Summary
نقدم هنا، بروتوكولات لاكتشاف المركبات النشطة في مستقبلات GABAA ، من الربط لعلم وظائف الأعضاء وعلم الصيدلة.
Abstract
يعرض مخطوطة هذا بروتوكول خطوة بخطوة لفحص المركبات في غاما-أمينوبوتيريك حمض اكتب مستقبلات (GABAA) واستخدامها على نحو تحديد رواية الجزيئات النشطة في الاختبارات الإكلينيكية من المؤتلف في المختبر مستقبلات لتأثيراتها الدوائية في مستقبلات الأصلية في شرائح الدماغ القوارض. للمركبات الملزمة في موقع المستقبلات البنزوديازيبين، هو الخطوة الأولى إعداد شاشة الأولية التي تتكون من تطوير فحوصات ملزمة راديوليجاند في أغشية الخلية معربا عن الأنواع الفرعية GABAA الرئيسية. ثم، مع الاستفادة من تعبير مغايرة للقوارض والإنسان مستقبلات GABAA في النمو بويضات أو خلايا HEK 293، فمن الممكن لاستكشاف الخصائص الفسيولوجية لمستقبلات مختلفة، في فحوصات الكهربية، أنواع فرعية والخصائص الدوائية للمركبات التي تم تحديدها. وسوف تعرض النظام البويضيه النمو هنا، بدءاً بالعزلة في بويضات وبهم microinjection مع مرناس مختلفة، تصل إلى توصيف الدوائية باستخدام المشابك الجهد الكهربائي اثنين. أخيرا، سيتم وصف التسجيلات التي تجري في الدماغ القوارض الشرائح التي يتم استخدامها كاختبار ثانوي فسيولوجية لتقييم نشاط الجزيئات في على مستقبلات الأصلية في دائرة العصبية محددة تحديداً جيدا. وأظهرت التسجيلات خارج الخلية باستخدام استجابات السكان من الخلايا العصبية متعددة جنبا إلى جنب مع تطبيق المخدرات.
Introduction
هنا، نقدم البروتوكولات لاكتشاف المركبات النشطة في مستقبلات GABAA ، من الربط لعلم وظائف الأعضاء وعلم الصيدلة. في البحث عن رواية جزيئات معينة لمستقبلات GABAA ، أنها حاسمة لتحديد، على أدق وجه ممكن، النوع الفرعي للفائدة، وتقييم الطابع الخاص لهذه المركبات التي تم تحديدها مؤخرا (انظرمثلاً، لإجراء استعراض، رودولف و كنوفلاتش1أو سيغارت2). مسار نموذجي في اكتشاف الأدوية والخطوات التي يلزم تحقيقها موضحة في الشكل 1.
فحوصات ملزمة كانت ولا تزال إلى حد كبير وتستخدم كخطوة أولى في اكتشاف الأدوية. وفي حالة مستقبلات GABAA ، أنها هي الأمثل للتعرف على المركبات التي تربط إلى موقع الربط البنزوديازيبين من مستقبلات حيث ربط عقاقير علاجية مفيدة وآمنة. التقنيات الأخرى، باستخدام فلوروميتريك التصوير لوحة قارئ (فليبر) غشاء المحتملة فحوصات صبغية حمراء3، الكشف عن المركبات مثل الباربيتورات ربط المواقع الإضافية التي أقل من المرغوب فيه بسبب صورتها من الآثار الجانبية غير المرغوب فيها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن مباشرة الأصباغ المستخدمة لتنشيط مستقبلات GABAA ، وبالتالي التشكيك في جدوى هذه الاختبارات ل اكتشاف المخدرات4. ملزمة فحوصات يمكن فقط تقديم الأدلة التي يمكن ربط مركب معين لفئة معينة من مستقبلات. في المختبر فحوصات مع أغشية الخلايا المستخدمة لتحديد α5β3γ2 GABAA البشرية انتقائية مستقبلات يغاندس. عابر transfected الخلايا HEK293 التعبير عن البشرية GABAA α5β3γ2، α1β3γ2، α2β3γ2، ومستقبلات α3β3γ2 تستخدم لإعداد الأغشية لهذه الاختبارات. يتم الكشف عن تأثير يغاندس طريق قياس التﻷلؤ من [ح]3[فلومازينيل منضمة إلى مستقبلات الغشاء (تثبيط [ح]3[فلومازينيل ملزمة). والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب تقديم تحديد سرعة وكفاءة تقارب ملزم المجمع في المستقبلات للفائدة في المستقبلات للفائدة.
الدراسات الفنية ضرورية لتقييم النشاط الوظيفي من المركبات وأن يقترح تفسيراً الفسيولوجية والدوائية للآليات الناجمة عن ربط المركبات المستقبلات. اليوم، فمن المعترف به جيدا أن مستقبلات GABAA الوظيفية نتيجة للجمعية من خمس وحدات فرعية حول محور بسيودوسيميتري التي شكلتها المسام الأيونية والنتيجة من الجمعية من خمس وحدات متماثلة. معظم مستقبلات GABAA تتكون من اثنين أو أكثر من وحدات فرعية مختلفة. مستقبلات الدماغ الرئيسية GABAA ، على سبيل المثال، تتألف من الوحدات الفرعية α1 و β2 γ2 في ستويتشيوميتري من 2، 2 و 1 على التوالي5،6. إعادة تشكيل نظام مضيف مثل النمو بويضات أو خلايا HEK293 يوفر إمكانية استكشاف الخصائص الدوائية مستقبلات سريعاً.
ثم يتم استكشاف الخصائص الدوائية للمركبات مع تسجيلات خارج الخلية في الدماغ شرائح7. هذا الأسلوب يتيح استكشاف تأثير المركبات على كبيرة ويوفر طريقة فعالة لتأكيد الآثار الوظيفية من المركبات مصممة في أنظمة تعبير مغايرة على مستوى مستقبلات الأم في الكلي البيئة العصبية. ويمكن أيضا تقييم جابايرجيك كبيرة على المستوى الجزيئي بقياس آثار المركبات على التيارات بوستسينابتيك المثبطة (إيبسكس)8. ولكن البروتوكول المستخدمة هنا وتستند إلى تسجيلات المشبك تصحيح كامل الخلية في شرائح الدماغ هو أكثر تفصيلاً وتؤدي إنتاجية أقل.
وأخيراً، تناقش نقاط القوة والضعف في المختبر فحص تتالي المستخدمة للتعرف على يغاندس α5β3γ2 انتقائية في منظور مختلف التقنيات وأوجه القصور الجوهرية. وينبغي تقديم هذا العمل الخبراء وغير الخبراء في مجال مستقبلات GABAA استعراض مفيدة للجمع بين نهج مختلفة في المختبر يستخدم للتصدي لاكتشاف جديد المغيرون من هذه القنوات عن طريق بوابة يجند أيون.
Protocol
يسكن ليفيس النمو والتعامل معها وفقا للمبادئ "التوجيهية الحيوان كانتون جنيف".
1-راديوليجاند ملزمة
-
إعداد لوحة الفحص
- إعداد ل 1.5 من المخزن المؤقت للمقايسة مع 5 مم بوكل، 1.25 مم كاكل2مم 1.25 مجكل2، 120 كلوريد الصوديوم، و 15 ملم تريس؛ ضبط الأس الهيدروجيني مع HCl إلى 7.4.
- إعداد المركبات لفحصها في 50.76 ميكرومتر (مثلاً، 5 ميليلتر مركبة على 10 ملم في المخزن مؤقت الإنزيم ميليلتر 980 في أنبوب ميكروسينتريفوجي). خلطهما جيدا باستخدام آلة دوامة سرعة عالية ل s 2 – 5.
- إعداد إضعاف ما قبل فلومازينيل مجمع الإشارة ميليلتر 1 بيبيتينج في المجمع (10 مم) إلى 1,970 ميليلتر من المخزن المؤقت للمقايسة. خلطهما جيدا باستخدام آلة دوامة سرعة عالية ل s 2 – 5.
- تمييع حل أسهم فلومازينيل [ح]3[مع المخزن المؤقت المقايسة عند 4 درجة مئوية إلى 4 نانومتر في أنبوب 50 مل البوليبروبيلين.
- ماصة 50 ميليلتر/جيدا من المخزن المؤقت المقايسة في الأعمدة 1 و 3 – 11 من الميكروسكوبية 96-جيدا كما هو موضح في تخطيط لوحة تمثل في الشكل 2.
