Summary
在这里, 我们提出的协议, 以发现活性化合物在 GABAA受体, 从绑定到生理学和药理学。
Abstract
这篇手稿提出了一个分步的协议, 筛选化合物在伽玛-丁酸 a (GABAa) 受体和它的用途, 以鉴定新分子活性的临床前化验方法从体外重组受体对他们的药理作用在本机受体在啮齿动物脑切片。对于受体的苯二氮部位的化合物结合, 第一步是建立一个主要的屏幕, 其中包括发展放射配基结合化验的细胞膜表达主要 GABAa亚型。然后, 利用鼠和人 GABA 的异种表达, 在 爪蟾卵母细胞或 HEK 293 胞内的受体, 可以在电生理检测中探讨不同受体的生理特性亚型和所鉴定化合物的药理性质。爪蟾卵母细胞系统将在这里提出, 从分离的卵母细胞和他们的显微注射与不同的基因, 由药理学表征使用双电极电压钳。最后, 在啮齿类动物脑切片中进行的录音将被描述为一种二次生理试验, 用于评估在定义良好的神经元回路中的分子在其本机受体中的活性。利用多神经元的种群反应进行细胞外记录, 并与药物应用相结合。
Introduction
在这里, 我们提出的协议, 发现化合物活性在 GABAA受体, 从绑定到生理学和药理学。在寻找特定于氨基丁酸受体的新分子时, 至关重要的是, 尽可能精确地定义感兴趣的亚型和新确定化合物的特异性评估 (例如, 为审查, 见鲁道夫和Knoflach1或 Sieghart2)。图 1说明了药物发现的典型路径和需要实现的步骤。
有约束力的化验已经和仍然是主要用于药物发现的第一步。在氨基丁酸受体的情况下, 它们被优化, 以确定绑定到受体苯二氮结合部位的化合物, 治疗有用和安全的药物绑定。其他技术, 使用荧光成像板阅读器 (FLIPR) 膜电位的红色染料为基础的化验3, 检测化合物, 如巴比妥, 绑定到其他网站, 是不太可取的, 因为他们不需要的副作用的轮廓。此外, 使用的染料可以直接激活 GABA 的受体, 从而质疑这些化验的效用4药物发现。结合化验只能提供证据表明, 某一化合物可以绑定到特定的受体类。用细胞膜进行体外检测, 鉴定选择性人 GABA α5β3γ2受体配位。瞬时转染的 HEK293 细胞表达人 GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2和α3β3γ2受体被用来为这些化验准备膜。对配体的影响通过测量马西尼的 [3h] 的闪烁 (抑制 [3h] 马西尼结合) 来检测。这项技术的主要优点是, 在感兴趣的受体中, 快速有效地测定复合结合的亲和性。
功能性研究对评价化合物的功能活性是至关重要的, 并对化合物与受体的结合所引起的机制提出生理和药理解释。今天, 它是公认的功能 GABAA感受器起因于五个亚基的汇编在由离子孔形成的 pseudosymmetry 的轴附近和结果从五个相同亚基的汇编。大多数 GABAA受体由两个或多个不同的亚基组成。主要大脑 GABAa受体, 例如, 由α1, β2和γ2亚基组成的化学计量学 2, 2 和1分别5,6。在诸如爪蟾卵母细胞或 HEK293 的宿主系统中进行重组, 可以快速探索受体的药理特性。
然后用脑切片7中的胞外记录探讨这些化合物的药理性质。这种方法可以探索化合物对神经传递的影响, 并提供了一个有效的方法来确认在异源表达系统中确定的化合物在本机受体水平上的功能效应, 在整个神经元环境。GABAergic 神经传递还可以通过测量化合物对抑制突触后电流 (IPSCs)8的影响, 在分子水平上进行评估。但是在这里使用的协议和基于全细胞补丁钳录音的脑切片更详细, 并产生较低的吞吐量。
最后, 从不同的技术及其内在的局限性出发, 探讨了体外筛选α5β3γ2的优缺点。这项工作应提供专家和非专家在氨基丁酸受体领域的一个有用的审查结合不同的体外方法, 用于解决新的调制器, 这些配体门控离子通道的发现。
Protocol
爪蟾被安置和处理根据日内瓦小行政区动物指南。
1. 放射配基装订
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测定板的制备
- 用5毫米氯化钾、1.25 毫米 CaCl2、1.25 毫米氯化镁2、120毫米氯化钠和15毫米三种方法制备 1.5 L 的测定缓冲器;用 HCl 调整 pH 值为7.4。
- 准备在50.76 µM (例如, 5 µL 化合物10毫米到980µL 化验缓冲区在离心管) 测试的化合物。用涡流机在高速2–5的情况下混合。
- 吹打1µL 的化合物 (10 毫米) 到1970µL 的检测缓冲剂, 制备参考化合物马西尼的预稀释。用涡流机在高速2–5的情况下混合。
- 稀释 [3H] 马西尼股票溶液与化验缓冲器在4°c 到4毫微米在50毫升聚丙烯管。
- 吸管50µL/井的化验缓冲区进入1和3–11的96井微板块, 如图 2所示的板块布局显示。
- 吸管73.2 µL 的化合物稀释在50.76 µM (见步骤 1.1.2) 到12栏的板块。
- 稀释每个化合物, 使用几何级数超过9步 (1E-10 -1E-06米), 23.12 µL 传输量和填充柱3–11。彻底混合稀释。每次稀释后都要改变笔尖。
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稀释细胞膜
- 解冻先前从 HEK293 overexpressing 人 GABAA受体 (0.025–0.15 毫克/毫升) 中分离出来的细胞膜, 在室温下获得80毫升, 并将悬浮液转移至4摄氏度的化验缓冲器。
