यहां, हम वर्तमान प्रोटोकॉल गाबा पर सक्रिय यौगिकों की खोज करने के लिएएक रिसेप्टर्स, फिजियोलॉजी और औषध विज्ञान के लिए बाध्यकारी से.
यह पांडुलिपि गामा-aminobutyric एसिड प्रकार एक (गाबाएक) रिसेप्टर्स और उपंयास से नैदानिक परख में सक्रिय अणुओं की पहचान की दिशा में इसके उपयोग में एक इन विट्रो रिकॉमबिनेंट स्क्रीनिंग यौगिकों के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है मूषक मस्तिष्क स्लाइस में देशी रिसेप्टर्स पर उनके औषधीय प्रभाव को रिसेप्टर. रिसेप्टर्स के बेंजोडाइजेपाइन साइट पर बाध्यकारी यौगिकों के लिए, पहला कदम प्रमुख गाबाएक उपप्रकार व्यक्त कोशिका झिल्ली पर radioligand बाध्यकारी परख के विकास के होते हैं कि एक प्राथमिक स्क्रीन स्थापित करने के लिए है. फिर, Xenopus अंडाणुओं या HEK २९३ कोशिकाओं में कुतर और मानव गाबाएक रिसेप्टर्स की heterologous अभिव्यक्ति का लाभ लेने, यह electrophysiological परख में, पता लगाने के लिए संभव है, अलग रिसेप्टर के शारीरिक गुण उपप्रकारों और औषधीय गुणों की पहचान की यौगिकों । Xenopus oocyte प्रणाली यहां प्रस्तुत किया जाएगा, अंडाणुओं के अलगाव और उनके microinjection अलग mRNAs के साथ शुरू, औषधीय लक्षण वर्णन दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज clamps का उपयोग करने के लिए ऊपर । अंत में, एक अच्छी तरह से परिभाषित ंयूरॉन सर्किट में उनके मूल रिसेप्टर्स पर अणुओं की गतिविधि का आकलन करने के लिए एक माध्यमिक शारीरिक परीक्षण के रूप में इस्तेमाल किया जाता है कि कुतर मस्तिष्क स्लाइस में किए गए रिकॉर्डिंग वर्णित किया जाएगा । एकाधिक न्यूरॉन्स की जनसंख्या प्रतिक्रियाओं का उपयोग Extracellular रिकॉर्डिंग दवा आवेदन के साथ एक साथ प्रदर्शन कर रहे हैं.
यहां, हम गाबा पर सक्रिय यौगिकों की खोज के लिए प्रोटोकॉल मौजूदएक रिसेप्टर्स, फिजियोलॉजी और औषध विज्ञान के लिए बाध्यकारी से. उपंयास गाबा के लिए विशिष्ट अणुओं के लिए खोज मेंएक रिसेप्टर्स, यह परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में संभव के रूप में ठीक है, ब्याज की उपप्रकार और नव पहचान यौगिकों की विशिष्टता का आकलन (जैसे, एक समीक्षा के लिए, रूडोल्फ देखें और Knoflach१या Sieghart२). दवा की खोज में एक विशिष्ट पथ और कदम है कि प्राप्त करने की जरूरत है चित्रा 1में सचित्र हैं ।
बाध्यकारी परख गया है और अभी भी मोटे तौर पर दवा की खोज में पहला कदम के रूप में इस्तेमाल किया । गाबाएक रिसेप्टर्स के मामले में, वे यौगिकों की पहचान करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं कि बेंजोडाइजेपाइन रिसेप्टर के बंधन साइट के लिए बाध्य जहां चिकित्सकीय उपयोगी और सुरक्षित दवाओं बाँध. अंय तकनीकों, fluorometric इमेजिंग प्लेट रीडर (FLIPR) झिल्ली संभावित लाल डाई आधारित परख3का उपयोग, barbiturates जैसे यौगिकों कि अतिरिक्त साइटों है कि उनके अवांछित पक्ष प्रभाव प्रोफ़ाइल के कारण कम वांछनीय है करने के लिए बाध्य का पता लगाने । इसके अलावा, उपयोग रंजक सीधे गाबाएक रिसेप्टर्स सक्रिय कर सकते हैं, इस प्रकार दवा4खोज के लिए इन परख की उपयोगिता पर सवाल. बाध्यकारी परख केवल सबूत