在这里, 我们提出的协议, 以发现活性化合物在 GABAA受体, 从绑定到生理学和药理学。
这篇手稿提出了一个分步的协议, 筛选化合物在伽玛-丁酸 a (GABAa) 受体和它的用途, 以鉴定新分子活性的临床前化验方法从体外重组受体对他们的药理作用在本机受体在啮齿动物脑切片。对于受体的苯二氮部位的化合物结合, 第一步是建立一个主要的屏幕, 其中包括发展放射配基结合化验的细胞膜表达主要 GABAa亚型。然后, 利用鼠和人 GABA 的异种表达, 在 爪蟾卵母细胞或 HEK 293 胞内的受体, 可以在电生理检测中探讨不同受体的生理特性亚型和所鉴定化合物的药理性质。爪蟾卵母细胞系统将在这里提出, 从分离的卵母细胞和他们的显微注射与不同的基因, 由药理学表征使用双电极电压钳。最后, 在啮齿类动物脑切片中进行的录音将被描述为一种二次生理试验, 用于评估在定义良好的神经元回路中的分子在其本机受体中的活性。利用多神经元的种群反应进行细胞外记录, 并与药物应用相结合。
在这里, 我们提出的协议, 发现化合物活性在 GABAA受体, 从绑定到生理学和药理学。在寻找特定于氨基丁酸受体的新分子时, 至关重要的是, 尽可能精确地定义感兴趣的亚型和新确定化合物的特异性评估 (例如, 为审查, 见鲁道夫和Knoflach1或 Sieghart2)。图 1说明了药物发现的典型路径和需要实现的步骤。
有约束力的化验已经和仍然是主要用于药物发现的第一步。在氨基丁酸受体的情况下, 它们被优化, 以确定绑定到受体苯二氮结合部位的化合物, 治疗有用和安全的药物绑定。其他技术, 使用荧光成像板阅读器 (FLIPR) 膜电位的红色染料为基础的化验3, 检测化合物, 如巴比妥, 绑定到其他网站, 是不太可取的, 因为他们不需要的副作用的轮廓。此外, 使用的染料可以直接激活 GABA 的受体, 从而质疑这些化验的效用4药物发现。结合化验只能提供证据表明, 某一化合物可以绑定到特定的受体类。用细胞膜进行体外检测, 鉴定选择性人 GABA α5β3γ2受体配位。瞬时转染的 HEK293 细胞表达人 GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2和α3β3γ2受体被用来为这些化验准备膜。对配体的影响通过测量马西尼的 [3h] 的闪烁 (抑制 [3h] 马西尼结合) 来检测。这项技术的主要优点是, 在感兴趣的受体中, 快速有效地测定复合结合的亲和性。
功能性研究对评价化合物的功能活性是至关重要的, 并对化合物与受体的结合所引起的机制提出生理和药理解释。今天, 它是公认的功能 GABAA感受器起因于五个亚基的汇编在由离子孔形成的 pseudosymmetry 的轴附近和结果从五个相同亚基的汇编。大多数 GABAA受体由两个或多个不同的亚基组成。主要大脑 GABAa受体, 例如, 由α1, β2和γ2亚基组成的化学计量学 2, 2 和1分别5,6。在诸如爪蟾卵母细胞或 HEK293 的宿主系统中进行重组, 可以快速探索受体的药理特性。
然后用脑切片7中的胞外记录探讨这些化合物的药理性质。这种方法可以探索化合物对神经传递的影响, 并提供了一个有效的方法来确认在异源表达系统中确定的化合物在本机受体水平上的功能效应, 在整个神经元环境。GABAergic 神经传递还可以通过测量化合物对抑制突触后电流 (IPSCs)8的影响, 在分子水平上进行评估。但是在这里使用的协议和基于全细胞补丁钳录音的脑切片更详细, 并产生较低的吞吐量。
最后, 从不同的技术及其内在的局限性出发, 探讨了体外筛选α5β3γ2的优缺点。这项工作应提供专家和非专家在氨基丁酸受体领域的一个有用的审查结合不同的体外方法, 用于解决新的调制器, 这些配体门控离子通道的发现。
在配体-门控离子通道上活性的新型化合物的开发, 如 GABA 受体需要使用多种方法。通常, 第一步通常是使用结合分析进行的;然而, 这种测量不足以描述化合物的生理活动或其精确的药理学。特别是, 与受体结合的化合物可以增强或抑制其功能, 甚至不产生功能性影响 (即, 在不改变其功能的情况下绑定到受体)。因此, 一个完整的复合特性需要一个功能测试。
装订化验:
结合试验的主要优点是, 它可以有效地进行大量的样品, 范围达数以千计, 它为活性分子提供了具有约束力的亲和力。如本文所述, 第一步包括建立一个评估所需受体亚型的方法。也就是说, 虽然结合可以对本地受体从分数或整个大脑, 这样的方法将防止确定的亲和力在特定的受体亚型。因此, 有必要使用重组系统在所需目标上筛选分子。目前, 在细胞系中对所需受体亚单位基因的瞬态或稳定转染提供了一种有效而可靠的方法来表达感兴趣的受体亚型 (如GABAa α5β3γ2)。传统的结合检测利用 radioligands, 但现在的技术可以避免处理放射性的不便 (例如, 定量荧光基配体结合)。
主机系统中的函数表达式:
为了表达宿主系统中的基因, 必须将感兴趣的编码序列插入包含适当助剂的质粒中。通常, 对于体外mRNA 合成, 使用细菌 T7 或 T6 助剂。对于 cDNA 表达, 感兴趣基因的转录必须由真核细胞助剂 (巨细胞病毒) 或等效物来调节。现在, 有几个质粒, 包括两个助剂 (即pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, pCI-新, pcDNA), 可以允许在体外合成 mRNA 或 cDNA 表达式, 如图 15所示。氨基丁酸受体的表达可以忠实地获得在细胞系或爪蟾卵母细胞。后者的主要优点是缺乏内源性受体表达、操作的简单性以及用于微注射和录音的自动化系统的有效性。本协议中描述的程序说明了自动系统的效率, 允许在大约7分钟内注射96只卵母细胞, 不需要微操作系统技能。记住, 在10,000–30,000 卵母细胞之间的一个单一的卵巢从爪蟾包含, 很明显, 大量的细胞测量可以进行一个单一的准备。此外, 作为一个表达可以使用 cDNA 注射, 相同的质粒含有的基因, 为结合实验开发的兴趣, 可以用于功能表征, 而无需进一步的分子生物学操作。
由于它的大面积和高表面表达, 一个单一的卵母细胞产生了一些受体, 大约相当于35毫米培养皿中的汇合细胞。然而, 卵母细胞的制备和注射是细胞系成本的一小部分, 因为实验不需要特定的培养基和无菌操作。一个单一的 GABA 的激活通道产生一些 picoamperes (10-12) 和电流范围高达十 microampere (10-6) 很容易记录在一个单一的卵母细胞, 这证实了伴随的活动, 数以百万计的受体在一个单一的反应。
在配体-门控离子通道的表征中, 第一步通常是受体的明显亲和性的测定。需要进行的实验包括应用一系列短暂的激动剂测试脉冲和绘制诱发电流的振幅, 或者在某些情况下, 将曲线下的区域作为激动剂浓度对数的函数。由于在同一批卵母细胞中 microinject 不同质粒浓度和比值是很容易的, 这种表达系统特别适合于这种特征。此外, 批对批次的比较显示, 在不同的 EC50s 的高度稳定性。亚单位组成对受体的明显亲和性的影响是容易形象化使用蜘蛛情节, 如图 10所示。
在爪蟾卵母细胞中获得的双电极电压钳的结果往往与使用膜片钳电极的录音进行比较。虽然它将超出这项工作的范围, 深入到这两个系统之间的详细比较, 有几个点可以审查。虽然细胞中的膜片钳为生物物理特性的快速药物应用提供了优势, 但它的要求比爪蟾卵母细胞的双电极记录更复杂。第一个和不可忽略的困难是一个特定的蛋白质的表达与细胞培养的必要性, 瞬变或稳定的转染, 以及表达所需结构的细胞的标识。此外, 研究细胞内源表达的可能贡献也是必不可少的。此外, 膜片钳记录要求有技能的人在高放大显微镜下进行微操作系统, 而该人也需要在实验期间进行充分的分析, 以评估, 例如, 密封的质量,接触电阻等, 双电极电压钳记录, 特别是使用自动电生理系统, 不需要任何具体技能, 可以由实验室技术员进行。
在获得电生理设置时, 成本考虑无疑是需要仔细分析的一个重要因素。例如, 虽然自动化系统的成本相对较高, 但更接近的比较表明, 安装完整的电生理平台包括购买设备, 如良好的并联, 双目透镜, 放大器, 灌注系统, 以及一个反振动表, 同时也获取数据和执行分析。两电极电压钳设置与膜片钳设置之间的成本比较显示出更大的差异。此外, 自动化系统还提供了全自动设备的优点, 日夜无人值守。
化合物的药理性质由受体的作用方式决定。例如, 竞争性抑制剂是分子, 可以进入相同的捆绑口袋, 或 orthosteric 网站, 因为激动剂本身导致竞争。非竞争性抑制剂是抑制受体的化合物, 在另一地点相互作用, 在配体-门控离子通道的情况下, 可以进入和阻断离子孔隙, 例如。这将超出这项工作的范围, 以审查不同的互动机制, 但进一步的信息可以获得从药理教科书和/或其他工作, 如22。
在构调制器的情况下, 化合物绑定在一个与 orthosteric 站点不同的站点上, 但分子的存在改变了活动状态和其他状态之间的能量屏障。正构调制器 (PAMs) 是一种能将能量屏障从静止状态减少到活性态的化合物, 因此增强了激动剂的作用。为了描述可能的 PAM 效应, 因此, 有必要确定接触到化合物是否增强了对激动剂的反应, 如果是这样, 那么浓度。图 11和图 14所示的实验说明了可以成功用于 PAMs 在 GABAA受体上的特性的协议。
在某些情况下, 单独接触 PAM 可能足以激活受体。此类活动可以通过对此处提出的实验协议稍加修改来确定。即, 在接触氨基丁酸的过程中, 不使用调制器的联合应用, 可以对该协议进行修改, 以单独使用该化合物, 然后在 gaba 的存在下进行。直接激动剂活动的特征将由化合物本身诱发的反应幅度的测定和与 GABA 诱发电流的比较来进行。
在脑切片中进行的实验, 如图 7所示, 用于确定抑制回路中的原生受体的复合活动, 然后再进一步的动物模型和沿路径的临床试验。相对简单的数据记录和分析协议, 通过评估其对 PS 振幅的差分调节效应, 可以对多个化合物进行排序。也可以检测与 GABA 系统无关的化合物的非特异效应 (例如, 当观察到 PS 形状的变化时)。直接, GABAergic 神经传递可以评估这些情况下, 通过测量化合物对抑制性突触后电流 (IPSCs) 使用全细胞膜片钳技术8。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢朱蒂丝兰格, 玛丽亚 Karg, Grégoire Friz, 雷切尔哈伯历和玛丽克莱尔 Pflimlin 从罗氏和 Tifany 马丁·舍尔和黛博拉保卢奇从 HiQScreen 为他们出色的技术援助。
