten en katoen stoppen met 300 mL gefilterde (0,2 µm) zeewater en 4 reageerbuisjes met 0.3 mL f/2 verrijking en 4 met silicaat oplossingen. De verrijking van de f/2 en de silicaat tot kamertemperatuur afkoelen, en voeg de oplossingen aan de conische kolven. Inoculeer hen met ca. 1 mL van de 2 - weken oude voorraadculturen.
Opmerking: Voorbereiden 2 flacons met S. marinoi en 2 met C. simplex. - Zet de kolven op een schudden tafel in een lichtsterkte van 50 µmole m-2s-1. Wanneer de start culturen hebben verworven dichte algen populaties (geel-bruin van kleur), zijn ze klaar om te worden gebruikt als entmateriaal voor de productie-culturen die van de rankpootkreeften larven voedsel voorzien zal.
- Autoclaaf 4 conische kolven, pipetten en katoen stoppen met 300 mL gefilterde (0,2 µm) zeewater en 4 reageerbuisjes met 0.3 mL f/2 verrijking en 4 met silicaat oplossingen. De verrijking van de f/2 en de silicaat tot kamertemperatuur afkoelen, en voeg de oplossingen aan de conische kolven. Inoculeer hen met ca. 1 mL van de 2 - weken oude voorraadculturen.
-
Groeien productie culturen in 4 L polycarbonaat flessen met siliconen stoppen met 2 geperforeerde poorten uitgerust met glazen buizen.
- Sluit 1 glazen buis naar de bodem van de fles een luchtpomp via een Siliconen slang met een luchtfilter 0,2 µm uitgerust te bereiken. Zorg ervoor dat de tweede glazen buis eindigt net onder de silicone stop en is gevuld met katoen zodat de uitgang van de geïnjecteerde lucht.
- Elke week, flessen opvulling vier 4 L met gefilterde zeewater en autoclaaf hen samen met de stoppers. Daarnaast buizen autoclaaf 4 test met 4 mL f/2 verrijkings- en silicaat oplossingen.
- Na afkoeling de f/2 verrijking en silicaat oplossingen toevoegen aan de flessen en vervolgens hen te inoculeren met de helft van het volume van de culturen van de start-up in de conische kolven.
- Plaats de vier 4 L flessen met een lage intensiteit van 50-100 µmole m-2s-1.
- Oogst de productie culturen na ca. 1 week; ze zijn dan voldoende dicht moet worden gebruikt voor het voederen van de rankpootkreeften nauplius-larven.
Opmerking: Productie culturen hebben een levensduur van ongeveer 2 weken, wat inhoudt dat er 8 actieve productie flessen op elk gewenst moment.
6. ontwerpen van experimentele Studies met zeepokken
-
Plaats de panelen met jonge of volwassen zeepokken in gecontroleerde aquaria waar ze kunnen worden gekweekt onder identicalconditions. Dit heet een common-tuin-experiment, dat, bijvoorbeeld, kan worden gebruikt om lokale aanpassingen of fenotypische plasticiteit18te begrijpen, of om te studeren van gen expressie veranderingen met betrekking tot externe factoren (bv, zoutgehalte, temperatuur of pH).
Opmerking: Het is ook mogelijk te gebruiken zeepokken direct verzameld uit het veld op de panelen. Een voordeel van het gebruik van laboratorium-gefokt individuen is dat moeders effecten bij het gebruik van de volgende generatie nakomelingen kunnen worden vermeden.- Zeepokken aan de specifieke ecologische omstandigheden bloot tijdens een chosentime interval, gevolgd door het oogsten van volwassenen (bijvoorbeeldvoor onderzoek naar genexpressie)2.
-
Voor experimenten met cyprid larven te bestuderen van gene expression3, plaatst u de cyprids in gecontroleerde aquaria waar larven onder identieke omstandigheden kunnen worden geteeld.
- Oogst van de cyprids na de opgegeven perioden door filteren met zeven (zoals beschreven in stap 4.7), en uittreksel van RNA volgens de protocollen hieronder (stap 8).
7. dissectie van zeepokken
- Reinig de lab-ruimte waar de dissectie en de bemonstering van DNA worden uitgevoerd, bothbefore en tussen individuen, met inbegrip van alle hulpmiddelen van de dissectie. Dit wordt gedaan met behulp van chloor voor de Bank (of 96% ethanol voor de verlostang).
Opmerking: Gelabelde buizen met fixatie media (ethanol of een RNA stabilisatie oplossing) worden voorbereid. - Selecteer grote en op korte termijn uitgehongerd individuen (Don't feed hen voor 2 dagen vóór de dissectie). Reinig de rankpootkreeften shell met een tandenborstel te minimaliseren van het risico van besmetting van andere diersoorten (bijvoorbeeld, bacteriën, algen) en spoel het af met water.
Opmerking: De reden voor de korte termijn honger van personen voor de dissectie is om elke besmetting van DNA (bvvan Artemia -eitjes in de darm) voorkomen. -
De individuele zeepokken op een egaal oppervlak, gekoppeld aan een panel of los in een schotel plaatsen. Het ontleden van de respectieve weefsels van de volwassene. Er zijn verschillende manieren om te ontleden zeepokken, afhankelijk van het doel van de studie.
- Dissectie methode A: vaststelling zo spoedig mogelijk de hele rankpootkreeften.
- De hele rankpootkreeften verwijderen uit het deelvenster met behulp van een scalpel, het onder de rankpootkreeften en dicht bij de oppervlakte van het paneel Invoegen.
Opmerking: In de meeste gevallen, deze manipulatie laat de basale plaat bijna intact, dus niet van invloed op de rankpootkreeften binnen. - Zorgvuldig barst de buitenste schil aan de ene kant door het invoegen van pincet (Figuur 3). Dit wordt gedaan om het binnendringen van een fixating medium in de schelp.
Opmerking: Als de shell niet helemaal gebroken is alvorens de rankpootkreeften te plaatsen in een reageerbuis, kan dit leiden tot een tragere fixatie proces en later een inferieure kwaliteit van DNA. - Zet de gebroken rankpootkreeften in de reageerbuis met RNA opslagoplossing of ethanol. Laat de rankpootkreeften in de oplossing gedurende ten minste 24 uur voor de fixatie. Wanneer de rankpootkreeften is vastgesteld, kan het dier worden onttrokken aan de fixatie media en geplaatst op een dissectie dienblad. De cirri, mantel, soma (lichaam) kunnen worden van elkaar gescheiden en geplaatst in afzonderlijke buizen voor verdere extracties van DNA of RNA.