है कि एक दिया यौगिक एक विशिष्ट रिसेप्टर वर्ग के लिए बाध्य कर सकते है प्रदान कर सकते हैं। इन विट्रो में सेल झिल्ली के साथ परख चयनात्मक मानव गाबाएक α5β3γ2 रिसेप्टर लाइगैंडों की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है. क्षणिक transfected HEK293 मानव गाबाएक α5β3γ2 व्यक्त कोशिकाओं, α1β3γ2, α2β3γ2, और α3β3γ2 रिसेप्टर्स इन परख के लिए झिल्ली तैयार करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. लाइगैंडों के प्रभाव [3 एच] flumazenil झिल्ली रिसेप्टर्स ([3एच] flumazenil बंधन का एक निषेध) के लिए बाध्य की जुटान को मापने के द्वारा पता चला है । इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि ब्याज की रिसेप्टर पर यौगिक बाध्यकारी अपनत्व का एक तेजी से और कुशल दृढ़ संकल्प ब्याज की रिसेप्टर पर प्रदान की जाती है ।
कार्यात्मक अध्ययन यौगिकों के कार्यात्मक गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए और रिसेप्टर्स के लिए यौगिकों के बंधन की वजह से तंत्र के एक शारीरिक और औषधीय विवरण का प्रस्ताव करने के लिए आवश्यक हैं. आज, यह अच्छी तरह से मांयता प्राप्त है कि कार्यात्मक गाबाएक रिसेप्टर्स pseudosymmetry की एक धुरी ईओण ताकना और पांच समान उपइकाईयों के विधानसभा से परिणाम द्वारा गठित के आसपास के विधानसभा से परिणाम है । गाबाएक रिसेप्टर्स के अधिकांश दो या अधिक विभिन्न उपइकाईयों से बना रहे हैं. प्रमुख मस्तिष्क गाबाएक रिसेप्टर, उदाहरण के लिए, 2, 2, और 1 के एक stoichiometry में हैं1, β2, और γ2 उपइकाईयों से बना है क्रमशः5,6. Xenopus अंडाणुओं या HEK293 कोशिकाओं के रूप में एक मेजबान प्रणाली में एक पुनर्गठन तेजी से रिसेप्टर्स के औषधीय गुणों की खोज की संभावना प्रदान करता है ।
यौगिकों के औषधीय गुणों तो मस्तिष्क स्लाइस7में extracellular रिकॉर्डिंग के साथ पता लगाया है । इस विधि neurotransmission पर यौगिकों के प्रभाव की एक खोज की अनुमति देता है और समग्र में देशी रिसेप्टर्स के स्तर पर heterologous अभिव्यक्ति प्रणालियों में निर्धारित यौगिकों के कार्यात्मक प्रभाव की पुष्टि करने के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है न्यूरॉन वातावरण. GABAergic neurotransmission निरोधात्मक postsynaptic स्वरुपात (IPSCs)८पर यौगिकों के प्रभाव को मापने के द्वारा आणविक स्तर पर भी मूल्यांकन किया जा सकता है. लेकिन यहां प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया और मस्तिष्क स्लाइस में पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के आधार पर अधिक विस्तृत है और एक कम प्रवाह पैदावार ।
अंत में, शक्तियों और कमजोरियों में इन विट्रो स्क्रीनिंग α5β3γ2 की पहचान के लिए इस्तेमाल झरना-चयनात्मक लाइगैंडों विभिंन तकनीकों और उनके आंतरिक सीमाओं के परिप्रेक्ष्य में चर्चा कर रहे हैं । इस काम के विशेषज्ञों और गैर गाबा के क्षेत्र में विशेषज्ञएक रिसेप्टर्स इन विट्रो इन ligand-gated आयन चैनलों के नए मॉडुलन की खोज से निपटने के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण में अलग के संयोजन की एक उपयोगी समीक्षा प्रदान करना चाहिए.