- 并用重悬膜溶液仍然在4°c 与组织均质体为 30–40 s 在 10,000–12,000 rpm。
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稀安定用于非特定结合 (NSB) 控制
- 将4毫米安定的溶液稀释成5毫升的浓度为40µM 的测定缓冲液。
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开始反应
- 吸管50µL 4 毫微米 [3H] 马西尼入96井板材的每个井并且保持它在一个冰水容器。
- 添加100µL 的 GABAa受体亚型膜制备有 0.5mg/毫升的蛋白质浓度。
- 吸管50µL 40 µM 安定入专栏2。
- 在冰上孵化1小时的盘子。
- 在96井滤板的每个井中添加50µL, 用于后续膜分离和放射性测量, 随后停止反应。
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停止反应
- 准备一个洗涤缓冲器与50毫米三 HCl, pH 值7.4。
- 使用96井细胞收割机过滤解决方案。用300µL 的冷水洗涤缓冲液将板材洗净3x。
- 用塑料薄膜封住盘子的底部, 并添加40µL 的闪烁鸡尾酒, 用于每个井中的液体闪烁计数, 并用乙醇70% 擦拭。
- 在 RT 中轻轻摇动盘子至少1小时。让它至少在 RT 上再坚持一个小时。
- 通过将盘子放在闪烁计数器上测量放射性 (在 CPM 中)。允许测量每井3分钟。
-
数据分析
- 确定8复制非特定绑定 (NSB) 和总绑定 (TB) 以及样本的重复或 triplicates 的平均值。根据以下公式计算每个样本的平均值的% 特定绑定 (SB):
这里
总某人= 平均 TB 减去平均 NSB。 - 在横坐标中, 在调节抑制剂浓度时, 将其与对照。使用单一站点竞争分析公式拟合数据:
这里
y = 某人的%,
最小的y,
B = 最大y,
C = IC50,
X = 竞争化合物浓度的对数10 ,
D = 曲线的斜率 (一个小山系数)。 - 用半最大抑制浓度 (IC50) 计算结合亲和性 (基), [3h] 马西尼在各自膜9上的离解常数 (Kd) 和 [3h] 的浓度马西尼在化验中根据以下数据使用等式:
- 确定8复制非特定绑定 (NSB) 和总绑定 (TB) 以及样本的重复或 triplicates 的平均值。根据以下公式计算每个样本的平均值的% 特定绑定 (SB):
2.爪蟾卵母细胞的受体表达和记录
- 卵巢采集与卵母细胞的制备
- 制备无菌 Barth 溶液, 88 毫米氯化钠, 1 毫米氯化钾, 2.4 毫米 NaHCO3, 10 毫米 HEPES, 0.82 毫米 MgSO4. 7H2o, 0.33 毫米钙 (NO3)2. 4H2o, 0.41 毫米 CaCl2. 6H2o, pH 值7。4, 辅以100单位/毫升青霉素, 100 µg/毫升链霉素和0.25 µg/毫升两性霉素 B。
- 准备 1x OR2 培养基 (no CaCl2) 与88.5 毫米氯化钠, 2.5 毫米氯化钾, 5 毫米 HEPES, 1 毫米氯化镁2. 6H2O, pH 值7.4。
- 在冷却的 Tricaine 甲磺酸 (浓度为150毫克/升, 调整在 pH 7.4) 和碳酸氢钠 (300 毫克/升) 后, 以20分钟的深度麻醉, 牺牲一只爪蟾女性, 然后斩首。
- 用干净的剪刀和镊子迅速收获卵巢, 并将其放置在2培养皿 (10 厘米), 填充40毫升 1x Barth 溶液和抗生素/防霉。
- 将非游离卵巢存放在 Barth 溶液中长达2周, 达到4摄氏度。
- 为离解, 切开卵巢与干净剃刀刀片在小组分 (3) 并且孵化他们在50毫升 OR2 培养基没有 CaCl2 (OR2-noCaCl2) 包含0.2% 个胶原酶 (I 型) 在17–19°c 在100毫升整流罩瓶与缓慢的搅拌第4-5 h. 验证磁条是否放置在微调瓶底部约3–5厘米, 以避免粉碎卵母细胞。
- 在第4-5 h 之后, 验证大多数卵母细胞是从卵泡中释放出来的 (也就是说, 它们单独游动)。用200毫升的 OR2 1.8 毫米 CaCl2洗净他们的5x。
- 将 defolliculated 卵母细胞转移到培养皿 (10 厘米), 填充 Barth 溶液和抗生素/antimycotics, 并使它们至少在17摄氏度前一夜间在 cDNA 或 mRNA 注射之前。
- 第二天, 在双目下选择一个健康的卵母细胞, 它呈现出一种清晰而独特的动物与植物极 (用于植物极的暗褐色与淡黄色)。使用干净的巴斯德吸管, 并将卵母细胞一个一个地处理成无菌的锥形96注入井板。
注: 在放置卵母细胞时, 不需要特别注意注射;而对于 cDNA 注射来说, 将卵母细胞定向到向上的动物极是必不可少的。
- mRNA 或 cDNA 自动注射
- 根据推荐的说明, 使用商业上可用的工具包合成基因。用 RNase 清洁仪器和桌子, 戴上适当的防护手套。
注意: mrna 的质量是决定表达良好的决定性因素, 在注射过程中防止 mrna 降解是必不可少的。 - 使用商用套件准备基因, 并在 bidistilled 水中溶解所需量, 浓度为0.2 µg/µL。