Opmerking: Het is belangrijk om te observeren als ei lamellen met bevruchte eieren aanwezig binnen de rankpootkreeften zijn. Indien aanwezig, moeten deze worden verwijderd voordat u verdergaat met de DNA-extracties om te voorkomen dat meerdere genotypen vinden in de steekproef.
- De hele rankpootkreeften verwijderen uit het deelvenster met behulp van een scalpel, het onder de rankpootkreeften en dicht bij de oppervlakte van het paneel Invoegen.
- Dissectie methode B: de rankpootkreeften verwijderen vanuit de shell voor de fixatie.
Opmerking: Deze methode kan niet altijd leiden tot de mantel wordt bemonsterd, omdat het vastzit aan de binnenkant van de calcareousshell. Maar het kan een snelle methode voor de bemonstering van DNA van een individu.- Verwijder voorzichtig, met behulp van dissectie pincet, de tergal en scutal platen (Figuur 3) door de tip van de verlostang tussen de platen tergal en scutal invoegen, grijpen greep van een plaat en trekken zachtjes om ze te verwijderen.
- Grab greep van de cirri met de Tang en trek de rankpootkreeften rechtstreeks uit en plaatst u deze rechtstreeks in 96% ethanol of RNA oplossing voor fixatie te stabiliseren...
Opmerking: Soms, de mantel zal ook worden bemonsterd op hetzelfde moment, zoals gezien als een dunne epitheel met donkere pigmentatie (in B. improvisus). Anders, de mantel kan worden verwijderd uit de binnenkant van de schelp met behulp van een scalpel en daarna geplaatst in ethanol of RNA oplossing te stabiliseren.
Opmerking: De tergal en scutal platen (als intact) kunnen worden gedroogd en opgeslagen omdat ze nuttig voor de soort identificatie10 zijn. Een algemene aanbeveling, indien er enige twijfel soorten, is ook de hele rankpootkreeften vóór het initialiseren van de dissectie fotograferen.
- Dissectie methode A: vaststelling zo spoedig mogelijk de hele rankpootkreeften.
8. RNA extractie voor kwantitatieve PCR
- Zet volwassenen moet worden gebruikt voor RNA extracties in een RNA oplossing te stabiliseren, incubeer ze 's nachts (maximaal 24 h) bij 4 ° C, en sla ze op-80 ° C.
Opmerking: Cyprid larven zijn bij voorkeur droog-bevroren, zonder RNA later rechtstreeks in-80 ° C, door hen te plaatsen in cryotubes en vervolgens kort dompelen de buizen (30 s) in vloeibare stikstof, alvorens ze op te slaan bij-80 ° C. - Op het moment van de extractie van RNA, ontdooien van de zeepokken op ijs en gebruik ze intact of ontleden uit de weefsels worden gebruikt (zie stap 7).
Opmerking: als gevolg van hoge genetische diversiteit tussen individuen (≈ 3 – 5% variatie in de codering van de regio's; Alm Rosenblad et al., niet-gepubliceerde gegevens) is het raadzaam om poola aantal volwassen individuen, die het effect van reeks variatie tussen individuen in de latere qPCR stap minimaliseert. - Voeg 350 µL van lysis buffer voorzien van een RNA voorbereiding kit in homogenisering buizen met 2,8 mm keramische kralen voor de RNAextraction.
Opmerking: Keramische kralen bieden een beter rendement van RNA in vergelijking met ultrasoonapparaat (Vertegenwoordiger resultaten). - Een volwassen rankpootkreeften (geheel of weefsels) of verzamelen van een minimum van 20 cyprid larven met pincet en leg ze in homogenisering buizen.
- Ga rechtstreeks naar de verstoring en homogenisering met een kraal molen.
- Zet de homogenisering buizen met het monster en de kralen in de kraal molen houder. Schud ze met een frequentie van 4,0 m/s voor 20 s. Cool het monster voor 1 min op ijs. Herhaal 2 x.
- Het RNA volgens het protocol van de verkrijgbare RNA isolatie kit voor te bereiden.
Opmerking: Een risico-evaluatie (met inbegrip van een lezing van de veiligheidsinformatiebladen) moet worden uitgevoerd voordat u RNA extractiemethoden, kunt identificeren van gevaarlijke chemische stoffen waarvoor het gebruik van een zuurkast en andere beschermende kleding, met inbegrip van handschoenen (bijvoorbeeldmet de toevoeging van β-mercaptoethanol aan de lysis buffer tijdens het RNA extractie moet worden uitgevoerd in een zuurkast). - Het RNA te kwantificeren. Een werkoplossing te bereiden en een standaard en monsters toevoegen aan een totaal volume van 200 µL. Vortex hen voor 2 – 3 s en hen Incubeer gedurende 2 min. invoegen de buizen in een Fluorimeter en lezingen.
- Controleer de RNA-monsters voor elke besmetting van eiwit met een spectrofotometer, en controleren hun integriteit van RNA met een systeem van geautomatiseerde elektroforese (Vertegenwoordiger resultaten).
Opmerking: Voor goede kwaliteit preparaten, RNA wordt aanbevolen een verhouding van 260/280 nm 2 – 2.2 en een DNA van ongeveer 1,8. Lagere waarden geven aan eiwit verontreinigingen en dat de extractie procedure moet worden geoptimaliseerd.
9. genexpressie: cDNA synthese en qPCR
-
Behandelen de verkregen RNAwith DNase Schakel eventuele remainingDNA alvorens de cDNA voor qPCR.
- Check voor genomic DNA door toevoeging van een RNA-monster, maar geen reverse-transcriptase bij de voorbereiding van de cDNA besmetten. Als er een PCR versterking van het geselecteerde gen op de cDNA gemaakt zonder reverse-transcriptase, is er DNA verontreiniging in het RNA.
Opmerking: Monsters worden gebruikt voor RNA-seq (RNA-sequencing met behulp van de volgende generatie sequencing technologie), de DNase stap is minder kritisch. In het bijzonder voor monsters met een laag gehalte van RNA, de DNase stap kan worden weggelaten om niet te verliezen teveel van het RNA in het proces.
- Check voor genomic DNA door toevoeging van een RNA-monster, maar geen reverse-transcriptase bij de voorbereiding van de cDNA besmetten. Als er een PCR versterking van het geselecteerde gen op de cDNA gemaakt zonder reverse-transcriptase, is er DNA verontreiniging in het RNA.