ऐसे गाबाएक रिसेप्टर्स के रूप में एक ligand-gated आयन चैनल पर सक्रिय उपंयास यौगिकों के विकास के कई तरीकों के उपयोग की आवश्यकता है. आमतौर पर, पहला कदम अक्सर बाध्यकारी परख का उपयोग किया जाता है; हालांकि, ऐसे माप यौगिक या इसके सटीक औषध विज्ञान की शारीरिक गतिविधि की विशेषता के लिए अपर्याप्त हैं । विशेष रूप से, एक यौगिक है कि एक रिसेप्टर को बांध बढ़ाने या अपने समारोह को बाधित या यहां तक कि कोई कार्यात्मक प्रभाव पैदा कर सकते हैं (चुप) (यानी, अपने कार्य को संशोधित करने के बिना रिसेप्टर को बांध). इस प्रकार, एक कार्यात्मक परीक्षण एक पूर्ण यौगिक लक्षण वर्णन के लिए आवश्यक है ।
बाध्यकारी परख:
बाध्यकारी परख का मुख्य लाभ यह है कि यह कुशलतापूर्वक कई हजारों को लेकर नमूनों की एक बड़ी संख्या पर आयोजित किया जा सकता है और यह सक्रिय अणुओं के लिए बाध्यकारी समानताएं प्रदान करता है । यहां वर्णित के रूप में, पहला कदम वांछित रिसेप्टर उपप्रकार के आकलन के लिए एक विधि की स्थापना के होते हैं । अर्थात्, जबकि बंधन भागों या पूरे दिमाग से मूल रिसेप्टर्स पर आयोजित किया जा सकता है, इस तरह के एक विधि विशिष्ट रिसेप्टर उपप्रकार में समानताएं के निर्धारण को रोकने जाएगा. इसलिए, वांछित लक्ष्य पर अणुओं स्क्रीन करने के लिए रिकॉमबिनेंट प्रणालियों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है । आजकल, सेल लाइनों में वांछित रिसेप्टर उपइकाई cDNAs के एक क्षणिक या स्थिर अभिकर्मक के लिए ब्याज की रिसेप्टर उपप्रकार व्यक्त करने के लिए एक कुशल और विश्वसनीय विधि प्रदान करता है (जैसे, गाबाएक α5β3γ2). पारंपरिक बाध्यकारी परख radioligands का उपयोग करते हैं, लेकिन आजकल तकनीक उपलब्ध है कि रेडियोधर्मिता से निपटने की असुविधा से बचने के (जैसे, मात्रात्मक प्रतिदीप्ति आधारित ligand-बाध्यकारी) ।
एक मेजबान प्रणाली में कार्यात्मक अभिव्यक्ति:
एक मेजबान प्रणाली में जीन एक्सप्रेस, ब्याज की कोडिंग अनुक्रम एक प्लाज्मिड है कि पर्याप्त मोटरों शामिल में डाला जाना चाहिए । आमतौर पर, के लिए इन विट्रो mRNA संश्लेषण, बैक्टीरियल T7 या T6 मोटरों का उपयोग किया जाता है । एक सीडीएनए अभिव्यक्ति के लिए, ब्याज की जीन की प्रतिलिपि ऐसे सीएमवी (cytomegalovirus) या समकक्ष के रूप में एक यूकेरियोट मोटर द्वारा विनियमित किया जाना चाहिए । आजकल, दो मोटरों सहित कई plasmids, (यानी, pUNIV, pCMV-6AC, पीएसएफ-सीएमवी/T7, पीसीआई-नव, pcDNA), या तो एक इन विट्रो संश्लेषण में mRNA की अनुमति उपलब्ध है या एक सीडीएनए अभिव्यक्ति के रूप में चित्र 15में दिखाया गया है । गाबाएक रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति ईमानदारी से या तो सेल लाइनों में या Xenopus अंडाणुओं में प्राप्त किया जा सकता है । बाद के मुख्य लाभ एक अंतर्जात रिसेप्टर अभिव्यक्ति की कमी, जोड़तोड़ की सादगी, और सूक्ष्म इंजेक्शन और रिकॉर्डिंग के लिए एक स्वचालित प्रणाली की उपलब्धता कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाओं स्वचालित प्रणाली की क्षमता है जो के बारे में 7 मिनट में ९६ अंडाणुओं के इंजेक्शन की अनुमति देता है और कोई micromanipulation कौशल की आवश्यकता है वर्णन । याद है कि एक Xenopus से एक एकल अंडाशय 10000 – 30000 अंडाणुओं के बीच होता है, यह स्पष्ट है कि सेल माप की एक बड़ी संख्या में एक ही तैयारी पर आयोजित किया जा सकता है । इसके अलावा, के रूप में एक अभिव्यक्ति सीडीएनए इंजेक्शन का उपयोग कर आयोजित किया जा सकता है, एक ही plasmids है कि बाध्यकारी प्रयोगों के लिए विकसित कर रहे है ब्याज की जीन युक्त एक कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए आगे आणविक जीवविज्ञान की आवश्यकता के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है जोड़तोड़.