- 注射10–50的 mRNA 溶液浓度为0.2 µg/µL, 或 10 nL 的 cDNA 溶液在浓度范围从0.02–0.2 µg/µL, 最好是分批95卵母细胞。
- 对于需要多个亚基的膜蛋白 (即异型缝隙连接α1β2γ2氨基丁酸A受体), 将相应的基因或基因混合在所需比例 (即1:1: 1 或 1:10:1)。
- 将卵母细胞保持在17摄氏度, 以防止卵母细胞对热休克蛋白的表达;将微板块存储在一个温度控制的存储区域中。
- 在0.1–1,000 µM OR2 的结合试验中, 溶解测试的化合物, 用于电生理记录, 并在96井平底聚丙烯板上处理。
- 根据推荐的说明, 使用商业上可用的工具包合成基因。用 RNase 清洁仪器和桌子, 戴上适当的防护手套。
- 表达的质粒
- 遵循商业可用的试剂盒的指导手册, 为 mRNA 合成与细菌 T7 或 T6 助剂, 并使20µL 的解决方案在0.2 µg/µL 在 RNase 无水。
- 准备至少20µL 的溶液, 其中含有真核细胞表达载体的 cDNA 表达, 通常在 bidistilled 水中溶解的0.2 µg/µL。
- 卵母细胞显微注射及其质量的可视化
- 注射含有质粒的溶液的 10–50 nL (见步骤2.3.1 或 2.3.2), 使用玻璃微注射针, 顶端直径可达100µm 安装在机器人装有压力弹射系统或自动注射系统。
注: 在这里讨论的例子中, 卵母细胞由95批次注射, 其自动化系统适合用于 cDNA 或 mRNA。 - 用1µL 的染料 (如亚甲基蓝) 填充注射针 1%, 并使用标准程序 (无论是在细胞核中的 cDNA 或细胞质中的 mRNA) 注射卵母细胞。
- 将注射卵母细胞在沸水中释放约1分钟。在双目下用剃刀刀片将卵母细胞切成两半。
注: 染料保持本地化, 如图 3E所示, 允许对注射进行精确观察。
- 注射含有质粒的溶液的 10–50 nL (见步骤2.3.1 或 2.3.2), 使用玻璃微注射针, 顶端直径可达100µm 安装在机器人装有压力弹射系统或自动注射系统。
- 双电极电压钳记录
- 将含有卵母细胞的井板放在自动系统上, 使用图 4所示的原理。
注: 与图 5所示的膜片钳系统相比, 该电池的真实膜电位是由电压电极读取的。 - 使用基于图标的界面编程自动记录系统, 例如,图 6所示的方案确定浓度活动关系。
- 将含有卵母细胞的井板放在自动系统上, 使用图 4所示的原理。
- 曲线拟合
- 使用适当的软件分析结果, 使用图示的浓度活化曲线, 将电流振幅绘制为激动剂浓度对数的函数。
- 观察 sigmoidal 曲线, 随后可以在形式上与经验性的希尔方程配合使用:
这里
Y= 诱发电流的分数,
欧共体50 = 集中为50% 激活,
x = 化合物的浓度,
nH = 小山系数或明显的协同。 - 通过将每个响应的振幅除以最高浓度记录的值来分析从一系列单元获得的数据, 将电流正常化为统一。
- 通过标准可用软件, 确定平均误差和标准偏差, 实现曲线拟合。
3. 脑切片的电生理记录
注: 海马大鼠切片是根据国家和机构指南编写的。
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海马切片的制备
- 准备解剖人工脑脊髓液 (dACSF) 与124毫米氯化钠 124, 2.5 毫米氯化钾, 1.25 毫米的 CaCl 2PO4, 2 毫米 MgSO4. 7H2o, 2.5 毫米2 2H2o, 26 毫米 NaHCO3, 10 毫米葡萄糖和4毫米蔗糖在瓶子里掺入 95% O2和 5% CO2的混合物。
- 准备记录人工脑脊髓液 (rACSF), 124 毫米氯化钠, 5 毫米氯化钾, 1.25 毫米的2PO4, 2 毫米 MgSO4. 7H2o, 2.5 毫米 CaCl2 2H2o, 25 毫米 NaHCO3, 10 毫米葡萄糖在瓶子里掺入 95% O2和 5% CO2的混合物。
- 麻醉大鼠使用2.5% 异氟醚和纯氧的混合物, 并斩首它们。
- 用一把细剪刀剪下中线的头皮。沿中线切开头骨, 不损害底层组织。用镊子取出头骨, 用细铲铲出大脑。
- 将大脑放在 RT 的毒气 dACSF 溶液中, 用细铲解剖左海马的形成。
- 将横片 (400 µm 厚) 从海马体的中等部位切割成组织斩波器, 并用画笔将其转移到录音室。保持45分钟的 RT 切片。
- 灌注的切片与毒气 rACSF 在35摄氏度和以1.5 毫升/分钟的速度. 气泡溶液与 95% O2和 5% CO2的混合物。
注意: 在这一步之后, 切片已经准备好进行电生理实验。
-
单种群穗记录
- 将脑切片放入显微镜下的腔室。
- 灌注的速度为3毫升/分钟与 rACSF。
- 拉一杯硼硅酸盐玻璃微与具有 2 MΩ电阻的吸管拉出器。
注: 此微用作记录电极, 并与放大器电连接。 - 用含有2米氯化钠的溶液填充微, 将其放入放大器的吸管支架中。
- 用右机器人将记录微定位在海马片 CA1 区 pyramidale 地层中。
注意:图 7中的位置以示意图表示。 - 将绝缘双极铂/铱电极置于左侧机器人的支架上。
注: 此电极用作刺激电极, 并与刺激发生器电连接。 - 用右机器人将刺激电极定位在海马片 CA1 区的谢弗络中。
注意:图 7中的位置以示意图表示。 - 每三十年代使用刺激发生器将电流脉冲传递给刺激电极 (100 µs 持续时间, 从10µA 开始), 并逐渐增加刺激强度直到出现人口峰值 (PS)。