- CDNA synthese op DNase behandeld RNA met behulp van een bedrag van RNA binnen het bereik dat is opgegeven in de commerciële cDNA synthese kit, maar meestal gebruik ten minste 50 ng uitvoeren.
- QPCR inleidingen zo ontwerpen dat ze aan delen van het gen van belang waar de identiteit van de sequentie tussen individuen wordt zo hoog mogelijk ontharden, maar de identiteit van de sequentie tussen gen paralogs is zo laag mogelijk. Raadpleeg de bijbehorende publicaties voor de specifieke primer-paren die worden gebruikt voor gen expressie studies van Na+/K+ ATPase3 en Zweden2 (Figuur 5).
Opmerking: Voor dit doel, RNA-seq sequencedata van honderden cyprids of meerdere volwassenen kan worden gebruikt. - Het ontwerpen van inleidingen voor een gen moet worden gebruikt voor de normalisatie van de niveaus van de expressie (bijvoorbeeld, actine). De inleidingen met succes gebruikt voor actine zijn, naar voren: 5'-CATCAAGATCAAGATCATCGC-3', en omgekeerde: 5'-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'.
Opmerking: Actine is een veelgebruikte controle-gen. Anderen hebben echter ook is voorgesteld als een verwijzing en getest op zeepokken19. Naast actine, is het gebruik van RPL8, 36B4, EF1 en NADHd1 als referentie geteste3geweest. Geconcludeerd werd dat er geen grote verschillen in de niveaus van de uitdrukking van de genen van de respectieve referentie tussen soma, cirri, volwassene of cyprids zijn. - Optimaliseer de onthardende temperatuur voor de ontworpen inleidingen door stijgende hoeveelheden van cDNA (meestal in het bereik van 0,25 – 50 ng) toe te voegen aan een mix met SYBR Green, dNTP polymerase en 0,3 µM voor voorwaartse en omgekeerde primer.
- QPCR protocollen uitvoeren bij verschillende onthardende temperaturen als volgt: een initiële denaturatie temperatuur van 95 ° C gedurende 3 min, een denaturatie stap bij 95 ° C gedurende 20 s, onthardende temperaturen van 55-63 ° C voor 20 s, en een rek bij 72 ° C gedurende 30 s. In totaal 40 cycli van PCR uitvoeren.
Opmerking: Primer efficiëntie moet liggen in het bereik van 90-105% en worden berekend als E = (10^(-1/slope)-1) x 100 waar de helling de helling van de curve verkregen is bij het uitzetten van de log-waarde van de cDNA concentraties tegen hun cyclus-drempelwaarden (Ct). - Uitvoeren van qPCR met behulp van een passend bedrag van cDNA, meestal 1 – 10 ng, met behulp van de PCR protocol beschreven in stap 3 met de optimale onthardende temperatuur gevonden.
Opmerking: De hogere hoeveelheid cDNA wordt alleen gebruikt voor de genen die op extreem lage bedragen zijn uitgedrukt.
Representative Results
Met de beschreven procedure voor het kweken van volwassen zeepokken van B. improvisus, maximaal vier partijen nauplius kunnen larven geproduceerd worden per week. Het zou mogelijk zijn voor het verzamelen van nauplius-larven bijna elke nacht, maar dit vereist meer mensen en infrastructuur (met vele zeepokken in de broodstock, een cultuur zal vrijgeven larven voortdurend). Een extra beperkende factor voor de productie van larven lijkt te zijn van de beschikbaarheid van diervoeders van hoge kwaliteit, met name met betrekking tot de Diatomee Skeletonema. Maximaal, bestaat elke batch van het kweken systeem uit ongeveer 12.000 naupliën, dus tot 50.000 naupliën per week kan worden gekweekt. Nochtans, enkele weken kunnen er tot tienvoudige minder larven geproduceerd. Een enkele volwassene kan produceren tot 7.000 larven per dag14, hetgeen betekent dat 1-2 volwassenen zijn het vrijgeven van larven voor elke partij. Binnen een week zal ongeveer 70-90% van de verzamelde naupliën uitgroeien tot cyprids (opbrengst ongeveer 30.000 cyprids per week, maximaal) die kunnen worden gebruikt voor het testen van de nederzetting en moleculaire studies.
Het moet worden benadrukt dat er bestaan verschillen in cyprid functies tussen partijen, en in het algemeen, er zijn grotere variaties tussen partijen dan in batches. Bijvoorbeeld, varieert de beslechting succes in regeling testen tussen 30 en 70% voor verschillende batches instellen. Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt door de individuele genetische variatie tussen de specifieke paren van volwassenen het vrijgeven van larven perioden verschillende bemonstering. Het is, natuurlijk, aanbevolen dat herhaalde experimenten (biologische wordt gerepliceerd) cyprids van een aantal partijen worden moeten als meer algemene uitspraken over de resultaten worden gemaakt. De variatie charges-legt eisen op de proefopzet, waar de juiste besturingselementen en belangrijk in gen expressie studies moeten worden toegepast. Echter, zelfs na verschillende statistische normalisatie procedures zijn doorgevoerd die aanzienlijk verminderen tussen-batch variatie, sommige effecten van de partij zijn meestal nog steeds herkenbaar (niet-gepubliceerde gegevens).
Na het geleverde protocol, is het mogelijk om te verkrijgen, gemiddeld 500 ng van kwalitatief hoogwaardige RNA uit zo weinig als 20 cyprids, ongeacht de fase van de rankpootkreeften nederzetting (tabel 1). De kwaliteit van het RNA wordt meestal gemeten als de verhouding tussen de pieken van het 18S en 28 (de verwachte positie van de twee bergtoppen zijn aangegeven in Figuur 4). Echter in het geval van zeepokken en vele andere geleedpotigen, de 28 rRNA breekt bij verhitting (als onderdeel van de analysemethode) en samen met de 18S piek20migreert. Dit is de reden waarom er, in beginsel, één enkele rRNA piek in dit type analyse voor zeepokken is. Het is duidelijk uit deze test (Figuur 4) dat een homogenisering door keramische kralen RNA voorziet van de hoogste integriteit en daarom is de methode van keuze. Het RNA volstaat in hoeveelheid en de kwaliteit te genereren van kwalitatief hoogwaardige sequencing bibliotheken voor het rangschikken, wat resulteert in een gemiddelde van 70 miljoen leest per monster (het aantal leest, natuurlijk, afhankelijk van het niveau van de tijdens de sequencing multiplexing). Het bedrag van RNA is ook voldoende voor analyse van de cDNA synthese en qPCR de expressie van een groot aantal genen.