अपने बड़े आकार और उच्च सतह अभिव्यक्ति को देखते हुए, एक एकल oocyte रिसेप्टर्स कि लगभग एक ३५ मिमी पेट्री डिश में धाराप्रवाह कोशिकाओं के बराबर है की एक संख्या पैदावार । हालांकि, एक अंडाणुओं तैयारी और इंजेक्शन एक सेल लाइन की लागत का एक अंश का प्रतिनिधित्व करता है, के रूप में प्रयोग एक विशिष्ट संस्कृति मध्यम और बाँझ जोड़तोड़ की आवश्यकता नहीं है । एक एकल गाबाएक चैनल के सक्रियकरण कुछ picoamperes (10-12) पैदावार और धाराओं microampere के दसियों को लेकर (10-6) आसानी से एक एकल oocyte में दर्ज कर रहे हैं, जो कई लाखों लोगों के सहवर्ती गतिविधि की पुष्टि एक भी प्रतिक्रिया के दौरान रिसेप्टर्स.
ligand-gated आयन चैनलों के लक्षण वर्णन में एक पहला कदम अक्सर रिसेप्टर्स के स्पष्ट संबंध का निर्धारण है. प्रयोगों है कि आयोजित की जरूरत है संक्षिप्त एगोनिस्ट परीक्षण दालों की एक श्रृंखला लागू करने और पैदा की वर्तमान के आयाम की साजिश रचने से मिलकर बनता है या, कुछ मामलों में, वक्र के तहत क्षेत्र (ईमेज) एगोनिस्ट एकाग्रता के लघुगणक के एक समारोह के रूप में. के रूप में यह आसानी से विभिंन प्लाज्मिड सांद्रता और अंडाणुओं के एक ही बैच में अनुपात microinject संभव है, अभिव्यक्ति की इस प्रणाली को इस तरह के लक्षण वर्णन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है । इसके अलावा, एक बैच के लिए बैच तुलना अलग चुनाव आयोग५०एस के लिए स्थिरता की एक उच्च डिग्री का पता चला । रिसेप्टर के स्पष्ट संबंध पर उपइकाई संरचना के प्रभाव को आसानी से एक मकड़ी की साजिश का उपयोग कर, चित्र 10में उदाहरण के रूप में कल्पना की है ।
दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना Xenopus अंडाणुओं में प्राप्त के परिणाम अक्सर पैच क्लैंप इलेक्ट्रोड का उपयोग कर बनाया रिकॉर्डिंग के साथ तुलना कर रहे हैं. जबकि यह इस काम के दायरे से बाहर जाने के लिए इन दोनों प्रणालियों के बीच एक विस्तृत तुलना में जाना होगा, कुछ बिंदुओं की जांच की जा सकती है । जबकि कोशिकाओं में एक पैच दबाना एक तेजी से दवा आवेदन के साथ एक भौतिक लक्षण वर्णन के लिए लाभ प्रदान करता है, अपनी आवश्यकताओं को Xenopus अंडाणुओं में दो इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग की तुलना में अधिक जटिल हैं. एक पहली और गैर नगण्य कठिनाई एक कोशिका संस्कृति की आवश्यकता के साथ एक दिया प्रोटीन की अभिव्यक्ति है, एक क्षणिक या स्थिर अभिकर्मक, और वांछित निर्माण व्यक्त कर रहे हैं कि कोशिकाओं की पहचान. इसके अलावा, यह माना जाता सेल में अंतर्जात अभिव्यक्ति के संभावित योगदान की जांच अपरिहार्य है । इसके अलावा, एक पैच दबाना रिकॉर्डिंग एक कुशल व्यक्ति के लिए एक उच्च आवर्धन माइक्रोस्कोप के तहत micromanipulation आचरण की आवश्यकता है, जबकि उस व्यक्ति को भी आकलन करने के लिए प्रयोग के दौरान एक पर्याप्त विश्लेषण करने की जरूरत है, उदाहरण के लिए, सील की गुणवत्ता, इसके विपरीत उपयोग प्रतिरोध आदि , एक दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग, विशेष रूप से एक स्वचालित electrophysiological प्रणाली का उपयोग कर, किसी भी विशिष्ट कौशल की आवश्यकता नहीं है और प्रयोगशाला तकनीशियनों द्वारा आयोजित किया जा सकता है ।