- 调整刺激强度以唤起与可获得的最大振幅的45% 对应的 PS。PSs 被过滤在2.4 赫和数字化在20赫使用信号放大器。
-
配对脉冲抑制
- 准备脑切片 (步骤 3.1) 并按照前面的描述进行 (步骤 3.2. 1–3.2 7)。
- 使用刺激发生器, 每三十年代交付两个电流脉冲 (100 µs 持续时间在20毫秒间隔) 到刺激电极。设置刺激强度来唤起一个对应于最大振幅的45% 的 PS。
-
复合测试
- 使稀释的化合物在毒气 ACSF 中进行测试, 使亚砜的最终浓度不高于0.1%。
- 在与复合溶液相同浓度的控制溶液中添加亚砜。
- 记录单个 (步骤 3.2) 或配对脉冲 (步骤 3.3) PS 诱发的谢弗间接刺激每三十年代至少30分钟。PS 形状在这个基线期间应该是稳定的。
- 准备一个装有含毒气 rACSF 的烧杯, 以测试该化合物的固定浓度。
- 灌注海马切片与这个解决方案, 而仍然记录单或配对脉冲 PS。
- 通过灌注片与无化合物的加毒气 rACSF 来评价复合效应的恢复。
注: 对于可逆效果, PS 还原为在复合应用程序之前的基线期间观察到的初始形状。
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数据分析
- 使用数据分析软件在4块实验过程中记录的 PS 痕迹平均值。
- 测量平均迹线的 PS 振幅。
- 将振幅正常化为在灌注化合物之前记录10分钟的基线值的百分比。
- 将数据表示为平均值。
Representative Results
绑定：
用细胞膜进行体外检测, 在γ2含受体的 BZD 构部位, 识别选择性人 GABA A α5β3γ2受体配位结合。瞬时转染的 HEK293 细胞表达人 GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2和α3β3γ2受体被用来准备该化验的膜。通过测量马西尼与膜受体 (抑制 [3h] 马西尼结合) 的闪烁, 检测出电位配体的作用。然后生成位移结合曲线, 以评估特定 GABA 受体化合物的选择性, 如 RO4938581中的例子 (图 8)。图 9总结了几种参考化合物的外形, 包括α5选择性 GABA 的受体负构调制器, RO49385819, 这是使用结合试验产生的。
录音在爪卵母细胞:
氨基丁酸受体的表达, 如α5β3γ2 heteromer, 在反应 gaba 暴露时产生强健的电流。典型的电压钳记录获得的卵母细胞表达人类α5β3γ2响应短 GABA 脉冲 (三十年代) 范围高达300µM, 如图 6所示。在本实验中, 将不同浓度的氨基丁酸在96井板中进行处理, 并通过在特定井中移动细胞来诱发反应。通过激活相应的蠕动泵, 将细胞回流至中心灌注室, 并应用控制液灌注, 将 GABA 彻底冲洗干净。用于确定浓度活化曲线的程序序列如图 6所示。这些数据完全自动进行, 说明了爪蟾卵母细胞可以获得的录音质量, 以及在 mRNA 注射后几天获得的高水平受体表达。这些实验, 在不同的受体组合, 产生了一系列 EC50s, 这是浓度的 GABA 需要激活一半的受体。在蜘蛛图上的 EC50值的一个图, 如图 10所示, 提供了对受体特性和亚基组成的影响的快速比较。
为了检查阴性或正构调制器 (南或 PAM) 的影响, 有必要比较激动剂 (GABA) 测试脉冲诱发的反应, 首先在控制, 然后在调制器的存在。图 11说明了进行这种实验的有效实验协议。细胞对 gaba 的参考浓度的反应首先确定, 并通过应用相同的 gaba 浓度, 然后由 gaba 加调制器的联合应用重复序列。两个叠加响应的一个情节在本例中显示了调制器存在的明显抑制。对调制器效应的量化是通过计算调制器与控制的存在所产生的响应的比值而得到的, 结果可以用热图的形式绘制出来。图 12所示的数据说明了与为96种化合物获得的三个数据集的记录相对应的热图。
在鉴定足够活跃的化合物之后, 评估这些分子是否在其他受体组合中活动是必不可少的。在氨基丁酸A受体的情况下, 已经确定了19种不同亚基的基因编码, 众所周知, 功能性受体可能是由不同亚基的 multimeric 组装引起的 (见 Knoflach、埃尔南德斯和10审查)。尽管多个亚基和组合产生了大量的受体亚型, 可能需要进行大量的计数器筛选, 但通常可以首先集中在最丰富的亚型, 在 GABA 的情况下,受体, 是α1β2γ2的组成。实验进行头部与头部的表达, 例如, α5β3γ2和α1β2γ2在同一批卵母细胞产量一个良好的比较, 一个特定的分子的影响。图 13显示了α5β3γ2和α1β2γ2三细胞的典型结果, 说明了α5β3γ2中一个分子的优先正调制。
图 11所示的实验性协议非常适合 PAM 活动的特性。在这个协议中, 被测试的化合物与激动剂在逐渐增加的浓度下协同应用。为了避免同一单元格上多个应用程序可能产生的累积影响, 为每个数据点测量一个新的和天真的单元格。用激动剂单独记录的响应幅度的测量, 然后在复合应用中产生一个比, 量化 PAM 或不结盟运动的效果。在α1β2γ2和α5β3γ2为安定获得的典型结果如图 14所示, 揭示了α5β3γ2的明显敏感性, 在这个受体组合中大约有10倍高。这些值与发布的数据11具有良好的相关性。由于认为苯二氮的部位是由γ2及其相邻α亚基12-14之间的界面组成, α5β3γ2的敏感性表明, 在γ2α1γ2α5中, 对西泮的亲和性优先。表达不同受体组合的可能性, 结合有效的功能表征开辟了多种方法来探讨 PAM 性质的决定因素及其对生理和药理作用的影响。