Figuur 5 toont het resultaat van de analyses van de qPCR van Zweden en nb+/K+ ATPase (NAK1) splice varianten, waar expressie veranderingen werden onderzocht in reactie op veranderingen in milieu signalen2,3. Een vergelijking van de relatieve uitdrukking van de lange en korte splice varianten van NAK1 toont een tweeledig verhogen voor de lange NAK1 mRNA in lage zoutgehalte in verband met de korte NAK (Figuur 5A). Dus, uit de gegevens blijkt dat de lange vorm overheersende laag zoutgehalte voorwaarden alternatieve splicing maakt. In het geval van Zweden is het duidelijk dat de twee water-vervoer paralogs AQP1 en AQP2 differentiële expressie (Figuur 5B) weergeven. In het bijzonder in het weefsel van de mantel is het duidelijk dat het AQP1 aanzienlijk naar beneden-geregeld op lagere zoutgehaltes is, die is niet gezien voor AQP2. In plaats daarvan toont AQP2 een licht verhoogd expressie op lagere zoutgehaltes, maar in het soma. Deze resultaten vormen een basis voor onderzoek van de functionele rollen van de verschillende B. improvisus ion vervoerders en Zweden in rankpootkreeften osmoregulatie.
Figuur 1 : Overzicht van de gehele procedure en de RNA extractie voor gen expressie studies bij volwassenen culturing. Om te beginnen een nieuwe cultuur, zijn panelen aan een frame gekoppeld en ingezet in de zee op 1-3 m diepte. Na enkele weken, worden de panelen met volwassenen/jonge exemplaren verticaal geplaatst in rekken in bakjes in het laboratorium. Elke lade heeft ongeveer 40 panelen met volwassenen. Met ongeveer 100 volwassenen per paneel, in totale ≈ zijn 4.000 volwassen individuen gekweekte per lade. De volwassen zeepokken worden gevoed met Artemia en houdbaar jaar-rond. Nauplius-larven zijn verzamelde meerdere malen per week van de laden via een filtering door een zeef. De verzamelde naupliën worden overgebracht naar de emmers gehouden bij 26 ° C in een waterbad en gevoerd met microalgen. Naupliën worden gehouden totdat ze in niet-voeding cyprids, die worden verzameld molt door te filteren. Nieuwe panelen in het laboratorium kunnen worden vastgesteld door de bepaling van de cyprids op panelen, ofwel om nieuwe panelen voor het jaar-rond cultuur of om te worden gebruikt voor specifieke experimentele opstellingen met gewijzigde externe omstandigheden. RNA wordt vervolgens gewonnen uit jongeren/volwassenen aan het einde van het experiment of op specifieke tijdstippen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Beelden van enkele belangrijke stappen in de procedure voor kweken. (A) deze afbeelding ziet u de frames met panelen voor het verzamelen van nieuwe bevolkingsgroepen uit het veld. (B) dit beeld toont de panelen met volwassen zeepokken van B. improvisus in rekken die in lade worden geplaatst. De panelen zijn ongeveer 2 cm uit elkaar geplaatst. (C) dit beeld toont de schaaltjes met de rankpootkreeften panelen en de voeding tank naar links. Vanuit elke lade is er een outlet waar de zeven zijn geplaatst voor het verzamelen van nauplius-larven. (D) dit beeld toont dat de productie van Artemia feed voor de volwassen zeepokken. (E) dit beeld toont het fokken van naupliën in emmers geplaatst in een waterbad ingesteld op 26 ° C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Beschrijving van de stappen van de initiële dissectie van volwassen zeepokken: het verwijderen van het lichaam uit zijn schelp. (A) pak een van de operculaire platen door het invoegen van pincet voorzichtig door het diafragma. Trek voorzichtig het blootstellen van het dier te verwijderen de plaat. (B) Trek het dier door het soma deel net onder de cirri grijpen. (C) dit paneel toont de algemene anatomie van acorn zeepokken. De mantel en potentieel bevruchte eieren (in de eierstok) verblijven in de holte van de shell, wanneer het lichaam wordt teruggetrokken. Een opmerking over de anatomie van de rankpootkreeften (Zie voor een meer diepgaande account, Anderson)9: de platen van de muur van een barnacle helling naar binnen, en samen vormen ze een kegel van vulkaan-achtige. Een opening, het diafragma, wordt bedekt door de twee operculaire platen, die vormen een deur of operculum, te sluiten het diafragma. Acorn zeepokken hebben over het algemeen een kalkhoudende basale plaat die stevig is vastgelijmd aan de ondergrond; echter een aantal soorten zeepokken gebrek aan deze kalkhoudende plaat (b.v. S. balanoides). Zeepokken afscheiden het exoskelet van de darkly gepigmenteerde mantel (het kopborststuk). Het buitenoppervlak van de dubbellaagse mantel is verkalkt om stijf, terwijl de binnenzijde van de mantel niet verkalkt is en daarom flexibel is. Binnen het diafragma zijn de cirri aanwezig in een teruggetrokken positie. Dit zijn de thoracale aanhangsels die zeepokken voor het voederen van de schorsing gebruiken. De eierstokken liggen vlakbij de voet van de rankpootkreeften, terwijl de teelballen in het soma liggen. Dit cijfer is vastgesteld van Panova et al. 21 en is gepubliceerd met toestemming van Springer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Bepaling van de integriteit van het rRNA door capillaire gelelektroforese. RNA werd voorbereid door twee verschillende homogenisering methoden: (A) ultrasoonapparaat en (B) keramische kralen. De eenheid op de y-as, FU, staat voor fluorescentie eenheden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Genexpressie voortvloeit uit twee verschillende studies van genen belangrijk voor osmoregulatie in B. improvisus. (A) dit paneel toont de differentiële expressie zoals gemeten door de qPCR van splice varianten van de nb+/K+ ATPase NAK1 reactie op verschillende zoutgehaltes en pCO2 3niveaus. Bij de behandeling van lage zoutgehalte, de uitdrukking van de lange isovorm (NAK1-L) is toegenomen ten opzichte van de korte (ANOVA, P < 0,001). (B) dit paneel toont de uitdrukking van Zweden bij volwassenen van B. improvisus tijdens hun blootstelling aan verschillende zoutgehaltes2. qPCR werd gebruikt om te bepalen van de aquaporin expressie niveaus ten opzichte van actine. Volwassen individuen werden bij 3 verschillende zoutgehaltes (3, 20 en 33 PSU) gedurende 14 dagen geïncubeerd. Voor de bereiding van RNA, werden de soma cirri en de mantel van de volwassenen gescheiden. Foutbalken geven in beide figuren, de standaarddeviatie. De ** en *** aangeven van het niveau van belang (ANOVA), 0.01 en 0.001, respectievelijk. Deze cijfers zijn gewijzigd van Lind et al. 2 , 3. beide cijfers zijn gepubliceerd met toestemming van PLoS ONE. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Regeling fase | Totale hoeveelheid RNA (ng) |
| Gratis zwemmen | 512 |
| Exploratie: Nauwe zoeken | 518 |
| Aangesloten cyprid | 550 |
| Nieuw gemetamorfoseerde jonge | 832 |
Tabel 1: opbrengsten van RNA. Deze tabel bevat het aantal van de RNA geëxtraheerd met een RNA voorbereiding kit uit pools van 20 cyprid personen verzameld in verschillende stadia tijdens het proces voor een regeling.