जब एक electrophysiological सेट अप प्राप्त करने, लागत विचार निश्चित रूप से एक महत्वपूर्ण कारक है कि जरूरतों को ध्यान से विश्लेषण किया है । उदाहरण के लिए, जबकि एक स्वचालित प्रणाली की लागत अपेक्षाकृत अधिक है, एक करीब तुलना से पता चलता है कि एक पूरा electrophysiological रिग की स्थापना जैसे अच्छे micromanipulators, एक दूरबीन लेंस, एक एंपलीफायर, एक छिड़काव के रूप में उपकरणों की खरीद भी शामिल है प्रणाली, और एक विरोधी कंपन तालिका, जबकि भी डेटा प्राप्त करने और एक विश्लेषण प्रदर्शन । एक दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना सेट अप बनाम एक पैच क्लैंप सेट अप के बीच एक लागत तुलना भी आगे विसंगतियों का पता चलता है । इसके अलावा, स्वचालित प्रणाली पूरी तरह से स्वचालित उपकरण का लाभ प्रदान करता है और दिन और रात को उपेक्षित चलाता है ।
एक यौगिक के औषधीय गुणों रिसेप्टर पर कार्रवाई की अपनी विधा के द्वारा निर्धारित कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, प्रतिस्पर्धी अवरोधकों अणुओं है कि एक ही बाध्यकारी जेब, या orthosteric साइट में प्रवेश कर सकते हैं, के रूप में एगोनिस्ट ही एक प्रतियोगिता का कारण बनता है । गैर प्रतिस्पर्धी अवरोधक यौगिकों कि एक और साइट पर बातचीत से रिसेप्टर्स को बाधित कर रहे हैं और, एक ligand के मामले में-gated आयन चैनल, कि दर्ज करें और ईओण ताकना ब्लॉक कर सकते हैं, उदाहरण के लिए. यह इस काम के दायरे से बाहर जाने के लिए संपर्क के विभिंन तंत्र की जांच करेंगे, लेकिन अधिक जानकारी एक औषधीय पाठ्यपुस्तक से प्राप्त किया जा सकता है और/या बर्ट्रेंड और बर्ट्रेंड है22के रूप में अंय काम से ।
allosteric मॉडुलन के मामले में, एक साइट है कि orthosteric साइट से अलग है पर यौगिक बांधता है, लेकिन अणु की उपस्थिति सक्रिय और अन्य राज्यों के बीच ऊर्जा बाधा को संशोधित करता है. पॉजिटिव allosteric ढा (पम्म) ऐसे यौगिक होते हैं जो आराम से सक्रिय अवस्था में ऊर्जा अवरोध को कम करते हैं और इसलिए, एगोनिस्ट के प्रभाव को बढ़ाते हैं । संभव पाम प्रभाव विशेषताएं, यह इसलिए, यदि यौगिक के लिए एक जोखिम एगोनिस्ट की प्रतिक्रिया को बढ़ाता है और निर्धारित करने के लिए आवश्यक है, अगर ऐसा है, जिस पर एकाग्रता । चित्र 11 और चित्रा 14 में प्रस्तुत प्रयोगों को सफलतापूर्वक गाबाएक रिसेप्टर्स पर पम्म के लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रोटोकॉल को स्पष्ट करना.
कुछ मामलों में, अकेले पाम करने के लिए जोखिम रिसेप्टर्स को सक्रिय करने के लिए पर्याप्त हो सकता है । इस तरह की गतिविधि प्रायोगिक प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत की एक मामूली संशोधन के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । अर्थात्, गाबा के लिए जोखिम के दौरान एक सह मॉडुलन के आवेदन का उपयोग कर के बजाय, प्रोटोकॉल पहले अकेले यौगिक के आवेदन के लिए संशोधित किया जा सकता है और फिर गाबा की उपस्थिति में. प्रत्यक्ष एगोनिस्ट गतिविधि का लक्षण वर्णन की प्रतिक्रिया के आयाम के निर्धारण द्वारा किया जाएगा खुद को यौगिक द्वारा पैदा की और गाबा की तुलना में वर्तमान पैदा की ।