- "الماصة؛" 73.2 ميليلتر من المركبات تضعف في 50.76 ميكرومتر (راجع الخطوة 1.1.2) في عمود 12 لوحة.
- تمييع كل مجمع، استخدام تقدم هندسية عبر خطوات 9 (1E-10 -1E–06 م)، ومع حجم نقل ميليلتر 23.12 وتعبئة الأعمدة 3 – 11. مزيج تمييع جيدا. تغيير التلميح بعد كل تخفيف.
-
تمييع أغشية الخلية
- ذوبان الجليد في أغشية الخلايا المعزولة سابقا من HEK293 أوفيريكسبريسينج بشرية GABAA مستقبلات (0.025 – 0.15 مغ/مل) للحصول على 80 مل في درجة حرارة الغرفة (RT) ونقل التعليق إلى المخزن المؤقت المقايسة عند 4 درجة مئوية.
- ريسوسبيند الحل الغشاء لا يزال عند 4 درجة مئوية مع الخالطون أنسجة ل 30-40 s 10,000 – 12,000 لفة في الدقيقة.
-
تمييع الديازيبام لعنصر التحكم غير محددة ملزمة (سيكسبون)
- تمييع حل أسهم ديازيبام 4 مم مع المخزن المؤقت المقايسة لتركيز 40 ميكرومتر في 5 مل.
-
بدء رد الفعل
- "الماصة؛" 50 ميليلتر من 4 نانومتر [ح]3[فلومازينيل في كل من لوحة 96-جيدا جيدا والحفاظ عليه في وعاء الماء المثلج.
- إضافة 100 ميليلتر من إعداد الأغشية النوع الفرعي مستقبلات GABAA أن يكون تركيز بروتين من 0.5 ملغ/مل.
- "الماصة؛" 50 ميليلتر من 40 ميكرومتر الديازيبام في العمود 2.
- احتضان لوحة ح 1 على الجليد.
- إضافة 50 ميليلتر من المخزن المؤقت للتحليل في كل من لوحة تصفية 96-جيدا لقياس النشاط الإشعاعي وفصل الغشاء اللاحقة جيدا والتوقف عن رد فعل بعد ذلك.
-
وقف رد الفعل
- إعداد المخزن مؤقت غسيل مع 50 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.4.
- تصفية الحل باستخدام حصاده خلية 96-جيدا. أغسل لوحة 3 x مع 300 ميليلتر من المخزن المؤقت الغسيل المثلج لكل بئر.
- ختم الجزء السفلي من اللوحة مع فيلم بلاستيك وإضافة 40 ميليلتر من التﻷلؤ كوكتيل للسائلة التﻷلؤ العد في كل جيدا والقضاء عليه مع الإيثانول 70%.
- بلطف يهز لوحة لمالا يقل عن 1 ح في الرايت وليكن على الوقوف لمدة ساعة أخرى على الأقل في الرايت
- قياس النشاط الإشعاعي (في الاجتماع التحضيري للمؤتمر) بوضع اللوحة على عداد التﻷلؤ. تسمح قياس 3 دقيقة لكل بئر.
-
تحليل البيانات
- تحديد الوسط 8 وإنشاء نسخ متماثلة غير محددة ملزمة (سيكسبون) ومجموع الربط (السل)، وكذلك أما بالنسبة للتكرارات أو تريبليكاتيس من العينات. حساب ملزمة محددة % (SB) لمتوسط كل عينة وفقا للمعادلة التالية:
هنا،
SB الإجمالي = السل يعني ناقص يعني سيكسبون. - مؤامرة في اﻻحداثي السيني س % مقابل في تنسيق تركيزات مثبط. احتواء البيانات باستخدام المعادلة تحليل المنافسة في موقع واحد:
هنا،
y = النسبة المئوية لبينالي الشارقة،
A = الحد الأدنى من y،
ب = الحد الأقصى من y،
ج = IC50،
X = سجل10 من تركيز المجمع المتنافسة،
د = ميل المنحنى (معامل هيل). - حساب ملزمة تقارب (كي) باستخدام نصف التركيز المثبطة القصوى (IC50)، ثابت التفكك (دينار كويتي) من [ح]3[فلومازينيل في الأغشية كل منها9، والتركيز [ح]3[ فلومازينيل في المقايسة وفقا للبيانات-باستخدام المعادلة التالية:
- تحديد الوسط 8 وإنشاء نسخ متماثلة غير محددة ملزمة (سيكسبون) ومجموع الربط (السل)، وكذلك أما بالنسبة للتكرارات أو تريبليكاتيس من العينات. حساب ملزمة محددة % (SB) لمتوسط كل عينة وفقا للمعادلة التالية:
2-مستقبلات التعبير والتسجيلات في بويضات النمو
- المبايض الحصاد وإعداد البويضات
- إعداد الحل بارث العقيمة مع 88 مم كلوريد الصوديوم و 1 مم بوكل، 2.4 مم ناكو3، 10 ملم حبيس، 0.82 مم MgSO4.7H2س، 0.33 مم Ca (لا3)2.4H2س و 0.41 مم كاكل2.6H2س، على درجة الحموضة 7.4 ، تكملها 100 وحدة/مل من البنسلين و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين 0.25 ميكروغرام/مل الامفوتريسين باء.
- إعداد متوسطة x OR2 1 (لا كاكل2) مع مم 88.5 كلوريد الصوديوم، 2.5 ملم بوكل، 5 ملم حبيس، 1 مم مجكل2.6H2س، على درجة الحموضة 7.4.
- التضحية النمو ليفيس أنثى بالتخدير العميق لمدة 20 دقيقة في تبريد تريكيني ميثانيسولفوناتي (بتركيز 150 مغ/لتر، يعدل في درجة الحموضة 7.4) وبيكربونات الصوديوم (300 مغ/لتر) متبوعاً بقطع الرأس.
- حصاد المبايض سريعاً مع مقص نظيف والملقط ووضعها في 2 بيتري-الأطباق (10 سم) مليئة 40 مل 1 × الحل بارث والمضادات الحيوية/فطري.
- تخزين المبايض غير فصلها لتصل إلى 2 أسابيع في الحل بارث في 4 درجات مئوية.
- للانفصال، قص المبايض مع شفرة حلاقة نظيفة في كسور صغيرة (1-2 سم3) واحتضانها لهم في 50 مل متوسطة OR2 دون كاكل2 (OR2-نوكاكل2) الذي يحتوي على 0.2% كولاجيناز (النوع الأول) في 17-19 درجة مئوية في لغزل 100 مل قارورة مع الانفعالات بطيئة على 4 – 5 حاء – تأكد من أن شريط مغناطيسي يوضع حوالي 3-5 سم فوق الجزء السفلي لقارورة زر الزيادة والنقصان لتجنب سحق بويضات.
- بعد 4 – 5 ح، تحقق من أن معظم بويضات تحررت من تلك المسام (أيأنها تسبح حول شكل فردي). أغسل منهم 5 س مع 200 مل OR2 تكملة مع 1.8 مم كاكل2.
- نقل ديفوليكولاتيد بويضات بيتري-الأطباق (10 سم) مليئة بارث الحل والمضادات الحيوية/أنتيميكوتيكس والاحتفاظ بها على الأقل بين عشية وضحاها في 17 درجة مئوية قبل الحقن كدنا أو مرناً.
- في اليوم التالي، حدد، تحت مجهر، البويضيه صحية تقدم واضحة ومتميزة حيوانية مقابل قطب فيجيتال (البنى الداكن للقطب الحيواني مقابل الضوء الأصفر للقطب فيجيتال). استخدام نظيف باستور الماصات والتصرف فيها بويضات واحداً تلو الآخر في لوحة جيدا 96-حقن معقمة مخروطية الشكل.
ملاحظة: هناك حاجة إلى لا رعاية خاصة في تنسيب بويضات لحقن مرناً؛ في حين، لحقن كدنا، أنه أمر لا غنى عنه لتوجيه بويضات مع القطب الحيوانية التي تواجه التصاعدي.
- حقن التلقائي مرناً أو كدنا
- توليف مرناس استخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً اتباع الإرشادات الموصى بها. تنظيف الأدوات والجدول مع رناسي وارتداء قفازات الحماية المناسبة.
ملاحظة: نوعية مرناً محدداً تسفر عن تعبير جيد، وأنه أمر لا غنى عنه لمنع تدهور مرناً أثناء عملية الحقن. - إعداد كدناس باستخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً ويحل المبلغ المطلوب في المياه بيديستيليد بتركيز 0.2 ميكروغرام/ميليلتر.