Discussion
De cultuur van de rankpootkreeften bij Tjärnö Marine Research Laboratory (Zweden) meer dan 20 jaar heeft gelopen en is gebruikt voor studies in vele verschillende onderzoeksgebieden. Meer dan 30 wetenschappelijke papers verschenen die het kweken systeem hebben gebruikt tijdens de afgelopen jaren, met inbegrip van studies in antifouling13,22, hydrodynamica23, chemische ecologie24, klimaatverandering16 , evolutionaire biologie5en moleculaire biologie2.
Om te voorkomen dat de selectie van bepaalde personen die meer aangepast zijn aan de labo-omgeving (personen die niet representatief voor de wilde populatie zijn mogelijk), is het aanbevolen om het verzamelen van een nieuwe broodstock uit het veld elk jaar. Bovendien, is het ook verstandig om te verjongen de cultuur jaarlijks, aangezien er ongeveer 50-80% van de sterfte bij volwassenen tijdens een normaal jaar. Echter als het doel is voor de productie van ingeteeldestammen of het opzetten van studies van experimentele evolutie, moeten alleen laboratorium-gefokt gezinnen worden gebruikt.
Een goed moment om het verzamelen van B. improvisus op panelen bij de Tjärnö Marine Research Laboratory is in juni – augustus omdat op dat moment er een goed aanbod van cyprid larven in de zee is. De panelen wekelijks te zien wanneer de rankpootkreeften nederzetting wordt gestart en handmatig verwijderen van andere soorten dan B. improvisus (b.v., mosselen, manteldieren, bryozoans, hydroïden, nemerteans/tubeworms en andere barnacle soorten) geregeld te controleren van de panelen (bijvoorbeeldmet een tandenborstel). Rond Tjärnö zijn er drie ondiep water rankpootkreeften soorten aanwezig (B. improvisus, Semibalanus balanoidesen Balanus crenatus). B. improvisus is echter de dominante fouler van gladde harde oppervlakken in juli-augustus. S. balanoides heeft de afrekeningstermijn in het vroege voorjaar en geeft de voorkeur aan hoofdzakelijk natuurlijke ondergronden (b.v., stenen). B. crenatus kan optreden bij lage aantallen op de panelen in de zomer.
Het is ook mogelijk om te starten nieuwe volwassen rankpootkreeften generaties van gekweekte cyprids, die zou zijn essentieel als bepaalde linages met specifieke kenmerken zijn vastgesteld, of in studies van experimentele ontwikkeling. De meest handige manier om te beginnen van nieuwe generaties van volwassenen is te vestigen cyprids op kunststof panelen in het laboratorium. Deze panelen met nieuw gevestigde cyprids kunnen ook worden gebruikt in experimentele behandelingen of voor blootstelling in het veld. In noodgevallen, kan men ook volwassenen gebruiken op keien uit een nabijgelegen site (bijvoorbeeldIdefjorden in het geval van het Tjärnö Marine Research Laboratory) waar B. improvisus gemeenschappelijk is. Deze reeds gevestigde volwassenen worden behandeld op dezelfde wijze als de volwassenen op de panelen, aldus gelegd in bakjes en gevoed via het flow-through systeem. Stroom cellen kunnen ook worden gebruikt om de panelen met zeepokken25. Dit zijn de doorstroom kamers met plankton net aan de zijkanten waarop de cyprids niet, met panelen als de enige nederzetting oppervlak voor de larven regelen doen.
Er zijn verschillende stappen die essentieel zijn voor het opzetten van een goed functionerende rankpootkreeften langetermijnkweek met inbegrip van alle levensfasen. De gebruikte methoden voor cultuur B. improvisus zijn waarschijnlijk voor een groot deel, ook van toepassing op de andere mariene ongewervelden met vrijzwemmende, planktotrophic larven. Kweken procedures voor sommige soorten al goed zijn beschreven (bijvoorbeeldvoor blauwe mosselen en verschillende soorten oesters)26, terwijl voor andere mariene ongewervelden, er zijn slechts een paar voorbeelden van lange termijn culturen verspreid over hun hele leven cyclus. Een van de eerste succesvolle pogingen om cultuur zeepokken (B. amphitrite) werd gedaan door Rittschof et al. 15. op de lange termijn financiële en persoonlijke middelen moeten zijn alvorens een barnacle culturing faciliteit opzetten. Het onderhoud van dit soort jaar-rond rankpootkreeften cultuur vereist ten minste één persoon half-arbeidstijd. Er kunnen enkele mogelijkheden voor de toekomstige automatisering van enkele stappen in de productielijn, vooral het kweken van microalgen27. Daarnaast, om te slagen, is het essentieel toegang hebben tot grote hoeveelheden hoogwaardige zeewater. Het kweken van microalgen, Artemia, en zeepokken gaat niet om een bepaalde veiligheidsprocedures. Nochtans, tests van sommige antifouling stoffen of giftige chemicaliën moeten speciale voorzorgsmaatregelen.