海马脑切片:
对大鼠海马脑切片进行了实验, 验证了本种受体模型体外测定中所鉴定化合物的药理学特征。主要 GABAA受体亚型表达在海马的锥体细胞是α1β2/3γ2, α2β2/3γ2, α5β2/3γ2, 这些都是由苯二氮 (BDZs)15调制。配对脉冲抑制是一种范式, 它可以通过测试两个配对的电刺激的第二次反应的变化来揭示海马电路的兴奋性, 分别提供20毫秒。第二反应的变化是由于中间神经元支配锥体细胞层16-18GABAergic 反馈。如图 7所示, 在控制情况下, 由于 GABAergic 抑制, 两个配对刺激的第二反应受到抑制。当这种抑制通过灌注切片与β CCM, 一个非选择性的不结盟运动, 第二反应的两个配对的刺激被抑制到更小的程度。这个实验范式对含有α5亚基的 GABA 受体的化合物是敏感的。
图 1: 筛选策略.一个典型的药物筛选途径开始于高通量筛选, 其中大型的化合物库被筛选为一个特定的目标。在确定候选者之后, 药物化学的工作就开始了。在这一阶段, 化学家将研究和提炼分子通过进行结构修改, 以满足预期的标准, 如目标选择性, 脑显性, 稳定性, 降解等在这个关键的阶段, 这是必不可少的评估化学修饰是否改变了分子的性质, 并为最佳候选者细化。下面的步骤是确定一些有希望的化合物, 并将其带到下一步, 其中包括安全性, 耐受性等.请注意, 电生理学是指功能检测, 但其他方法, 包括钙荧光化验或电压敏感染料, 可作为替代品使用。这些后一种方法也用于高通量化验, 作为一种替代的结合化验。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2:96-镀层的布局, 用于结合实验.列1用于对非特定绑定度量的总绑定度量和2列。行 A–H 填充4种不同的化合物在增加浓度 (列 3–12), 每个化合物的重复 (即,复合1在行 A 和 e, 复合2在 B 和 F等) 在布局中表示不同的颜色。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 使用自动系统进行显微注射.(a) 一个精确的 XYZ 系统, 其中装满含有感兴趣质粒的液体的玻璃注射针, 会自动戳入卵母细胞。(B) 本小组展示了96井锥底板, 其中 (C) 卵母细胞自动注射。(D) 本小组阐述了注射原理。对于核注射, 针穿透卵母细胞略深于细胞核, 如小组B所示。然后, 针从细胞核中取出 (见面板C) 注射前 (见面板D)。(E) 对注射质量进行评估, 可以用染料填充针头, 并将 "熟" 卵母细胞切成两半。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 全自动两个电压钳电极原理.该原理是以在井间的准备工作为基础, 而不是在灌注中应用液体。(A) 小组的左手边表示允许在爪蟾卵母细胞中记录两个电极和一个小篮子的安排, 在运动过程中从一个样品中保持液滴围绕准备工作。到另一个。在篮子里放置有两个电极的卵母细胞的图片显示在右手边。(B) 本小组显示 "倒置" 电生理记录原理的示意图。(C) 本小组显示了在记录表上的卵母细胞、复合板和洗手台的配置。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 双电极电压钳记录与膜片钳.一个典型的双电极电压钳记录的卵母细胞 (左面板) 与膜片钳配置用于细胞线 (右面板)。请注意, 直径约1毫米的卵母细胞与大约20µm 的体细胞之间的大小差异。在双电极电压钳中, 将卵母细胞的膜电位与所需的保持电压进行比较, 将信号差注入电流电极中。在膜片钳记录中, 假定膜片钳电极的电阻与膜电阻是微不足道的, 因此, 放大器施加的电压会忠实地送入细胞膜19。这幅画展示了一种液体灯丝灌注, 其中一个θ管 () 的两个通道被填充, 一方面是一个控制解决方案, 另一方面是含有药物20,21的溶液。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 集中活化关系在人α5β3γ2感受器官.(A) 控制自动系统的顺序由一系列图标组成, 并为确定浓度活化关系设置实验协议。在步骤1–3中, 如本面板所示, 系统将卵母细胞从盘中加载到测量篮中。泄漏电流是在步骤2中测量的, 如果此值超出所需条件, 则单元格将自动更改 (步骤 3)。在稳定期 (步骤 4) 后, 测定卵母细胞对参考 GABA 浓度的反应 (步骤 5-8)。显示电流大于1µA 的卵母细胞为随后的测量保留。在步骤11–13中, 细胞受到不同浓度的 GABAA的挑战, 而这个过程会重复自己所需的浓度 (步骤 14) 和细胞 (步骤 15)。(B) 本小组显示了一系列在生长秩序中应用的短 GABA 应用 (三十年代) 诱发的典型电流。复合应用程序的时间由条形指示。(C) 作为 GABA 浓度对数函数的峰值内向电流的一个地块产生浓度活化曲线, 由经验性的希尔方程容易地拟合, 连续曲线, EC50在大约11µM, 和一座小山系数为1.3。8个细胞中的电流被规范化为最大诱发反应的统一。条形指示平均值的标准误差。请单击此处查看此图的较大版本.