- حقن nL 10 – 50 من الحل مرناً بتركيز 0.2 nL ميكروغرام/ميليلتر، أو 10 من حل كدنا بتركيز تتراوح بين 0.02-0.2 ميكروغرام/ميليلتر، يفضل أن يكون ذلك على دفعات بويضات 95.
- للغشاء مرناس المقابلة أو كدناس بنسبة المطلوب مزيج البروتينات التي تتطلب وحدات متعددة (أي، هيتيروميريك α1β2γ2 مستقبلات GABAA )، (أي1:1:1 أو 1:10:1).
- الاحتفاظ البويضات في 17 درجة مئوية لمنع التعبير عن حرارة صدمة بروتينات من بويضات؛ تخزين الصفيحة في منطقة تخزين تسيطر الحرارية.
- حل اختبار المركبات التي تم اختبارها إيجابية في مقايسة الربط في OR2 0.1 – ألف ميكرون للتسجيلات الكهربية والتخلص منها في صفيحة البوليبروبيلين أسفل شقة 96-جيدا.
- توليف مرناس استخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً اتباع الإرشادات الموصى بها. تنظيف الأدوات والجدول مع رناسي وارتداء قفازات الحماية المناسبة.
- والبلازميدات للتعبير
- اتبع كتيبات التعليمات لمجموعات المتاحة تجارياً لتوليف مرناً مع promotors T7 أو T6 البكتيرية وجعل 20 ميليلتر للتوصل إلى حل في 0.2 ميكروغرام/ميليلتر في المياه خالية من رناسي.
- إعداد على الأقل 20 ميليلتر من محلول يحتوي على ناقل تعبير يوكاريوتي التعبير كدنا، عادة في 0.2 ميكروغرام/ميليلتر المذابة في الماء بيديستيليد.
- Microinjection في البويضات والتصور من نوعيته
- حقن nL 10 – 50 من الحل الذي يحتوي على بلازميد (راجع الخطوة 2.3.1 أو 2.3.2) استخدام إبرة حقن الصغير زجاج قطره نصيحة تتراوح يصل إلى 100 ميكرومتر التي شنت على ميكرومانيبولاتور مجهزة مع نظام طرد ضغط أو بنظام حقن الآلي.
ملاحظة: في المثال مناقشتها هنا، يتم حقن بويضات بدفعات 95 مع نظام مناسب للاستخدام مع كدنا أو مرناً. - شغل إبرة حقن مع 1 ميليلتر من صبغة مثل الميثيلين الأزرق في 1% وحقن بويضات استخدام الإجراء القياسي (أما في نواة لكدنا أو في السيتوبلازم مرناً).
- التصرف حقن بويضات لحوالي 1 دقيقة في الماء المغلي. قص بويضات في نصف مع شفرة حلاقة تحت مجهر.
ملاحظة: الصبغة يبقى المترجمة كما هو موضح في الشكل 3ه، مما يسمح مراقبة دقيقة من الحقن.
- حقن nL 10 – 50 من الحل الذي يحتوي على بلازميد (راجع الخطوة 2.3.1 أو 2.3.2) استخدام إبرة حقن الصغير زجاج قطره نصيحة تتراوح يصل إلى 100 ميكرومتر التي شنت على ميكرومانيبولاتور مجهزة مع نظام طرد ضغط أو بنظام حقن الآلي.
- تسجيلات المشبك الجهد الكهربائي اثنين
- ضع لوحة جيدا يحتوي على بويضات على النظام الآلي، الذي يستخدم مبدأ هو موضح في الشكل 4.
ملاحظة: على نقيض النظام المشبك التصحيح هو موضح في الشكل 5, تتم قراءة إمكانات الحقيقية غشاء الخلية بالجهد الكهربائي. - برنامج نظام التسجيل الآلي باستخدام واجهة المستندة إلى رمز مع، على سبيل المثال، مخطط هو موضح في الشكل 6 لتحديد العلاقة تركيز النشاط.
- ضع لوحة جيدا يحتوي على بويضات على النظام الآلي، الذي يستخدم مبدأ هو موضح في الشكل 4.
- تركيب منحنى
- تحليل النتائج باستخدام البرنامج المناسب، استخدام منحنى التنشيط تركيز المصور، ارسم السعة الحالية كدالة لوغاريتم تركيز مؤثر.
- مراقبة منحنى سيجمويدال التي يمكن تركيبها في وقت لاحق مع المعادلة هيل التجريبية في النموذج:
هنا،
Y= جزء صغير من مقولة الحالية،
المفوضية الأوروبية 50 = تركز تنشيط 50%،
x = تركيز المجمع،
nح = معامل هيل أو كوبيراتيفيتي الظاهر. - تطبيع التيارات لوحدة بتقسيم السعة لكل استجابة مقابل القيمة المسجلة في أعلى تركيز لتحليل البيانات التي تم الحصول عليها من مجموعة من الخلايا.
- تحديد متوسط والأخطاء المعيارية وتحقيق تركيب منحنى باستخدام البرمجيات المتاحة اصطلاحا.
3-الكهربية التسجيلات في شرائح المخ
ملاحظة: تعد شرائح الفئران هيبوكامبال وفقا للمبادئ التوجيهية الوطنية والمؤسسية.
-
إعداد شرائح الحصين
- إعداد التشريح الاصطناعي الدماغية الشوكي السائل (داكسف) مع مم 124 124 كلوريد الصوديوم، 2.5 ملم بوكل، 1.25 مم خ2ص4، 2 مم MgSO4.7H2س، 2.5 مم كاكل2 ح 22س، 26 مم ناكو3، الجلوكوز 10 ملم و 4 مم ساكتشاروسي الغاز في الزجاجة مع خليط من 95% O2 و 5% CO2.
- إعداد تسجيل اصطناعية الدماغية الشوكي السائل (راكسف) مع 124 مم كلوريد الصوديوم و 5 ملم بوكل، 1.25 مم خ2ص4، 2 مم MgSO4.7H2س، 2.5 مم كاكل2 ح 22س، 25 مم ناكو3والجلوكوز 10 ملم بالغاز في الزجاجة مع خليط من 95% O2 و 5% CO2.
- تخدير الفئران باستخدام خليط من إيسوفلوراني 2.5% والأكسجين النقي وقطع رأس لهم.
- قص فروة الرأس بعد خط الوسط مع زوج خير من المقص. قطع الجمجمة على طول خط الوسط دون إلحاق الضرر بالانسجة الكامنة. إزالة الجمجمة بملاقط واستخدام ملعقة غرامة ليستخرج الدماغ.
- ضع الدماغ في حل داكسف المشككين في الرايت وتشريح تشكيل هيبوكامبال اليسرى مع ملعقة غرامة.
- قطع شرائح عرضية (400 ميكرون سميكة) من الجزء المتوسط من الحصين مع مروحية أنسجة ونقلها إلى دائرة التسجيل باستخدام فرشاة الطلاء. حفظ الشرائح في RT لمدة 45 دقيقة.
- نتخلل الشرائح مع راكسف المشككين في 35 درجة مئوية و بمعدل 1.5 مل/دقيقة فقاعة الحل مع خليط من 95% O2 و 5% CO2.
ملاحظة: بعد هذه الخطوة، الشرائح على استعداد للتجارب الكهربية.
-
تسجيل السكان واحدة سبايك
- ضع شريحة الدماغ في قاعة مدمجة بالمجهر.
- نتخلل الشريحة بمعدل 3 مل/دقيقة مع راكسف.
- سحب ميكروبيبيتي زجاج البورسليكات مع ساحبة ماصة وجود مقاومة MΩ ~ 2.
ملاحظة: يستخدم كقطب تسجيل هذا ميكروبيبيتي ومتصل كهربائياً بمكبر للصوت. - تعبئة في ميكروبيبيتي بمحلول يحتوي على كلوريد الصوديوم م 2 ووضعها في حامل ماصة مكبر للصوت.
- ضع ميكروبيبيتي التسجيل في بيراميدالي الطبقة في منطقة CA1 هيبوكامبال الشريحة باستخدام ميكرومانيبولاتور الحق.
ملاحظة: يمثل الموقع تخطيطياً في الشكل 7. - مكان قطب كهربائي معزول قطبين البلاتين/ايريديوم في الحامل في ميكرومانيبولاتور اليسرى.