इस तरह के चित्र 7में सचित्र के रूप में मस्तिष्क स्लाइस में किए गए प्रयोगों, पशु मॉडल में आगे जाने के लिए और नैदानिक परीक्षणों की ओर मार्ग के साथ पहले एक निश्चित निरोधात्मक सर्किट में देशी रिसेप्टर्स पर यौगिक गतिविधि की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. अपेक्षाकृत सरल डेटा रिकॉर्डिंग और विश्लेषण प्रोटोकॉल पुनश्च आयाम पर उनके अंतर modulatory प्रभाव का मूल्यांकन करके कई यौगिकों की रैंकिंग की अनुमति देता है । गैर विशिष्ट यौगिकों जो गाबा प्रणाली से संबंधित नहीं हैं के प्रभाव भी पता लगाया जा सकता है (जैसे, पुनश्च आकार में परिवर्तन मनाया जाता है). प्रत्यक्ष, GABAergic neurotransmission इन मामलों में निरोधात्मक postsynaptic धाराओं (IPSCs) पर यौगिकों के प्रभाव को मापने के द्वारा पूरे सेल पैच दबाना तकनीक8का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों जूडिथ Lengyel, मारिया कॅग, Grégoire Friz, राहेल Haab, और Pflimlin से मैरी क्लेयर Roche और Tifany Schaer और दबोरा Paolucci से HiQScreen उनके उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए धंयवाद ।
General equipment | |||
96 well cell harvester -(Filtermate 196) | Packard | To filter membranes with bound radioligand | |
Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT) | Packard | Microplate Scintillation and Luminescence counter | |
Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR) | Packard | Vial Scintillation and Luminescence counter | |
Liquid handler (Biomek 2000) | Beckman coulter | To prepare compound dilutions | |
Vortex (Vortex Genie 2) | Scientific industries Inc. | To mix compound stock solutions | |
Tissue homogenizer (Polytron PT1200E) | Kinematica AG | To resuspend the membrane preparations | |
XLfit5 software | Microsoft Excel add-on by IDBS |
Curve fitting software | |
Smart Pull | UniPix | – | Electrode Puller |
RoboInject | MultiChannel Systems | – | Automated Injection (Xenopus Oocytes) |
HiClamp | MultiChannel Systems | – | Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes) |
DataMining | MultiChannel Systems | – | Data Analysis Software |
DataMerger | MultiChannel Systems | – | Data Processing Software |
Digidata 1550 | Molecular Devices | Low noise data acquisition system | |
CyberAmp 380 or equivalent | Axon Instruments | Programmable Signal Conditioner | |
pClamp program suite | Molecular Devices | Software for data acquisition and analysis software | |
Antivibraton table | TMC | To avoid microelectrode vibrations | |
Patchstar Micromanipulators | Scientifica | To accurately position microelectrodes in brain slices | |
Faraday Cage | Sutter Instruments | To isolate recordings from noise | |