图 7: β-CCM, GABAa在海马切片减少配对脉冲抑制.(A) 这个小组显示了鼠海马切片的示意图表示。谢弗络 (C) 来源于 CA3 锥体细胞轴突项目上的 CA1 锥体神经元的树突树枝状。Micropipettes 被放置在地层 pyramidale (str pyramidale) 记录人口峰值 (PS) 和在地层 radiatum (str radiatum) 的树突状记录的领域兴奋后突触电位 (epsp)。刺激电极放在谢弗络内。(B) 本小组显示在20毫秒间隔内通过同一刺激电极通过配对刺激诱发的 PSs。对第二刺激 (PS2) 的人口反应幅度比对第一次刺激 (PS1) 的反应小。(C) PSs 是记录在缺席 (黑酒吧) 和存在的β-CCM, 非选择性 GABAa受体南 (绿色酒吧)。通过部分阻断前馈 GABAergic 抑制, β-CCM 增强了第二 PS2 的振幅。条形图表示平均值和 ** 的标准误差, 数据在p < 0.01 中具有高度的显著性。请单击此处查看此图的较大版本.
图 8:在竞争性 (抑制或置换) 试验中获得的典型绑定结果.产生的位移结合曲线, 使 IC50和基可以确定。IC50是一个相互竞争的配体的浓度, 它取代了放射配基的50% 的特定约束力, 而基 (药物的抑制常数) 是一个竞争配体的浓度, 如果没有放射配基, 将占据50% 的受体。存在。该基由 IC50计算, 使用 Prusoff 方程:
请单击此处查看此图的较大版本。
图 9: 在大 GABAA受体亚型上进行了具有竞争性置换结合的配体结合.亲和 (nM) 测量使用 [3H] 马西尼结合检测和膜从 HEK293 细胞瞬时转染的不同的人 GABAa受体亚基组合。直方图表示清楚地说明了在α5β3γ2受体中, 与最低 RO493851 的化合物的差异敏感性。请单击此处查看此图的较大版本.
图 10: 受体的差异 GABA 敏感性.一个图的受体 GABA 欧共体50在蜘蛛情节和表示的假定亚基组成提供了有效的方法来比较不同亚基的作用。请注意, γ2亚基的引入与受体敏感性的降低有关。请单击此处查看此图的较大版本.
图 11: 探讨调制器的作用.(A) 此面板说明用于控制自动系统的图标序列。注意, 两个 (a/d) 图标对应于控制 (绿色) 和调制器曝光 (红色) 中的记录。(B) 本小组显示在这种序列中表达 GABAa受体的细胞中记录的典型电流。为了评估调制器的效果, 首先测量了由暴露于 gaba (绿迹) 的固定浓度所诱发的反应, 其次是先接触 gaba, 然后再到 gaba 加上调制器 (红色的痕迹)。定位十字线光标 (青色和蓝色) 分隔测量, 蓝色十字表示两个记录条件之间的最大差异。在分析软件中自动计算出控制与调制条件的比值。请单击此处查看此图的较大版本.
图 12: 热图与三复制.该面板显示了一个热图, 对应于在人类α5β3γ2 GABAa受体上获得的96种化合物的调制效果的三复制。测试反应的比率在控制范围在0.5 和1.2 之间被考虑了与控制没有明显地不同, 并且由一个绿色点代表。低于0.5 的比率被认为是一种抑制效应, 由蓝点表示。超过1.2 的比率被认为是增强反应, 由红点表示。注意三独立录音之间的模式相似。请单击此处查看此图的较大版本.
图 13: α1β2γ2的柜台检查.(A) 本小组显示一个假定的亚单位组织的代表。下面的面板显示 (BD) 对人α5β3γ2和 (α1β2γ2) 中的正构调制器的影响进行评价, 使用GABA 的可比浓度和类似浓度 (100 µM)调制器, 突出了在这些实验中测试的化合物的特异性。(E) 本小组还显示一个假定的亚单位组织的代表。请单击此处查看此图的较大版本.
图 14: PAM 敏感性和受体组成.在α1β2γ2和 (EH) α5β3γ2受体中, 一系列浓度的安定效应 (aD) 的测定结果表明, 近10倍的明显亲和性差异。也注意亚单位组分的影响在反应时间路线以一个快速的脱敏在α1β2γ2感受器 (例如, 看, 小组D和H)。请注意, 由于α1β2γ2和α5β3γ2受体显示 GABA 的不同亲和力 (参见图 10), 激动剂的浓度被调整在两个受体之间是在一个可比较的活化范围。(I) 此面板表示在当前振幅中对统一与控制条件进行正常化的褶皱增加的情节。请单击此处查看此图的较大版本.
图 15: 表达质粒包括 T7 和巨细胞病毒助剂.这些面板显示的质粒的表达在爪蟾卵母细胞 (右上板) 和单元格线。右下方的面板说明了一个典型的 HEK-293 细胞转染的质粒, 也含有绿色荧光蛋白 (GFP) 的基因与补丁钳记录电极。请单击此处查看此图的较大版本.