ملاحظة: هذا القطب كمسري التحفيز وكهربائيا متصلاً بمولد التحفيز. - موقف مسرى التحفيز في الضمانات شافر في المنطقة CA1 هيبوكامبال الشريحة باستخدام ميكرومانيبولاتور الصحيح.
ملاحظة: يمثل الموقع تخطيطياً في الشكل 7. - إيصال نبض الحالية إلى التحفيز الكهربائي استخدام مولد حافز كل 30 ثانية (100 المايكروثانيه المدد الزمنية، بدءاً من 10 µA) وزيادة قوة التحفيز تدريجيا حتى تظهر زيادات سكان (PS).
- ضبط قوة الحافز لاستحضار PS المقابلة إلى 45 في المائة السعة القصوى التي يمكن الحصول عليها. PSs يتم تصفيتها في 2.4 كيلو هرتز ورقمية في 20 كيلوهرتز استخدام مكبر للصوت إشارة.
-
تثبيط إقران نبض
- إعداد شرائح المخ (الخطوة 3.1) والمضي قدما كما هو موضح سابقا (الخطوات 3.2.1–3.2.7).
- تسليم هما البقول الحالي (100 المايكروثانيه المدد الزمنية في فاصل زمني 20 مللي ثانية) للتحفيز الكهربائي كل 30 s استخدام مولد التحفيز. تعيين قوة الحافز لاستحضار PS المقابلة إلى 45 في المائة السعة القصوى.
-
مجمع اختبار
- جعل تخفيف المركبات لفحصها في قام المشككين حيث أن تركيز النهائية [دمس] لا يزيد عن 0.1%.
- إضافة [دمس] في حل التحكم في تركيز نفسه منه في حل مركب.
- سجل مفرد (الخطوة 3.2) أو PS إقران--نبض (الخطوة 3، 3) أثارت قبل التحفيز الجانبية شافر كل 30 ثانية لمدة 30 دقيقة على الأقل. ينبغي أن يكون الشكل PS مستقرة خلال هذه الفترة المرجعية.
- تحضير كوب مع المشككين راكسف التي تحتوي على تركيز ثابت للمجمع لفحصها.
- نتخلل شريحة هيبوكامبال مع هذا الحل بينما لا يزال تسجيل مفردة أو إقران نبض س.
- تقييم الانتعاش من تأثير مركب من بيرفوسينج الشريحة مع المشككين راكسف دون المجمع.
ملاحظة: آثار عكسية، ليعود الحزب الاشتراكي إلى شكله الأولى لاحظت خلال فترة خط الأساس قبل تطبيق مجمع.
-
تحليل البيانات
- متوسط آثار PS سجلت خلال التجربة في كتل من 4 باستخدام برنامج تحليل البيانات.
- قياس ستريك PS من آثار متوسط.
- تطبيع الاتساع كنسبة مئوية من قيم الأساس سجلت 10 دقيقة قبل بيرفوسينج مركب.
- التعبير عن البيانات يعني ± sem.
Representative Results
الملزمة:
الفحص في المختبر مع أغشية الخلية يستخدم لتحديد انتقائية البشرية GABAA α5β3γ2 مستقبلات يغاندس ملزمة في موقع allosteric BZD من γ2 المحتوية على مستقبلات. عابر transfected الخلايا HEK293 التعبير عن البشرية GABAA α5β3γ2، α1β3γ2، α2β3γ2، ومستقبلات α3β3γ2 تستخدم لإعداد الأغشية لهذا التحليل. تم الكشف عن تأثير يغاندس المحتملة عن طريق قياس التﻷلؤ من [ح]3[فلومازينيل منضمة إلى مستقبلات الغشاء (تثبيط [ح]3[فلومازينيل ملزمة). ثم يتم إنشاء منحنيات ملزمة التشرد لتقييم القدرة الانتقائية للمركبات لمستقبلات GABAA محددة كما هو الحال في المثال مع RO4938581 (الشكل 8). ويلخص الشكل 9 الشخصية من عدة مركبات الإشارة بما في ذلك α5 انتقائية GABAA مستقبلات السلبية allosteric المغير، RO49385819، التي تم إنشاؤها باستخدام مقايسة ملزمة.
التسجيلات في النمو بويضات:
التعبير عن مستقبلات GABAA مثل هيتيرومير α5β3γ2 غلة تيارات قوية ردا على التعرض GABA. الحصول على تسجيلات المشبك الجهد النموذجية في بويضتها الإعراب عن α5β3γ2 البشرية استجابة لنبضات غابا قصيرة (30 ثانية) تتراوح تصل إلى 300 ميكرون وترد في الشكل 6. في هذه التجربة، تم التخلص منها تركيزات مختلفة من GABA في لوحة 96-جيدا وكانت أثارت الردود قبل الانتقال الخلية في بئر محددة. تم غسلها غابا دقة تعود الخلية للدائرة التروية المركزية وتطبيق نضح لحل السيطرة عن طريق تفعيل مضخة تمعجية المقابلة. تسلسل البرنامج المستخدمة لتحديد المنحنى التنشيط تركيز يتضح في الشكل 6A. أجرى كاملا تلقائياً، توضح هذه البيانات كل من نوعية التسجيلات التي يمكن الحصول عليها في بويضات النمو وارتفاع مستوى التعبير مستقبلات الحصول على بضعة أيام بعد حقن مرناً. التجارب في تركيبات مختلفة من مستقبلات، تسفر عن سلسلة من المفوضية الأوروبية50ق، وهو تركيز اللازمة لتنشيط نصف مستقبلات GABA. مؤامرة من المفوضية الأوروبية50للقيم على الرسم بياني عنكبوت، مثل كما هو موضح في الشكل 10، يوفر مقارنة خصائص مستقبلات سريع والتأثير لتشكيل وحدة فرعية.
لدراسة تأثير المغير allosteric السلبية أو الإيجابية (نام أو بام)، من الضروري مقارنة الاستجابة أثارت من قبل نبض اختبار مؤثر (GABA)، أولاً في عنصر التحكم، ومن ثم حضور في المغير. ويتضح في الشكل 11بروتوكولا تجريبية تتسم بكفاءة لإجراء هذه تجربة. أولاً يتم تحديد استجابة الخلية لتركيز مرجع غابا ويتم تكرار التسلسل بتطبيق نفس تركيز غابا وثم تطبيق المشارك غابا بالإضافة إلى المغير. يكشف مؤامرة لاثنين من الردود فرضه في هذا المثال تثبيط ملحوظ الناجم عن وجود المغير. سهولة الحصول على إجراء تقييم كمي لتأثير المغير بحساب نسبة الاستجابة أثارت حضور المغير مقابل عنصر التحكم ويمكن رسم النتائج في شكل مؤامرة الحرارة. وتوضح البيانات المبينة في الشكل 12 المؤامرة الحرارة المناظرة إلى التسجيلات لثلاث مجموعات من البيانات التي تم الحصول عليها للمركبات 96.
وبعد تحديد المركبات التي تنشط بما فيه الكفاية، أنها غالباً ما لا غنى عنه تقييم ما إذا كانت هذه الجزيئات التي تنشط في تركيبات مستقبلات أخرى. في حالة مستقبلات GABAA ، حددت 19 الجينات ترميز للوحدات الفرعية المختلفة، وأنه من المعروف أن مستقبل وظيفي يمكن أن تنجم عن جمعية مولتيميريك من وحدات فرعية مختلفة (انظر كنوفلاتش وهرنانديز برتران10 استعراض). على الرغم من أن العائد المفارز وتركيبات متعددة هو مرجع شاسعة من مستقبلات subtypes التي قد تتطلب عددا كبيرا من فحص العداد التي يتعين القيام بها، وأنها كثيرا ما يمكن التركيز أولاً على الأكثر وفرة النوع الفرعي الذي، في حالة غاباA المستقبلات، هو تكوين α1β2γ2. التجارب التي تجري وجها لوجه مع التعبير عن، على سبيل المثال، α5β3γ2 و α1β2γ2 في نفس الدفعة من البويضات العائد مقارنة جيدة لكل منهما آثار جزيء معين. يتم إظهار النتائج النموذجية التي تم الحصول عليها في ثلاث خلايا ل α5β3γ2 و α1β2γ2 في الشكل 13، الذي يوضح التعديل الإيجابي تفضيلية من جزيء واحد في α5β3γ2.