McIlwain Tissue Chopper | Campden Instruments LTD | To prepare brain slices | |
Borosilicate glass micropipette | Warner Instruments | GC150TF-10 | To record extracellular potentials in brain slices |
Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode | World Precision Instruments | To stimulate the brain slices with current | |
Stimulus generator for current and voltage driven stimulation | MultiChannel Systems | STG4000 | Delivers the current to the stimulation electrode |
Plasticware | |||
Microtiter plate round bottom | Corning | #3365 | Used for the binding assay |
GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2µm poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter | Packard | #6005174 | used for the binding assay |
50 mL Tubes | Falcon | #352070 | used for the binding assay |
Safe-lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | #0030 120086 | used for the binding assay |
Safe-lock tubes 2 mL | Eppendorf | #0030 120094 | used for the binding assay |
Shipping tubes 180ml | Semadeni Europe AG | #3722 | used for the binding assay |
Pony vial Polyethylene 6ml | Perkin Elmer | #6013329 | used for the binding assay |
Top Seal | Perkin Elmer | #60051859 | used for the binding assay |
Spinner Flask | Bellco | BELLCO # 1965-00100 | Spinner Flask |
96 Well Plate (Conical) | Thermo Scientific Milian | 56368 | Injection plate for the oocytes |
96 Well Plate (Flat bottom) | Corning (Vitaris Switzerland) | 3364-cor | Compound Plate for the HiClamp |
Glass capillary | Hilgenberg (Germany) | – | borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament |
RNA preparation | |||
Ambion mMessage mMachine | Thermo Fisher Scientific | for the in vitro synthesis | |
Chemicals | |||
Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4°C. | Used for binding assay | ||
Washing buffer: Tris 50mM -HCl pH 7.4; store at 4°C. | Used for binding assay | ||
Stock solution of test compounds 10mM in DMSO | Used for binding assay | ||
Flumazenil (RO0151788) 10mM in DMSO | Used for binding assay | ||
Diazepam 4mM in DMSO | Used for binding assay | ||
[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20°C | Used for binding assay | ||
Microscint 40 | Packard | #6013641 | Used for binding assay |
Ultima Gold | Perkin Elmer | #6013329 | Used for binding assay |
MS-222 | Sigma | Sigma # A5040 | MS-222 |
AB/AM | Sigma | Sigma # A5955 | antibiotics / antimycotics |
Collagenase | Sigma | Sigma # C1030 | Collagenase Type I |
Rnase | Sigma | Sigma # R2020-250 mL | RNaseZAP |
EndoFree Plasmid maxi Kit | Qiagen | Qiagen # 12362 | |
Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.) | Sigma | ||
Membranes | |||
Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: α1β3γ2, α2β3γ2, α3β3γ2, α5β3γ2. See Ballard et al 2009 for detailed methods. | Used for binding assay |