Discussion
在配体-门控离子通道上活性的新型化合物的开发, 如 GABA 受体需要使用多种方法。通常, 第一步通常是使用结合分析进行的;然而, 这种测量不足以描述化合物的生理活动或其精确的药理学。特别是, 与受体结合的化合物可以增强或抑制其功能, 甚至不产生功能性影响 (即, 在不改变其功能的情况下绑定到受体)。因此, 一个完整的复合特性需要一个功能测试。
装订化验:
结合试验的主要优点是, 它可以有效地进行大量的样品, 范围达数以千计, 它为活性分子提供了具有约束力的亲和力。如本文所述, 第一步包括建立一个评估所需受体亚型的方法。也就是说, 虽然结合可以对本地受体从分数或整个大脑, 这样的方法将防止确定的亲和力在特定的受体亚型。因此, 有必要使用重组系统在所需目标上筛选分子。目前, 在细胞系中对所需受体亚单位基因的瞬态或稳定转染提供了一种有效而可靠的方法来表达感兴趣的受体亚型 (如GABAa α5β3γ2)。传统的结合检测利用 radioligands, 但现在的技术可以避免处理放射性的不便 (例如, 定量荧光基配体结合)。
主机系统中的函数表达式:
为了表达宿主系统中的基因, 必须将感兴趣的编码序列插入包含适当助剂的质粒中。通常, 对于体外mRNA 合成, 使用细菌 T7 或 T6 助剂。对于 cDNA 表达, 感兴趣基因的转录必须由真核细胞助剂 (巨细胞病毒) 或等效物来调节。现在, 有几个质粒, 包括两个助剂 (即pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, pCI-新, pcDNA), 可以允许在体外合成 mRNA 或 cDNA 表达式, 如图 15所示。氨基丁酸受体的表达可以忠实地获得在细胞系或爪蟾卵母细胞。后者的主要优点是缺乏内源性受体表达、操作的简单性以及用于微注射和录音的自动化系统的有效性。本协议中描述的程序说明了自动系统的效率, 允许在大约7分钟内注射96只卵母细胞, 不需要微操作系统技能。记住, 在10,000–30,000 卵母细胞之间的一个单一的卵巢从爪蟾包含, 很明显, 大量的细胞测量可以进行一个单一的准备。此外, 作为一个表达可以使用 cDNA 注射, 相同的质粒含有的基因, 为结合实验开发的兴趣, 可以用于功能表征, 而无需进一步的分子生物学操作。
由于它的大面积和高表面表达, 一个单一的卵母细胞产生了一些受体, 大约相当于35毫米培养皿中的汇合细胞。然而, 卵母细胞的制备和注射是细胞系成本的一小部分, 因为实验不需要特定的培养基和无菌操作。一个单一的 GABA 的激活通道产生一些 picoamperes (10-12) 和电流范围高达十 microampere (10-6) 很容易记录在一个单一的卵母细胞, 这证实了伴随的活动, 数以百万计的受体在一个单一的反应。
在配体-门控离子通道的表征中, 第一步通常是受体的明显亲和性的测定。需要进行的实验包括应用一系列短暂的激动剂测试脉冲和绘制诱发电流的振幅, 或者在某些情况下, 将曲线下的区域作为激动剂浓度对数的函数。由于在同一批卵母细胞中 microinject 不同质粒浓度和比值是很容易的, 这种表达系统特别适合于这种特征。此外, 批对批次的比较显示, 在不同的 EC50s 的高度稳定性。亚单位组成对受体的明显亲和性的影响是容易形象化使用蜘蛛情节, 如图 10所示。
在爪蟾卵母细胞中获得的双电极电压钳的结果往往与使用膜片钳电极的录音进行比较。虽然它将超出这项工作的范围, 深入到这两个系统之间的详细比较, 有几个点可以审查。虽然细胞中的膜片钳为生物物理特性的快速药物应用提供了优势, 但它的要求比爪蟾卵母细胞的双电极记录更复杂。第一个和不可忽略的困难是一个特定的蛋白质的表达与细胞培养的必要性, 瞬变或稳定的转染, 以及表达所需结构的细胞的标识。此外, 研究细胞内源表达的可能贡献也是必不可少的。此外, 膜片钳记录要求有技能的人在高放大显微镜下进行微操作系统, 而该人也需要在实验期间进行充分的分析, 以评估, 例如, 密封的质量,接触电阻等, 双电极电压钳记录, 特别是使用自动电生理系统, 不需要任何具体技能, 可以由实验室技术员进行。
在获得电生理设置时, 成本考虑无疑是需要仔细分析的一个重要因素。例如, 虽然自动化系统的成本相对较高, 但更接近的比较表明, 安装完整的电生理平台包括购买设备, 如良好的并联, 双目透镜, 放大器, 灌注系统, 以及一个反振动表, 同时也获取数据和执行分析。两电极电压钳设置与膜片钳设置之间的成本比较显示出更大的差异。此外, 自动化系统还提供了全自动设备的优点, 日夜无人值守。
化合物的药理性质由受体的作用方式决定。例如, 竞争性抑制剂是分子, 可以进入相同的捆绑口袋, 或 orthosteric 网站, 因为激动剂本身导致竞争。非竞争性抑制剂是抑制受体的化合物, 在另一地点相互作用, 在配体-门控离子通道的情况下, 可以进入和阻断离子孔隙, 例如。这将超出这项工作的范围, 以审查不同的互动机制, 但进一步的信息可以获得从药理教科书和/或其他工作, 如22。
在构调制器的情况下, 化合物绑定在一个与 orthosteric 站点不同的站点上, 但分子的存在改变了活动状态和其他状态之间的能量屏障。正构调制器 (PAMs) 是一种能将能量屏障从静止状态减少到活性态的化合物, 因此增强了激动剂的作用。为了描述可能的 PAM 效应, 因此, 有必要确定接触到化合物是否增强了对激动剂的反应, 如果是这样, 那么浓度。图 11和图 14所示的实验说明了可以成功用于 PAMs 在 GABAA受体上的特性的协议。
在某些情况下, 单独接触 PAM 可能足以激活受体。此类活动可以通过对此处提出的实验协议稍加修改来确定。即, 在接触氨基丁酸的过程中, 不使用调制器的联合应用, 可以对该协议进行修改, 以单独使用该化合物, 然后在 gaba 的存在下进行。直接激动剂活动的特征将由化合物本身诱发的反应幅度的测定和与 GABA 诱发电流的比较来进行。
在脑切片中进行的实验, 如图 7所示, 用于确定抑制回路中的原生受体的复合活动, 然后再进一步的动物模型和沿路径的临床试验。相对简单的数据记录和分析协议, 通过评估其对 PS 振幅的差分调节效应, 可以对多个化合物进行排序。也可以检测与 GABA 系统无关的化合物的非特异效应 (例如, 当观察到 PS 形状的变化时)。直接, GABAergic 神经传递可以评估这些情况下, 通过测量化合物对抑制性突触后电流 (IPSCs) 使用全细胞膜片钳技术8。
Disclosures
作者弗雷德里克·帕西 Knoflach 和玛丽亚-克莱门的雇员是霍夫曼-罗氏股份公司, 4070 瑞士巴塞尔, 一家制药公司。作者丹尼尔. HiQScreen Sàrl 6, Compois, 1222 Vésenaz 瑞士日内瓦, 为制药公司提供甄别设施的雇员。
Acknowledgments
作者感谢朱蒂丝兰格, 玛丽亚 Karg, Grégoire Friz, 雷切尔哈伯历和玛丽克莱尔 Pflimlin 从罗氏和 Tifany 马丁·舍尔和黛博拉保卢奇从 HiQScreen 为他们出色的技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General equipment | |||
| 96 well cell harvester -(Filtermate 196) | Packard | To filter membranes with bound radioligand | |
| Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT) | Packard | Microplate Scintillation and Luminescence counter | |
| Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR) | Packard | Vial Scintillation and Luminescence counter | |
| Liquid handler (Biomek 2000) | Beckman coulter | To prepare compound dilutions | |
| Vortex (Vortex Genie 2) | Scientific industries Inc. | To mix compound stock solutions | |
| Tissue homogenizer (Polytron PT1200E) | Kinematica AG | To resuspend the membrane preparations | |
| XLfit5 software | Microsoft Excel add-on by IDBS |
Curve fitting software | |
| Smart Pull | UniPix | - | Electrode Puller |