البروتوكول التجريبي هو موضح في الشكل 11 أيضا مناسبة لوصف النشاط بام. في هذا البروتوكول، والمجمع التي يتم اختبارها التطبيقية يشترك مع مؤثر في التركيزات المتزايدة تدريجيا. لتجنب الآثار التراكمية المحتملة الناجمة عن تطبيقات متعددة في نفس الخلية، يقاس خلية جديدة وساذجة لكل نقطة بيانات. قياس السعة للاستجابة المسجلة مع مؤثر وحدها وثم أثناء تطبيق مجمع تعطي نسبة التي يوضحها أثر بام أو حركة عدم الانحياز. وترد النتائج النموذجية التي تم الحصول عليها في α1β2γ2 و α5β3γ2 الديازيبام في الشكل 14، كاشفة حساسية واضحة من α5β3γ2 أن حوالي 10 إضعاف أعلى في هذا الجمع مستقبلات. تكون هذه القيم في علاقة جيدة مع البيانات المنشورة11. كما يعتقد بأن الموقع البنزوديازيبين ويشكل التفاعل بين γ2 وبه α المتاخمة وحدة فرعية 12-14، تقترح حساسية α5β3γ2 تقارب ديازيبام تفضيلية ل γ2-α5 على γ2 α1. إمكانية التعبير عن تركيبات مستقبلات مختلفة جنبا إلى جنب مع وصف وظيفي كفاءة يفتح طرقاً متعددة لاستكشاف العوامل المحددة للخصائص بام وأثرها على الآثار الفسيولوجية والدوائية.
شرائح المخ هيبوكامبال:
وتجري التجارب مع الفئران الدماغ هيبوكامبال شرائح للتحقق من صحة الشخصية الدوائية لأن المركبات التي تم تحديدها في فحوصات في المختبر في نموذج مستقبلات أصلي. هي الغالب GABAA مستقبلات الأنواع الفرعية المعرب عنها في الخلايا الهرمية الحصين α1β2/3γ2، α2β2/3γ2، و α5β2/3γ2، التي هي جميعا عن طريق التضمين البنزوديازيبين (بدزس)15. تثبيط نبض إقران هو نموذج يمكن أن تكشف عن استثارة هيبوكامبال الدائرة عن طريق اختبار التغيير في الرد الثاني من المحفزات الكهربائية المزدوجة هما تسليم 20 مللي ثانية عن بعضها البعض. تغيير الرد الثاني سبب ردود فعل جابايرجيك من إينتيرنيورونس إينيرفاتينج طبقة الخلايا الهرمية16-18. كما هو موضح في الشكل 7، في حالة التحكم، تحول دون الرد الثاني من المنبهات إرفاقها اثنين بسبب تثبيط جابايرجيك. عندما يتم خفض هذا التثبيط من بيرفوسينج الشريحة مع β-CCM، هو إعاقة حركة عدم الانحياز غير انتقائية، الرد الثاني من المحفزات إقران اثنين إلى حد أقل بكثير. هذا النموذج التجريبي حساسة للمركبات انتقائية لمستقبلات GABAA التي تحتوي على وحدة فرعية α5.
الشكل 1 : فحص الاستراتيجية. دواء نموذجي فحص المسار يبدأ الفرز الفائق الذي يجري فحص مكتبات كبيرة من المركبات لهدف محدد. وبعد تحديد المرشح الرائدة، يبدأ عمل الكيمياء الطبية. خلال هذه المرحلة، ستدرس الكيميائيين وصقل الجزيئات عن طريق إجراء تعديل هيكلي للوفاء بالمعايير المطلوبة، مثل الانتقائية المستهدفة، penetrance الدماغ، والاستقرار، وتدهور إلخ خلال هذه المرحلة الحاسمة، من الضروري تقييم ما إذا كانت التعديلات الكيميائية لم تتغير خصائص الجزيء وصقل لأفضل المرشحين. الخطوة التالية تحديد واعدة بعض المركبات، وتقديمهم للخطوات التالية التي تشمل السلامة، التسامح، إلخ علما أن الكهربية يرد كالاعتداء الوظيفية إلا أن الأساليب الأخرى، بما في ذلك الكالسيوم الفلورية يمكن استخدام الاختبارات أو الجهد الأصبغة الحساسة، كبدائل. كما تستخدم هذه الأساليب الأخير في فحوصات الفائق كبديل لفحوصات ملزمة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تخطيط 96-بئر مطلي تستخدم لربط التجارب. يتم استخدام العمود 1 لربط مجموع القياسات والعمود 2 لقياسات غير محددة ملزمة. تمتلئ صفوف A – ح مع 4 مركبات مختلفة في زيادة تركيزات (الأعمدة 3 – 12)، كل مجمع في التكرارات (أي 1 مركبة في صفوف ألف وهاء، 2 مجمع في صفوف ب و إلخ) ممثلة في التخطيط بألوان مختلفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : استخدام نظام الآلي microinjection. (A) A دقيقة نظام XYZ، الذي هو مطعون إبرة حقن زجاجية مليئة بسائل يحتوي على بلازميد الاهتمام، تلقائياً إلى بويضات. (ب) يظهر هذا الفريق المخروطية 96-جيدا-أسفل لوحة في فيه (ج) يتم حقنها في بويضات تلقائياً. (د) هذا الفريق يوضح مبدأ الحقن. لحقن النووية، تخترق الإبرة البويضيه أعمق قليلاً من النواة، كما هو مبين في لوحة ب. ثم، يتم سحب الإبرة من النواة (راجع لوحة ج) قبل الحقن (انظر لوحة د). (ﻫ) تقييم نوعية الحقنة، الإبرة يمكن أن تملأ بصبغة وبويضات "المطبوخة" يمكن أن يكون خفض إلى النصف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : مبدأ القطب اثنين المشبك الجهد الآلي. يستند المبدأ نقل الإعداد بين الآبار بدلاً من تطبيق السائل في التروية. (أ) الجانب الأيسر من لوحة يمثل هذا الترتيب يسمح التسجيل في البويضيه النمو مع الأقطاب اثنين وسلة صغيرة تحافظ على معالجة تجميعية سائل حول إعداد أثناء الحركة من عينة واحدة إلى آخر. يتم عرض صورة من البويضات توضع في السلة مع الأقطاب اثنين على الجانب الأيسر. (ب) هذا الفريق يظهر تمثيل تخطيطي الكهربية "رأسا على عقب" تسجيل مبدأ. (ج) هذا الفريق يظهر التصرف في البويضات ولوحة المركبة، ومحطة المياه والصرف الصحي على جدول التسجيل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : المشبك الجهد الكهربائي اثنين تسجيل مقابل المشبك التصحيح. تتم مقارنة المشبك جهد الكهربائي اثنين نموذجي تسجيل لبويضات (اللوحة اليمنى) لتكوين التصحيح المشبك المستخدمة لخط خلية (اللوحة اليمنى). لاحظ الفرق في الحجم بين بويضات وهي حوالي 1 ملم في القطر مقابل الخلايا التي هي حوالي 20 ميكرومتر. في المشبك الجهد الكهربائي اثنين، تتم مقارنة بإمكانات الأغشية البويضيه الجهد المطلوب عقد والفرق إشارة يحقن مسرى الحالية. في تسجيل تصحيح المشبك، يفترض أن مقاومة مسرى المشبك التصحيح ضئيلة مقابل مقاومة الغشاء، وعليه، إخلاص تغذية أن الجهد التي فرضتها مكبر للصوت إلى غشاء الخلية19. ويوضح الصورة نضح سائل شعيرة التي تمتلئ في القناتين لخط (أنبوب ثيتا) مع حل السيطرة من ناحية، ومن ناحية أخرى، مع حل الذي يحتوي على20،المخدرات21. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : تركيز تفعيل العلاقة في مستقبلات α5β3γ2 البشرية- (أ) التسلسل السيطرة على النظام الآلي يتكون من سلسلة من الرموز ويحدد البروتوكول التجريبي لتحديد العلاقة التنشيط تركيز. في الخطوات من 1-3، كما هو مبين في هذا الفريق، يحمل النظام البويضات من اللوحة في سلة قياس. يتم قياس تسرب الحالية في الخطوة 2، وينبغي أن تتجاوز هذه القيمة المعايير المطلوبة، يتغير تلقائياً الخلية (الخطوة 3). بعد فترة استقرار (الخطوة 4)، استجابة البويضات إلى مرجع تركيز غابا (خطوات محسوبة 5-8). يتم الاحتفاظ ببويضات عرض التيارات أكبر من 1 µA لقياس اللاحقة. في الخطوات من 11 – 13، هو تحدي الخلية بتركيزات مختلفة من GABAA وتكرر العملية نفسها للعدد المطلوب من تركيزات (الخطوة 14) وخلايا (الخطوة 15). (ب) يظهر هذا الفريق التيارات النموذجية أثارت سلسلة من موجز غابا التطبيقات (30 ق) المطبق في تزايد الطلب. يتم الإشارة إلى توقيت تطبيق مجمع القضبان. (ج) الأرض الحالية الذروة إلى الداخل كدالة لوغاريتم تركيز غابا غلة المنحنى تنشيط التركيز بسهولة مزودة بالمعادلة هيل التجريبية، مع منحنى مستمر والمفوضية الأوروبية50 في حوالي 11 ميكرون، وتلة معامل 1.3. تم تطبيع التيارات التي سجلت في 8 خلايا لوحدة للاستجابة مقولة القصوى. وتبين الأشرطة الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7 : Β-CCM، نام GABAA يقلل من تثبيط نبض إقران في شرائح هيبوكامبال. (أ) هذا الفريق يظهر تمثيل تخطيطي من شريحة هيبوكامبال الفئران. شافر الضمانات (Sch ج) التي تنشأ من الخلايا الهرمية CA3 مشروع محاور عصبية أربوريزيشن الجذعية من CA1 الخلايا العصبية الهرمية. ووضعت ميكروبيبيتيس في بيراميدالي الطبقة (شارع بيراميدالي) لتسجيل السكان والتموج (PS) وفي رادياتوم الطبقة (شارع رادياتوم) لتسجيلات الجذعية من الميدان إمكانات بوستسينابتيك ضادات (ابسب). وكان وضع مسرى التحفيز داخل الضمانات شافر. (ب) يظهر هذا الفريق PSs أثارت قبل المحفزات مقترن بتطبيقها من خلال نفس الكهربائي محفزة في فاصل زمني 20 مللي ثانية. السكان استجابة لحافز الثانية (PS2) من السعة أصغر من ذلك استجابة لحافز الأولى (PS1). (ج) PSs سجلت في غياب (شريط أسود) ووجود β-CCM، نام مستقبلات GABAA غير انتقائية (شريط أخضر). Β-CCM تتعزز السعة لل PS2 الثانية جزئيا حظر أي تثبيط جابايرجيك تغذية إلى الأمام. تبين الأشرطة الخطأ المعياري للوسط و * * * أن البيانات كبيرة جداً مع ف < 0.01. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8: الحصول على نتائج ملزمة نموذجية في مقايسة (تثبيط أو التشرد) تنافسية. منحنيات ملزمة التشرد تتولد من الذي IC50 وكي يمكن تحديد. IC50 تركيز يجند المتنافسة التي تحل محل 50% ملزمة محددة راديوليجاند، وكي (تثبيط المستمر لمخدرات) هو تركيز يجند المتنافسة التي ستشغل 50% مستقبلات إذا لم راديوليجاند كانت موجودة. كي يحسب من ال IC50 باستخدام المعادلة تشنغ-براسوف:
الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 9 : تم إجراء ملزم التشرد تنافسية مع يغاندس ملزم في الأنواع الفرعية مستقبلات GABAA الرئيسية. الانتماءات (nM) كانت تقاس باستخدام مقايسة فلومازينيل-ملزم [ح]3[وأغشية من الخلايا HEK293 عابر transfected مع وحدة فرعية تركيبات مستقبلات GABAA بشرية مختلفة. تمثيل الرسم البياني يبين بوضوح حساسية المتمايزة لوحظت بالنسبة RO493851 المركب مع كي أدنى في مستقبلات α5β3γ2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 10 : حساسية مستقبلات GABA التفاضلية. مؤامرة من مستقبلات GABA المفوضية الأوروبية50 قطعة عنكبوت وتمثيل لتشكيل وحدة فرعية المفترضة توفير سبل فعالة لمقارنة دور الوحدات الفرعية المختلفة. علما بأن الأخذ بمفارز γ2 مرتبط بانخفاض في حساسية مستقبلات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 11 : سبر تأثير المغير. (أ) هذا الفريق يوضح تسلسل رمز يستخدم للتحكم في النظام الآلي. لاحظ أن اثنين من الرموز (A/D) مطابقة لتسجيل عنصر التحكم (الأخضر) وخلال التعرض المغير (أحمر). (ب) هذا الفريق يوضح التيارات النمطية المسجلة في خلية التعبير عن مستقبلات GABAA خلال هذا تسلسل. لتقييم آثار المغير، أجرى تسلسل من قياس الاستجابة أثارت قبل التعرض إلى تركيز ثابت لغابا (تتبع الخضراء)، يليه التعرض أولاً إلى GABA وثم إلى غابا بالإضافة إلى المغير (تتبع الحمراء)، أولاً. وضع المؤشرات التقاطع (السماوي والأزرق) تحدد القياسات، والصليب الأزرق يشير إلى الفرق القصوى بين شروط تسجيل اثنين. النسبة بين حالة عنصر التحكم والمغير يحسب تلقائياً في برنامج التحليل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 12 : الأرض الحرارة مع ثلاثة replicates. ويبين هذا الفريق مؤامرة حرارة المقابلة لثلاثة replicates المغير الآثار التي تم الحصول عليها للمركبات 96 في مستقبلات GABAA α5β3γ2 البشرية. واعتبرت أنها لا تختلف كثيرا عن السيطرة نسب استجابة اختبار للسيطرة التي تتراوح بين 0.5 و 1-2 وتتمثل نقطة خضراء. واعتبرت أنها تمثل تأثير مثبطة النسب أدناه 0.5 وتمثلها النقاط الزرقاء. النسب أعلاه 1.2 اعتبرت تعزيز الاستجابة، وهي ممثلة بنقاط حمراء. ملاحظة المشابهة في النمط بين التسجيلات المستقلة الثلاثة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 13 : التصدي للفحص في α1β2γ2- (أ) هذا الفريق يظهر تمثيل منظمة فرعية المفترضة. وتظهر اللوحات التالية (ب-د) تقييما للآثار المترتبة المغير اللوستيريك الإيجابية في α5β3γ2 البشرية و (وح) في α1β2γ2، باستخدام تركيزات قابلة للمقارنة من GABA وتركيزات مماثلة (100 ميكرومتر) من اختبار المغير، التي تسلط الضوء على الطابع الخاص للمجمع في هذه التجارب. (ه) هذا الفريق أيضا يظهر تمثيل منظمة فرعية المفترضة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 14 : تكوين حساسية ومستقبلات بام- تحديد آثار سلسلة من تركيزات تأثيرات الديازيبام (أ-د) في α1β2γ2 و (ه-ح) مستقبلات α5β3γ2 يكشف عن اختلاف الوقت تقريبا في تقارب واضح. لاحظ أيضا تأثير تشكيل وحدة فرعية في الدورة وقت استجابة مع الحساسية أسرع في مستقبلات α1β2γ2 (انظر، على سبيل المثال، ألواح د وح). لاحظ أنه كما α1β2γ2 و α5β3γ2 مستقبلات عرض مختلف الانتماءات لغابا (انظر أيضا الشكل 10)، تم تعديل تركيز مؤثر بين مستقبلات اثنين في مجموعة تنشيط قابلة لمقارنة. (ط) هذا الفريق يمثل مؤامرة إضعاف الزيادة في سعة الحالية تطبيع للوحدة مقابل حالة عنصر التحكم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 15 : بلازميد التعبير بما في ذلك مروج T7 و CMV- إظهار هذه الألواح بلازميد للتعبير في البويضيه النمو (لوحة الأيمن العلوي) وفي خط خلية. اللوحة اليسرى السفلي يوضح خلية HEK-293 نموذجي transfected مع بلازميد تتضمن أيضا الجين لبروتين فلورية خضراء (بروتينات فلورية خضراء) مع تسجيل التصحيح-المشبك الكهربائي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
ويتطلب وضع رواية المركبات النشطة في قناة عن طريق بوابة يجند أيون مثل مستقبلات GABAA استخدام نهج متعددة. عادة، الخطوة الأولى هي كثيرا ما تجري باستخدام فحوصات ملزمة؛ ومع ذلك، هذه القياسات ليست كافية لتميز النشاط الفسيولوجية للمجمع أو الصيدلة دقة. على وجه الخصوص، مجمعا يربط مستقبل قد تعزز أو تعوق وظيفتها أو حتى تنتج أي أثر الوظيفية (السكوت) (أيربط لمستقبلات دون تعديل مهمتها). وهكذا، مطلوب اختبار وظيفية لتوصيف كامل مجمع.