De panelen werden meerdere malen per week voor verontreinigingen gecontroleerd. Het zeewater in de cultuur gebruikt werd opgepompt uit een diepte van 40 m in de Koster Fjord buiten het Tjärnö Marine Research Laboratory en twee zandfilters alvorens het watersysteem lab was gepasseerd. Als geen filtering van het water had gedaan, zou er veel meer verontreiniging in de cultuur. Het is essentieel om het regelmatig schoonmaken van de panelen in de cultuur van detritus en andere ongewervelde dieren die gaan van het systeem via de levering van zeewater vanuit het veld (bijvoorbeeldstolonen-gebouw hydroïden en roofzuchtige nemerteans). Bijvoorbeeld, als geen larven worden geproduceerd, ondanks het feit dat de cultuur goed gevoed en anders is lijkt te zijn in goede staat, het probleem zou de aanwezigheid van nemerteans die worden weergegeven voor de remming van de paring. Natuurlijk, veel van de besmettende organismen in de cultuur in het Tjärnö Marine Research Laboratory waren specifiek voor de Zweedse westkust, en andere soorten verontreinigende organismen zullen overwegend en meer een uitdaging in andere geografische gebieden. Aan de westkust van Zweden is het ongebruikelijk om te vinden van verontreiniging door andere barnacle soorten op de panelen. Af en toe, is gebleken dat de oprichting van S. balanoides , maar dit is een zeer marginaal probleem (hooguit één S. balanoides verontreinigingen voor 10.000 B. improvisus monsters). Het ontbreken van contaminerende soorten was waarschijnlijk afhankelijk van het regime om nieuwe culturen in de zomer, wanneer larvaefrom B. improvisus waren zeer dominante. Daarnaast was er ook een duidelijke verrijking van B. improvisus op de panelen aangezien deze soort selectieve voor gladde oppervlakken13.
Het is essentieel om te verwijderen dode volwassen zeepokken. Als de lege hulzen op de panelen zitten, kunnen ze een schuilplaats voor Artemia naupliën en verschillende contaminerende diersoorten. Daarnaast is het geconstateerd dat dode individuen invloed hebben op het welzijn van de individuen, waarschijnlijk met de release van toxische verbindingen tijdens de decompositie naburige. Een extra gevolg van volwassen sterfte is dat sommige individuen wordt overgelaten alleen en ver van alle andere volwassenen toe paring (hoewel zeepokken de langste penis in de dierenwereld ten opzichte van de grootte)28. Deze individuen zullen overleven, maar zijn niet-productieve voor de larven. Echter deze eenzame volwassen individuen kunnen voorzichtig worden verwijderd zonder afbreuk te doen aan de base-plaat en horizontaal worden geplaatst dicht bij anderen om de paring. Zeepokken kunnen ook worden gedekt door het plaatsen van panelen met één volwassene op elk, maar dicht genoeg zodat kruisbestuiving kan plaatsvinden. Op deze manier kunnen genetische lijnen geproduceerde14.
Het is essentieel om een feed van hoge kwaliteit te produceren en te voeden culturen bijna elke dag. Zelfs een paar dagen zonder voedsel kunnen resulteren in een dalende release van larven. Eerdere tests van dieet samenstelling hebben aangetoond dat diatomeeën essentieel voor de groei en de overleving van de rankpootkreeften naupliën zijn. Verschillende Diatomee soorten lijken voldoende als voeden, hoewel kleine of eenzame cellen (minder dan 10 µm in diameter) nodig voor de naupliën van inname zijn kunnen. De soorten T. pseudonana , S. marinoien C. simplexgebleken al voldoende voer voor B. improvisus naupliën, alsmede gemakkelijk te cultiveren. Daarnaast is de feed kwaliteit is over het algemeen hoger voor exponentieel groeiende algen. Men heeft ook gerapporteerd dat diatomeeën essentieel zijn voor de totstandbrenging van productieve culturen van B. amphitrite15. Een theorie van het belang van diatomeeën is dat ze een uniek vetzuur profiel en bijzonder rijk aan het 20:5 zeer meervoudig onverzadigde vetzuur29 zijn. Het is aangetoond dat bepaalde vetzuren zijn belangrijk voor de succesvolle ontwikkeling van oester larven30.
Door de jaren heen, zijn er geen gevallen van schadelijke ziekten in de cultuur van de rankpootkreeften. In veel commerciële ongewervelde waterculturen, zoals oesters en mosselen, ziekten vrij gemeenschappelijk zijn en zeer schadelijk kunnen zijn. Nadelige effecten van virussen zijn ook gemeld uit wilde populaties. De inheemse oester in Frankrijk werd in 1925 vervangen door de Portugese oester Crassostrea angulata , maar deze soort werd weggevaagd door een iridovirus rond 197031. Meer recentelijk zijn er massale sterfte gebeurtenissen in de oester Crassostrea gigas in culturen wereldwijd, die lijkt te worden geassocieerd met de ostreid herpesvirus 132. Geen verslagen over ziekteverwekkers, bacteriën of virussen op zeepokken hebben tot nu toe verschenen. Echter, in de lopende-genoomproject op B. improvisus, virus sequenties bleken (Alm Rosenblad et al., niet-gepubliceerde gegevens), maar met geen zichtbare link naar symptomen van ziekten. Mengsels van antibiotica zijn eerder toegepast op de culturen om te minimaliseren van het risico van bacteriële infecties; echter, deze procedure is momenteel verlaten en tot nu toe, dit heeft niet geleid tot besmetting problemen.
Als zeewater wordt verwarmd (zoals hierboven beschreven), oververhitting mogelijk de ernstigste risico in de productielijn van cultuur. Het is natuurlijk moeilijk te beschermen tegen oververhitting, hoewel sensoren en passende waarschuwingssystemen gebruikte (b.v., e-mail of SMS-berichten verzenden naar verantwoordelijke personen) mogelijk. Weerslag van deze soort in het verleden hebben geresulteerd in het aanzienlijke doden van volwassenen in de cultuur. Dit kan, natuurlijk rampzalig zijn en ruïneren van investeringen op lange termijn van tijd en geld. Dit zou in het bijzonder rampzalig als genetische ingeteeldestammen zijn vastgesteld. Om te zorgen voor de levensduur van deze lijnen en hen veilig uit accidentele verlies, zou het wenselijk zijn om een cryopreservatie methodologie voor zeepokken te ontwikkelen. Er werd gemeld dat de larven van de oester kunnen worden bevroren neer en nieuw leven met gedeeltelijk succes33 ingeblazen. Cryobanking is ook een waardevol instrument voor het behoud van de genetische hulpbronnen van een breed scala van soorten34. Zelfs naupliën van B. amphitrite worden gemeld om te overleven bevriezing35, en het werd gevonden dat 20% van de bevroren-down individuen succesvol in cyprids36 gemetamorfoseerde. Toepassing van de bevriezing voor de houdbaarheid op lange termijn van culturen is tot nu toe niet goedgekeurd, maar dit inderdaad nodig zou zijn voor het onderhoud van de geselecteerde lijnen; Dit zou een essentiële stap om stevig B. improvisus in een krachtige mariene modelsystem.