| RoboInject | MultiChannel Systems | - | Automated Injection (Xenopus Oocytes) |
| HiClamp | MultiChannel Systems | - | Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes) |
| DataMining | MultiChannel Systems | - | Data Analysis Software |
| DataMerger | MultiChannel Systems | - | Data Processing Software |
| Digidata 1550 | Molecular Devices | Low noise data acquisition system | |
| CyberAmp 380 or equivalent | Axon Instruments | Programmable Signal Conditioner | |
| pClamp program suite | Molecular Devices | Software for data acquisition and analysis software | |
| Antivibraton table | TMC | To avoid microelectrode vibrations | |
| Patchstar Micromanipulators | Scientifica | To accurately position microelectrodes in brain slices | |
| Faraday Cage | Sutter Instruments | To isolate recordings from noise | |
| McIlwain Tissue Chopper | Campden Instruments LTD | To prepare brain slices | |
| Borosilicate glass micropipette | Warner Instruments | GC150TF-10 | To record extracellular potentials in brain slices |
| Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode | World Precision Instruments | To stimulate the brain slices with current | |
| Stimulus generator for current and voltage driven stimulation | MultiChannel Systems | STG4000 | Delivers the current to the stimulation electrode |
| Plasticware | |||
| Microtiter plate round bottom | Corning | #3365 | Used for the binding assay |
| GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2 µm poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter | Packard | #6005174 | used for the binding assay |
| 50 mL Tubes | Falcon | #352070 | used for the binding assay |
| Safe-lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | #0030 120086 | used for the binding assay |
| Safe-lock tubes 2 mL | Eppendorf | #0030 120094 | used for the binding assay |
| Shipping tubes 180 mL | Semadeni Europe AG | #3722 | used for the binding assay |
| Pony vial Polyethylene 6 mL | Perkin Elmer | #6013329 | used for the binding assay |
| Top Seal | Perkin Elmer | #60051859 | used for the binding assay |
| Spinner Flask | Bellco | BELLCO # 1965-00100 | Spinner Flask |
| 96 Well Plate (Conical) | Thermo Scientific Milian | 56368 | Injection plate for the oocytes |
| 96 Well Plate (Flat bottom) | Corning (Vitaris Switzerland) | 3364-cor | Compound Plate for the HiClamp |
| Glass capillary | Hilgenberg (Germany) | - | borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament |
| RNA preparation | |||
| Ambion mMessage mMachine | Thermo Fisher Scientific | for the in vitro synthesis | |
| Chemicals | |||
| Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4 °C. | Used for binding assay | ||
| Washing buffer: Tris 50 mM -HCl pH 7.4; store at 4 °C. | Used for binding assay | ||
| Stock solution of test compounds 10 mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| Flumazenil (RO0151788) 10 mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| Diazepam 4 mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| [3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20 °C | Used for binding assay | ||
| Microscint 40 | Packard | #6013641 | Used for binding assay |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | #6013329 | Used for binding assay |
| MS-222 | Sigma | Sigma # A5040 | MS-222 |
| AB/AM | Sigma | Sigma # A5955 | antibiotics / antimycotics |
| Collagenase | Sigma | Sigma # C1030 | Collagenase Type I |
| Rnase | Sigma | Sigma # R2020-250 mL | RNaseZAP |
| EndoFree Plasmid maxi Kit | Qiagen | Qiagen # 12362 | |
| Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.) | Sigma | ||
| Membranes | |||
| Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: α1β3γ2, α2β3γ2, α3β3γ2, α5β3γ2. See Ballard et al. 2009 for detailed methods. | Used for binding assay |
References
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