Binding assays:
والميزة الرئيسية مقايسة الربط هو أن فإنه يمكن أن يجري كفاءة في عدد كبير من العينات تتراوح ما يصل إلى عدة آلاف، وأنه يقدم الانتماءات الملزمة للجزيئات النشطة. كما هو موضح هنا، يتكون الخطوة الأولى لإنشاء أسلوب لتقييم المخططات مستقبلات المرجوة. إلا وهي بينما يمكن إجراء ملزم في مستقبلات أصلي من الكسور أو العقول كامل، سيمنع هذه طريقة تحديد الصلات في أنواع فرعية من مستقبلات محددة. ولذلك، من الضروري استخدام نظم المؤتلف إلى جزيئات الشاشة في الهدف المنشود. في الوقت الحاضر، تعداء عابرة أو مستقرة من كدناس وحدة فرعية مستقبلات المرجوة في خطوط الخلايا يوفر طريقة فعالة وموثوق بها للتعبير عن الأنواع الفرعية مستقبلات للفائدة (مثلاً، α5β3γ2 GABAA ). استخدام الربط التقليدية إجراء فحوصات راديوليجاندس، ولكن في الوقت الحاضر التقنيات المتاحة التي تجنب الإزعاج للتعامل مع النشاط الإشعاعي (مثلاً، الكمية على أساس fluorescence يجند الملزمة).
التعبير الوظيفية في نظام مضيف:
للتعبير عن الجينات في نظام مضيف، يجب إدراج تسلسل الترميز للفائدة في بلازميد يحتوي على بروموتورس كافية. عادة، تستخدم في المختبر التوليف مرناً، promotors T7 أو T6 البكتيريا. لتعبير كدنا، يجب أن تنظمها نسخ الجينات للفائدة مروج eukaryote مثل CMV (الفيروس المضخم للخلايا) أو ما يعادلها. في الوقت الحاضر، والبلازميدات عدة، بما في ذلك بروموتورس اثنين (أي، بونيف، بكمف-6AC، psf-CMV/T7, pCI-الأجسام القريبة من الأرض، بكدنا)، يتم السماح المتوفرة في المختبر توليف مرناً أو تعبير كدنا كما هو مبين في الشكل 15. تعبير عن مستقبلات GABAA يمكن الحصول على إخلاص في خطوط الخلايا أو في بويضات النمو . المزايا الرئيسية لهذه الأخيرة هي عدم وجود تعبير مستقبلات ذاتية والبساطة من التلاعب، وتوافر نظام مؤتمت الصغرى-الحقن والتسجيلات. وتوضح الإجراءات المبينة في هذا البروتوكول كفاءة النظام الآلي الذي يسمح بحقن بويضات 96 في حوالي 7 دقيقة وتتطلب أي مهارات ميكرومانيبوليشن. تذكر يحتوي مبيض واحد من النمو بين 10,000 – 30,000 بويضات، فمن الواضح أن عددا كبيرا من قياسات خلية يمكن أن يجري على إعداد واحد. وعلاوة على ذلك، كتعبير يمكن أن تجري باستخدام الحقن كدنا، يمكن استخدام والبلازميدات نفس تحتوي على جينات الفائدة التي يتم تطويرها للتجارب ملزمة لتوصيف وظيفي دون الحاجة إلى مزيد من البيولوجيا الجزيئية التلاعب.
نظراً لحجمه الكبير والتعبير السطحية العالية، غلة البويضيه واحدة عدد من مستقبلات معادلة تقريبا للخلايا المتلاقية في 35 مم طبق بيتري. ومع ذلك، يمثل إعداد بويضات وحقن جزء صغير من تكلفة خط الخلية، كما لا تتطلب التجارب وسيلة ثقافة معينة والتلاعب العقيمة. تفعيل قناة GABAA واحدة غلة بيكوامبيريس قليلة (10-12) والتيارات التي تتراوح مدة تصل إلى عشرات ميكروامبيري (10-6) تسجل بسهولة في البويضات واحدة، مما يؤكد النشاط المتزامن لعدة ملايين من مستقبلات أثناء رد واحد.
خطوة أولى في توصيف القنوات عن طريق بوابة يجند أيون هي غالباً تحديد تقارب واضح مستقبلات. تتألف التجارب التي تحتاج إلى إجراء لتطبيق سلسلة من النبضات اختبار قصير مؤثر والتآمر السعة لمقولة الحالية، أو في بعض الحالات، المنطقة الواقعة تحت المنحنى (AUC) كدالة لوغاريتم تركيز مؤثر. كما أنه من الممكن بسهولة ميكروينجيكت تركيزات مختلفة بلازميد ونسبة في نفس الدفعة من بويضات، نظام هذا التعبير مناسبة خاصة لهذا وصف. وعلاوة على ذلك، كشفت مقارنة دفعة إلى دفعة بدرجة عالية من الاستقرار للمفوضية الأوروبية مختلفة50s. هو تصور تأثير تشكيل وحدة فرعية في تقارب واضح المستقبلات سهولة استخدام قطعة أرض عنكبوت، كما يتضح في الشكل 10.
غالباً ما تتم مقارنة نتائج المشبك الجهد الكهربائي اثنين التي تم الحصول عليها في بويضات النمو مع التسجيلات باستخدام أقطاب المشبك التصحيح. في حين أنها تتجاوز نطاق هذا العمل للذهاب إلى مقارنة تفصيلية بين هذين النظامين، يمكن فحص عدد قليل من النقاط. بينما المشبك تصحيح في الخلايا يوفر مزايا لتوصيف الفيزيائية الحيوية مع تطبيق المخدرات بسرعة، أكثر تعقيداً من تلك التسجيلات اثنين-القطب في بويضات النمو متطلباتها. صعوبة الأولى ولا يستهان به هو التعبير عن بروتين معين مع ضرورة ثقافة خلية، وعابرة أو تعداء مستقرة، وتحديد الخلايا التي هي التعبير عن بناء المطلوب. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه أمر لا غنى عنه لدراسة المساهمة الممكنة للتعبير الذاتية في الخلية تعتبر. وعلاوة على ذلك، يتطلب تسجيل تصحيح المشبك شخص مهرة للقيام ميكرومانيبوليشن تحت مجهر عالية التكبير، في حين أن الشخص يحتاج أيضا إجراء تحليل كاف خلال التجربة لتقييم نوعية الختم،، على سبيل المثال، المقاومة الوصول إلخ في المقابل، المشبك جهد الكهربائي اثنين التسجيل، وخصوصا واحد باستخدام نظام الكهربية، لا تتطلب أي مهارات محددة، ويمكن أن تضطلع بها فنيو المختبرات.
عند الحصول إعداد الكهربية، النظر في التكلفة هو بالتأكيد عاملاً هاما يحتاج إلى أن تحلل بعناية. على سبيل المثال، في حين أن تكلفة نظام مؤتمت مرتفع نسبيا، مقارنة أوثق يكشف أن تركيب منصة الكهربية كاملة تشمل شراء معدات مثل ميكرومانيبولاتورس جيدة، عدسة مجهر، مكبر للصوت، ومن نضح النظام، وجدول المضادة اهتزاز، بينما أيضا الحصول على البيانات، وإجراء تحليل. مقارنة تكاليف بين جهد الكهربائي اثنين المشبك الهيكل مقابل مجموعة المشبك تصحيح يكشف عن تناقضات أبعد. وعلاوة على ذلك، النظام الآلي يوفر ميزة معدات مؤتمتة بالكامل وتشغيل غير مراقب ليلا ونهارا.
الخصائص الدوائية لمجمع تتحدد بأسلوب العمل على المستقبلات. على سبيل المثال، هي مثبطات تنافسية الجزيئات التي يمكن إدخال نفس الملزمة الجيب، أو موقع أورثوستيريك، كمؤثر حد ذاته أسباب منافسة. مثبطات عدم تنافسية هي المركبات التي تمنع المستقبلات من خلال التفاعل في موقع آخر، وفي حالة قناة بوابات يجند أيون، التي يمكن أن تدخل ومنع المسام الأيونية، على سبيل المثال. أنها تتجاوز نطاق هذا العمل لدراسة آليات مختلفة للتفاعل، ولكن كذلك يمكن الحصول على المعلومات من كتاب مدرسي الدوائي و/أو من الأعمال الأخرى مثل برتران وبرتراند في22.