Hier werd een protocol voor de dissectie van verschillende weefsels van volwassenen van B. improvisus (d.w.z., cirri, soma en mantel) uitgereikt. Echter op gewezen dat er ook andere weefsels kunnen worden geëxtraheerd. Bijvoorbeeld, is de weke delen tussen de buitenkant en interne mantel membraanachtig-base soorten Tetraclita japonica formosana goed geïsoleerd en gebruikt voor een RNA extractie en analyse van de RNA-seq van gen expressie37. Het overzicht geoptimaliseerd extractie protocol beschreven hier biedt voldoende hoeveelheden van hoogwaardige RNA voor het rangschikken van een minimale hoeveelheid grondstof. Eerst, de collectie van individuele larven direct in de homogenisering buizen minimaliseert enig verlies bij de overdracht van een buis naar de andere. Bovendien onder de verschillende methoden getest, de homogenisering met keramische kralen bleek te zijn het meest efficiënt in termen van RNA opleveren en integriteit, in vergelijking met ultrasoonapparaat of stamper homogenisering. Bij de planning voor de genexpressie of genomics experimenten, moet men in gedachten te houden de uitdaging van de hoge genetische variatie in zeepokken, ten minste voor B. improvisus. Rankpootkreeften heeft een genetische diversiteit in het assortiment 3 – 5%, zelfs in de codering van de regio's (Alm Rosenblad et al., niet-gepubliceerde gegevens). Dit, natuurlijk, brengt specifieke eisen op het ontwerpen van inleidingen voor qPCR analyse, waar meer geconserveerd regio's moeten worden opgespoord en worden gebruikt als sjablonen voor inleidingen om consistente expressie resultaten betweenbatches. Geconserveerde gebieden voor doelgenen, zoals Zweden en Na +/ K + ATPasen, kan worden geïdentificeerd door het bestuderen van de variabiliteit van de volgorde van deze genen bij RNA-seq gegevens verkregen uit populaties van cyprids met honderden personen. Voor een analyse van het genoom, zal DNA worden bemonsterd. Echter, het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige DNA van B. improvisus kan lastig21.
Kortom, is de gevestigde rankpootkreeften cultuur instrumentaal in verschillende soorten experimentele studies gebleken. In het bijzonder de larvale productie jaar-rondom stelt ons in staat om uit te voeren van de experimenten zonder wordt beperkt tot de natuurlijk voorkomende kuit periode (voor B. improvisus, dit is in de zomer). Verkregen larven kunnen worden gebruikt voor het uitvoeren van een brede reeks van experimentele studies, met inbegrip van de nederzetting testen, testen van gedrag, expressie studies over specifieke genen, evenals genoom-brede transcriptome studies.
Disclosures
De auteurs hebben niets te verklaren.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door subsidie 2017-04559 van de Zweedse Raad voor onderzoek (VR) en de EU ondersteunde project kust naar Anders Blomberg. In het bijzonder, de oprichting van het kweken faciliteit, jarenlang werd ondersteund door subsidies aan Per R. Jonsson uit de volgende financieringsinstanties: SSF (Zweedse Stichting voor strategisch onderzoek) via het programma mariene wetenschap en technologie en MISTRA via het programma Marine verf. Kent Berntsson speelde in de vroege fasen van het opzetten van de culturingfacility. Extra geld voor de vaststelling van de kweken faciliteit is gekomen van het centrum voor mariene evolutionaire biologie (www.cemeb.science.gu.se), die is gesteund door een subsidie van Linnaeus van de Zweedse onderzoek raden FORMAS en VR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plexiglas (poly-methyl methacrylate) panels | Plastic produkter, Bromma, Sweden | transparent glas | |
| 1.5 L PET bottle | |||
| Artemia | INVE Aquaculture, Belgium | We have tested different companies; this is really the best one | |
| Skeletonema marinoi (CCAP strain 1077/5) | CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland | strain 1077/5 | |
| Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP strain 1085/3) | CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Scotland | strain 1085/3 | |
| Millipore cartridge filter system | Millipore | ||
| cartridge with a nominal pore size of 0.2 µm | Millipore | cartridge CWSS01S03 | High capacity for large volumes |
| polycarbonate bottle | Nalgene | autoclavable | |
| RNA later | Qiagen | 76106 | Fixation solution to preserve RNA |
| TURBO DNA-free Kit | Invitrogen/Thermofisher Scientific | AM1907 | DNAse kit to remove DNA from prepared RNA |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Biorad | 1708890 | cDNA synthesis kit |
| SYBR Green supermix | Biorad | 1708880 | Dye for QPCR |
| RNeasy minikit | Qiagen | 74104 | RNA extraction of adults or many cyprids |
| Soft tissue homogenising CK 14, 2 ml tubes | Precellys | KT03961-1-003.2 | Ceramic beads for homogenisation |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | RNA extraction of few cyprids |
References
- Darwin, C. A monograph of the sub-class Cirripedia, with figures of all species. The Balanidae (or sessile cirripedes); the Verrucidae, etc., etc., etc. , Ray Society. London, UK. (1854).
- Lind, U., et al. Analysis of aquaporins from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals differential expression in response to changes in salinity. PLoS ONE. 12 (7), 0181192 (2017).
- Lind, U., et al. Molecular characterization of the alpha-subunit of Na+/K+ ATPase from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals multiple genes and differential expression of alternative splice variants. PLoS ONE. 8, 77069 (2013).
- Fyhn, H. J. Holeuryhalinity and its mechanisms in a cirriped crustacean, Balanus improvisus. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 53 (1), 19-30 (1976).
- Wrange, A. L., et al. The story of a hitchhiker: population genetic patterns in the invasive barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus Darwin 1854. PLoS ONE. 11 (1), 0147082 (2016).
- Berntsson, K. M., Jonsson, P. R. Temporal and spatial patterns in recruitment and succession of a temperate marine fouling assemblage: a comparison of static panels and boat hulls during the boating season. Biofouling. 19 (3), 187-195 (2003).
- Lind, U., et al. Octopamine receptors from the barnacle Balanus improvisus. are activated by the alpha2-adrenoceptor agonist medetomidine. Molecular Pharmacology. 78 (2), 237-248 (2010).