General equipment | |||
96 well cell harvester -(Filtermate 196) | Packard | To filter membranes with bound radioligand | |
Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT) | Packard | Microplate Scintillation and Luminescence counter | |
Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR) | Packard | Vial Scintillation and Luminescence counter | |
Liquid handler (Biomek 2000) | Beckman coulter | To prepare compound dilutions | |
Vortex (Vortex Genie 2) | Scientific industries Inc. | To mix compound stock solutions | |
Tissue homogenizer (Polytron PT1200E) | Kinematica AG | To resuspend the membrane preparations | |
XLfit5 software | Microsoft Excel add-on by IDBS |
Curve fitting software | |
Smart Pull | UniPix | – | Electrode Puller |
RoboInject | MultiChannel Systems | – | Automated Injection (Xenopus Oocytes) |
HiClamp | MultiChannel Systems | – | Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes) |
DataMining | MultiChannel Systems | – | Data Analysis Software |
DataMerger | MultiChannel Systems | – | Data Processing Software |
Digidata 1550 | Molecular Devices | Low noise data acquisition system | |
CyberAmp 380 or equivalent | Axon Instruments | Programmable Signal Conditioner | |
pClamp program suite | Molecular Devices | Software for data acquisition and analysis software | |
Antivibraton table | TMC | To avoid microelectrode vibrations | |
Patchstar Micromanipulators | Scientifica | To accurately position microelectrodes in brain slices | |
Faraday Cage | Sutter Instruments | To isolate recordings from noise | |
McIlwain Tissue Chopper | Campden Instruments LTD | To prepare brain slices | |
Borosilicate glass micropipette | Warner Instruments | GC150TF-10 | To record extracellular potentials in brain slices |
Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode | World Precision Instruments | To stimulate the brain slices with current | |
Stimulus generator for current and voltage driven stimulation | MultiChannel Systems | STG4000 | Delivers the current to the stimulation electrode |
Plasticware | |||
Microtiter plate round bottom | Corning | #3365 | Used for the binding assay |
GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2µm poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter | Packard | #6005174 | used for the binding assay |
50 mL Tubes | Falcon | #352070 | used for the binding assay |
Safe-lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | #0030 120086 | used for the binding assay |
Safe-lock tubes 2 mL | Eppendorf | #0030 120094 | used for the binding assay |
Shipping tubes 180ml | Semadeni Europe AG | #3722 | used for the binding assay |
Pony vial Polyethylene 6ml | Perkin Elmer | #6013329 | used for the binding assay |
Top Seal | Perkin Elmer | #60051859 | used for the binding assay |
Spinner Flask | Bellco | BELLCO # 1965-00100 | Spinner Flask |
96 Well Plate (Conical) | Thermo Scientific Milian | 56368 | Injection plate for the oocytes |
96 Well Plate (Flat bottom) | Corning (Vitaris Switzerland) | 3364-cor | Compound Plate for the HiClamp |
Glass capillary | Hilgenberg (Germany) | – | borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament |
RNA preparation | |||
Ambion mMessage mMachine | Thermo Fisher Scientific | for the in vitro synthesis | |
Chemicals | |||
Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4°C. | Used for binding assay | ||
Washing buffer: Tris 50mM -HCl pH 7.4; store at 4°C. | Used for binding assay | ||
Stock solution of test compounds 10mM in DMSO | Used for binding assay | ||
Flumazenil (RO0151788) 10mM in DMSO | Used for binding assay | ||
Diazepam 4mM in DMSO | Used for binding assay | ||
[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20°C | Used for binding assay | ||
Microscint 40 | Packard | #6013641 | Used for binding assay |
Ultima Gold | Perkin Elmer | #6013329 | Used for binding assay |
MS-222 | Sigma | Sigma # A5040 | MS-222 |
AB/AM | Sigma | Sigma # A5955 | antibiotics / antimycotics |
Collagenase | Sigma | Sigma # C1030 | Collagenase Type I |
Rnase | Sigma | Sigma # R2020-250 mL | RNaseZAP |
EndoFree Plasmid maxi Kit | Qiagen | Qiagen # 12362 | |
Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.) | Sigma | ||
Membranes | |||
Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: α1β3γ2, α2β3γ2, α3β3γ2, α5β3γ2. See Ballard et al 2009 for detailed methods. | Used for binding assay |