في حالة اللوستيريك المغيرون، يعدل يربط المركب في موقع يختلف عن الموقع أورثوستيريك، ولكن وجود جزيء حاجز الطاقة بين الدول النشطة وغيرها. المغيرون allosteric الإيجابية (PAMs) هي المركبات التي تقلل من حاجز الطاقة من الراحة إلى الحالة النشطة، وتعزز تأثير مؤثر ولذلك. وصف الآثار المحتملة في بام، من الضروري، لذلك، لتحديد إذا كان تعرض للمجمع ويعزز استجابة مؤثر، وإذا كان الأمر كذلك، أي تركيز. وتوضح التجارب التي عرضت في الرقم 11 و الرقم 14 البروتوكولات التي يمكن استخدامها بنجاح لوصف PAMs في مستقبلات GABAA .
وفي بعض الحالات، قد يكون التعرض إلى بام وحدها كافية لتنشيط المستقبلات. يمكن تحديد هذا النشاط بواسطة تعديل طفيف للبروتوكول التجريبي المقدمة هنا. هي بدلاً من استخدام تطبيق المشاركين المغير خلال التعرض إلى غابا، البروتوكول يمكن تعديله لتطبيق أول مجمع وحدها ومن ثم حضور GABA. وصف نشاط مؤثر مباشر سيدلي تحديد السعة للاستجابة أثارت من قبل المجمع نفسه، ومقارنة بالحالي أثارت GABA.
وتستخدم تجارب أجريت في شرائح المخ، مثل كما هو موضح في الشكل 7، تأكيد نشاط المجمع في مستقبلات الأصلية في دارة مثبطة محددة قبل المضي قدما في نماذج حيوانية، وعلى طول الطريق نحو التجارب السريرية. يسمح بروتوكول تسجيل وتحليل البيانات بسيطة نسبيا تصنيف مركبات متعددة عن طريق تقييم أثرها مودولاتوري التفاضلية على السعة PS. الآثار الخاصة بعدم للمركبات التي لا تتصل بنظام GABA يمكن أيضا الكشف عن (مثلاً، عند ملاحظة التغييرات في الشكل PS). المباشر، جابايرجيك كبيرة يمكن تقييم في هذه الحالات بقياس آثار المركبات على التيارات بوستسينابتيك المثبطة (إيبسكس) باستخدام تقنية المشبك تصحيح كامل الخلية8.
Disclosures
المؤلف فريدريك كنوفلاتش، وماريا-كليمانسيا هرنانديز موظفون من ف. هوفمان-لوس أنجليس روش AG، 4070 بازل، سويسرا، وشركة أدوية. دانيال برتران مقدم البلاغ موظف هيقسكرين Sàrl 6، آر دي كومبويس، 1222 Vésenaz جنيف، سويسرا، توفير مرافق الفحص لشركات الأدوية.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون جوديث لينجيل كارج ماريا و Friz غريغوار، هاب راشيل، وماري كلير بفليملين من روش وشير تيفاني ومتفائلا ديبورا من هيقسكرين لمساعداتها التقنية الممتازة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General equipment | |||
| 96 well cell harvester -(Filtermate 196) | Packard | To filter membranes with bound radioligand | |
| Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT) | Packard | Microplate Scintillation and Luminescence counter | |
| Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR) | Packard | Vial Scintillation and Luminescence counter | |
| Liquid handler (Biomek 2000) | Beckman coulter | To prepare compound dilutions | |
| Vortex (Vortex Genie 2) | Scientific industries Inc. | To mix compound stock solutions | |
| Tissue homogenizer (Polytron PT1200E) | Kinematica AG | To resuspend the membrane preparations | |
| XLfit5 software | Microsoft Excel add-on by IDBS |
Curve fitting software | |
| Smart Pull | UniPix | - | Electrode Puller |
| RoboInject | MultiChannel Systems | - | Automated Injection (Xenopus Oocytes) |
| HiClamp | MultiChannel Systems | - | Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes) |
| DataMining | MultiChannel Systems | - | Data Analysis Software |
| DataMerger | MultiChannel Systems | - | Data Processing Software |
| Digidata 1550 | Molecular Devices | Low noise data acquisition system | |
| CyberAmp 380 or equivalent | Axon Instruments | Programmable Signal Conditioner | |
| pClamp program suite | Molecular Devices | Software for data acquisition and analysis software | |
| Antivibraton table | TMC | To avoid microelectrode vibrations | |
| Patchstar Micromanipulators | Scientifica | To accurately position microelectrodes in brain slices | |
| Faraday Cage | Sutter Instruments | To isolate recordings from noise | |
| McIlwain Tissue Chopper | Campden Instruments LTD | To prepare brain slices | |
| Borosilicate glass micropipette | Warner Instruments | GC150TF-10 | To record extracellular potentials in brain slices |
| Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode | World Precision Instruments | To stimulate the brain slices with current | |
| Stimulus generator for current and voltage driven stimulation | MultiChannel Systems | STG4000 | Delivers the current to the stimulation electrode |
| Plasticware | |||
| Microtiter plate round bottom | Corning | #3365 | Used for the binding assay |
| GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2 µm poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter | Packard | #6005174 | used for the binding assay |
| 50 mL Tubes | Falcon | #352070 | used for the binding assay |
| Safe-lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | #0030 120086 | used for the binding assay |
| Safe-lock tubes 2 mL | Eppendorf | #0030 120094 | used for the binding assay |
| Shipping tubes 180 mL | Semadeni Europe AG | #3722 | used for the binding assay |
| Pony vial Polyethylene 6 mL | Perkin Elmer | #6013329 | used for the binding assay |
| Top Seal | Perkin Elmer | #60051859 | used for the binding assay |
| Spinner Flask | Bellco | BELLCO # 1965-00100 | Spinner Flask |
| 96 Well Plate (Conical) | Thermo Scientific Milian | 56368 | Injection plate for the oocytes |
| 96 Well Plate (Flat bottom) | Corning (Vitaris Switzerland) | 3364-cor | Compound Plate for the HiClamp |
| Glass capillary | Hilgenberg (Germany) | - | borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament |
| RNA preparation | |||
| Ambion mMessage mMachine | Thermo Fisher Scientific | for the in vitro synthesis | |
| Chemicals | |||
| Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4 °C. | Used for binding assay | ||
| Washing buffer: Tris 50 mM -HCl pH 7.4; store at 4 °C. | Used for binding assay | ||
| Stock solution of test compounds 10 mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| Flumazenil (RO0151788) 10 mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| Diazepam 4 mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| [3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20 °C | Used for binding assay | ||
| Microscint 40 | Packard | #6013641 | Used for binding assay |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | #6013329 | Used for binding assay |
| MS-222 | Sigma | Sigma # A5040 | MS-222 |
| AB/AM | Sigma | Sigma # A5955 | antibiotics / antimycotics |
| Collagenase | Sigma | Sigma # C1030 | Collagenase Type I |
| Rnase | Sigma | Sigma # R2020-250 mL | RNaseZAP |
| EndoFree Plasmid maxi Kit | Qiagen | Qiagen # 12362 | |
| Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.) | Sigma | ||
| Membranes | |||
| Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: α1β3γ2, α2β3γ2, α3β3γ2, α5β3γ2. See Ballard et al. 2009 for detailed methods. | Used for binding assay |
References
- Rudolph, U., Knoflach, F. Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).
- Sieghart, W. Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes. Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).
- Liu, J., et al. A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).
- Mennerick, S., et al. Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function. Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).
- Hevers, W., Luddens, H. The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes. Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).
- Macdonald, R. L., Olsen, R. W. GABAA receptor channels. Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).
- Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors. British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).
- Prenosil, G. A., et al. Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).
- Ballard, T. M., et al. RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors. Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).
- Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all. Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).
- Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding. Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).
- Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites. PLoS One. 8, 52323 (2013).
- Richter, L., et al. Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands. Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).
- Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions. Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).
- Wisden, W., Seeburg, P. H. GABAA receptor channels: from subunits to functional entities. Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).
- Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus. The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).
- Karnup, S., Stelzer, A. Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells. The Journal of Physiology. 516, Pt 2 485-504 (1999).
- Turner, D. A. Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells. The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. 391, 85-100 (1981).
- Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy. European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).
- Hapfelmeier, G., et al. Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block. Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).
- Bertrand, S., Bertrand, D. Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 11, Unit11 17 (2004).