- Semmler, H., Hoeg, J. T., Scholtz, G., Wanninger, A. Three-dimensional reconstruction of the naupliar musculature and a scanning electron microscopy atlas of nauplius development of Balanus improvisus (Crustacea: Cirripedia: Thoracica). Arthropod Structure & Development. 38 (2), 135-145 (2009).
- Anderson, D. T. Barnacles - structure, function, development and evolution. , Chapman & Hall. London, UK. (1994).
- Kennedy, V. S., DiCosimo, J. Subtidal distribution of barnacles in Chesapeake Bay, Maryland. Estuaries. 6, 95-101 (1983).
- Dreanno, C., Kirby, R. R., Clare, A. S. Locating the barnacle settlement pheromone: spatial and ontogenetic expression of the settlement-inducing protein complex of Balanus amphitrite. Proceedings of the National Academy of Sciences. 273, 2721-2728 (2006).
- Rittschoff, D., et al. Cues and context: larval responses to physical and chemical cues. Biofouling. 12 (1-3), 31-44 (1998).
- Berntsson, K. M., Jonsson, P. R., Lejhall, M., Gatenholm, P. Analysis of behavioural rejection of micro-textured surfaces and implications for recruitment by the barnacle Balanus improvisus. Journal of Experimental Marine BIology and Ecology. 251 (1), 59-83 (2000).
- Gamfeldt, L., Wallén, J., Jonsson, P. R., Berntsson, K. M., Havenhand, J. N. Increasing intraspecific diversity enhances settling success in a marine invertebrate. Ecology. 86, 3219-3224 (2005).
- Rittschof, D., Clare, A. S., Gerhart, D. J., Sister Avelin, M., Bonaventura, J. Barnacle in vitro assays for biologically active substances: toxicity and settlement inhibition assays using mass cultured Balanus amphitrite amphitrite Darwin. Biofouling. 6 (2), 115-122 (1992).
- Pansch, C., Schaub, I., Havenhand, J., Wahl, M. Habitat traits and food availability determine the response of marine invertebrates to ocean acidification. Global Change Biology. 20 (3), 765-777 (2014).
- Guillard, R. R. L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. Culture of marine invertebrate animals. Smith, W. L., Chanley, M. H. , Springer. Boston, MA. 22-60 (1975).
- Wrange, A. L., et al. Importance of plasticity and local adaptation for coping with changing salinity in coastal areas: a test case with barnacles in the Baltic Sea. BMC Evolutionary Biology. 14, 156 (2014).
- Bacchetti De Gregoris, T., et al. Construction of an adult barnacle (Balanus amphitrite) cDNA library and selection of reference genes for quantitative RT-PCR studies. BMC Molecular Biology. 10, 62 (2009).
- Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. Why does insect RNA look degraded. Journal of Insect Science. 10, 159 (2010).
- Panova, M., et al. DNA extraction protocols for whole-genome sequencing in marine organisms. Methods in Molecular BIology. 1452, 13-44 (2016).
- Berglin, M., Larsson, A., Jonsson, P., Paul Gatenholm, P. The adhesion of the barnacle, Balanus improvisus, to poly(dimethylsiloxane) fouling-release coatings and poly(methyl methacrylate) panels: the effect of barnacle size on strength and failure mode. Journal of Adhesion Science and Technology. 15, 1485-1502 (2001).
- Larsson, A. I., Granhag, L. M., Jonsson, P. R. Instantaneous flow structures and opportunities for larval settlement: barnacle larvae swim to settle. PLoS ONE. 11, 0158957 (2016).
- Toth, G. B., Lindeborg, M. Water-soluble compounds from the breadcrumb sponge Halichondria panicea. deter attachment of the barnacle Balanus improvisus. Marine Ecology Progress Series. 354, 125-132 (2008).
- Pansch, C., Jonsson, P. R., Berglin, M., Pinori, E., Wrange, A. L. A new flow-through bioassay for testing low-emission antifouling coatings. Biofouling. 33 (8), 613-623 (2017).
- Walne, P. Observation of food value of 7 species of algae to larvae of Ostrea edulis 1. Feeding experiments. Journal of the Marine Biological Associateion of the UK. 43, 767-784 (1963).
- Sandnes, J. M., et al. Real-time monitoring and automatic density control of large-scale microalgal cultures using near infrared (NIR) optical density sensors. Journal of Biotechnology. 122 (2), 209-215 (2006).
- Neufeldt, C. J., Palmer, A. R. Precisely proportioned: intertidal barnacles alter penis form to suit coastal wave action. Proceedings of the Royal Society B Biological Sciences. 275, 1081-1087 (2008).
- Dunstan, G., Volkman, J., Barrett, S., Leroi, J., Jeffrey, S. Essential polyunsaturated fatty acids from 14 species of diatom (Bacillariophyceae). Phytochemistry. 35, 155-161 (1994).
- Jonsson, P. R., Berntsson, K., André, C., Wängberg, S. -Å Larval growth and settlement of the European oyster (Ostrea edulis) as a function of food quality measured as fatty acid composition. Marine Biology. 134 (3), 559-570 (1999).
- Comps, M., Bonami, J. R., Vago, C. Virus-disease of Portuguese oyster (Crassostrea angulata. lmk). Comptes rendus hebdomadaires des séances de l'Académie des Sciences. Série D, Sciences naturelles. 282, 1991-1993 (1976).
- Segarra, A., et al. Detection and description of a particular Ostreid herpesvirus. 1 genotype associated with massive mortality outbreaks of Pacific oysters, Crassostrea gigas, in France in 2008. Virus Research. 153 (1), 92-99 (2010).
- Suquet, M., et al. Survival, growth and reproduction of cryopreserved larvae from a marine invertebrate, the Pacific oyster (Crassostrea gigas). PLoS ONE. 9 (4), 93486 (2014).
- Martínez-Páramo, S., et al. Cryobanking of aquatic species. Aquaculture. 472, 156-177 (2017).
- Anil, A. C., Tulaskar, A. S., Khandeparkar, D. C., Wagh, A. B. Cryopreservation of Balanus amphitrite nauplii. Cryobiology. 34, 131-140 (1997).
- Oo, K., et al. Cryopreservation of nauplius larvae of the barnacle, Balanus amphitrite Darwin. Fisheries Science. 64, 857-860 (1998).
- Lin, H. C., et al. First study on gene expression of cement proteins and potential adhesion-related genes of a membranous-based barnacle as revealed from next-generation sequencing technology. Biofouling. 30 (2), 169-181 (2014).
